CN116042854A - 一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法，其中，本发明提供的一种Diego血型基因分型的引物组，包括能够扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1694的引物对；本发明还提供了一种基于非治疗目的检测Diego血型的方法，包括提取待测血液中的DNA作为模板，以上述的一种Diego血型基因分型的引物组作为扩增引物，进行实时荧光PCR扩增，获得荧光信号与温度变化的熔解曲线，根据熔解曲线判断分型结果。本发明提供的一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法能够满足快速、精确检测不同Diego血型的需要，实现血型的简单、准确判断。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
Diego血型系统的基因是SLC4A1(GenBank ID：NG_007498.1)，该基因编码的蛋白质是阴离子交换剂家族的一部分。SLC4A1在红细胞质膜中表达，可作为氯化物/碳酸氢盐交换剂，参与二氧化碳从组织到肺的转运。人类已知该基因有许多突变，这些突变可分为两类。一类可导致疾病，主要是红细胞膜不稳定导致遗传性球形红细胞增多和/或肾脏细胞分泌缺陷导致远端肾小管酸中毒。第二类主要是其他不会引起疾病的突变会产生新的血型抗原，形成Diego血型系统。从突变形式上看，杂合缺失和无义突变也有重要的临床意义。东南亚卵母细胞增多症(SAO，美拉尼西亚卵母细胞增多症)是由于编码蛋白中存在杂合缺失所致，在恶性疟原虫疟疾流行的地区很常见。该基因也有无义突变，可导致非常严重的贫血和肾钙质沉着症。
Diego血型系统目前发现有23个抗原，具有重要的临床意义。血型不合会引发溶血性输血反应和新生儿溶血病，甚至危及患者生命。常规的方法基于血型血清学技术，需要相对应的抗体试剂，稀少且价格昂贵。考虑到每个抗原对应特定的等位基因，可通过对突变位点进行检测来确定。
现有的基因检测技术通过桑格法或者高通量测序，获得Diego血型基因的目标序列，然后与标准序列进行比对。桑格法测序需要选定并针对目标序列设计测序引物，测序的结果片段因人而异，所测序列的质量和准确度也因待测对象和引物的不同而不同。高通量测序能够获得较长的目标序列，然而需要多次重复检测进行拼接，较为耗时费力，而且成本高，只有某些样本有特殊需求才用。还有用凝胶电泳基因分型的方法，操作相对简单，缺点也很明显，譬如较为费时；不便于实现自动化；精确度不高；位点设计单一。
可见，以前的试剂和方法难以满足临床日益增长的检测需求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法(荧光PCR法)，以满足快速、精确检测不同Diego血型的需要。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种Diego血型基因分型的引物组，包括能够扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1694的引物对。
所述靶标位点为c.1694的引物对为靶标位点为c.1694G的引物对或/和靶标位点为c.1694G>C的引物对。
所述扩增靶标位点为c.1694G的引物对，其上游引物序列如SEQ IDNO.1所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述扩增靶标位点为c.1694G>C的引物对，其上游引物序列如SEQ IDNO.3所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的引物组还包括扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1972的引物对，优选为扩增靶标位点为c.1972G的引物对或/和靶标位点为c.1972G>A的引物对。
所述扩增靶标位点为c.1972G的引物对中，其上游引物序列如SEQ IDNO.5所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
所述扩增靶标位点为c.1972G>A的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的引物组还包括扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.2561C或/和c.2561C>T的引物对；
优选的，所述扩增靶标位点为c.1972G>A的引物对中，其上游引物序列如SEQ IDNO.7所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；
所述扩增靶标位点为c.2561C的引物对中，其上游引物序列如SEQ IDNO.9所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；
所述扩增靶标位点为c.2561C>T的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。
一种试剂盒，包括上述的一种Diego血型基因分型的引物组。
本发明中的一种试剂盒，还包括孔板，针对不同靶标位点扩增的引物对分别设置在孔板的不同孔中；
优选的，针对相同靶标位点的不同变异设置不同的引物对，相同靶标位点的不同引物对设置在相邻的两个孔中；
更为优选的，所述孔板至少包括一组孔槽，每组孔槽包括6个孔，每组孔槽的每个孔分别包括靶标位点为c.1694G、c.1694G>C、c.1972G、c.1972G>A、c.2561C和c.2561C>T的引物对；
和/或，每个孔中均无额外设置内参引物。
一种基于非治疗目的检测Diego血型的方法，包括提取待测血液中的DNA作为模板，以上述的引物组作为扩增引物，进行实时荧光PCR扩增，获得荧光信号与温度变化的熔解曲线，判断分型结果。
所述实时荧光PCR扩增的PCR扩增程序为：
熔解曲线的采集条件采用现有公开条件均可；优选的，熔解曲线的采集条件为:每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60-98℃。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供了基于Diego血型抗原基因位点设计专一性引物，包括能够扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1694的引物，利用该引物结合荧光染料进行实时荧光PCR扩增及熔解曲线反应，当引物序列与待测序列互补时，通过PCR反应将目的片段复制与放大，再通过熔解曲线的荧光信号与温度变化，检测特异性产物在双链解离50％时的温度(Tm)，通过温度(Tm)即可判断是否存在特异性扩增，有特异性扩增产物即代表该靶标位点为阳性，无特异性扩增即为阴性，进而有效实现血型的简单、准确判断。
2.本发明优选提供6组引物对，分别针对不同靶标位点进行准确扩增，六对引物均能有效避开目前为止发现的突变位点，具有检测准确度好的优势，并且，结合所设计的反应体系能提高PCR扩增的效率和准确度。
3.本发明提供的试剂盒中，其中孔板至少包括一组孔槽，且每组孔槽包括6个孔，每组孔槽的每个孔分别包括靶标位点为c.1694G、c.1694G>C、c.1972G、c.1972G>A、c.2561C和c.2561C>T的引物对；每组孔槽可以适应一人份检测，当孔板中孔槽有多组时，即可适用于多人份检测。
4.本发明提供的试剂盒中，针对同一靶标位点的两种不同碱基变异设计了对应引物，可以识别纯合和杂合以及无效检测。具体判读方法为：同一位点，两个检测结果均为阳性时判定为杂合子；同一位点，一个检测结果为阳性，一个检测结果为阴性，则为纯合子，纯合碱基与该显示阳性的孔位的变异对应；如果同一位点，两个检测结果均为阴性，则判定为实验结果无效。
5.本发明针对Diego血型基因分型的试剂盒中，每个孔无需额外添加内参引物，可以简化实验，节约成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中靶标位点为c.1694的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图2是本发明实施例1中靶标位点为c.1972的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图3是本发明实施例1中靶标位点为c.2561的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图4是本发明实施例2中靶标位点为c.1694的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图5是本发明实施例2中靶标位点为c.1972的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图6是本发明实施例2中靶标位点为c.2561的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图7是本发明对比例1中靶标位点为c.1694的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图8是本发明对比例1中靶标位点为c.1972的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图9是本发明对比例1中靶标位点为c.2561的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图10是本发明对比例2中靶标位点为c.1694的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图11是本发明对比例2中靶标位点为c.1972的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图12是本发明对比例2中靶标位点为c.2561的引物对的检测结果的荧光信号与温度变化的熔解曲线；
图13是本发明试验例1的测序结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了Diego血型基因分型的引物组，包括：靶标位点为c.1694G、c.1694G>C、c.1972G、c.1972G>A、c.2561C和c.2561C>T的引物对。
其中，扩增靶标位点为c.1694G的引物对，产物长度219bp，可辅助识别等位基因DI*02，结果阳性对应抗原DI:–9,22或者Wu–,DISK+，其中：
上游引物序列为：GATGGTGCCCAAACCTCAGGG，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物序列为：GGAAGCTAAGGGCACTGAGGAAT，如SEQ IDNO.2所示。
扩增靶标位点为c.1694G>C的引物对，产物长度366bp，可辅助识别等位基因DI*02.09，结果阳性对应抗原Wu+,DISK–或者DI:9,–22，其中：
上游引物序列为：GATGGTGCCCAAACCTCAGGC，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物序列为：GCTATGTCTGCCTCCTTTCTTCT，如SEQ ID NO.4所示。
扩增靶标位点为c.1972G的引物对，产物长度197bp，可辅助识别等位基因DI*02.04，结果阳性对应抗原Wr(a–b+)或者DI:-3,4，其中：
上游引物序列为：CACCCACTGGGCTTGCGTTCCG，如SEQ ID NO.5所示；
下游引物序列为：AGTCCTGGGTCTCTTGCCTGC，如SEQ ID NO.6所示。
扩增靶标位点为c.1972G>A的引物对，产物长度384bp，可辅助识别等位基因DI*02.03，结果阳性对应抗原DI:3,–4或者Wr(a+b–)，其中：
上游引物序列为：CACCCACTGGGCTTGCGTTCCA，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物序列为：GCCCGCCTCGGCCTCTCAAACTGT，如SEQ IDNO.8所示。
扩增靶标位点为c.2561C的引物对，产物长度116bp，可辅助识别等位基因DI*02或者DI*B，结果阳性对应抗原DI:–1,2或者Di(a–b+)，其中：
上游引物序列为：TGTGGGTGGTGAAGTCCACGCC，如SEQ ID NO.9所示；
下游引物序列为：ACACTGAAGCTCCACGTTCCT，如SEQ ID NO.10所示。
扩增靶标位点为c.2561C>T的引物对，产物长度360bp，可辅助识别等位基因DI*01或者DI*A，结果阳性对应抗原DI:1,–2或者Di(a+b–)，其中：
上游引物序列为：TGTGGGTGGTGAAGTCCACGCT，如SEQ IDNO.11所示；
下游引物序列为：TGTCTGCCTCTTGACGCTCTC，如SEQ ID NO.12所示。
本发明还公开了一种试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，同时还包括孔板，针对不同靶标位点扩增的引物对分别设置在孔板的不同孔中，每个孔无需额外添加内参引物。本实施例中的试剂盒采用96孔板，6孔为一组，一组中每个孔分别命名为孔1、孔2、孔3、孔4、孔5、孔6，并且每个孔分别包含一对引物对，每个孔中引物对的含量为1μl。其中，靶标位点为c.1694G的引物对设置在孔1中，靶标位点为c.1694G>C的引物对设置在孔2中，靶标位点为c.1972G的引物对设置在孔3中，靶标位点为c.1972G>A的引物对设置在孔4中，靶标位点为c.2561C的引物对设置在孔5中，靶标位点为c.2561C>T的引物对设置在孔6中。
检测时，对每份样本，可将样本调整浓度至50ng/μl，然后吸取6μl样本后与60μlPCR工作液形成反应混合物，每孔中加入10μl反应混合物进行检测。本实施例中，每板可做16人份的血型检测。以16人份为例，PCR工作液在试剂配制区进行，该PCR工作液一般按照下表1中记载的比例配制成1ml，再进行分装、储存，在使用前加入样本混合即可。
表1
| 人份数 | PCR荧光缓冲液(μl) | Taq酶(5U/μl) | 去离子水(μl) |
| 16 | 500 | 12μl | 500 |
配制时振荡混匀数秒，800rpm离心数秒。其它人份按照以上比例进行相应扩大或缩小比例配制即可。其中，PCR荧光缓冲液配制比例如下表2所示：
表2
| 序号 | 品名 | 体积 |
| 1 | 10X TE缓冲液 | 30ml |
| 2 | dNTPs | 8ml |
| 3 | 甲酚红钠溶液(10mmol/L) | 6ml |
| 4 | SYBR Green I | 2ml |
| 5 | 水 | 4ml |
本发明还提供了利用Diego血型基因分型的引物组进行分型的方法。针对本实施例中的引物组而言，其具体分型过程包括：
DNA提取：取EDTA抗凝血样2ml，采用磁珠法，机器自动提取DNA，采用该DNA作为样本，获得的DNA测量OD(260/280)＝1.8。
PCR工作液配制：采用PCR荧光缓冲液1000μl、去离子水1000μl与Taq酶24μl加入PCR反应液管中，用漩涡振荡器混匀即可。
加样：在加样前将PCR工作液反复抽吸10次，在每个孔中加PCR工作液1μl，再加样本1μl，采用PCR工作液补足，使每孔加样完成后达到10μl，封膜(石蜡油)，封膜后96孔板在7500RPM的转速下离心1分钟。
PCR扩增：仪器选用型号为
Q6000的PCR扩增仪进行扩增，扩增的反应体积设定：10μl。扩增的程序设定如下表3所示。
表3
| 步骤 | 温度和时间 | 循环 |
| 1 | 96℃6min | 1cycle |
| 2 | 96℃15sec，66℃60sec，72℃45sec | 10cycles |
| 3 | 96℃20sec，63℃50sec，72℃45sec | 18cycles |
| 4 | 72℃2min | 1cycle |
| 5 | 4℃保存 |
PCR扩增后进行熔解曲线采集，采集过程为：每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60-98℃，不同孔的熔解曲线如图1-图3所示。其中图1为靶标位点为c.1694的引物对的检测结果，图2为靶标位点为c.1972的引物对的检测结果，图3为靶标位点为c.2561的引物对的检测结果。
根据图1-3所示的采集荧光曲线的对比峰值，可以判断样本的分型结果为：Di(a–b+)；Wr(a+b–)；Wu–,DISK+。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中利用Diego血型基因分型的引物组进行分型中，其所采用的样本不同以及PCR扩增仪器不同。具体的，本实施例中样本DNA的获取如下：取EDTA抗凝血样2ml，磁珠法机器自动提取DNA，测量OD(260/280)＝1.9。
PCR扩增仪器的型号为Line 9600plus。
本实施例中样本的熔解曲线如图4-6所示，根据图4-6所示的采集荧光曲线的对比峰值，可以判断样本的分型结果为：Di(a+b–)；Wr(a–b+)；Wu+,DISK–。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中PCR扩增程序不同，其他与实施例1相同，本实施例中PCR扩增程序如下表4所示。
表4
本实施例的检测结果与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中PCR扩增程序不同，其他与实施例1相同，本实施例中PCR扩增程序如下表5所示。
表5
本实施例的检测结果与实施例1相同。
对比例1
采用通过其他常规设计的引物对进行实验，发现在相同PCR扩增条件下无法实现准确测量。
具体的，本对比例提供的针对靶标位点为c.1694G、c.1694G>C、c.1972G、c.1972G>A、c.2561C和c.2561C>T的引物对分别如下：
其中，针对靶标位点为c.1694G的引物对，
上游引物序列为：GCCCAAACCTCAGGGCCCC，如SEQ ID NO.13所示；
下游引物序列为：GAGAACTGCTGGGGGAAGAA，如SEQ ID NO.14所示。
针对靶标位点为c.1694G>C的引物对，
上游引物序列为：GCCCAAACCTCAGGCCCC，如SEQ ID NO.15所示；
下游引物序列为：GATGCTGATGGATCCCCTGGAA，如SEQ ID NO.16所示。
针对靶标位点为c.1972G的引物对，
上游引物序列为：GGCTTGCGTTCCGAGTTTCC，如SEQ ID NO.17所示；
下游引物序列为：GAATAGTGAAAAGCCAGGGG，如SEQ ID NO.18所示。
针对靶标位点为c.1972G>A的引物对，
上游引物序列为：GGCTTGCGTTCCAAGTTTCC，如SEQ ID NO.19所示；
下游引物序列为：GCAGATCACCTGAGGTCAGGA，如SEQ ID NO.20所示。
针对靶标位点为c.2561C的引物对，
上游引物序列为：GAAGTCCACGCCGGCCTCCCT，如SEQ ID NO.21所示；
下游引物序列为：GTCTGGGGCTAGGGCTGGTGTC，如SEQ ID NO.22所示。
针对靶标位点为c.2561C>T的引物对，
上游引物序列为：GAAGTCCACGCTGGCCTCCCT，如SEQ ID NO.23所示；
下游引物序列为：GTCACTCCTCTAATAGGATT，如SEQ ID NO.24所示。
本对比例的熔解曲线如图7-9所示。通过图7-9可知，本对比例的引物对无法实现准确测量。
对比例2
采用本发明设计的引物对进行实验，发现在不同PCR扩增条件下无法实现准确测量，熔解曲线形态不好或者无法正常扩增。
本对比例的PCR扩增条件如下表6所示：
表6
| 步骤 | 温度和时间 | 循环 |
| 1 | 96℃6min | 1cycle |
| 2 | 96℃15sec，66℃60sec，75℃30sec | 10cycles |
| 3 | 96℃20sec，63℃50sec，75℃30sec | 10cycles |
| 4 | 72℃2min | 1cycle |
| 5 | 4℃保存 |
熔解曲线如图10-12所示。通过图10-12可以说明，本发明提供的PCR扩增条件是经过实验优化的条件，其他扩增条件下会导致熔解曲线形态不好或者无法正常扩增的问题。
试验例：
为了验证实施例1的结果，对同一实验样本通过Sanger测序法做了检测，获得了相应位点的信息，分别为c.2561C、c.1972A和c.1694G，样本序列与标准序列(即参比序列)对照，可以判断样本的分型结果为：Di(a–b+)；Wr(a+b–)；Wu–,DISK+，与实施例1的结果一致。此样本三个位点的测序结果如图13所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种Diego血型基因分型的引物组，其特征在于，包括能够扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1694的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述靶标位点为c.1694的引物对为靶标位点为c.1694G的引物对或/和靶标位点为c.1694G>C的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述扩增靶标位点为c.1694G的引物对，其上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述扩增靶标位点为c.1694G>C的引物对，其上游引物序列如SEQ IDNO.3所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物组，其特征在于，还包括扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.1972的引物对，优选为扩增靶标位点为c.1972G的引物对或/和靶标位点为c.1972G>A的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述扩增靶标位点为c.1972G的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
所述扩增靶标位点为c.1972G>A的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的引物组，其特征在于，还包括扩增SLC4A1基因中靶标位点为c.2561C或/和c.2561C>T的引物对；
优选的，所述扩增靶标位点为c.2561C的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；
所述扩增靶标位点为c.2561C>T的引物对中，其上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括孔板，针对不同靶标位点扩增的引物对分别设置在孔板的不同孔中；
优选的，针对相同靶标位点的不同变异设置不同的引物对，相同靶标位点的不同引物对设置在相邻的两个孔中；
更为优选的，所述孔板至少包括一组孔槽，每组孔槽包括6个孔，每组孔槽的每个孔分别包括靶标位点为c.1694G、c.1694G>C、c.1972G、c.1972G>A、c.2561C和c.2561C>T的引物对；
和/或，所述每个孔中均无额外设置内参引物。
9.一种基于非治疗目的检测Diego血型的方法，其特征在于，包括：提取待测血液中的DNA作为模板，以权利要求1-6任一项所述的引物组作为扩增引物，进行实时荧光PCR扩增，获得荧光信号与温度变化的熔解曲线，根据熔解曲线判断分型结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的PCR扩增程序为：
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