CN104694657A - 用于检测人类红细胞Duffy血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组及试剂盒。用于Duffy血型基因测定的引物组包括Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Duffy血型的种种限制、是正确判定Duffy血型不可缺少的辅助手段,具有广泛的应用前景和临床参考价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因分型的试剂盒(PCR-SSP法)。
背景技术
Cutbush 等在1950年,在一个多次输血的血友病病人血清中发现了一种抗体, 称抗2Fya 。因为该病人姓Duffy , 故称为Duffy 血型。抗2Fya 的对偶抗体抗2Fyb 是Ikin EW 等在1951年发现的。Sanger 等在1955年使用抗2Fya 、抗2Fyb 二种抗血清调查黑人, 结果发现了Fy (a2b2) 型。为此, 假设存在第三个等位基因Fy。而后Chown 等在白人中检出了另一个等位基因Fyx , 该基因只产生少量的Fyb 抗原, 与某些抗2Fyb 血清只呈弱反应。将混合的人红细胞注射小白鼠产生与抗2Fy3十分相似的单克隆抗体, 称为抗2Fy6 (Nichols et al , 1981) 。
Duffy 血型在染色体上的座位与先天性白内障座位连锁, 也与遗传性视觉异常连锁。从而证明Duffy 座位位于第1 号常染色体上(1q22223) 。这是定位于常染色体上的第一个人类遗传标记。 国际输血协会( ISBT) 1995 年确定Fy 系统编号为008。本系统共有6 个抗原, 其命名及编号分别为Fya(001) , Fyb (002) , Fy3 (003) , Fy4 (004) , Fy5 (005) 及Fy6 (006) 。
国内学者调查发现中国汉族人绝大多数是Fya抗原阳性。1988年曾有学者对我国部分少数民族的Fya抗原携带情况进行调查,他们以满族、藏族、蒙古族、维吾尔族、朝鲜族、壮族、彝族和侗族为调查对象,发现也是Fya抗原阳性者占绝大多数。而白种人却是Duffy血型系统Fya抗原阴性者较多,因此,2008年在奥运期间北京还专门建立了一个稀有血型联动互助机制,以保证具有稀有血型的外籍人士能获得合适的急救血源。
临床上,对于罕见血型新生儿溶血病患儿,换血疗法可换出部分血中游离抗体和致敏红细胞,减轻溶血;置换出血中大量胆红素,预防胆红素脑病发生;同时可以纠正贫血,改善携氧,防止心力衰竭。适当的方法应采用罕见血型系统与母亲同型,AB0系统与患儿同型的血液,换血量一般为患儿血量的2倍(约150~180ml/kg),大约可换出85%的致敏红细胞和60%的胆红素及抗体。杨女士的儿子正是采取了这些措施,所以病情很快好转。
据了解,产前曾多次多胎妊娠,是引起Duffy(Fya)等新生儿及胎儿血型不合溶血病的主要原因。
发明内容
本发明的目的是:克服血清学检测试剂的价格昂贵,试剂不好购买等不足,提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒。
一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组,其特征是包括Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对。
所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒,其特征是包括包被有Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
附图说明
图 1为人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图。
图 2为实验结果阴阳性判读图。
图 3 人类红细胞Duffy血型基因测定结果分型读板纸。
图 4 人类红细胞Duffy血型基因测定试剂盒电泳结果胶图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1。
依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的Duffy等位基因序列,设计出用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组,该引物组包括Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对。
实施例2。
一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒,包括包被有Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒的制备方法是:
(1) 依据人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图(见图1),分别将Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上,干燥处理;
(2) 依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer;
(3) 将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔,浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒。
实施例3。
使用操作流程。
一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。
1. 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液(Tris-硼酸盐-EDTA溶液),加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂,混合均匀。
2. 将凝胶槽置于水平位置,向凝胶槽中加入适量凝胶溶液,插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽,确保凝胶溶液覆盖均匀。
3. 待凝胶完全凝固后,竖直拔出电泳梳。
二、PCR循环参数见表。
表1 扩增参数特征表。
1 | 96℃/2 min | 1 cycle |
2 | 96℃/20 sec, 68℃/60 sec | 5 cycles |
3 | 96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec | 10 cycles |
4 | 96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec | 15 cycles |
5 | 72℃/3 min | 1 cycle |
6 | 4℃保存 |
三、必须满足的试验条件。
1. 从冷冻室取出Taq聚合酶,放置冰上备用。
2. 根据实验所需数量,将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出,放置室温解冻,备用。
3. 根据实验所需数量,将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出,彻底融化,混匀离心。
四、实验过程中的注意事项。
1. PCR扩增前后使用的加样器具要分开,不得混用。
2. 所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。
3. 当观察和拍摄胶凝体时,要戴防紫外光的保护镜,不要直视紫外光源。
4. 试剂和样本应加样到微孔板的底部。
5. 为避免交叉污染,在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。
6. 在检测前应准备好所有试剂和样本,一旦开始试验,为确保得到可靠结果不可中断操作。
7. Taq聚合酶粘性很大,在分装过程中必须小心操作确保准确。
8. 严格按照指定的顺序操作。
五、操作步骤。
1. 选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒,配制dNTP-Buffer工作液:
440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。
2. 配制Buffer-酶混合液:
每人份用量:20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶(5 units/μl)+2μl DNA = 22.3μl 。
3. 漩涡混匀Buffer-酶混合液,并瞬时离心,,使液体位于管底。
4. 分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。
5. 每孔再分别加入15-20μl石蜡油,用密封膜封好PCR反应板(引物板)。
6. 将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内,配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。
7. 反应板顶部置PCR密封压力垫,以防止液体蒸发,关上PCR仪,启动程序直至循环结束。
8. 启动PCR程序,直到循环结束。
9. 取出引物板,轻轻地撕掉密封膜,防止样品溅出。或者如果不立即电泳,置于4℃可保存48小时。
10. 按照引物孔位图的顺序,将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。
11. 140-150V电泳15-20分钟,内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。
12. 紫外光下观察结果并拍摄成像。
13. 根据提供的读板纸解释分型结果。
六、质量控制程序:
内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段,在阴性孔应该总是可见的;阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在,这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
七、实验结果的判读:
人类红细胞Duffy血型基因检测试剂盒电泳结果胶图(见图4);
实验结果阴阳性判读图(见图2);
人类红细胞Duffy血型基因测定结果分型读板纸(见图3)。
预期结果:
阳性孔:有两条带,一条是内参带,另一条是特异性扩增带;
阴性孔:只有一条带,是内参带,无特异性扩增带;
产物大小和孔位:见人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图(见图1);
根据人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图(见图1)或该试剂配套软件进行分型结果的判定。
该实验为定性试验,特异性扩增带强弱将不影响结果判读;扩增产物大小请参见人类红细胞Duffy血型基因特异引物孔位图(见图1) ;并符合人类基因座位规则。
以上各实验涉及到的引物对如下:
所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
序列表
<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司
<120>人类红细胞Duffy血型基因测定试剂盒(PCR-SSP法)
<160>17
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(22)
<400> 1
tcttccggtgtaactcggatgg 22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(21)
<400> 2
cagctgcttccaggtgggcac 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(21)
<400> 3
cagctgcttccaggtgggcat 21
Claims (2)
1.一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的引物组,其特征是包括Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对;
所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测人类红细胞Duffy血型基因的试剂盒,其特征是包括包被有Duffy FYA引物对,Duffy FYB引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer;
所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA参考序列的Intron1 437-457和EXON2 131-151位置,上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
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