CN115725711A

CN115725711A - 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法

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Publication number: CN115725711A
Application number: CN202210978856.0A
Authority: CN
Inventors: 梁爽; 章昊; 吴凡; 任建卫; 苏宇清; 梁延连; 彭龙
Original assignee: Shenzhen Blood Center Shenzhen Institute Of Transfusion Medicine
Current assignee: Shenzhen Blood Center Shenzhen Institute Of Transfusion Medicine
Priority date: 2022-08-16
Filing date: 2022-08-16
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明提供了冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法，涉及血型体外诊断技术领域。本发明对冰冻全血的ABO血型系统的抗原编码基因ABO或Kidd血型系统的抗原编码基因JK进行RNA剪接体测序。本发明实施例中，利用从冰冻全血样本中提取得到的mRNA，通过原创的引物进行多轮巢式PCR，得到血型抗原编码基因后，进行常规的测序、序列比对即可完成基因分型。本发明利用mRNA测序进行ABO基因或JK基因RNA剪接体分型，能直接根据RNA序列推断抗原蛋白结构变化，结果预测更准确。

Description

冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法

技术领域

本发明属于血型体外诊断技术领域，具体涉及冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法。

背景技术

当前，对于血型方面的新变异型抗原进行的研究，主要是通过分子生物学手段在基因组DNA层面鉴定等位基因型。由于RNA的不稳定性和RNA操作的技术挑战，极少有研究者从mRNA水平开展血型研究。然而，据报道，对于单基因遗传性状，基于DNA测序的诊断，无论是全外显子组测序还是全基因组测序，准确率都不到50％；而RNA测序可大幅提高诊断准确率。这表明，相比DNA，RNA鉴定提供的信息对于表型预测更为直观和精准。因为mRNA是蛋白质合成的直接模板，所以RNA剪接体鉴定在分子诊断中优于DNA测序。但是目前已知的可用于进行RNA剪接体分析的样本均为新鲜血液样本，至于冰冻样本则没有过任何成功的报道。

另外，对于临床输血，Kidd血型的重要性和危险性仅次于ABO和Rh血型。有研究认为，抗-Jk是引起临床上迟发型溶血输血反应的主要原因之一。另外，Kidd血型系统引起的新生儿溶血病，常常可以引起高胆红素血症，危及胎儿或新生儿生命。导致溶血性输血反应和新生儿溶血病的原因主要是Kidd血型抗体通常为IgG类型，这类型的抗体容易结合补体，并激活补体系统，可直接破坏红细胞，引起频繁的迟发性溶血性输血反应(DHTR)。抗Jk^a是Kidd血型系统中最常见的抗体，约三分之一以上的迟发性溶血性输血反应可能由这一抗体导致。更为关键的是，抗-Jk通常在血浆中含量很低，仅有不到30％的抗-Jk抗体能被血清学试验检出，但是一旦受到相应抗原的刺激，这种抗体将会迅速大量产生，从而导致溶血反应的发生。因此，在输血前对供受(血)双方Kidd血型的检测极为重要。但是，很多医院并没有开展此项目。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法，可简单便捷的对冰冻全血样本进行基因分型。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用冰冻全血扩增血型抗原编码基因的引物组，当所述血型抗原编码基因为ABO基因时，包括Fa、Fb、Fc、Fd、Ra、Rd、Re和Rf；所述Fa的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，Fb的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Fd的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Ra的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Rd的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，Re的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Rf的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

当所述血型抗原编码基因为JK基因时，包括Fa、Fb、Ra和Rb；所述Fa的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Fb的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，Ra的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，Rb的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了利用上述引物组扩增冰冻全血ABO基因的方法，包括以下步骤：对提取自冰冻全血的mRNA进行反转录，以所述反转录得到的cDNA为模板，依次利用Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，以Fb/Re为引物对进行第二轮PCR，以Fc/Rf或Fc/Re为引物对进行第三轮PCR，扩增得到ABO基因的第一片段；

以所述cDNA为模板，依次以Fa/Ra和Fd/Rd为引物对进行两轮巢式PCR，扩增得到ABO基因的第二片段。

优选的，每一轮PCR的程序，均包括：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。

优选的，每一轮PCR的体系以10μL计，包括：2×EmeraldAmp PCR Master Mix 5μL、模板1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL和余量的无核酸酶水。

本发明还提供了利用上述引物组扩增冰冻全血JK基因的方法，包括以下步骤：对提取自冰冻全血的mRNA进行反转录，以所述反转录得到的cDNA为模板，依次利用Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，以Fb/Rb为引物对进行第二轮PCR，扩增得到JK基因。

优选的，每一轮PCR的程序，均包括：95℃2min；95℃2min，95℃20S，55℃45S，72℃2min，共30循环。

优选的，以前一轮PCR的产物作为下一轮PCR的模板时，包括将所述产物稀释100倍。

本发明还提供了一种利用冰冻全血进行ABO基因分型的方法，包括对利用上述方法扩增得到的ABO基因的第一片段和第二片段进行单独测序，或将所述第一片段和第二片段连接后进行测序，根据测序结果进行ABO基因分型。

本发明还提供了一种利用冰冻全血进行JK基因分型的方法，包括对利用上述方法扩增得到的JK基因进行测序，根据测序结果进行JK基因分型。

有益效果：本发明提供了一种利用冰冻全血扩增血型抗原编码基因的引物组，可对冰冻血液样本中提取得到的mRNA进行扩增富集，且富集得到的ABO基因和JK基因均可满足测序要求。本发明还提供了一种利用冰冻全血进行基因分型的方法，包括以冰冻全血的mRNA为原始材料，对扩增得到的ABO基因和/或JK基因进行测序。本发明实施例中，利用从冰冻全血样本中提取得到的mRNA，通过原创的引物进行多轮巢式PCR，分别得到ABO基因和JK基因后，进行常规的测序即可完成ABO基因和JK基因的分型。本发明利用mRNA测序进行ABO基因和JK基因的分型，能直接根据RNA序列推断抗原蛋白结构变化，结果预测更准确。

附图说明

图1为新鲜全血与冰冻全血提取的mRNA电泳图，条带1和条带2均为新鲜全血提取的mRNA电泳结果；条带3为3例冰冻全血提取的mRNA等比例混合后的电泳结果；

图2为新鲜全血以及速冻后提取的mRNA电泳图，条带1为新鲜全血立即进行PBMC分离、提取mRNA；条带2为新鲜全血进行速冻、融化后立即提取mRNA；条带3为新鲜全血进行速冻、融化后静置5min再提取mRNA；

图3为5例冰冻全血标本提取mRNA进行第一、二、三轮扩增产物电泳图，A为经过第一轮巢式PCR扩增产物电泳图；B为经过第二轮巢式PCR扩增产物电泳图；C为标本3、4和5号继续进行第三轮巢式PCR扩增产物电泳图；D为4号标本第二轮巢式PCR产物进行TA克隆分析结果；

图4为冰冻全血RNA剪接体测序引物设计原则；上图为ABO基因的测序引物设计原则，下图为JK基因的测序引物设计原则；

图5为五例A变异型标本的RNA剪接体测序结果分析；

图6为5例冰冻全血标本提取mRNA第一、二轮JK扩增产物电泳图，A为经过第一轮巢式PCR扩增产物电泳图；B为经过第二轮巢式PCR扩增产物电泳图；C为1号标本第二轮巢式PCR产物进行TA克隆分析结果；

图7为标本3进行JK mRNA测序检测出的三种不同的RNA剪接异变体序列情况。

具体实施方式

表1多轮PCR设计的引物

本发明优选根据冰冻全血RNA剪接体测序引物设计(图4)，其中针对ABO基因，第一轮PCR引物对Fa与Ra；第二轮PCR引物对Fb与Re，Fd与Rd；第三轮PCR引物对Fc与Rf；克隆测序引物Rc(SEQ ID NO.13)；针对JK基因，则是以Fa/Ra进行第一轮PCR，利用Fb/Rb进行第二轮PCR，克隆测序引物为Fc(SEQ ID NO.14)。

本发明所述冰冻全血样本优选为经低温冷冻保存后的样本，并优选利用Qiagen试剂盒进行冰冻全血样本的mRNA提取。本发明对利用所述Qiagen试剂盒进行冰冻全血样本的mRNA提取的方法并没有特殊限定，优选根据试剂盒说明书进行即可。本发明所述Qiagen试剂盒优选购自深圳市百胜科创生物科技有限公司，货号为cat#219610。

由于血型抗原编码基因在全血中转录水平极低，因此本发明设计了多轮PCR扩增以完成富集。本发明进行所述多轮PCR扩增前，优选还包括逆转录为cDNA。本发明优选采用Thermo/Invitrogen SuperscriptIII体系进行所述逆转录。

本发明以所述cDNA为模板进行多轮PCR扩增，扩增所述第一片段时，优选以Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，产物稀释后作为第二轮PCR模板；以Fb/Re为引物对进行第二轮PCR，产物稀释后作为第三轮PCR模板；以Fc/Rf或Fc/Re为引物进行第三轮PCR。本发明在扩增所述第一片段后，优选还包括对所述第一片段进行测序。本发明进行每一轮PCR的体系均相同，以10μL计，优选包括：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL、模板1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL和余量的无核酸酶水；且正向引物和反应引物的终浓度优选均为10μM。本发明每一轮PCR的程序也相同，优选均包括：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。本发明所述稀释优选为将扩增产物稀释100倍后作为下一轮PCR扩增的模板。

本发明在扩增所述第二片段时，优选以Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，产物稀释后作为第二轮PCR模板；以Fd/Rd为引物对进行第二轮PCR。本发明在扩增所述第二片段后，优选还包括对所述第二片段进行测序。本发明对所述每一轮的PCR扩增体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。本发明对所述测序的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可，如实施例中参考彭及良的方法进行(彭及良,梁延连,苏宇清,等.8例家系中A,B血型抗原编码基因连锁遗传多态性分析[J].临床血液学杂志,2020,33(8):550-554.)。在本发明中，可根据样本的不同扩增结果采用不同测序方案，如对PCR产物进行直接测序或先克隆再测序，如样本显示从某一位置出现杂峰，说明不同RNA剪切异变体共存，需进行克隆后再测序。本发明所述克隆后再测序的方法与新鲜血液样本的方法相同，在此不再赘述，同样参考彭及良的方法进行。

本发明所述冰冻全血的mRNA提取以及反转录的操作与上述相同，在此不再赘述。

本发明每一轮PCR的程序，优选均包括：95℃2min；95℃2min，95℃20S，55℃45S，72℃2min，共30循环；且每一轮PCR的体系以10μL计，优选均包括：2×EmeraldAmp PCRMasterMix 5μL、模板1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL和余量的无核酸酶水。本发明优选以cDNA为模板进行第一轮PCR，并以第一轮PCR的扩增产物经稀释后作为第二轮PCR的模板，所述稀释优选为将扩增产物稀释100倍后作为下一轮PCR扩增的模板。

本发明还提供了上述引物组或上述方法在对冰冻全血进行ABO基因分型中的应用。

本发明还提供了一种利用冰冻全血进行ABO基因分型的方法，包括对利用上述方法扩增得到的ABO基因的第一片段和第二片段进行单独测序，或将所述第一片段和第二片段连接后进行测序，根据测序结果进行ABO基因分型。本发明对所述测序的方法并没有特殊限定，优选参考彭及良的方法进行测序即可。

本发明还提供了一种利用冰冻全血进行JK基因分型的方法，包括对利用上述方法扩增得到的JK基因进行测序，根据测序结果进行JK基因分型。本发明所述测序的方法优选与上述相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、利用Qiagen试剂盒(cat#219610)，提取冰冻全血样本的RNA

(1)冰冻全血样本快速融化、涡旋打匀、分装至1.5mL EP管(200μL/管)；每管加入1mL的QIAzoL Lysis Reagent，涡旋混匀，12000g，离心10min，转移上清至新的EP管；

(2)每管加入200μL的氯仿，漩涡混匀；10000g离心15min分层，转移水相上清；

(3)加入与上清液体积1.5倍量的无水乙醇，吹打混匀；

(4)吸取700μL混匀后的样品(包括沉淀物)，转移到洗脱柱，离心1min，丢弃收集管中的液体；

(5)700μLBuffer RWT清洗洗脱柱；

(6)500μL Buffer RPE清洗洗脱柱；

(7)500μL 80％(v/v)的乙醇清洗洗脱柱；

(8)向滤膜中心加入15μL RNase-water洗脱；

(9)转移洗脱液至新的EP管，定量，-70℃保存。

二、分离PBMC后，利用Trizol法提取新鲜血液的RNA

1.分离PBMC

8mL抗凝全血使用外周血淋巴细胞(PBMC)分离液(ficoll)分离PBMC

(1)新鲜全血于2800rpm，4℃离心10min后，弃上清血浆；

(2)下层血细胞中加入PBS至5mL，移液管吹打混匀；

(3)缓慢加入5mL ficoll分离液上方，保持两液面界面清晰；室温条件下水平转子700g离心20min；

(4)用吸管吸取中间淋巴细胞及单个核细胞至50mL离心管，加入30mL的PBS，悬浮细胞、混匀、计数；

(5)水平转子500g离心12min收集细胞团进行RNA提取。

2.Trizol法提取RNA

(1)加入1mLTrizol裂解液，吹打混匀，提取RNA；

(2)加入200μL氯仿，剧烈震荡、混合，静置3min；

(3)吸取上清(约500μL)，加入500μL等体积异丙醇，上下颠倒试管混匀；12000rpm4℃离心15min，弃上清；

(4)加入1mL 75％乙醇，涡旋30s，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，室温静置干燥沉淀20min；

(5)加入20-30μL DEPC水，溶解、定量，保存于-70℃备用。

三、新鲜血液样本进行速冻(置于液氮中1h)，融化后利用Qiagen试剂盒提取RNA。

1.速冻血液样本融化后立即提取RNA；

2.速冻血液样本融化后，静置5min再提取RNA。

对利用冰冻全血和新鲜血液样本提取得到的RNA进行质量检测，结果如表2所示，同时对上述三种处理得到的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，验证质量，结果如图1和图2所示；提取的mRNA浓度，冰冻全血略低于新鲜全血。提取的mRNA质量，新鲜全血所提取的mRNA的质量很高，OD值显示没有出现明显的降解，图1可以看出mRNA满足扩增和测序的需要(图1)；而OD值显示冰冻全血所提取的mRNA大量降解，随机选取3个标本等量混合后电泳，无任何条带，说明在传统技术下，冰冻全血所提取的mRNA严重降解，无法继续进行扩增和测序(图1)；即使是新鲜全血，稍经冰冻后，全血mRNA快速降解至无法进行后续实验(图2)。

表2新鲜全血与冰冻全血提取的mRNA浓度和质量

实施例2对实施例1中提取自冰冻样本的mRNA进行反转录

采用Thermo/Invitrogen SuperscriptIII体系，首先配制7μL预处理体系：冰冻全血RNA 6μL、AUAP(dT)₂₀0.5μL和10μM dNTP 0.5μL，将与反应体系于75℃反应5min，冰上静置5min；

配制反转录体系：5×Reaction Buffer 2μL、DTT 0.5μL和SuperScript III RT酶0.5μL，将反转录体系与预处理体系均匀混合，进行如下反应：50℃1.5h，95℃5min，4℃10min。

实施例3利用表1所示引物，对实施例2得到的cDNA进行PCR扩增使用TakaraPCR试剂(Cat#RR300)，进行巢式PCR。

(1)ABO第一片段的第一轮PCR：

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR Master Mix 5μL；cDNA 1μL；10μM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

PCR扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。用无核酸酶水稀释100X，保存于-20℃备用。

(2)ABO第一片段的第二轮PCR：

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL；100x稀释后第一轮PCR产物1μL；10μM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

PCR扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。保存于-20℃备用。用于进一步PCR或测序或TA克隆。

(3)ABO第一片段的第三轮PCR：

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL；100x稀释后第二轮PCR产物1μL；10μM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

PCR扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。保存于-20℃备用。用于测序或TA克隆。

(4)ABO第二片段的第一轮PCR

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL；cDNA 1μL；10μM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

(5)ABO第二片段的第二轮PCR

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL；100x稀释后第二片段的第一轮PCR产物1μL；10μM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

取5例冰冻全血标本提取得到的mRNA，对ABO第一片段进行扩增，结果如图3所示，只经过第一轮巢式PCR扩增，5例标本都没有扩增出明显条带(图3中A)；经过两轮巢式PCR扩增，5例标本条带不一，1号和2号标本获得特异性和浓度均较好的目标条带；3号标本无可见的目标条带；4号和5号标本虽然有目标条带，但是同时扩增出杂带，需要TA克隆进一步分离目标条带(图3中B)。4号标本第二轮巢式PCR产物剪切2000bp左右的琼脂糖凝胶条带后提取并进行TA克隆分析(图3中D)，结果显示阳性克隆占比较少，说明即使是B4大小正确的目的条带中，也混杂了大量的非特异性条带，而所需要的目标条带占比很低。因此，第二轮巢式PCR扩增的产物特异性差，必须继续进行第三轮巢式PCR扩增富集目标条带。标本3、4和5号继续进行第三轮巢式PCR扩增，获得特异性和浓度均较好的目标条带(图3中C)。

实施例4对实施例3得到的PCR扩增产物进行TA克隆和测序分型。

(1)TA克隆：配制5μL连接反应体系：PCR产物1-2.5μL(根据电泳条带轻、重调整)；pCR2.1载体(Thermo/Invitrogen，#K202020)1μL；10xT4 ligation buffer(NEB，#M0202L)0.5μL；T4 ligase 1μL；无核酸酶水Until 5μL。14℃孵育20小时。连接产物进行感受态细菌转化、铺板、挑取克隆。

(2)利用克隆PCR来筛选阳性克隆：挑取克隆菌体作为模板，配制15μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR Master Mix 7.5μL；10μM正向引物、反向引物各0.3μL；无核酸酶水7.2μL。PCR扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸5s。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有正确条带者为阳性克隆；阳性克隆扩大培养、提取质粒、测序。

(3)ABO测序分型步骤参考论文：彭及良,梁延连,苏宇清,等.8例家系中A,B血型抗原编码基因连锁遗传多态性分析[J].临床血液学杂志,2020,33(8):550-554.

(4)传统的血清学鉴定技术、DNA测序技术以及本技术应用对比。

结果如图5和表3所示，本实施例五例标本均是传统的血清学鉴定无法判定血型，利用DNA测序进行ABO基因编码区测序，也没有发现有义突变。但是，利用本发明的方案，发现这五例标本的ABO基因转录后形成的RNA剪接体的剪接与参比序列相比，出现异变，推测这可能是ABO血型表型异常的分子背景。因此，与传统技术相比，在分子诊断中，本发明可以解决DNA测序无法解决的难题。

表3五例A变异型标本的血清学鉴定、DNA以及RNA测序分型结果对比

实施例5以新鲜全血标本作为对比，统计提取自冰冻全血标本的mRNA测序分型的成功率和准确率。

随机选取正常O型，年龄20-30岁的健康男性(本发明与性别无关)，静脉采血2管/人(10ml/管，分别命名为标本号-I、标本号-II)，置于EDTA-Na₂抗凝管中，标本号-I置于4℃贮存24h内进行mRNA提取(方法同实施例1中二)，标本号-II置于-40℃冻存7天后进行mRNA提取(方法同实施例1中一)。随后，进行反转录、PCR扩增、TA克隆和测序，对比血型抗原编码基因分型的成功率和准确率；

其中新鲜血样的反转录、PCR扩增、TA克隆和测序参考彭及良的方法进行；

冰冻血样的反转录、PCR扩增、TA克隆和测序同实施例2至实施例4。

结果如表4所示，在10例标本中，新鲜全血标本提取mRNA进行RNA剪接体测序均得到唯一并且准确的分型结果。但是，同样来源的全血标本冷冻后提取mRNA并利用本发明进行测序分型，在10例标本中有1例因mRNA降解过快导致实验失败，其余9例均得到唯一并且准确的分型结果，结果与新鲜全血标本一致。据此计算，本发明的成功率约为90％，准确率100％。

表4冰冻全血ABO基因mRNA测序分型的成功率和准确率分析。

实施例6利用表1所示引物，对实施例2得到的cDNA进行PCR扩增。

使用TakaraPCR试剂(Cat#RR300)，进行巢式PCR。

(1)JK的第一轮PCR：

配制10μL反应体系：2×EmeraldAmp PCR Master Mix 5μL；逆转录产物cDNA 1μL；10uM正向引物、反向引物各0.2μL；无核酸酶水3.6μL。

PCR扩增条件：95℃2min；95℃2min，95℃20S，55℃45S，72℃2min，共30cycles；4℃∝。用无核酸酶水稀释100X，保存于-20℃备用。

(2)JK的第二轮PCR：

PCR扩增条件：95℃2min；95℃2min，95℃20S，55℃45S，72℃2min，共30cycles；4℃∝。保存于-20℃备用。用于进一步PCR或测序或TA克隆。

取5例冰冻全血标本提取得到的mRNA，对JK进行扩增，结果如图6所示，只经过第一轮巢式PCR扩增，5例标本都没有扩增出明显条带(图6中A)；第一轮巢式PCR产物剪切琼脂糖凝胶条带后提取并进行第二轮巢式PCR扩增，5例标本均获得特异性和浓度较好的目标条带(图6中B)；剪切琼脂糖凝胶条带后提取并进行TA克隆分析(图6中C)，获得阳性克隆占比约三分之一(5/16)。

实施例7对实施例6得到的PCR扩增产物进行TA克隆和测序分型。

方法同实施例4。

五例标本经传统的血清学鉴定均能得到唯一的结果，其中标本1、2、4、5在血清学抗原抗体反应凝集强度均达到3+，说明Kidd抗原表型为正常。但是，标本3在血清学鉴定时反应凝集强度都只有1+，弱于正常表型，为弱抗原型，或称为变异型。利用DNA测序技术进行JK基因编码区测序，五例标本均得到了明确的JK等位基因型结果，没有发现有义突变。利用本发明，对这五例标本所提取的mRNA进行测序，对于标本1、2、4、5，均检测出唯一、明确的RNA剪接体序列，且同DNA测序结果一致；但是，标本3则检测出三种序列不同的RNA剪接异变体(图7)，推测这可能是该标本Kidd血型表型异常的产生原因。因此，与传统技术相比，在分子诊断中，本发明可以解决DNA测序无法解决的难题。

表5五例标本的Kidd血型血清学鉴定、JK DNA以及RNA测序分型结果对比

实施例8

随机选取血清学鉴定结果为Jk(a+b+)、且抗原抗体反应凝集强度均达到3+，年龄20-30岁的健康男性(本发明与性别无关)全血标本，静脉采血2管/人(10ml/管，分别命名为标本号-I、标本号-II)，置于EDTA-Na₂抗凝管中，标本号-I置于4℃贮存24h内进行mRNA提取(方法同实施例1中二)，标本号-II置于-40℃冻存7天后进行mRNA提取(方法同实施例1中一)。随后，进行反转录、PCR扩增、TA克隆和测序，对比血型抗原编码基因分型的成功率和准确率；

冰冻血样的反转录、PCR扩增、TA克隆和测序同实施例6至实施例7。

结果如表6所示，在10例标本中，新鲜全血标本提取mRNA进行RNA剪接体测序均得到唯一并且准确的分型结果。但是，同样来源的全血标本冷冻后提取mRNA并利用本发明进行测序分型，10例标本均得到唯一并且准确的分型结果，结果与新鲜全血标本一致。据此计算，本发明的成功率约为100％，准确率100％。

表6冰冻全血JKmRNA测序分型的成功率和准确率分析。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用冰冻全血扩增血型抗原编码基因的引物组，其特征在于，当所述血型抗原编码基因为ABO基因时，包括Fa、Fb、Fc、Fd、Ra、Rd、Re和Rf；所述Fa的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，Fb的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Fd的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Ra的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Rd的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，Re的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Rf的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

当所述血型抗原编码基因为JK基因时，包括Fa、Fb、Ra和Rb；所述Fa的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，Fb的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，Ra的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，Rb的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.利用权利要求1所述引物组扩增冰冻全血ABO基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：对提取自冰冻全血的mRNA进行反转录，以所述反转录得到的cDNA为模板，依次利用Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，以Fb/Re为引物对进行第二轮PCR，以Fc/Rf或Fc/Re为引物对进行第三轮PCR，扩增得到ABO基因的第一片段；

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，每一轮PCR的程序，均包括：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火55s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃再延伸5s。

4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，每一轮PCR的体系以10μL计，包括：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL、模板1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL和余量的无核酸酶水。

5.利用权利要求1所述引物组扩增冰冻全血JK基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：对提取自冰冻全血的mRNA进行反转录，以所述反转录得到的cDNA为模板，依次利用Fa/Ra为引物对进行第一轮PCR，以Fb/Rb为引物对进行第二轮PCR，扩增得到JK基因。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，每一轮PCR的程序，均包括：95℃2min；95℃2min，95℃20S，55℃45S，72℃2min，共30循环。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，每一轮PCR的体系以10μL计，包括：2×EmeraldAmp PCR MasterMix 5μL、模板1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL和余量的无核酸酶水。

8.根据权利要求2或4所述方法，其特征在于，以前一轮PCR的产物作为下一轮PCR的模板时，包括将所述产物稀释100倍。

9.一种利用冰冻全血进行ABO基因分型的方法，其特征在于，包括对利用权利要求2～4任一项所述方法扩增得到的ABO基因的第一片段和第二片段进行单独测序，或将所述第一片段和第二片段连接后进行测序，根据测序结果进行ABO基因分型。

10.一种利用冰冻全血进行JK基因分型的方法，其特征在于，包括对利用权利要求5～7任一项所述方法扩增得到的JK基因进行测序，根据测序结果进行JK基因分型。