CN104726587A - 用于检测人类红细胞Kidd血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents
用于检测人类红细胞Kidd血型基因分型的引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的引物组及试剂盒。用于Kidd血型基因测定的引物组包括JKa引物对,JKb引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Kidd血型的种种限制、是正确判定血型不可缺少的辅助手段,具有广泛的应用前景和临床参考价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因分型的试剂盒(PCR-SSP法)。
背景技术
Kidd血型是一种稀有血型。1951年Allen在一新生儿溶血病患儿的母亲血清中发现一新的抗体,称抗-Jka,检出相应的Jka抗原。该母亲姓Kidd,故被称为Kidd 血型。1953年检出Kidd血型中的另一个抗原Jkb,家系调查表明这两个抗原受控于同一座位上的二个显性基因。1959年Pinkerton在菲律宾的西班牙-中国血统的后裔中,发现存在于Jk(a-b-)以外的所有红细胞上。
Kidd血型系统的决定基因位于18号染色体(18q12.3)的 JK基因。该基因有一对共显性等位基因Jk和Jk,分别编码抗原Jk和Jk。1997年,国际输血协会(ISBT)确定Kidd血型系统(009)有三个抗原:即Jka(009001),Jkb(009002)Jk3(009003)。
在不同种族中,Kidd血型分布有一定差异。白种人和黑人中Jka基因频率较高,Jk基因几乎不存在。东方人中Jkb基因一般高于Jka。
抗-Jka及抗-Jkb都可以引起急性溶血性输血反应HTR,特别是迟发性溶血性输血反应DHTR,约占据1/2。这至少部分是由于Kidd抗体,在初次测到后很少几个月内不再测到,病人再次输血后,需经再次免疫产生抗体。
发明内容
本发明的目的是:克服血清学检测试剂的价格昂贵,试剂不好购买等不足,提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Kidd血型基因的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒。
一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的引物组,其特征是包括JKa引物对,JKb引物对及内参引物对。
所述JKa的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述JKb的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒,其特征是包括包被有JKa引物对,JKb引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
所述JKa的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述JKb的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
附图说明
图 1为人类红细胞Kidd血型基因特异引物孔位图。
图 2为实验结果阴阳性判读图。
图 3 为人类红细胞Kidd血型基因测定结果分型读板纸。
图 4 为人类红细胞Kidd血型基因测定试剂盒电泳结果胶图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1。
依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的Kidd等位基因序列,设计出用于检测人类红细胞Kidd血型基因的引物组,该引物组包括JKa引物对,JKb引物对及内参引物对。
实施例2。
一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒,包括包被有JKa引物对,JKb引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒的制备方法是:
(1) 依据人类红细胞Kidd血型基因特异引物孔位图(见图1),分别将JKa引物对,JKb引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上,干燥处理;
(2) 依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer;
(3) 将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔,浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒。
实施例3。
使用操作流程。
一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。
1. 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液(Tris-硼酸盐-EDTA溶液),加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂,混合均匀。
2. 将凝胶槽置于水平位置,向凝胶槽中加入适量凝胶溶液,插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽,确保凝胶溶液覆盖均匀。
3. 待凝胶完全凝固后,竖直拔出电泳梳。
二、PCR循环参数见表1。
表1 扩增参数特征表。
1 | 96℃/2 min | 1 cycle |
2 | 96℃/20 sec, 68℃/60 sec | 5 cycles |
3 | 96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec | 10 cycles |
4 | 96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec | 15 cycles |
5 | 72℃/3 min | 1 cycle |
6 | 4℃保存 |
三、必须满足的试验条件。
1. 从冷冻室取出Taq聚合酶,放置冰上备用。
2. 根据实验所需数量,将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出,放置室温解冻,备用。
3. 根据实验所需数量,将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出,彻底融化,混匀离心。
四、实验过程中的注意事项。
1. PCR扩增前后使用的加样器具要分开,不得混用。
2. 所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。
3. 当观察和拍摄胶凝体时,要戴防紫外光的保护镜,不要直视紫外光源。
4. 试剂和样本应加样到微孔板的底部。
5. 为避免交叉污染,在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。
6. 在检测前应准备好所有试剂和样本,一旦开始试验,为确保得到可靠结果不可中断操作。
7. Taq聚合酶粘性很大,在分装过程中必须小心操作确保准确。
8. 严格按照指定的顺序操作。
五、操作步骤。
1. 选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒,配制dNTP-Buffer工作液:
440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。
2. 配制Buffer-酶混合液:
每人份用量:20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶(5 units/μl)+2μl DNA = 22.3μl 。
3. 漩涡混匀Buffer-酶混合液,并瞬时离心,,使液体位于管底。
4. 分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。
5. 每孔再分别加入15-20μl石蜡油,用密封膜封好PCR反应板(引物板)。
6. 将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内,配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。
7. 反应板顶部置PCR密封压力垫,以防止液体蒸发,关上PCR仪,启动程序直至循环结束。
8. 启动PCR程序,直到循环结束。
9. 取出引物板,轻轻地撕掉密封膜,防止样品溅出。或者如果不立即电泳,置于4℃可保存48小时。
10. 按照引物孔位图的顺序,将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。
11. 140-150V电泳15-20分钟,内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。
12. 紫外光下观察结果并拍摄成像。
13. 根据提供的读板纸解释分型结果。
六、质量控制程序:
内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段,在阴性孔应该总是可见的;阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在,这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
七、实验结果的判读:
人类红细胞Kidd血型基因检测试剂盒电泳结果胶图(见图4)。
实验结果阴阳性判读图(见图2)。
人类红细胞Kidd血型基因测定结果分型读板纸(见图3)。
预期结果:
阳性孔:有两条带,一条是内参带,另一条是特异性扩增带;
阴性孔:只有一条带,是内参带,无特异性扩增带;
产物大小和孔位:见人类红细胞Kidd血型基因特异引物孔位图(见图1);
根据人类红细胞Kidd血型基因特异引物孔位图(见图1)或该试剂配套软件进行分型结果的判定。
该实验为定性试验,特异性扩增带强弱将不影响结果判读;扩增产物大小请参见人类红细胞Kidd血型基因特异引物孔位图(见图1) ;并符合人类基因座位规则。
以上各实验涉及到的引物对如下。
所述JKa的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述JKb的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
序列表
<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司
<120>人类红细胞Kidd血型基因测定试剂盒(PCR-SSP法)
<160>17
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(20)
<400> 1
tctttcagccccatttcagg 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(19)
<400> 2
gggctcaagccagaatcct 19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(20)
<400> 3
tctttcagccccatttcaga 20
Claims (2)
1.一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的引物组,其特征是包括JKa引物对,JKb引物对及内参引物对;
所述JKa的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述JKb的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测人类红细胞Kidd血型基因的试剂盒,其特征是包括包被有JKa引物对,JKb引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer;
所述JKa的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述JKb的上下游引物位于Kidd的DNA参考序列的EXON8 818-838和Intron8 91-111位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
CN115725711A (zh) * | 2022-08-16 | 2023-03-03 | 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) | 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法 |
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2015
- 2015-03-20 CN CN201510125425.XA patent/CN104726587A/zh active Pending
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NIDAL M.ISSHAID ET AL.: "Genomic typing of the kidd blood group locus by a single-tube allele-specific primer PCR technique", 《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》 * |
Cited By (1)
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CN115725711A (zh) * | 2022-08-16 | 2023-03-03 | 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) | 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法 |
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