CN103255199A

CN103255199A - 一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法和试剂

Info

Publication number: CN103255199A
Application number: CN 201210033455
Authority: CN
Inventors: 周昌华; 洪缨; 巩天祥; 王乃红; 杨群身; 傅雪梅
Original assignee: CHENGDU BLOOD CENTER
Current assignee: CHENGDU BLOOD CENTER
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以检测人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)。它包括下述步骤：引物设计；制备人基因组DNA；常规PCR，初步确认扩增引物的有效性和特异性；单对引物实时荧光定量PCR测定β-actin、Fy(a)以及Fy(b)基因扩增产物的熔链曲线，确定Tm值及峰形；建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定β-actin+Fy(a)，β-actin+Fy(b)混合产物的熔链曲线，通过Tm值及峰形确定Fy(a)，Fy(b)的基因型。本发明所涉及的方法具有成本相对低廉，能实现多重反应，产物分析在计算机上完成而避免了人为偏差、并能最大限度地避免常规PCR产物污染，每一反应孔均设内参照、便于对实验质量的监控等特点，从而实现对红细胞Duffy血型基因型快速、准确的大规模筛查。

Description

一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法和试剂

技术领域

本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以对人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)进行大规模筛查。

技术背景

Duffy抗原(CD234)是一种位于红细胞表面的蛋白，根据首次发现时的患者(Duffy)而命名。该抗原是一种糖基化的膜蛋白及部分趋化因子的非特异性受体，由Duffy抗原趋化因子受体基因编码，该基因亦称为CC家族结合蛋白1、糖蛋白D、FY等。1950年在一名多次输血的血友病患者血清中首次发现了Duffy血型，其血清中含有抗Fy(a)的抗体，次年在一多次生产的妇女血清内发现了抗Fy(b)抗体。运用这两种抗体确定了4种表型：Fy(a+b+)、Fy(a+b-)、Fy(a-b+)及Fy(a-b-)。其中Fy(a-b-)被国际输血协会定义为稀有血型。Duffy血型抗原具有重要的生物学功能：Duffy是间日疟原虫、杂性趋化因子的受体，同时参与了多种疾病的发生与发展过程，如新生儿溶血病、HIV感染、炎症、肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应等。

Duffy抗原基因位于人类染色体1.q22-1.q23，为含有两个外显子的单拷贝基因，根据其mRNA的简并与否，Duffy抗原肽可分为主要(336aa)和次要(338aa)两种形式，二者区别在于N-末端的氨基酸残基数目前者为6个后者为8个，但此两种形式均能很好结合抗Fy抗体和趋化因子。Duffy抗原具有7次跨膜结构域，含一胞外N-末端结构域和一胞内C-末端结构域。Fy(a)cDNA 131位碱基为鸟嘌呤(G)，Fy(b)为腺嘌呤(A)，造成Fy(a)和Fy(b)抗原在氨基酸序列上有1个氨基酸残基的区别，前者42位上为甘氨酸(Gly)，后者为天冬氨酸(Asp)。

产生Duffy阴性表型Fy(a-b-)的原因主要有两种，较为常见的是由于Fy基因上游GATA-1结合位点突变引起，GATA-1是一种调节红系细胞基因表达的转录因子，此突变阻止Fy基因转录，Fy糖蛋白无法表达于红系细胞，但其余非红系细胞的表达不受影响，因此体内不产生抗Fy(b)或抗Fy-3抗体；产生Fy(a-b-)的另一原因是点突变导致编码序列中提前出现终止密码，并且截短的Duffy蛋白无法被运送至细胞表面，此类突变个体内所有组织中Duffy抗原表达缺失，因而可伴有抗Fy-3强抗体。

红细胞上Duffy抗原在不同种族间的表达存在高度差异，黑人以Fy(a-b-)表型为主：78％非裔美国人，47-90％非洲黑人为此表型；白人Fya与Fyb等位基因的频率分别为0.425和0.557；中国人群以Fy(a+b+)、Fy(a+b-)为主。临床输血中Duffy血型的鉴定逐渐引起人们的重视。Fya和Fyb抗原具有一定的免疫原性，相应的抗体可引起即发型或迟发型溶血性输血反应，必须输注Fya/Fyb阴性血，因此Duffy血型的鉴定对确保输血安全具有重要的临床意义和实用价值，同时对Duffy抗原的研究促进了对人类多种疾病本质与机理的认识。

我国卫生部于2008年启动了国家稀有红细胞血型库建设项目，其中包括Duffy稀有血型[Fy(a-b-)和Fy(a-b+)]的筛选与鉴定。该项目的实施，将满足临床上对稀有血型血液的迫切需求，减少输血不良反应的发生，提高输血疗效。

目前，Duffy血型抗原的检测主要有血清学和分子生物学方法等。前者主要是应用Fya、Fyb抗血清做间接抗人球蛋白实验，后者主要采用PCR-SSP进行基因分型。上述血清学检测试剂依赖进口，价格昂贵；而常规的基因分型检测过程复杂、操作繁琐、容易产生污染、试剂价格昂贵，不适合大规模的Duffy血型抗原的筛查与鉴定。因此，有必要建立简便、快速、准确而廉价的筛选方法。

发明内容

本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以检测人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)。本发明所涉及的方法具特点成本相对低廉，能实现多重反应，产物分析在计算机上完成而避免了人为偏差、并能最大限度地避免常规PCR产物污染，每一反应孔均设内参照、便于对实验质量的监控等特点，从而实现对红细胞Duffy血型基因型快速、准确的大规模筛查。

本发明采用以下技术方案。

它包括下述步骤：

(1)设计扩增引物，用于扩增内参照基因β-actin、Duffy血型Fy(a)以及Fy(b)基因；

(2)制备人基因组DNA；

(3)常规PCR，对扩增引物的有效性和特异性进行初步确认；

(4)单对引物实时荧光定量PCR测定β-actin、Fy(a)以及Fy(b)基因扩增产物的熔链曲线，确定Tm值及峰形，对扩增引物的有效性和特异性进行确认；

(5)建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定β-actin+Fy(a)，β-actin+Fy(b)混合产物的熔链曲线，对照步骤(4)测得的Tm值及峰形确定反应的有效性及Fy(a)，Fy(b)的基因型。

(6)应用本发明检测成都地区献血人群Fy(a)、Fy(b)基因型；

(7)本发明与其他商品Fy-a/b试剂盒的比较研究。

本发明另一个所要解决的问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案：它包括3对寡核苷酸扩增引物，用于扩增内参照基因β-actin、Duffy血型Fy(a)以及Fy(b)基因，其中Fy(a)、Fy(b)的上游扩增引物序列相同。

所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：

β-actin扩增引物：

actb-F：5’-gatgagattggcatggcttt-3’

actb-R：5’-caccttcaccgttccagttt-3’

Fy(a)扩增引物：

Fy：5′-ctctccccctcaactgagaa-3’

Fy(a)-R：5′-agctgcttccaggttggcac-3’

Fy(b)扩增引物：

Fy：5′-ctctccccctcaactgagaa-3’

Fy(b)-R：5′-agctgcttccaggttggcat-3’

附图说明

附图1显示的是常规PCR结果，Fy(a)、Fy(b)及β-actin的PCR产物片段大小接近(Fy(a)、Fy(b)：117bp，β-actin：100bp)，采用常规的琼脂糖凝胶不能区分二者，因此分别在独立的PCR管中扩增，再进行电泳分析，以确认引物的特异性。其中，M：DL2000DNA marker，Takara；1、3、5泳道为Fy(a)及β-actin，2、4、6泳道为Fy(b)及β-actin；1、2泳道为#316标本，基因型为Fy(a+b+)；3、4泳道为#317标本，基因型为Fy(a+b-)；5、6泳道为#294标本，基因型为Fy(a-b+)。本发明设计的引物能够较好区分Fy(a)和Fy(b)，分型结果与国产秀鹏试剂一致。

附图2显示的是单独扩增Fy(a)测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm为82℃。

附图3显示的是单独扩增Fy(b)测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm为82℃。

附图4显示的是单独扩增内参照β-actin测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm为77℃。

附图5显示的是多重PCR扩增β-actin和Fy(a)测定的熔链曲线。上图有两个熔链峰，说明有两条扩增产物，Tm为77℃的峰为β-actin，Tm为82℃的峰为Fy(a)，该标本基因型为Fy(a+)；下图Tm为77℃处有一个熔链峰，为β-actin扩增产物，而Tm为82℃处无熔链峰，该标本基因型为Fy(a-)。

附图6显示的是多重PCR扩增β-actin和Fy(b)测定的熔链曲线。上图有两个熔链峰，说明有两条扩增产物，Tm为77℃的峰为β-actin，Tm为82℃的峰为Fy(b)，该标本基因型为Fy(b+)；下图Tm为77℃处有一个熔链峰，为β-actin扩增产物，而Tm为82℃处无熔链峰，该标本基因型为Fy(b-)。

附图7显示的是多重PCR测定#316标本Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)的熔链曲线。其中兰色为Fy(a)孔的熔链曲线，紫色为Fy(b)孔的熔链曲线，Tm 77℃、82℃均有熔链峰，该标本基因型为Fy(a+b+)，熔链曲线分型结果与常规PCR一致。

附图8显示的是多重PCR测定#317标本Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)的熔链曲线。其中兰色为Fy(a)孔的熔链曲线，Tm 77℃、82℃均有熔链峰；紫色为Fy(b)孔的熔链曲线，仅Tm 77℃有熔链峰。该标本基因型为Fy(a+b-)，熔链曲线分型结果与常规PCR一致。

附图9显示的是多重PCR测定#294标本Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)的熔链曲线。其中兰色为Fy(a)孔的熔链曲线，仅Tm 77℃有熔链峰；紫色为Fy(b)孔的熔链曲线，Tm 77℃、82℃均有熔链峰。该标本基因型为Fy(a-b+)，熔链曲线分型结果与常规PCR一致。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明内容进行详细说明。

实施例：包括引物设计，基因组DNA提取，常规PCR反应，单对引物实时荧光定量PCR测定熔链曲线，实时荧光定量多重PCR测定熔链曲线，应用本发明检测成都地区献血人群Fy(a)、Fy(b)基因型，本发明与其他商品试剂的比较研究。

(1)引物设计

根据Gene Bank中β-actin(actb)，Fy-a和Fy-b mRNA序列设计扩增引物，通过BLAST比对确认其特异性。actb引物序列为5’-gatgagattggcatggcttt-3’(F)和5’-caccttcaccgttccagttt-3’(R)，产物为100bp。根据Fy(a)、Fy(b)cDNA 131位碱基的不同(前者为G，后者为A)设计扩增引物，序列如下：Fy(a)引物序列为5′-ctctccccctcaactgagaa-3’(F)和5′-agctgcttccaggttggcac-3’(R)，产物为117bp；Fy(b)引物序列为5′-ctctccccctcaactgagaa-3’(F)和5′-agctgcttccaggttggcat-3’(R)，产物为117bp。

(2)基因组DNA提取

采用天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)，按操作说明书从500μL全血中提取基因组DNA。Nanodrop微量分光光度计(Thermo)测定DNA含量和纯度(260/280比值≥1.80)，-20℃保存DNA样品。

(3)常规PCR反应

采用本发明设计的引物扩增β-actin，Fy(a)和Fy(b)基因。采用Takara的Taq酶，按表1扩增体系进行操作：

表1常规PCR扩增体系

常规PCR扩增体系	体积(μL)
		Taq酶(5U/μl)	0.25
10×PCR缓冲液	5
		25mM MgCl₂	3
dNTP(各2.5mM)	4
		模板DNA(50ng/μL)	1
上游引物(20μmol/L)	1
		下游引物(20μmol/L)	1
dH₂O	至50μL

采用AB2720型PCR仪，反应条件：94℃2min，30个循环(94℃15sec，60℃30sec)，72℃2min。2％琼脂糖，恒压90V电泳，EB染色，凝胶成像系统采集图像。结果见附图1。

(4)单对引物实时荧光定量PCR测定熔链曲线

测定β-actin，Fy(a)和Fy(b)单一扩增产物的熔链曲线峰形及Tm值。

采用本发明设计的β-actin，Fy(a)和Fy(b)扩增引物(β-actin为内参照)，2×SYBRPremix Ex Taq II预混酶(Takara)，按表2扩增体系进行操作：

表2单对引物实时荧光定量PCR扩增体系

扩增体系	体积(μL)
		2×SYBR Premix Ex Taq II预混酶	10
上游引物(10μmol/L)	1
		下游引物(10μmol/L)	1
模板DNA(50ng/μL)	1
		dH₂O	至20μL

采用AB7300型实时荧光定量PCR仪，反应条件为：95℃30sec，30个循环(95℃15sec，60℃30sec)，熔链曲线分析。结果见附图2-4。

(5)实时荧光定量多重PCR测定熔链曲线

采用本发明设计的β-actin，Fy(a)和y(b)扩增引物(以多重PCR方式检测β-actin+Fy(a)以及β-actin+Fy(b)，β-actin为内参照)，2×SYBR Premix Ex Taq II预混酶(Takara)，按表3扩增体系进行操作：

表3实时荧光定量多重PCR扩增体系

采用AB7300型实时荧光定量PCR仪，反应条件为：95℃30sec，30个循环(95℃15sec，60℃30sec)，熔链曲线分析。结果见附图5-9。

(6)应用本发明检测成都地区献血人群Duffy血型Fy(a)、Fy(b)基因型

采用步骤(5)的方法检测204例成都地区献血人员Fy(a)、Fy(b)基因型，分型结果见表4。结果显示，成都地区献血人群Duffy血型Fy(a+b+)基因型频率为9.8％，Fy(a+b-)为89.7％，Fy(a-b+)为0.5％，未检测到Fy(a-b-)基因型。

(7)本发明与其他商品Fy-a/b分型试剂盒的比较研究

采用某商品Fy-a/b分型试剂盒对步骤(6)中的标本作同步检测，进行比较研究，严格按说明书操作。采用AB2720型PCR仪，反应条件：96℃2min，5个循环(96℃20sec，68℃60sec)，10个循环(96℃20sec，65℃45sec，72℃30sec)，15个循环(96℃20sec，62℃45sec，72℃30sec)，72℃2min。2％琼脂糖，恒压90V电泳，EB染色，凝胶成像系统采集图像。结果见表4，分型结果与本发明方法完全一致。

表4本发明方法与某商品试剂的Fy-a/b基因分型结果

Claims

1.一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征在于它包括如下步骤：

(2)制备人基因组DNA；

(3)常规PCR，对扩增引物的有效性和特异性进行初步确认；

(5)建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定β-actin+Fy-a，β-actin+Fy-b混合产物的熔链曲线，对照步骤(4)测得的Tm值及峰形确定反应的有效性及Fy(a)，Fy(b)的基因型。

2.如权利要求1所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤(1)中的3对寡核苷酸扩增引物，所述引物分别扩增参照基因β-actin、Duffy血型Fy(a)以及Fy(b)基因，其中Fy(a)、Fy(b)的上游扩增引物序列相同。

所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：

β-actin扩增引物：

actb-F：5’-gatgagattggcatggcttt-3’

actb-R：5’-caccttcaccgttccagttt-3’

Fy(a)扩增引物：

Fy：5′-ctctccccctcaactgagaa-3’

Fy(a)-R：5′-agctgcttccaggttggcac-3’

Fy(b)扩增引物：

Fy：5′-ctctccccctcaactgagaa-3’

Fy(b)-R：5′-agctgcttccaggttggcat-3’

3.如权利要求1所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤(4)中的单对引物实时荧光定量PCR熔链曲线法检测Duffy血型Fy(a)，Fy(b)基因型，其反应体系和反应程序如下：

其特征在步骤(4)中，测定β-actin，Fy(a)和Fy(b)单一扩增产物的熔链曲线峰形及Tm值。扩增体系，以20μL计，包括：2×SYBR Premix Ex Taq II预混酶10μL，上、下游引物各1μL(终浓度均为0.5μmol/L)，50ng/μL DNA模板1μL，余量以纯水补足。反应程序为：95℃30sec，30个循环(95℃15sec，60℃30sec)，熔链曲线分析。

4.如权利要求1所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤(5)中的实时荧光定量多重PCR熔链曲线法检测Duffy血型Fy(a)，Fy(b)基因型，其反应体系和反应程序如下：

其特征在步骤(5)中，在步骤(4)基础上，建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定β-actin+Fy-a，β-actin+Fy-b混合产物的熔链曲线，确定反应的有效性及Fy(a)，Fy(b)的基因型。扩增体系，以20μL计，包括：2×SYBR Premix Ex Taq II预混酶10μL，上游混合引物(β-actin+Fy(a)或β-actin+Fy(b))1μL(终浓度均为0.5μmol/L)，下游混合引物(β-actin+Fy(a)或β-actin+Fy(b))1μL(终浓度均为0.5μmol/L)，50ng/μL DNA模板1μL，余量以纯水补足。反应程序为：95℃30sec，30个循环(95℃15sec，60℃30sec)，熔链曲线分析。