CN104694657A - 用于检测人类红细胞Duffy血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组及试剂盒。用于Duffy血型基因测定的引物组包括Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Duffy血型的种种限制、是正确判定Duffy血型不可缺少的辅助手段，具有广泛的应用前景和临床参考价值。

Description

用于检测人类红细胞Duffy血型基因分型的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因分型的试剂盒（PCR-SSP法）。

背景技术

Cutbush 等在1950年，在一个多次输血的血友病病人血清中发现了一种抗体, 称抗2Fya 。因为该病人姓Duffy , 故称为Duffy 血型。抗2Fya 的对偶抗体抗2Fyb 是Ikin EW 等在1951年发现的。Sanger 等在1955年使用抗2Fya 、抗2Fyb 二种抗血清调查黑人, 结果发现了Fy (a2b2) 型。为此, 假设存在第三个等位基因Fy。而后Chown 等在白人中检出了另一个等位基因Fyx , 该基因只产生少量的Fyb 抗原, 与某些抗2Fyb 血清只呈弱反应。将混合的人红细胞注射小白鼠产生与抗2Fy3十分相似的单克隆抗体, 称为抗2Fy6 (Nichols et al , 1981) 。

Duffy 血型在染色体上的座位与先天性白内障座位连锁, 也与遗传性视觉异常连锁。从而证明Duffy 座位位于第1 号常染色体上(1q22223) 。这是定位于常染色体上的第一个人类遗传标记。 国际输血协会( ISBT) 1995 年确定Fy 系统编号为008。本系统共有6 个抗原, 其命名及编号分别为Fya(001) , Fyb (002) , Fy3 (003) , Fy4 (004) , Fy5 (005) 及Fy6 (006) 。

国内学者调查发现中国汉族人绝大多数是Fya抗原阳性。1988年曾有学者对我国部分少数民族的Fya抗原携带情况进行调查，他们以满族、藏族、蒙古族、维吾尔族、朝鲜族、壮族、彝族和侗族为调查对象，发现也是Fya抗原阳性者占绝大多数。而白种人却是Duffy血型系统Fya抗原阴性者较多，因此，2008年在奥运期间北京还专门建立了一个稀有血型联动互助机制，以保证具有稀有血型的外籍人士能获得合适的急救血源。

临床上，对于罕见血型新生儿溶血病患儿，换血疗法可换出部分血中游离抗体和致敏红细胞，减轻溶血；置换出血中大量胆红素，预防胆红素脑病发生；同时可以纠正贫血，改善携氧，防止心力衰竭。适当的方法应采用罕见血型系统与母亲同型，AB0系统与患儿同型的血液,换血量一般为患儿血量的2倍（约150～180ml／kg），大约可换出85%的致敏红细胞和60%的胆红素及抗体。杨女士的儿子正是采取了这些措施，所以病情很快好转。

据了解，产前曾多次多胎妊娠，是引起Duffy（Fya）等新生儿及胎儿血型不合溶血病的主要原因。

发明内容

本发明的目的是：克服血清学检测试剂的价格昂贵，试剂不好购买等不足，提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组。

本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒。

一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组，其特征是包括Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对。

所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

附图说明

图 1为人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图。

图 2为实验结果阴阳性判读图。

图 3 人类红细胞Duffy血型基因测定结果分型读板纸。

图 4 人类红细胞Duffy血型基因测定试剂盒电泳结果胶图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1。

依据美国国立生物技术信息中心基因库（NCBI Gene Bank）公开的Duffy等位基因序列，设计出用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组，该引物组包括Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对。

实施例2。

一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒，包括包被有Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒的制备方法是：

(1)       依据人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图（见图1），分别将Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；

(2)       依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer；

(3)       将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒。

实施例3。

使用操作流程。

一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。

1. 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液（Tris-硼酸盐-EDTA溶液），加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。

2. 将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。

3.  待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。

二、PCR循环参数见表。

  表1 扩增参数特征表。

1	96℃/2 min	1 cycle
			2	96℃/20 sec, 68℃/60 sec	5 cycles
3	96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec	10 cycles
			4	96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec	15 cycles
5	72℃/3 min	1 cycle
			6	4℃保存

三、必须满足的试验条件。

1.  从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。

2.   根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。

3.   根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。

四、实验过程中的注意事项。

1.   PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。

2.   所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。

3.  当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。

4.  试剂和样本应加样到微孔板的底部。

5.  为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。

6. 在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。

7.  Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。

8.   严格按照指定的顺序操作。

五、操作步骤。

 1.   选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒，配制dNTP-Buffer工作液：

440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。

2.   配制Buffer-酶混合液：

每人份用量：20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶（5 units/μl）+2μl DNA = 22.3μl 。

3.  漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。

4.  分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。

5.  每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板（引物板）。

6. 将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。

7.  反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。

8.  启动PCR程序，直到循环结束。

9.  取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。

10. 按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。

11. 140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。

12. 紫外光下观察结果并拍摄成像。

13. 根据提供的读板纸解释分型结果。

六、质量控制程序：

内参质控带（缓慢迁移的）作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。

七、实验结果的判读：

人类红细胞Duffy血型基因检测试剂盒电泳结果胶图（见图4）；

实验结果阴阳性判读图（见图2）；

人类红细胞Duffy血型基因测定结果分型读板纸（见图3）。

预期结果：

阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带；

阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带；

产物大小和孔位：见人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图（见图1）；

根据人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图（见图1）或该试剂配套软件进行分型结果的判定。

该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图(见图1) ；并符合人类基因座位规则。

以上各实验涉及到的引物对如下：

所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

序列表

<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司

<120>人类红细胞Duffy血型基因测定试剂盒（PCR-SSP法）

 

<160>17

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(22)

<400> 1

tcttccggtgtaactcggatgg   22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(21)

<400> 2

cagctgcttccaggtgggcac   21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(21)

<400> 3

cagctgcttccaggtgggcat   21

 

Claims (2)

1.一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组，其特征是包括Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对；

所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Duffy FYA引物对，Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；

所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。