CN104726586A - 用于检测人类红细胞Kell血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类红细胞Kell血型基因分型的引物组及试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的引物组及试剂盒。用于Kell血型基因测定的引物组包括K1引物对，K2引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Kell血型的种种限制、是正确判定血型不可缺少的辅助手段，具有广泛的应用前景和临床参考价值。

Description

用于检测人类红细胞Kell血型基因分型的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测人类红细胞Kell血型基因分型的试剂盒（PCR-SSP法）。
背景技术
在欧美Kell和ABO、Rh 被并列为3大血型系统，在输血中具有较重要的意义，抗-K、抗-k都会引起溶血性输血反应。我国汉族人Kell血型系统虽大多数为kk，但产生抗K的可能 性仍然存在。一项运用抗-K、抗-k血型研究668例北京地区汉族人群的调查发现，K（＋）个体3例，基因频率为0.0022。
Kell血型系统以往采用血清学技术分型，至今无国产抗-K、-k血清供应，进口血清价格昂贵，较难普及，而采用DNA分型技术则一是可以降低成本，适合国内大多数实验室使用；二是标本可长期保存，便于复查及各实验室相互比较结果；三是实验结果易于判定。
Kell血型是使用抗人球蛋白试验方法(又称为Coombs试验)检出的第1个血型，相应抗体是在一位姓Kell的产妇血清中发现的，故被称为抗-Kell， 后来又检出了抗-K的对偶抗体抗-k。K和k抗原均表现为显性遗传，因此具有KK、Kk、kk、和K-k-4种表型。由于Kell抗原的抗原性较强，所以 在输血中有较重要的意义。到目前为止，我国已有关于Kell血型系统的血清学分型研究报道，但尚未见采用基因分型技术分型报告。
发明内容
本发明的目的是：克服血清学检测试剂的价格昂贵，试剂不好购买等不足，提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Kell血型基因的引物组；
本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒。
一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的引物组，其特征是包括K1引物对，K2引物对及内参引物对。
所述K1的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述K2的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有K1引物对，K2引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
所述K1的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述K2的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。 
附图说明
图 1为人类红细胞Kell血型基因特异引物孔位图。
图 2为实验结果阴阳性判读图。
图 3为人类红细胞Kell血型基因测定结果分型读板纸。
图 4为人类红细胞Kell血型基因测定试剂盒电泳结果胶图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1。
依据美国国立生物技术信息中心基因库（NCBI Gene Bank）公开的Kell等位基因序列，设计出用于检测人类红细胞Kell血型基因的引物组，该引物组包括K1引物对，K2引物对及内参引物对。
实施例2。
一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒，包括包被有K1引物对，K2引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒的制备方法是：
(1)    依据人类红细胞Kell血型基因特异引物孔位图（见图1），分别将K1引物对，K2引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；
(2)    依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer；
(3)    将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒。
实施例3。
使用操作流程。
一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。
(1) 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液（Tris-硼酸盐-EDTA溶液），加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。
(2) 将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。
(3)待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。
二、PCR循环参数见表1。
  表1 扩增参数特征表。 
1 96℃/2 min 1 cycle
2 96℃/20 sec, 68℃/60 sec 5 cycles
3 96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec 10 cycles
4 96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec 15 cycles
5 72℃/3 min 1 cycle
6 4℃保存  
三、必须满足的试验条件。
(1)从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。
(2)根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。
(3)根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。
四、实验过程中的注意事项。
(1)PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。
(2)所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。
(3)当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。
(4)试剂和样本应加样到微孔板的底部。
(5)为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。
(6)在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。
(7)Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。
(8)严格按照指定的顺序操作。
五、操作步骤。
(1) 选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒，配制dNTP-Buffer工作液：
440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。
(2) 配制Buffer-酶混合液：
每人份用量：20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶（5 units/μl）+2μl DNA = 22.3μl 。
(3) 漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。
(4) 分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。
(5) 每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板（引物板）。
(6) 将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。
(7) 反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。
(8) 启动PCR程序，直到循环结束。
(9) 取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。
(10) 按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。
(11) 140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。
(12) 紫外光下观察结果并拍摄成像。
(13) 根据提供的读板纸解释分型结果。
六、质量控制程序：
内参质控带（缓慢迁移的）作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
七、实验结果的判读。
人类红细胞Kell血型基因检测试剂盒电泳结果胶图（见图4）。
实验结果阴阳性判读图（见图2）。
人类红细胞Kell血型基因测定结果分型读板纸（见图3）。
预期结果：
阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带。
阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带。
产物大小和孔位：见人类红细胞Kell血型基因特异引物孔位图（见图1）。
根据人类红细胞Kell血型基因特异引物孔位图（见图1）或该试剂配套软件进行分型结果的判定。
该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见人类红细胞Kell血型基因特异引物孔位图(见图1) ；并符合人类基因座位规则。
以上各实验涉及到的引物对如下：
所述K1的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述K2的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
序列表
<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司
<120>人类红细胞Kell血型基因测定试剂盒（PCR-SSP法）
 
<160>17
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(22)
<400> 1
gaccttgggagaaggcacataa   22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(23)
<400> 2
ctgactcatcagaagtcccagca   23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(23)
<400> 3
ctgactcatcagaagtcccagcg   23
 

Claims (2)

1.一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的引物组，其特征是包括K1引物对，K2引物对及内参引物对；
所述K1的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述K2的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测人类红细胞Kell血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有K1引物对，K2引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；
所述K1的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述K2的上下游引物位于Kell的DNA参考序列的Intron5 168-188和EXON6 578-598位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
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