JP2002078500A - 遺伝子多型解析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 泳動条件変化によらずＬＯＨ判定できる遺伝
子多型解析方法の提供。 【解決手段】 キャピラリ電気泳動を用いるＳＳＣＰ法
による遺伝子多型解析方法に於いて，被検細胞に由来す
る分析対象ＤＮＡ断片と，分析対象ＤＮＡ断片の比較基
準とするヘテロ接合型の基準ＤＮＡ断片（健常細胞に由
来する）とをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し，分析対
象ＤＮＡ断片と基準ＤＮＡ断片とを同一のキャピラリで
同時に電気泳動分離し，得られた泳動パターンに出現す
る２つの基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度を用いて，
分析対象ＤＮＡ断片のピークの信号強度を補正して，分
析対象ＤＮＡ断片のヘテロ接合性の消失の有無を判定す
る。 【効果】 ＬＯＨ判定を正確にでき診断のための信頼性
の高いデータを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，キャピラリ電気泳
動を用いるＳＳＣＰ法による遺伝子（核酸）多型解析方
法に係り，特に遺伝子の欠失やヘテロ接合性の消失等，
癌等の疾病と関連のある遺伝子異常を，遺伝子多型マー
カーを用いて検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト正常細胞には父母由来の１対の染色
体が含まれ，特定の遺伝子座について，例えば，片方の
アリルが野生型，もう片方のアリルが変異型である場合
のごとく，両者の遺伝子型が異なる場合はヘテロ接合体
と呼ばれる。一方，両者の遺伝子型が同じ場合はホモ接
合体と呼ばれる。健常なヘテロ接合体の場合，それぞれ
のアリルの存在量の比は理論的に１：１である。ヘテロ
接合体をＳＳＣＰ法で解析すると，野生型と変異型等，
それぞれのアリルに対応する２つのピークが観測され，
２つのピークの信号強度比は１：１となる。

【０００３】一方，殆どの悪性の癌細胞では遺伝子の欠
失や増幅等の異常が生じる。ヘテロ接合体で片方の対立
遺伝子が欠失や増幅を起こすと，いわゆるヘテロ接合性
の消失（ロス オブ ヘテロツァイゴシティ，ＬＯＨ）
が生じる。ＳＳＣＰ法ではＬＯＨはヘテロ接合体の各ア
リルに対応する２つのピークの信号強度比が１：１から
外れる現象として観測される。

【０００４】遺伝子の多型性，即ち，塩基配列の個人差
をマーカーとして利用し，癌の診断を行なう方法（特開
平９−２０１１９９号公報，以下，従来技術−１とい
う）。の概略を以下に説明する。遺伝子の塩基配列中の
特定の領域を標識プライマーを用いてＰＣＲ法により増
幅した後，３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵
素（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント等）により３’末端を平
滑化する。このＰＣＲ産物をスラブゲル型電気泳動装置
を用いて一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）法による
解析を行ない，１塩基多型を持つ対立遺伝子（アリル）
を分離検出する。

【０００５】正常組織由来のＤＮＡ断片と癌組織由来の
ＤＮＡ断片とを同一の蛍光色素で標識し，複数レーンを
持つスラブゲル型電気泳動装置を用いてそれぞれ別のレ
ーンで測定している。正常組織由来の２つのピークＡ
１，Ａ２の信号強度比と，癌組織由来の２つのピークＢ
１，Ｂ２の信号強度比とから，癌細胞の割合を推定して
いる。ｐ５３遺伝子での１塩基多型を指標とする膀胱癌
のＬＯＨ検出の例では，癌細胞の割合が１０％を越えた
場合，異常（ＬＯＨ＋，陽性）としている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来技術−１ではスラ
ブゲル型電気泳動装置を使用しているが，ルーチンの臨
床検査に適用するためには自動化，省力化，高速化が求
められる。本発明では，従来技術−１に於いてスラブゲ
ル型電気泳動装置に代えて，ゲルの自動充填機構やサン
プルの自動注入機構を持つキャピラリ電気泳動装置を使
用し，自動化，省力化，高速化を図る検討を行った。し
かし，キャピラリ電気泳動装置を用いたＳＳＣＰは研究
段階であり，多くの課題が残されている。キャピラリ電
気泳動装置を従来技術−１に適用することを試みたが，
正常組織と癌組織とを同一の蛍光色素で標識して別々の
キャピラリで電気泳動すると，又は，１本キャピラリで
２回に分けて電気泳動すると，測定条件の変動等により
ピークの信号強度が変動しＬＯＨを正しく判定できない
という問題が見出された。

【０００７】本発明の目的は，キャピラリ電気泳動装置
を用いてＳＳＣＰ法による解析を行ないＬＯＨを検出す
る遺伝子多型解析方法に於いて，泳動ピークの信号が泳
動条件等により変動しても，ＬＯＨ判定を正確に行な
い，診断のための信頼性の高いデータを得ることができ
る遺伝子多型解析方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は，キャピラリ電
気泳動装置によるＳＳＣＰ法に於いて，健常細胞と被検
細胞とに由来する標的ＤＮＡ断片をそれぞれ異なる蛍光
色素で標識し，同一のキャピラリで同時に電気泳動して
泳動パターンを比較することにより，ＬＯＨの正確な判
定（ヘテロ接合性の消失の有無の判定）を可能とし，癌
等の診断のために信頼性の高いデータを提供する。

【０００９】本発明では，１又は複数のキャピラリ電気
泳動を用いるＳＳＣＰ法により遺伝子多型解析を行な
う。分析対象とする分析対象ＤＮＡ断片とこの分析対象
ＤＮＡ断片の比較基準とするヘテロ接合型の基準ＤＮＡ
断片とがそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。分
析対象ＤＮＡ断片と基準ＤＮＡ断片とが同一のキャピラ
リで同時に電気泳動分離される。得られた泳動パターン
に出現する２つの基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度を
用いて，泳動パターンに出現する分析対象ＤＮＡ断片の
ピークの信号強度を補正して，分析対象ＤＮＡ断片のヘ
テロ接合性の消失の有無の判定がなされる。分析対象Ｄ
ＮＡ断片のピークの信号強度の補正は，２つの基準ＤＮ
Ａ断片のピークの信号強度比を用いて実行される。

【００１０】基準ＤＮＡ断片として被験者の健常細胞由
来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用され，
分析対象ＤＮＡ断片として同一の被験者の被検細胞由来
のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用される。
また，基準ＤＮＡ断片としてヘテロ接合型の健常者の健
常細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使
用され，分析対象ＤＮＡ断片として被験者の被検細胞由
来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用され
る。特に，分析対象ＤＮＡ断片として血液中から回収し
た上皮細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物
が使用される。血液中からの上皮細胞の回収は，抗原抗
体反応に基づいて上皮細胞を選択的に吸着するカラムを
具備する遺伝子多型解析装置を用いて実行される。上記
のＰＣＲ産物を得るＰＣＲ反応ではＴｓｐポリメラーゼ
が使用される。

【００１１】分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片がｐ
５３遺伝子のｅｘｏｎ４に於けるｃｏｄｏｎ７２の一塩
基多型サイトを含む場合には，分析対象ＤＮＡ断片，基
準ＤＮＡ断片のｒｅｖｅｒｓｅ鎖について，温度範囲，
４４℃ないし４８℃で電気泳動を行なう。

【００１２】本発明では，注目している標的ＤＮＡ断片
（分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片）の二次構造を
計算により求め，多型による二次構造の差異の拡大を指
標として電気泳動に於ける断片の分離（Ｒｓ）が大とな
る好適な温度条件を求め，この好適な温度条件で電気泳
動を行なう。

【００１３】また，本発明では，ＰＣＲ増幅される注目
している標的ＤＮＡ断片（分析対象ＤＮＡ断片，基準Ｄ
ＮＡ断片）の二次構造を計算により求め，ＰＣＲ反応に
於けるプライミングサイトを変化させて，多型による二
次構造の差異の拡大を指標として電気泳動に於ける断片
の分離（Ｒｓ）が大となる好適なプライマ配列を求め，
この好適なプライマ配列を用いて標的ＤＮＡ断片を調製
する。

【００１４】

【発明の実施の形態】〔実施例１〕図１は，本発明の実
施例１であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図
である。以下，実施例１での手順の概略を図１を用いて
説明する。

【００１５】（工程Ａ）健常細胞からのゲノムＤＮＡ抽
出と標的ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例１では診断対
象を膀胱癌とし，被検細胞は被験者の尿中に漏洩した膀
胱癌由来の癌細胞，対照実験に用いる健常細胞は同じ被
験者の血液中の白血球とした。工程Ａでは健常細胞のゲ
ノムＤＮＡを得るために，血液中の白血球からＤＮＡを
抽出した。実施例１では自動核酸抽出装置を使用し，迅
速簡便かつ安全な抽出作業を実現し，ルーチンの臨床検
査に好適に適用可能とした。

【００１６】次に，抽出したゲノムＤＮＡをテンプレー
トとし，前記の従来技術−１と同様にＴａｑ酵素（ＡＢ
Ｉ社製，ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）を用いてＰＣＲ
増幅を行ない，標的ＤＮＡ断片を得た。工程Ａでは従来
技術−１で使用しているプライマーセットと同じ塩基配
列のプライマーを使用したので，標的ＤＮＡ断片の領域
（癌抑制遺伝子ｐ５３のｅｘｏｎ４の一部）や長さ（１
１５ｎｔ（ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ，ｂａｓｅ））は従来技
術−１と同じとなる。

【００１７】但し，従来技術−１では，ｒｅｖｅｒｓｅ
鎖（Ｃｌｉｃｋ鎖）に対して５’端を蛍光色素Ｃｙ５で
標識したプライマーを，ｆｏｒｗａｒｄ鎖（Ｗａｔｓｏ
ｎ鎖）に対して標識しないプライマーをＰＣＲに使用す
るのに対し，実施例１では，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖に対して
５’端をＲＯＸで標識したプライマー（ＧＥＮＳＥＴ社
製）を，ｆｏｒｗａｒｄ鎖に対して５’端をＦＡＭで標
識したプライマー（ＧＥＮＳＥＴ社製）をＰＣＲに使用
して，ＰＣＲ産物として標的ＤＮＡを得た。

【００１８】最後に，従来技術−１に記載の方法と同様
にして，ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化処理をで行っ
た。即ち，Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素）を加えて３７℃，３０分間反応させ，３’末
端の突出端のｄＮＰＴを除去し，目的とする１１５ｎｔ
の標的ＤＮＡ断片を得た。

【００１９】（工程Ｂ）被検細胞からのゲノムＤＮＡ抽
出と標的ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：基本的に工程Ａと同
様の手順により，同一の被験者から被検細胞を得て，ゲ
ノムＤＮＡ抽出を行ない，ＰＣＲ増幅を行った。

【００２０】工程Ｂが工程Ａと異なるのは被検細胞が尿
中に漏れ出た膀胱由来の細胞である点であり，被験者の
尿から細胞を回収しＤＮＡ抽出と増幅を行った。回収し
た細胞からのゲノムＤＮＡの抽出では工程Ａと同様に自
動核酸抽出装置を使用した。また，工程Ｂではこの被検
細胞から得たゲノムＤＮＡに基づくＰＣＲ増幅の際，ｒ
ｅｖｅｒｓｅ鎖に対して５’端をＦＡＭで標識したプラ
イマーを，ｆｏｒｗａｒｄ鎖に対して５’端をＲＯＸで
標識したプライマーを用いて標的ＤＮＡ断片を得た。

【００２１】（工程Ｃ）健常細胞に基づく増幅ＤＮＡ断
片の電気泳動と多型分離検出：実施例１では電気泳動装
置として１本のキャピラリを有するＤＮＡシーケンサ
（ＡＢＩ社）を使用し，基本的にＡＢＩ社推奨のＳＳＣ
Ｐ条件に基づき泳動を行ない，１塩基多型を有するＰＣ
Ｒ増幅産物の分離検出を行った。この装置は泳動ポリマ
をキャピラリに自動充填する機構と，オートサンプラ上
の試料をキャピラリに自動注入する機構を備えるため，
全自動の連続測定が可能であり，ルーチンの臨床検査に
好適に使用可能である。この装置は，複数の異なる発光
波長を検出できる機能（以下，多波長検出という）を有
し，標準蛍光色素を用いた蛍光の相互干渉を事前評価し
て補正マトリクスを予め作製し，実試料での干渉の影響
をマトリクス変換により除去し，複数の蛍光色素を独立
に検出可能である。

【００２２】試料調製条件は下記の通り。ＰＣＲの反応
液を水で１／２０ないし１／５０に希釈した溶液１μ
Ｌ，サイズスタンダード（ＡＢＩ社製ＧｅｎｅＳｃａｎ
５００ ＴＡＭＲＡ）０．５μＬ，ホルムアミド１２
μＬを混合，９４℃で２分間熱変性，室温まで放冷す
る。但し，工程Ｄで説明する通り，実際には工程Ｃ，工
程Ｄの電気泳動は同時に同一のキャピラリで実施した。
従って，ＰＣＲ反応液は，工程Ｃによる健常細胞由来の
もの０．５μＬと，工程Ｄによる被検細胞由来のもの
０．５μＬの，合計１μＬを用いた。

【００２３】実施例１でのＳＳＣＰ法による泳動条件は
下記の通り。キャピラリ寸法は，有効長３０ｃｍ，全長
４１ｃｍ，内径５０μｍ，外径３７５μｍである。試料
注入条件は，１５ｋＶ，５秒で行った。泳動電圧は，１
５ｋＶである。泳動バッファは，グリセロール１０重量
％を含む１ｘＴＢＥ緩衝溶液である。泳動ポリマは，泳
動バッファをベースとし，ＡＢＩ社製ＧｅｎｅＳｃａｎ
Ｐｏｌｙｍｅｒを９重量％となるよう添加した。

【００２４】図２は，本発明の実施例１であり，上記の
試料について，ＳＳＣＰ法による電気泳動を行って得ら
れた電気泳動パターンの例を示す図である。図２（ａ）
の横軸は時間（ｔ）に相当し，左から右にむけてｔは大
となる。縦軸は特定の発光波長での蛍光信号強度を示
し，ピークの高さは発光波長で蛍光を発する蛍光色素で
標識されたＤＮＡ断片の濃度に比例する。図２（ａ）の
縦軸は，蛍光色素ＦＡＭの蛍光波長の信号強度を示す。

【００２５】事前の検討で，標的ＤＮＡ断片（ｐ５３ｅ
ｘｏｎ４の一部）のｆｏｒｗａｒｄ鎖の一塩基多型に関
し野生型のホモ接合型の試料は，図２（ａ）のピーク１
２と同じ位置に単一のピークを示し，また変異型の試料
の場合は，図２（ａ）のピーク１３と同じ位置に単一の
ピークを示すことを確認した。

【００２６】従って，図２（ａ）のピークはそれぞれ，
標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型と変異型の
断片に由来する。一方，ＦＡＭで標識されているｆｏｒ
ｗａｒｄ鎖は工程Ａで説明した健常細胞由来の試料であ
るため，この健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片は，ｅｘｏ
ｎ４の一塩基多型に関し，野生型と変異型とを含むヘテ
ロ接合型であることが理解される。２つのピーク１２，
１３が観測されたことから，この一塩基多型を有する２
つの標的ＤＮＡ断片が，実施例１によるＳＳＣＰ法によ
り分離検出できることが示された。なお，各ピークの泳
動時間はそれぞれ２３．６分，２３．８分，信号強度は
それぞれ２５５，２６３（任意単位）であった。

【００２７】一方，ＲＯＸで標識したｒｅｖｅｒｓｅ鎖
の信号も同様に分離検出されたが，図２の時間軸範囲の
外であったため図２では省略した。ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の
野生型，変異型のピークの泳動時間はそれぞれ２０．３
分，２０．４分であった。このｒｅｖｅｒｓｅ鎖の分離
特性については後述する。従来技術−１の泳動時間は約
５時間であるから，実施例１は従来技術−１と比較して
約１５倍高速という特長を有する。これは放熱特性に優
れるキャピラリ方式の採用により，約３６６Ｖ／ｃｍと
高い電場の採用が可能となり，泳動が高速化したためと
考えられる。

【００２８】（工程Ｄ）被検細胞に基づく標的ＤＮＡ断
片の電気泳動と多型分離検出：被検細胞から工程Ｂによ
り得られた標的ＤＮＡ断片について，工程Ｃと同じ手順
でＳＳＣＰ法による解析を行なうことにより，ｅｘｏｎ
４の一塩基多型に関する解析を行った。なお，使用した
装置が多波長検出できるので，実際には工程Ｃと工程Ｄ
の試料を混合し，同じキャピラリで同時に電気泳動を行
ったのは前述の通りである。電気泳動の結果を図２
（ｂ）に示した。

【００２９】図２（ｂ）の横軸と図２（ａ）の横軸は共
通の原点と時間スケールを持つ時間軸であり，既知試料
との比較から，２つのピーク１４，１５は標的ＤＮＡ断
片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型と変異型の断片に対応す
る。図２（ｂ）の縦軸は蛍光色素ＲＯＸの蛍光波長の信
号強度を示し，ＲＯＸで標識されているｆｏｒｗａｒｄ
鎖は工程Ｂで説明した被検細胞由来の試料であるため，
この被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片は，ｅｘｏｎ４の一
塩基多型に関し，野生型と変異型とを含むヘテロ接合型
である。

【００３０】マトリクス変換による干渉補正を用いた多
波長検出により，同一キャピラリで被検細胞と健常細胞
から得た標的ＤＮＡ断片を同時に電気泳動するにもかか
わらず，図２（ａ）に示したＦＡＭで標識した健常細胞
のｆｏｒｗａｒｄ鎖の断片に基づく信号と，図２（ｂ）
に示したＲＯＸで標識した被検細胞のｆｏｒｗａｒｄ鎖
の断片に基づく信号とは互いに独立に検出できることが
理解される。ピーク１４，１５の泳動時間はそれぞれ２
３．６分，２３．７分，信号強度はそれぞれ２５５，２
７４（任意単位）であった。

【００３１】なお，ピーク１２，１４はそれぞれ同一の
配列を有する標的ＤＮＡ断片のピークであることを，そ
れぞれＦＡＭ，ＲＯＸで標識した野生型試料の泳動結果
との比較により確認したが，両者の泳動時間は僅かに異
なった。これは，蛍光色素の違いにより移動度が僅かに
影響を受けるためと考えられる。ピーク１３と１５につ
いても変異型である点以外は同様である。なお，ＦＡＭ
で標識した被検細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖の断片に基
づく信号は図２の時間軸の範囲外であったが，工程Ｃで
のｒｅｖｅｒｓｅ鎖の断片に基づく信号の結果と類似の
結果が得られた。

【００３２】（工程Ｅ）対立遺伝子が互いに異なるヘテ
ロ接合型か否かの判定：工程Ｃに関する説明の通り，健
常細胞から得たＤＮＡはＳＳＣＰ法で２つのピーク１
２，１３が得られたことから，標的ＤＮＡ断片（ｐ５３
ｅｘｏｎ４）のｃｏｄｏｎ７２について野生型と変異型
とを含み，換言すると対立遺伝子が互いに異なるヘテロ
接合型であった。従って，この被験者の被検細胞につい
て，この遺伝子座に関するＬＯＨ判定を行なうことが可
能である。

【００３３】一方，ＳＳＣＰ法でピーク１２又は１３ど
ちらか一方のピークしか観測されなかった場合は，この
被験者はこの遺伝子座に関してホモ接合型であり，被検
細胞のＤＮＡを調べてもＬＯＨに関する情報が得られ
ず，この遺伝子座に関するＬＯＨ判定を行なうことがで
きない。従って，別の遺伝子座について検査を行なう必
要がある。

【００３４】（工程Ｆ）健常細胞の対立遺伝子に由来す
る断片の信号強度からの補正係数の算出：以下の説明で
は，Ｘ＝Ｓ，Ｐ，Ｃとして，変数Ｘ１（Ｓ１，Ｐ１，Ｃ
１），Ｘ２（Ｓ２，Ｐ２，Ｃ２）を使用するが，Ｘに続
く１，２はそれぞれ，野生型，変異型に対応することを
示す。工程Ｃに関する説明の通り，健常細胞のｆｏｒｗ
ａｒｄ鎖の野生型，変異型に対応する標的ＤＮＡ断片の
信号強度Ｓ１，Ｓ２は，それぞれ２５５，２６３であっ
た。補正係数Ｆは（数１）によって定義され，補正係数
Ｆの値は２６３／２５５＝１．０３１である。

【００３５】

【数１】 Ｆ＝Ｓ２／Ｓ１ …（数１） （工程Ｇ）：被検細胞の対立遺伝子に由来する断片の信
号強度と，補正係数とから，被検細胞での対立遺伝子の
存在量の比を求める：工程Ｄの説明の通り，被検細胞の
ｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型，変異型に対応する標的ＤＮ
Ａ断片の信号強度Ｐ１，Ｐ２はそれぞれ２５５，２７４
であった。被検細胞での対立遺伝子の存在量の比Ｔは
（数２）によって定義され，Ｔ＝２７４／２５５／１．
０３１＝１．０４２である。

【００３６】

【数２】 Ｔ＝Ｐ２／Ｐ１／Ｆ …（数２） （工程Ｈ）Ｔの１からの乖離（ずれ）の判定：工程Ｇで
求めた通りＴ＝１．０４２であり，Ｔの１からの乖離は
＋４．２％である。Ｔの１からの乖離が±１０％以上を
ＬＯＨあり（異常有り）と判定する基準を設けて，この
ケースは被検細胞にＬＯＨなし（異常なし）と判断し
た。このケースではＴの１からの乖離が１０％未満であ
ったが，Ｔ≦０．９の場合や，Ｔ≧１．１の場合はＴの
１からの乖離が±１０％以上となるため，ＬＯＨあり
（異常有り）と判断する。この結果を，膀胱癌の診断を
行なうためのデータとして医師に提供することができ
る。

【００３７】なお，実施例１で用いた被検細胞は健常者
のものであったため，上記の異常無しの判定は正しい結
果であった。実施例１ではそれぞれの標的ＤＮＡ断片を
異なる蛍光色素で標識したにもかかわらず，工程Ｃと工
程Ｄで同一のキャピラリで同時に電気泳動を行ったため
に，健常細胞由来の断片の強度比を基準とする被検細胞
由来の断片の強度比の補正が有効に機能したと考えられ
る。注意すべき点は，蛍光色素の違いによる両者の挙動
の違いが事実上無関係であったことである。これは従来
当業者の予見が困難であった事実であり，本発明の進歩
性のポイントの一つである。

【００３８】実施例１では，ＳＳＣＰ法による解析を行
なうためのキャピラリ電気泳動装置として，例えば，光
源としてＡｒ＋レーザとＨｅ−Ｎｅレーザ，検出器とし
て回折格子とＣＣＤカメラを用いて，多波長の蛍光検出
が可能な装置も使用できる。本発明の適用範囲はこれら
装置に限定されるものではなく，広く一般の多波長の蛍
光検出が可能なキャピラリ電気泳動装置が適用できる。
実施例１では，簡単のために２種の蛍光色素からの蛍光
検出を行なう場合について例示し，被検細胞由来の標的
ＤＮＡ断片を１種のみ用いる方法を例示した。ｎ種の蛍
光色素からの蛍光検出が可能な装置を使用して，各標的
ＤＮＡ断片をｎ種の異なる蛍光色素で標識すれば，当然
（ｎ−１）種までの被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片を同
時に測定可能である。

【００３９】本発明の適用範囲は，実施例１で示した試
料，ＰＣＲ領域，適用用途等についても，上記の血液や
尿から採取した細胞から抽出したゲノムＤＮＡ試料のｐ
５３ｅｘｏｎ４領域，膀胱癌の診断に限定されない。本
発明は，その他の生体に由来する細胞から得た試料に適
用可能であり，他の遺伝子領域での一塩基多型，マイク
ロサテライト多型，ショートタンデムリピート多型等を
マーカーとして使用可能である。また，ＬＯＨが指標と
なる他の疾病の遺伝子診断にも適用可能である。他のキ
ャピラリ電気泳動装置応用の分析試験に対しても，信号
強度比を高精度に評価する必要がある場合には，同様に
適用可能である。

【００４０】実施例１の特有の効果は，健常細胞由来の
断片と，被検細胞由来の断片とを，同時に同じキャピラ
リで電気泳動することにより，蛍光色素の違い以外の全
ての泳動条件を統一できることである。ＬＯＨの判断基
準となる対立遺伝子由来の断片の信号強度比に影響を及
ぼすような電気泳動条件の変動があったとしても，変動
要因の影響を相殺でき高精度の測定が可能になるという
効果がある。

【００４１】〔実施例２〕実施例２は実施例１と同様で
あるが，ＰＣＲ増幅に用いた酵素並びにＰＣＲ後の工程
が異なる。実施例１の工程Ａ，工程Ｂでは，ＰＣＲ酵素
としてＴａｑポリメラーゼを使用した。この場合３’末
端にｄＮＰＴ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が一つ付加したＰ
ＣＲ産物が生じ，それによるゴーストピークがＳＳＣＰ
法での定量的解析を妨害する不具合がある。この不具合
を避けるためにＰＣＲ産物をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理し
て３’末端を平滑化して，３’末端の突出端部のｄＮＴ
Ｐを除去した。

【００４２】実施例２では，ＰＣＲ酵素としてＰｌａｔ
ｉｎｕｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｔｓｐポリメラーゼ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ
社）を使用することにより，３’末端に対するｄＮＴＰ
の付加を抑制しＫｌｅｎｏｗ酵素処理を省略した。実施
例２により，時間，手間，コストがかかるＫｌｅｎｏｗ
酵素反応を省略した。また，酵素反応ステップを１段省
略することにより，その酵素の失活による再現性不良等
の誤差要因を排除した。従って，実施例２は，迅速，簡
便，安価かつ信頼性の高い臨床検査を行えるという特有
の効果がある。なお，３’末端に対するｄＮＴＰ付加が
起こりにくいとされるＰＣＲ酵素は各種報告されている
が，各種酵素を比較検討した結果，上記のＴｓｐが最も
好適であった。

【００４３】図３は，本発明の実施例２であり，各種ポ
リメラーゼを用いてｐ５３遺伝子のｅｘｏｎ４領域をＰ
ＣＲ増幅した産物について，変性ゲルＰＯＰ４（ＡＢＩ
社製）を充填したキャピラリ電気泳動装置を用いてフラ
グメント長の解析を行った結果の一例である。図３
（ａ）ではＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社製）
を，図３（ｂ）ではＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇｅｎｏｔｙｐ
ｅ Ｔｓｐを，図３（ｃ）ではＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒
造社製）を，図３（ｄ）ではＰｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）をそれぞ
れ，ポリメラーゼとして用いて得られたＰＣＲ産物の電
気泳動パターンの例である。

【００４４】図３（ａ），図３（ｃ）の泳動パターンで
は，ＰＣＲ産物として目的とする１１５ｎｔの断片１６
の他に，それより塩基数の多い断片１７，１８が副産物
として生成している。図３（ｄ）の泳動パターンでは，
ＰＣＲ産物として１１５ｎｔの断片１６より塩基数の短
い断片１９が生成している。図３（ｂ）に示すように，
Ｔｓｐポリメラーゼを使用したＰＣＲ産物の泳動パター
ンでは，目的とする１１５ｎｔの断片１６以外の長さの
副産物が殆ど含まれていない。従って，ＰＣＲ反応でＴ
ｓｐをポリメラーゼとして用いることにより，３’末端
が平滑なＤＮＡ断片が得られＫｌｅｎｏｗ酵素反応を省
略できるという効果がある。

【００４５】〔実施例３〕図４は，本発明の実施例３で
あり，ＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図である。
実施例３の手順は実施例２の手順と類似であるが補正係
数Ｆの算出方法が異なる。

【００４６】（工程Ｉ）：実施例２では，補正係数Ｆは
被験者の健常細胞から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅に
より得られた標的ＤＮＡ断片を標準試料として補正係数
Ｆを求めた。実施例３では必ずしも被験者自身の健常細
胞からではなく，他の個人や他の生物の細胞等から得た
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた標的ＤＮＡ断
片，又は，化学合成によって得られた標的ＤＮＡ断片を
単独もしくは混合して用いた。

【００４７】単独で用いる場合には，試料はヘテロ接合
型の健常細胞から得られたものである必要があるが，混
合して用いる場合はこの限りでなく，ホモ接合型やＬＯ
Ｈの細胞から得られたものや，化学合成品であってもよ
い。勿論，ホモ接合型やＬＯＨの細胞から，又は化学合
成品によって標的ＤＮＡ断片を得た場合には，野生型だ
けでなく変異型の試料も用意し混合することによりヘテ
ロ接合型と類似の組成とする（この場合，下記の理由に
より組成比は，必ずしも厳密に１：１である必要はな
い）。何れにせよ，工程Ｉにより，実施例１，実施例２
の工程Ａに相当するヘテロ接合型類似の組成を有する標
的ＤＮＡ断片を，標準試料ストックとして準備する。

【００４８】（工程Ｊ）：ヘテロ接合型類似の組成を有
する標的ＤＮＡ断片（標準試料ストック）の対立遺伝子
に由来する断片（実施例３では野生型と変異型）の濃度
Ｃ１，Ｃ２を定量する。様々な方法を用いて濃度を定量
できる。実施例３では，野生型と変異型の一次標準試料
（濃度検定済み）をそれぞれ準備し，標準試料ストック
と各一次標準試料を使用して電気泳動装置を用いたＳＳ
ＣＰ法による解析を行ない，野生型と変異型のそれぞれ
に由来する断片に対応する泳動ピークの高さを比較する
ことにより，標準試料ストックの対立遺伝子に由来する
各断片の濃度Ｃ１，Ｃ２を定量した。

【００４９】濃度Ｃ１，Ｃ２決定の他の方法としては，
ＬＯＨが無いことが確認されているヘテロ接合型の一次
標準試料（濃度検定済み，この場合は野生型と変異型の
濃度は同じ）を準備し，そのＳＳＣＰパターンを標準試
料ストックのそれと比較することにより濃度Ｃ１，Ｃ２
を決定する。或いは，野生型，変異型のそれぞれについ
て標的ＤＮＡ断片を準備し，予めＵＶ吸収測定，Ｐｉｃ
ｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社
製）等のインターカレータとの相互作用による蛍光強度
測定等により，それぞれの断片の濃度を求めた後，それ
らを所定の割合で混合することにより濃度Ｃ１，Ｃ２を
決定する。或いは，ヘテロ接合型の健常者を多数集め，
彼らがＬＯＨを有さないことを確認し，彼らから得た標
的ＤＮＡ断片を概ね等量ずつとなるように混合すること
により，概ね１：１に近い濃度比を持つと見做すことの
できる標準試料ストックを準備し，その標的ＤＮＡ断片
の合計濃度Ｃを求め（数３）により濃度Ｃ１，Ｃ２を決
定する方法もある。

【００５０】

【数３】 Ｃ１＝Ｃ２＝Ｃ／２ …（数３） 工程Ｉでの標準試料ストックの由来に関わらず，工程Ｊ
で標準試料ストックの対立遺伝子に由来する断片の濃度
Ｃ１，Ｃ２を決定する。工程Ｉ，工程Ｊにより，対立遺
伝子に由来する濃度既知の断片を含むヘテロ接合型（類
似）の標準試料ストックが得られる。

【００５１】（工程Ｋ）：標準試料ストックの電気泳動
を行ない塩基配列多型性に基づき分離検出を行なう。工
程Ｋは，実施例１，実施例２での工程Ｃと同様であり，
その結果，対立遺伝子に由来する各断片の信号強度Ｓ
１，Ｓ２を得た。異なるのは，用いる試料が標準試料ス
トックである点と，それが確実にヘテロ接合型かもしく
はヘテロ接合型類似の組成であることが判明している
点，その対立遺伝子に由来する各断片の濃度がそれぞれ
Ｃ１，Ｃ２である点である。

【００５２】（工程Ｆ’）：断片１，断片２の信号強度
Ｓ１，Ｓ２と，濃度Ｃ１，Ｃ２とから補正係数Ｆを求め
る。ＤＮＡ断片１，２はそれぞれ，野生型，変異型に対
応する。工程Ｆ’は，実施例１，実施例２での工程Ｆと
類似である。異なるのは断片１，２が被験者の健常細胞
由来でなく，上記の標準試料ストック由来である点，断
片１，断片２の濃度が必ずしも等しくなくその濃度がＣ
１，Ｃ２で与えられるため補正係数Ｆも（数４）に示す
ように濃度を勘案して求める点である。勿論，Ｃ１＝Ｃ
２の完全なヘテロ接合型の場合は，実施例３の工程Ｆ’
により求めた補正係数Ｆは，実施例１，実施例２での工
程Ｆにより求まる補正係数Ｆと一致する。

【００５３】

【数４】 Ｆ＝（Ｓ２／Ｃ２）／（Ｓ１／Ｃ１） …（数４） （工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅ）：実施例３での工程Ａ，工
程Ｃ，工程Ｅは，実施例１，実施例２での工程Ａ，工程
Ｃ，工程Ｅとほぼ同じである。異なるのは実施例３では
工程Ｃで健常細胞から得た断片のＳＳＣＰ法解析での信
号強度は補正係数Ｆの計算には使用せず，ただ単に工程
Ｅでヘテロ接合型であるか否かの判定のみに使用するこ
とである。

【００５４】（工程Ｂ，工程Ｄ，工程Ｇ）：実施例３で
の工程Ｂ，工程Ｄ，工程Ｇは，実施例１，実施例２での
工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅとほぼ同じである。異なるのは
実施例３では工程Ｄで，被検細胞からのＤＮＡ断片の電
気泳動を工程Ｋでの標準試料ストックと一緒に行なう点
である。勿論，実施例１，実施例２と同様，工程Ｃの健
常細胞からのＤＮＡ断片と一緒に電気泳動を行っても良
いが必ずしも必要ではない（上述の通り，健常細胞のデ
ータはヘテロ接合型であることの確認にのみ利用され，
補正係数には反映されないため）。

【００５５】工程Ｃの健常細胞からのＤＮＡ断片と一緒
に電気泳動を行なう場合，工程Ｃの健常細胞からのＤＮ
Ａ断片を，工程Ｋの標準試料ストックや工程Ｄでの被検
細胞からのＤＮＡ断片と区別するため，工程Ａでの健常
細胞からのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅では，工程Ｉ，工程
Ｂで用いた蛍光色素と異なる第３の蛍光色素で標識す
る。

【００５６】（工程Ｇ，工程Ｈ）：実施例３での工程
Ｇ，工程Ｈは，実施例１，実施例２と同様である。唯一
の相違点は，工程Ｇでの被検細胞の対立遺伝子の存在量
の比Ｔを求める際の補正係数Ｆとして，工程Ｆ’の説明
の通り標準試料ストックの測定により求めた値を用いる
点である。実施例３では補正係数Ｆを求める際，被検者
の健常細胞由来のＤＮＡ断片の泳動パターンを用いる代
わりに，標準試料ストックの泳動パターンを用いる。以
下，実施例３の特有の効果を説明する。

【００５７】第１に，健常細胞と想定して用いた被験者
の細胞中の標的領域での対立遺伝子の存在量の比Ｔが万
一１：１からずれ（乖離し）ていたとしても，被検細胞
のＬＯＨが高精度に算定可能となるという効果がある。
この様なことが起こるケースとしては，例えば，健常細
胞として血液中の白血球を用いる場合に，被験者が白血
病に罹患している場合等がある。

【００５８】第２に，工程Ｉ，工程Ｊはユーザではな
く，好ましくは機器メーカ或いは試薬メーカが実行し，
ユーザは濃度既知の標準試料ストックを機器メーカ或い
は試薬メーカから購入して使用することができる。この
場合，分析結果の信頼性向上が可能となるという効果が
ある。更に，被験者に関する事前の検討により，その被
験者が標的領域について本来ヘテロ接合型であることが
確認されている場合は，工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅは省略
できる。この場合，ユーザは標準試料ストックの購入使
用により基準となる試料の調製作業を省略できるため，
ユーザにとって省力化が可能となるという効果もある。

【００５９】第３に，標準試料ストックはヘテロ接合
型，あるいはそれに類似した組成であることが事前に確
認されている。従って，工程Ｋでこの試料をＳＳＣＰ法
により分析した際に２つのピークが検出されない場合
は，分析方法に何らかの問題があること意味し，この情
報を用いて分析方法の品質管理が可能となるという効果
がある。標準試料ストックの組成比と泳動パターンのピ
ーク強度比とを比較して両者が大きく乖離した場合は，
分析条件の大きな変動を意味する場合があるため，分析
方法の品質管理が可能となるとともに，ユーザに注意を
喚起して原因究明と対策を促すこともできるという効果
もある。

【００６０】（実施例４）図５は，本発明の実施例４に
よるＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図である。実
施例４の手順は，実施例３の手順と類似であるが，泳動
パターンの信号強度や濃度の計算の各段階で，対立遺伝
子に由来する断片について独立に計算を行なうのではな
く，対立遺伝子に由来する２つの断片に関する比の値を
用いて計算を行なう点が異なる。具体的には，工程Ｊ’
で，断片１，断片２の濃度をそれぞれＣ１，Ｃ２として
求める代わりに，（数５）により濃度比Ｃ_1,2を求め
る。同様に，工程Ｆ”で，信号強度Ｓ１，Ｓ２の代わり
に，（数６）により信号強度比Ｓ_1,2を求め，Ｆを（数
７）から求める。同様に，工程Ｇ’で被検細胞の断片
１，断片２の信号強度Ｐ１，Ｐ２の代わりに，（数８）
により信号強度比Ｐ_1,2を求め，Ｔを（数９）から求め
る。

【００６１】

【数５】 Ｃ_1,2＝Ｃ２／Ｃ１ …（数５）

【００６２】

【数６】 Ｓ_1,2＝Ｓ２／Ｓ１ …（数６）

【００６３】

【数７】 Ｆ＝Ｓ_1,2／Ｃ_1,2 …（数７）

【００６４】

【数８】 Ｐ_1,2＝Ｐ２／Ｐ１ …（数８）

【００６５】

【数９】 Ｔ＝Ｐ_1,2／Ｆ …（数９） 実施例４の特有の効果は，扱う情報量が約半分で済むた
め，計算機にとっては記憶容量が少なくて済み，ユーザ
にとっては数値入力の手間が省け，また計算の流れがよ
り理解しやすくなることである。

【００６６】（実施例５）実施例５は実施例２と同様で
あるが，工程Ｃ，工程Ｄで分離定量するＤＮＡ断片をｆ
ｏｒｗａｒｄ鎖由来の断片でなく，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖由
来の断片とした点が異なる。手順の変更点としては，電
気泳動開始後約２０分付近の泳動パターンを取得し，健
常細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来のＲＯＸで標識した
断片，被検細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来のＦＡＭで
標識した断片について解析を行った。観測したピークが
ｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片である点を除けば，実施例
２と同様の手順により，実施例２と同等の結果が得られ
た。

【００６７】この時の分析条件は，ＡＢＩ社推奨のＳＳ
ＣＰ条件，即ち，ポリマ濃度３％，温度３０℃であっ
た。この場合，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の対立遺伝子に由来す
る２つの断片のピークの分離Ｒｓ（泳動パターンのピー
ク形状をガウス分布型と仮定した場合，ピーク間隔を，
バンド幅，即ち，４シグマで割った値として定義され
る）は約０．８〜１．０であった。

【００６８】次に，ポリマ濃度について検討を行った。
６％以上の泳動ポリマ調製の際は，予めＧｅｎｅＳｃａ
ｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ溶液（７％）（ＡＢＩ社製）を遠心
濃縮して約１５％に濃縮した溶液に基づき，泳動ポリマ
を調合した。その結果，ポリマ濃度が９％までの範囲で
は濃度上昇とともに分離が直線的に改善することが判明
した。濃度９％でのｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片の分離
は約２．３という高い分離が得られた。

【００６９】１０％以上のポリマ濃度では電気泳動結果
の再現性が低下した。これは，ポリマ溶液の粘性が増
し，キャピラリへのポリマ溶液の充填が均一にできなく
なったためと考えられる。従って，高い分離を得る観点
からはポリマ濃度の最適値は約９％であると考えられ
る。実施例１でのポリマ濃度９％の条件も，以上の検討
から得られた知見に基づいて設定した。

【００７０】次に，電気泳動を行なう温度について検討
した。従来技術−１ではｐ５３ ｅｘｏｎ４の電気泳動
の温度条件として２０℃を採用している。また，一般に
ＳＳＣＰ法では低温の方が高分離の傾向があるとされて
いるため，低温での電気移動を試みた。しかし，キャピ
ラリ電気泳動法を用いる本発明での検討では，温度２０
℃の条件下でも分離は殆ど改善しなかった。逆に，３０
℃より高温の条件での電気泳動について検討したとこ
ろ，驚くべき事に，約４６℃〜４８℃でのｒｅｖｅｒｓ
ｅ鎖由来の断片の分離が特異的に改善する現象が見出さ
れた。

【００７１】図６は，本発明の実施例５であり，ｐ５３
ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片のＳＳＣＰ法
による分離（Ｒｓ）の温度依存性の例を示す図である。
図６は，３０℃から６０℃まで温度変えた場合のｐ５３
ｅｘｏｎ４ ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型と変異型由来
の断片の泳動ピークの分離のポリマ濃度による変化，即
ち，ポリマ濃度３％での分離の温度変化２３（○印），
ポリマ濃度６％での分離の温度変化２４（△印），ポリ
マ濃度９％での分離の温度変化２５（□印）を示す。

【００７２】図６から明らかなように，３０℃から４０
℃の範囲では分離（Ｒｓ）は温度によらずほぼ一定であ
ったが，４０℃から５０℃付近の狭い温度範囲で急峻な
分離（Ｒｓ）の改善が見られた。この範囲での分離（Ｒ
ｓ）の最高値はポリマ濃度３％，６％，９％でそれぞ
れ，約３．３，４．８，６．０であった。これらの値
は，３０℃での値と比較した場合，約３倍高かった。

【００７３】実施例５では，この様な大きい分離（Ｒ
ｓ）を与える特異的な温度である４６℃〜４８℃を電気
泳動条件として採用したため，ピークの分離，定量が容
易となり，測定精度が改善するという効果がある。ま
た，分離（Ｒｓ）はキャピラリ有効長の（１／２）乗に
比例するが，分析（泳動）時間はキャピラリ有効長に比
例するため，温度の最適化により得た３倍の分離（Ｒ
ｓ）の改善を，キャピラリ有効長短縮による分離（Ｒ
ｓ）の低下と相殺した場合，同じ分離（Ｒｓ）をキャピ
ラリ有効長９分の１で，従って，分析（泳動）時間も９
分の１で実現できる。

【００７４】従って，温度の最適化によって得られた３
倍の分離（Ｒｓ）の改善と引き替えに約１桁の高速化が
可能となるという効果もある。同様に，温度の最適化に
より得られた大きい分離（Ｒｓ）を，ポリマ濃度の低下
による分離（Ｒｓ）の低下と相殺すれば，高速化が可能
である。

【００７５】なお，上記のようなＳＳＣＰ法の分離（Ｒ
ｓ）に関する特異温度，特に４６℃〜４８℃という高い
温度での分離（Ｒｓ）の改善の報告は少なく，そのメカ
ニズムも未解明である。そこでそのメカニズムを解析す
るためにＤＮＡ断片の２次構造の計算を，パブリックド
メインのソフトウエア ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｍｏｎａｔｓ
ｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ １２５，１６７−
１８８，１９９４）を使用して行った。計算のアルゴリ
ズムには，分配関数（partition function）とペア確率
（pair probabilities）を併用する計算方法を採用し
た。

【００７６】文献（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１４６０
−１４６５，１９９８）に記載のＤＮＡ用のパラメータ
を，エネルギー計算に使用した。勿論，ＤＮＡ断片の２
次構造計算のためのソフトウエアは他にも幾つか存在
し，他のソフトウエアでも同様の計算が可能である。

【００７７】図７は，本発明の実施例５であり，上記の
特異温度を示したｐ５３ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖
の野生型，変異型のＤＮＡ断片の３０℃と４６℃での二
次構造の計算結果を示す図である。図７では，縮尺の都
合で個々の塩基配列が見にくいため，野生型と変異型と
の唯一の相違点である一塩基多型の位置（ｃｏｄｏｎ７
２）をアロー（←）により，またその塩基の種類をＣ
（野生型）又はＧ（変異型）で示した。図７（ａ）は３
０℃での野生型の２次構造を示し，図７（ｂ）は３０℃
での変異型の２次構造を示す。図７（ａ），図７（ｂ）
に示す２次構造はともに自己会合の多い２次構造を示
し，その構造は一塩基多型の位置の近傍で僅かに異なる
が，全体として良く類似した２次構造であることが理解
される。

【００７８】図７（ｃ）は４６℃での野生型の２次構造
を示し，図７（ｄ）は４６℃での変異型の２次構造を示
す。図７（ｄ）の２次構造は，末端が一部解離している
他は基本的に図７（ｂ）に示す２次構造と相似であっ
た。一方，図７（ｃ）の２次構造は，図７（ａ）の２次
構造と大きく異なり，自己会合構造の多くが解離してお
り一本鎖領域が多いという結果となった。

【００７９】以上の２次構造計算結果は，３０℃，４６
℃で，ＳＳＣＰ法での野生型と変異型の両断片の分離特
性が大きく異なることに対応づけられると考えられる。
即ち，３０℃では野生型と変異型の両断片は自己会合の
多い２次構造を取るが，その構造は互いに類似してい
る。従って，ＳＳＣＰ法による電気泳動を行っても，構
造上大きな差異がないために分離が良くない。４６℃に
昇温すると，野生型と変異型の両断片は互いに共通点が
殆ど無いほど２次構造が異なるため，ＳＳＣＰ法による
電気泳動で高い分離（Ｒｓ）が得られる。

【００８０】４６℃での電気泳動特性は以下のような更
に詳細な考察も可能と考えられる。野生型は自己会合構
造の大部分が解離し，一本鎖部分の割合が多いため，禁
止点が少なく柔軟となる。すると泳動ゲルの間を移動す
る際の動的半径が減少し，換言すると移動度が高くな
る。一方，変異型は４６℃に昇温しても構造変化が少な
いため，移動度の変化も小さい。従って，野生型の泳動
時間が変異型と比較して相対的に短縮し分離が改善する
と考えられる。

【００８１】ＳＳＣＰ法は一塩基多型等の塩基配列変化
により泳動断片の高次構造が変わることが分離のメカニ
ズムであると提唱されてきたが，高次構造と対応づけて
分離特性を解析した例は少ない。特に約４６℃というＳ
ＳＣＰ法としては異例に高い温度での特異的かつ急峻な
分離（Ｒｓ）の改善現象について解析し，分離改善の原
因を高次構造と対応づけて解析するのに成功した例は，
本発明が初めてであると考えられる。従来はＳＳＣＰ法
は分離が得られるか否かは試行錯誤が必要であった。即
ち，あるケースでは分離が得られさもなければ断念する
という勘と経験と運に依存する技法であった。実施例５
の上記した検討により，核酸２次構造とＳＳＣＰ分離と
の関係が理論的に対応付けられる可能性が示された。

【００８２】従って，ＳＳＣＰ法による分離を試みる前
に，予め２次構造を計算により予測し，一塩基多型等を
有する断片同士の分離が期待できるか否か，また最も分
離（Ｒｓ）が良い温度が何度位であるか等の予測を計算
により行ない，その結果を踏まえてＳＳＣＰ法の条件を
最適化するという方法が，実施例５で有効であることが
示された。

【００８３】この方法で最適化可能なＳＳＣＰ法の条件
としては，泳動温度，断片の配列等がある。目的とする
一塩基多型の位置が決まっていても，それを挟むプライ
マーの位置を変更すると，ＰＣＲ増幅する断片の配列を
変えることができ，その場合の分離特性を上記と同様の
手順により予測，最適化することが可能である。当然，
最適化の結果に基づいてプライマーを設計することも実
施例５では有効である。また，プライマーの５’端に任
意の配列を付加し分離改善を図るシミュレーションも可
能である。

【００８４】実施例５の特有の効果は，癌抑制遺伝子と
して注目されているｐ５３遺伝子上の，パピローマウイ
ルスによる子宮頚癌のかかり易さ等との関連が報告され
ているｅｘｏｎ４ｃｏｄｏｎ７２の遺伝子座の一塩基多
型を分離検出する際，従来比３倍以上の極めて高い分離
（Ｒｓ）がＳＳＣＰ法で得られ，理論解析によりその理
由を説明でき，ＳＳＣＰ法の分離をシミュレートできる
ことである。

【００８５】（実施例６）実施例６は実施例２と同様で
あるが，工程Ｂで，尿中の膀胱由来の細胞ではなく，組
織由来の上皮細胞を抹消血中から回収して使用した点が
異なる。

【００８６】血液中からの上皮細胞の選別回収はセルソ
ータを用いる文献（Ｒａｃｉｌａ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，４５８９−４５
９４（１９９８））に記載の方法を採用した。具体的に
は，ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）に対する抗体を結
合した磁性粒子と抹消血とを混合した後，磁石を用いて
Ｂ／Ｆ分離を行ない，磁性粒子に結合した細胞を含む分
画を得た。

【００８７】この分画をフィコエリスリンを結合した抗
サイトケラチン抗体と，ペリディニンクロロフィルでラ
ベルした抗ＣＤ４５抗体とを含む溶液で処理した。磁石
によるＢ／Ｆ分離，精製の後，セルソータにより測定し
た。上記文献に記載されているように，ＣＤ４５抗体の
数が少なく，高い濃度でサイトケラチン抗体が反応した
上皮細胞の分取を行った。この際，分取した細胞の数を
記録した。

【００８８】この様にして抹消血中から上皮細胞を選別
回収した後，実施例２の工程Ｂと同じ手順により，ＤＮ
Ａ抽出と増幅を行った。他の工程については実施例２と
同じ工程を採用して，血液中の上皮細胞由来の核酸のＬ
ＯＨを求めた。

【００８９】上記の文献に記載の通り，ＣＤ４５抗体の
数が少なく，高い濃度でサイトケラチン抗体が反応した
細胞は上皮細胞系の細胞であり，抹消血中に存在する上
皮細胞の多くは癌腫の細胞であるから，セルソータで分
取した細胞の多くは転移性の癌細胞と考えられる。しか
し，抹消血の採取の際の穿針による上皮細胞の混入や，
各種の外傷や炎症等により癌細胞以外の上皮細胞が抹消
血中へ混入する場合もあるため，セルソータで記録され
た上皮細胞の数だけに基づいて癌の診断を行なうと偽陽
性となる場合があり，精度が低いという課題があった。

【００９０】実施例６では，抹消血中の上皮細胞を分取
して計数するだけでなく，その細胞のゲノムＤＮＡのＬ
ＯＨを求めることにより，その細胞が癌細胞由来である
か否かを高精度に評価可能である。従って，実施例６
は，偽陽性の少ない，精度の高い診断材料を提供できる
という特長がある。また，膀胱癌に限らず広く転移性の
癌腫一般を抹消血を用いて検出，診断できるため，適用
範囲が広く，被験者に対する侵襲性も少なく，各種の癌
の早期発見のためのスクリーニング法として有効であ
り，早期治療，生存率の改善に貢献できるという特長が
ある。

【００９１】（実施例７）実施例７は実施例６と同様で
あるが，セルソータによる分取を行わず，免疫法のみに
よる細胞分離を行った点が異なる。具体的には，ＥＰＣ
ＡＭ（上皮細胞接着分子）に対する抗体を結合した磁性
粒子と抹消血とを混合した後，磁石を用いてＢ／Ｆ分離
を行ない，磁性粒子に結合した細胞を含む分画を得た。

【００９２】ＥＰＣＡＭと磁性粒子との結合を切断した
後，磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，非結合分画と抗
サイトケラチン抗体を結合した磁性粒子とを混合し，磁
石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，磁性粒子に結合した細
胞を含む分画を得た。この分画から，実施例２の工程Ｂ
と同じ手順により，ＤＮＡ抽出と増幅を行った。他の工
程については実施例２と同じ工程を採用して，血液中の
上皮細胞由来の核酸のＬＯＨを求めた。

【００９３】実施例７では，免疫反応だけでなくＤＮＡ
のＬＯＨも判断材料とするため，少量の白血球が混入し
ても影響が少ない。従って，簡便な装置，方法で高精度
の診断が可能な判断材料を提供できるという効果があ
る。

【００９４】なお，以上の説明では免疫法による細胞分
離法として磁気免疫法を例にとって説明したが，勿論磁
気を用いない各種の免疫法による細胞分離法も適用可能
である。例えば，抗体を結合した無機又は有機のビーズ
等の担体を用い，遠心分離によりＢ／Ｆ分離を行なう免
疫ビーズ法，抗体を結合した無機又は有機のビーズ状あ
るいは繊維状の担体を充填したカラムによりＢ／Ｆ分離
を行なう免疫クロマトグラフィー法等も適用可能であ
る。なお，上記の説明ではＥＰＣＡＭとサイトケラチン
に対する２種の免疫反応を，両方とも磁気免疫法で行な
うために，途中で磁性粒子との結合を切断するステップ
を採用した。

【００９５】しかし，後段の免疫反応を磁気免疫法以外
の方法，例えば，免疫クロマトグラフィー法で行なう場
合には，この磁性粒子除去のステップは不要であり，直
接第２の抗体を有するカラムによるＢ／Ｆ分離にかけら
れる。カラム内の担体に結合した細胞は，一旦結合を切
断して細胞として回収してから後工程であるＤＮＡ抽出
を行なうことができる。或いは，カラム内に細胞を結合
したまま，細胞を溶解する試薬を加えて核酸を遊離さ
せ，抽出することも可能である。

【００９６】次に，本発明の効果，即ち，高精度なＬＯ
Ｈ判定ができることについて説明する。ここで，本発明
との対比のための対比例の方法について説明する。本発
明との比較を行なうこの対比例の方法は，従来技術−１
の方法の一部の条件を変更した方法である。従来技術−
１と本発明の実施例１は，（１）健常細胞と被検細胞の
標的ＤＮＡ断片を，従来技術−１では同じ蛍光色素で，
本発明では異なる蛍光色素で標識する点，（２）電気泳
動で，従来技術−１ではスラブゲルを，本発明ではキャ
ピラリを用いる点，（３）健常細胞と被検細胞の標的Ｄ
ＮＡ断片を，従来技術−１では別の泳動路で，本発明で
は同じキャピラリで泳動する点で基本的に異なる。

【００９７】対比例の方法では，健常細胞と被検細胞の
標的ＤＮＡ断片を，従来技術−１と同様に同じ蛍光色素
で標識し，健常細胞の標的ＤＮＡ断片，被検細胞の標的
ＤＮＡ断片を，一本キャピラリを用いて電気泳動する。
健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片は同じ蛍光色素で
標識されているので，電気泳動は２回行なうことにな
る。対比例の方法は，従来技術−１の方法を１本キャピ
ラリを用いる電気泳動に適用した方法である。

【００９８】図８は，本発明の実施例１の手順と比較例
の手順によるＬＯＨ判定の精度比較例の結果を示す図で
ある。図８は，４種類の異なる試料（実験番号１，２，
３，４）に関して，繰り返して実験を行って得たＬＯＨ
判定の結果を示す。また，実施例１の手順による，生デ
ータ（測定データ）Ｓ１，Ｓ２，Ｐ１，Ｐ２と，解析結
果としてＬＯＨの値（Ｔの１からのずれ（乖離）の割合
を％表示）を示す。

【００９９】図８では，実施例１の手順による測定デー
タＳ１，Ｓ２，Ｐ１，Ｐ２をそのまま使用して，健常細
胞からの標的ＤＮＡ断片のデータＳ１，Ｓ２として，各
実験番号でのｎ（ｎ＝１，２，…）回目の測定データ
を，被検細胞からの標的ＤＮＡ断片のデータＰ１，Ｐ２
として，各実験番号での（ｎ＋１）回目の測定データを
それぞれ使用して解析することにより，比較例をシミュ
レートした。図８の最右欄は比較例の手順によるＬＯＨ
の値を示す。

【０１００】本発明では，実験番号１から実験番号４の
試料の何れついても，ＬＯＨの値が全て±１０％以内と
なり，被検細胞にＬＯＨなし（異常なし）と判断され
た。使用した試料は健常細胞，被検細胞ともに健常者の
正常細胞であったためこの判断結果は全て正しい。一
方，比較例では，殆どの実験番号の試料について同様の
結果が得られたが，実験番号２の試料の１回目の測定，
実験番号３の試料の２回目の測定では，ＬＯＨの値が−
１０．７％，＋１３．８％となり，±１０％の範囲を超
えたため，被検細胞にＬＯＨあり（異常あり）と誤った
結果となった。

【０１０１】実験番号３の試料に関しては平均しても±
１０％の範囲を超えている。図８に示すように，対比例
では，実験番号１から実験番号４の試料のうち，半分の
試料で誤った結果となった。

【０１０２】以上の結果は，シングルキャピラリ装置を
使用した場合の比較結果であるが，キャピラリを複数有
するマルチキャピラリ装置を使用した場合にも，同様に
高精度なＬＯＨ判定ができる。本発明をマルチキャピラ
リに適用する場合，異なる蛍光色素で標識された，健常
細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を混合して試料毎に異
なるキャピラリに注入して，複数の試料に関する断片を
各キャピラリで同時に泳動分離する。これに対する対比
例として，全ての標的ＤＮＡ断片を同じ蛍光色素で標識
し，あるキャピラリに健常細胞の標的ＤＮＡ断片を注入
し，別のキャピラリに被検細胞の標的ＤＮＡ断片を注入
し，各試料についてそれぞれ２本のキャピラリを使用し
て，複数の試料に関する断片を各キャピラリで同時に泳
動分離する方法が考えられる。

【０１０３】この対比例の方法では，本発明の方法と同
様に経時的な測定条件の変動の影響は被らない。しか
し，この比較例では，キャピラリ毎の微妙な条件の差が
測定結果に影響を及ぼすが，本発明の方法では，同一の
キャピラリで健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を同
一のキャピラリで泳動分離するので，キャピラリ間での
条件の差の影響は受けず，本発明の方法の方が比較例，
従来技術−１よりも高精度であることが理解できる。

【０１０４】以上の比較から明らかなように，本発明の
実施例１は対比例と比較してＬＯＨを高精度に判定可能
であり，高精度の診断に好適なデータを提供できるとい
う効果がある。また，本発明の他の実施例も同様であ
る。

【０１０５】

【発明の効果】本発明によれば，泳動ピークの信号が電
気泳動条件等により変動しても，ＬＯＨを高精度に判定
可能であり，信頼性の高いデータを診断のために提供で
きるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１であり，ＬＯＨ判定の手順の
概略を示すフロー図。

【図２】本発明の実施例１であり，ＳＳＣＰ法による電
気泳動パターンの例を示す図。

【図３】本発明の実施例２であり，各種のポリメラーゼ
を用いたＰＣＲ産物の断片長の解析例を示す図。

【図４】本発明の実施例３であり，ＬＯＨ判定の手順の
概略を示すフロー図。

【図５】本発明の実施例４であり，ＬＯＨ判定の手順の
概略を示すフロー図。

【図６】本発明の実施例５であり，ｐ５３ｅｘｏｎ４の
ｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片のＳＳＣＰ法による分離の
温度依存性の例を示す図。

【図７】本発明の実施例５であり，ｐ５３ｅｘｏｎ４の
ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型，変異型のＤＮＡ断片の３０
℃と４６℃での二次構造の計算結果を示す図。

【図８】本発明の実施例１の手順と比較例の手順による
ＬＯＨ判定の比較結果例を示す図。

【符号の説明】

１…野生型対応するＤＮＡ断片，２…変異型に対応する
ＤＮＡ断片，３…工程Ｅ，４…情報なし，５…工程Ｆ，
５’…工程Ｆ’，５”…工程Ｆ”，６…工程Ｂ，７…工
程Ｄ，８…工程Ｇ，８’…工程Ｇ’，９…工程Ｈ，１０
…ＬＯＨなし（正常），１１…ＬＯＨあり（異常），１
２…健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖
の野生型のＦＡＭ標識された断片に対応する泳動ピー
ク，１３…健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａ
ｒｄ鎖の変異型のＦＡＭ標識された断片に対応する泳動
ピーク，１４…被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒ
ｗａｒｄ鎖の野生型のＲＯＸ標識された断片に対応する
泳動ピーク，１５…被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆ
ｏｒｗａｒｄ鎖の変異型のＲＯＸ標識された断片に対応
する泳動ピーク，１６…目的とする１１５ｎｔの断片，
１７…１１５ｎｔより１塩基長い断片，１８…１１５ｎ
ｔより１塩基以上長い断片，１９…１１５ｎｔより短い
断片，２０…工程Ｉ，２１…工程Ｊ，２１’…工程
Ｊ’，２２…工程Ｋ，２３…ポリマ濃度３％での分離の
温度変化，２４…ポリマ濃度６％での分離の温度変化，
２５…ポリマ濃度９％での分離の温度変化，１００…工
程Ａ，２００…工程Ｃ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 入江 隆史 東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA14 4B063 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR62 QS03 QS25 QS34 QX02

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キャピラリ電気泳動を用いるＳＳＣＰ法に
   よる遺伝子多型解析方法に於いて，分析対象とする分析
   対象ＤＮＡ断片と該分析対象ＤＮＡ断片の比較基準とす
   るヘテロ接合型の基準ＤＮＡ断片とがそれぞれ異なる蛍
   光色素で標識されており，前記分析対象ＤＮＡ断片と前
   記基準ＤＮＡ断片とを同一のキャピラリで同時に電気泳
   動分離し，得られた泳動パターンに出現する２つの前記
   基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度を用いて，前記泳動
   パターンに出現する前記分析対象ＤＮＡ断片のピークの
   信号強度を補正して，前記分析対象ＤＮＡ断片のヘテロ
   接合性の消失の有無を判定することを特徴とする遺伝子
   多型解析方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の遺伝子多型解析方法に於
   いて，前記２つの前記基準ＤＮＡ断片のピークの信号強
   度比を用いて，前記泳動パターンに出現する前記分析対
   象ＤＮＡ断片のピークの信号強度を補正することを特徴
   とする遺伝子多型解析方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載の遺伝子多型解析方法に於
   いて，前記基準ＤＮＡ断片が被験者の健常細胞由来のゲ
   ノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物であり，前記分析対
   象ＤＮＡ断片が前記被験者の被検細胞由来のゲノムＤＮ
   Ａを鋳型とするＰＣＲ産物であることを特徴とする遺伝
   子多型解析方法。
4. 【請求項４】請求項１に記載の遺伝子多型解析方法に於
   いて，前記基準ＤＮＡ断片がヘテロ接合型の健常者の健
   常細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物であ
   り，前記分析対象ＤＮＡ断片が被験者の被検細胞由来の
   ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物であることを特徴
   とする遺伝子多型解析方法。
5. 【請求項５】請求項１に記載の遺伝子多型解析方法に於
   いて，前記分析対象ＤＮＡ断片が，血液中から回収した
   上皮細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物で
   あることを特徴とする遺伝子多型解析方法。
6. 【請求項６】請求項３から請求項５の何れかに記載の遺
   伝子多型解析方法に於いて，Ｔｓｐポリメラーゼを用い
   てＰＣＲ反応を行なうことを特徴とする遺伝子多型解析
   方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載の遺伝子多型解析方法に於
   いて，前記分析対象ＤＮＡ断片，前記基準ＤＮＡ断片が
   ｐ５３遺伝子のｅｘｏｎ４に於けるｃｏｄｏｎ７２の一
   塩基多型サイトを含み，前記分析対象ＤＮＡ断片，前記
   基準ＤＮＡ断片のｒｅｖｅｒｓｅ鎖について，４４℃な
   いし４８℃の温度範囲で電気泳動を行なうことを特徴と
   する遺伝子多型解析方法。