JP2016176764A

JP2016176764A - キャピラリー電気泳動装置及びキャピラリー電気泳動による試料分析方法

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Publication number: JP2016176764A
Application number: JP2015056059A
Authority: JP
Inventors: 加地　徹; Toru Kaji; 徹加地
Original assignee: Shimadzu Corp
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Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2016-10-06
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: JP6350349B2

Abstract

【課題】エレクトロカイネティック法によってキャピラリー流路に試料が導入された場合であっても測定対象成分の定量性を向上させる。【解決手段】第１色素で標識された測定対象成分及びマーカー成分と、第２色素で標識され、かつ濃度が既知の測定対象リファレンスと、第２色素で標識され、かつマーカー成分との濃度比が既知のマーカーリファレンスと、を含む試料を用いる。例えばエレクトロカイネティック法によりキャピラリー流路に試料を導入する。電気泳動により各成分を泳動させて検出する。マーカー成分とマーカーリファレンスとの濃度比とマーカー成分及びマーカーリファレンスの検出信号とによって得られる第１色素と第２色素の検出信号強度比と、測定対象成分及び測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて測定対象成分の濃度を算出する。【選択図】図１

Description

本発明は、キャピラリー流路に試料を導入した後、キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて成分を検出するキャピラリー電気泳動装置及びキャピラリー電気泳動による試料分析方法に関するものである。

極微量のタンパクや核酸などを分析する方法として電気泳動による分析方法が知られている。その代表的なものとしてキャピラリー電気泳動がある。電気泳動によって分析用のキャピラリー流路にサンプルを導入する方法として、エレクトロカイネティック法とクロスインジェクション法が知られている（例えば特許文献１を参照。）。

エレクトロカイネティック法では、分析用のキャピラリー流路の一端にサンプルが直接導入される。また、エレクトロカイネティック法では、濃度を知りたい測定対象の成分、例えば測定対象フラグメントとは異なる位置にマーカーが設定される。

クロスインジェクション法では、サンプルは、分析用のキャピラリー流路に交差されたサンプル導入用のローディング流路に導入され、ローディング流路から分析用のキャピラリー流路に導入される。

キャピラリー電気泳動による分析方法において、サンプルに含まれるフラグメントの濃度は検出信号強度に反映される。
図９に示されるように、クロスインジェクション法（実線を参照。）では、サンプルに含まれる各フラグメントの濃度比は信号強度に反映される。また、エレクトロカイネティック法（点線を参照。）では、キャピラリー流路に導入される各フラグメントの濃度はインジェクション条件によって異なり、各フラグメントの濃度比は均一にならず、定量精度が低下する。そこで、キャピラリー電気泳動で濃度を定量する場合、濃度比が均一となるクロスインジェクション法が用いられるのが一般的である。

特開２００２−３１０８５８号公報

クロスインジェクション法では、キャピラリー流路内への分離媒体の充填が複雑になるという問題があった。また、ローディング流路にサンプルを満たす必要があるための、スループットが悪くなるという問題があった。また、クロスインジェクション法は流路構成が複雑となるため、複数のキャピラリー流路で同時に分析を行うマルチ流路に適さない。

例えばシステムをシンプルにするためにエレクトロカイネティック法を用いた場合、同じ濃度のフラグメントであっても各フラグメントのインジェクション量が泳動条件により異なるため、定量性が犠牲となるという問題があった。

本発明の目的とするところは、エレクトロカイネティック法によってキャピラリー流路に試料が導入された場合であっても測定対象成分の定量性を向上させることである。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置の一態様は、キャピラリー流路に試料を導入した後、上記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動装置であって、上記試料として、第１色素で標識された測定対象成分と、上記第１色素とは異なる第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、上記第１色素で標識され、かつ上記測定対象成分とは異なる電気泳動移動度をもつマーカー成分と、上記第２色素で標識され、かつ上記マーカー成分との濃度比が既知のマーカーリファレンスと、を含むものが用いられるときに、上記測定対象成分、上記測定対象リファレンス、上記マーカー成分及び上記マーカーリファレンスをそれぞれ検出する検出器と、上記マーカー成分と上記マーカーリファレンスとの濃度比と上記マーカー成分の検出信号と上記マーカーリファレンスの検出信号とによって得られる上記第１色素と上記第２色素の検出信号強度比と、上記測定対象成分の検出信号と上記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、上記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて上記測定対象成分の濃度を算出する算出部と、を備えたものである。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置の他の態様は、キャピラリー流路に試料を導入した後、上記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動装置であって、上記試料として、第１色素で標識された測定対象成分と、上記第１色素とは異なる色素でありかつ同濃度の上記第１色素との検出信号強度比が既知の第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、を含むものが用いられるときに、上記測定対象成分及び上記測定対象リファレンスをそれぞれ検出する検出部と、上記第１色素と上記第２色素の既知検出信号強度比と、上記測定対象成分の検出信号と上記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、上記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて上記測定対象成分の濃度を算出する算出部と、を備えたものである。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動による試料分析方法の一局面は、キャピラリー流路に試料を導入した後、上記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動による試料分析方法であって、上記試料として、第１色素で標識された測定対象成分と、上記第１色素とは異なる第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、上記第１色素で標識され、かつ上記測定対象成分とは異なる電気泳動移動度をもつマーカー成分と、上記第２色素で標識され、かつ上記マーカー成分との濃度比が既知のマーカーリファレンスと、を含むものを用い、上記測定対象成分、上記測定対象リファレンス、上記マーカー成分及び上記マーカーリファレンスをそれぞれ検出するステップと、上記マーカー成分と上記マーカーリファレンスとの濃度比と上記マーカー成分の検出信号と上記マーカーリファレンスの検出信号によって得られる上記第１色素と上記第２色素の検出信号強度比と、上記測定対象成分の検出信号と上記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、上記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて上記測定対象成分の濃度を算出するステップと、を含む。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動による試料分析方法の他の局面は、キャピラリー流路に試料を導入した後、上記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動による試料分析方法であって、上記試料として、第１色素で標識された測定対象成分と、上記第１色素とは異なる色素でありかつ同濃度の上記第１色素との検出信号強度比が既知の第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、を含むものを用い、上記測定対象成分及び上記測定対象リファレンスをそれぞれ検出するステップと、上記第１色素と上記第２色素の既知検出信号強度比と、上記測定対象成分の検出信号と上記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、上記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて上記測定対象成分の濃度を算出するステップと、を含む。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置及びキャピラリー電気泳動による試料分析方法は、エレクトロカイネティック法によってキャピラリー流路に試料が導入された場合であっても測定対象成分の定量性を向上させることができる。

キャピラリー電気泳動による試料分析方法の一実施形態を説明するためのフローチャートである。キャピラリー電気泳動装置の一実施形態の構成例を説明するための概略的な構成図である。同キャピラリー電気泳動装置の検出器の光学系の一構成例を説明するための概略的な構成図である。同キャピラリー電気泳動装置の制御部の濃度算出機能の一構成例を説明するための概略的な構成図である。試料分析方法の一実施形態における検出信号の一例を示した図である。キャピラリー電気泳動による試料分析方法の他の実施形態を説明するためのフローチャートである。同試料分析方法の実施形態における検出信号の一例を示した図である。キャピラリー電気泳動装置の他の実施形態の構成例を説明するための概略的な構成図である。試料がクロスインジェクション法とエレクトロカイネティック法で導入されたときの検出信号の違いを説明するための図である。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置において、例えば、上記算出部は、上記検出信号の強度としてピークの面積もしくはピークの高さ又はその両方を用いる。
本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動による試料分析方法において、例えば、上記検出信号の強度は、ピークの面積もしくはピークの高さ又はその両方である。
ただし、上記検出信号の強度はピークの面積やピーク高さに限定されない。

本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置及びキャピラリー電気泳動による試料分析方法では、少なくとも２種類の色素を検出できる検出器が用いられる。
図２は、キャピラリー電気泳動装置の一実施形態の構成例を説明するための概略的な構成図である。

例えば溶融石英キャピラリーからなるキャピラリー流路２が配置されている。電気泳動時には、キャピラリー流路２の一端は泳動バッファ液４ａに浸され、他端は泳動バッファ液６ａに浸される（実線を参照。）。泳動バッファ液４ａはバッファ液容器４に収容されている。泳動バッファ液６ａはバッファ液容器６に収容されている。電源装置８から泳動バッファ液４ａ，６ａを介してキャピラリー流路２の両端間に泳動電圧が印加される。電源装置８はキャピラリー流路２を流れる電流を検知する電流計を備えている。

電気泳動に先立ちキャピラリー流路２の一端に試料を注入するために、オートサンプラー１０が設けられている。オートサンプラー１０は複数の試料容器１２をサンプルプレートに保持している。試料の分析時に、オートサンプラー１０は分析しようとする試料を収容した試料容器１２を試料注入位置に移動させる。試料注入時には、キャピラリー流路２の一端と電極が試料容器１２の試料に浸される（波線を参照。）。電源装置８によって試料容器１２と泳動バッファ液６ａの間に試料注入用の電圧が印加される。このようにして、キャピラリー流路２の一端に試料が注入される。

キャピラリー流路２は恒温槽１４に収容されて一定温度に保たれる。
キャピラリー流路２の他端側の検出位置に検出器１６（検出部）が配置されている。検出器１６は少なくとも２種類の色素を検出できるものである。検出器１６は例えばレーザ励起蛍光検出器である。

制御部１８が設けられている。制御部１８は、オートサンプラー１０の動作、電源装置８による試料注入電圧の印加、電源装置８による泳動電圧の印加などの制御を行う。また、制御部１８は、検出器１６の検出信号を取り込んでデータ処理し、電気泳動により分離された試料成分の同定と定量の動作を行う。

制御部１８に分析情報などを入力するための入力部２０が設けられている。入力部２０は例えばＣＰＵに接続されたキーボードやタッチパネルなどの入力機器である。
例えば分析情報や制御部１８によって計算された測定対象フラグメント（測定対象成分）の濃度などを表示する表示部２２が設けられている。表示部２２は例えばモニタやデジタル表示器などの表示機器である。

図３は、このキャピラリー電気泳動装置の検出器の光学系の一構成例を説明するための概略的な構成図である。
励起光の光源は例えばレーザである。励起光のレーザビームの光路上にショートパスフィルター１６ａとダイクロイックミラー１６ｂがその順に配置されている。ダイクロイックミラー１６ｂの反射光路上にレンズ１６ｃが配置されている。レンズ１６ｃの透過光はキャピラリー流路２に集光される。

キャピラリー流路２からの反射光路上にレンズ１６ｃ、ダイクロイックミラー１６ｂを介して高周波カットフィルター１６ｄとダイクロイックミラー１６ｅが配置されている。ダイクロイックミラー１６ｅの透過光を受光する位置に光検出器１６ｆが配置されている。

ダイクロイックミラー１６ｅの反射光路上にダイクロイックミラー１６ｇが配置されている。ダイクロイックミラー１６ｇの透過光を受光する位置に光検出器１６ｈが配置されている。

ダイクロイックミラー１６ｇの反射光路上にダイクロイックミラー１６ｉが配置されている。ダイクロイックミラー１６ｉの透過光を受光する位置に光検出器１６ｊが配置されている。ダイクロイックミラー１６ｉの反射光を受光する位置に光検出器１６ｋが配置されている。

励起光源、電気泳動されるサンプルの標識色素、各光学素子の光学特性の一例を説明する。
励起光源としてアルゴンレーザを使用してその４８８ｎｍのレーザ光を励起光とする。標識色素として、ｄＲ１１０（発生する蛍光波長は５３０−５３５ｎｍ）、ｄＲ６Ｇ（発生する蛍光波長は５６０−５６５ｎｍ）、ｄＴＡＭＵＲＡ（発生する蛍光波長は５９０−５９５ｎｍ）及びｄＲＯＸ（発生する蛍光波長は６１５−６２０ｎｍ）の４種類の蛍光色素のうち少なくとも２種類を使用する。

ショートパスフィルター１６ａとして７５０ｎｍよりも短波長側の光を透過させるものを使用する。

ダイクロイックミラー１６ｂとして５２５ｎｍよりも長波長側の光を透過させ、それより短波長側の光を反射させるように調整されたものを使用する。ダイクロイックミラー１６ｂは４８８ｎｍの励起光を反射させ、使用されている標識色素からの蛍光を透過させる。

高周波カットフィルター１６ｄとして５２５ｎｍよりも短波長側の光を遮蔽し、それより長波長側の光を透過させるものを使用する。高周波カットフィルター１６ｄは励起光成分を遮蔽し、蛍光を透過させる。

ダイクロイックミラー１６ｅとして６００ｎｍよりも長波長側の光を透過させ、それより短波長側の光を反射させるように調整されたものを使用する。ダイクロイックミラー１６ｅを透過して光検出器１６ｆで検出される蛍光はｄＲＯＸから発生した蛍光（６１５−６２０ｎｍ）のみとなる。

ダイクロイックミラー１６ｇとして５７５ｎｍよりも長波長側の光を透過させ、それより短波長側の光を反射させるように調整されたものを使用する。ダイクロイックミラー１６ｇを透過して光検出器１６ｈで検出される蛍光は５７５−６００ｎｍの範囲のものであるので、ｄＴＡＭＵＲＡから発生した蛍光（５９０−５９５ｎｍ）のみとなる。

ダイクロイックミラー１６ｉとして５４５ｎｍよりも長波長側の光を透過させ、それより短波長側の光を反射させるように調整されたものを使用する。ダイクロイックミラー１６ｉを透過して光検出器１６ｊで検出される蛍光は５４５−５７５ｎｍの範囲のものであるので、ｄＲ６Ｇから発生した蛍光（５６０−５６５ｎｍ）のみとなる。

ダイクロイックミラー１６ｉで反射されて光検出器１６ｋで検出される蛍光は５４５ｎｍより短波長のものであるので、ｄＲ１１０から発生した蛍光（５３０−５３５ｎｍ）のみとなる。

励起光源からの励起光は、ショートパスフィルター１６ａを透過してダイクロイックミラー１６ｂで反射され、レンズ１６ｃを介してキャピラリー流路２に照射される。キャピラリー流路２で発生した蛍光は、レンズ１６ｃを介してダイクロイックミラー１６ｂへ戻され、ダイクロイックミラー１６ｂを透過し、高周波カットフィルター１６ｄで励起光成分が除去される。

高周波カットフィルター１６ｄを透過した蛍光は、ダイクロイックミラー１６ｅ，１６ｇ，１６ｉによって４種類の標識色素からの蛍光に分離されてそれぞれの光検出器１６ｆ，１６ｈ，１６ｊ，１６ｋにより検出される。光検出器１６ｆ，１６ｈ，１６ｊ，１６ｋは例えば光電子増倍管である。

図４は、このキャピラリー電気泳動装置の制御部の濃度算出機能の一構成例を説明するための概略的なブロック図である。

制御部１８は、例えば、装置本体に設けられたキャピラリー電気泳動装置専用のＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＥＰＲＯＭ（Erasable Programmable ROM）などを含むマイクロコンピュータを中心に構成されている。

制御部１８は、キャピラリー電気泳動装置専用のＣＰＵ等以外の、例えばこのキャピラリー電気泳動装置の外部のワークステーションやパーソナルコンピュータにより実現することもできる。また、制御部１８は、複数のＣＰＵ、複数のワークステーション、複数のパーソナルコンピュータ、又はこれらの組み合わせなどにより構成されていてもよい。

制御部１８の構成は、例えばマイクロコンピュータに搭載されたプログラムにより実行される機能とＥＰＲＯＭに保持されたデータである。ＥＰＲＯＭに替えて電気的に消去可能なＥＥＰＲＯＭ（Electrically Erasable Programmable ROM）やフラッシュメモリなどを使用することもできる。

制御部１８は、データ保持部２４と算出部２６を含んでいる。
データ保持部２４は試料情報を保持している。試料情報には、濃度が既知のフラグメントである測定対象リファレンスの濃度情報が含まれている。また、試料情報には、例えば、マーカーフラグメント（マーカー成分）とマーカーリファレンスの濃度比や、測定対象フラグメント、測定対象リファレンス、マーカーフラグメント、マーカーリファレンスに標識された色素情報も含まれている。なお、データ保持部２４は、試料情報以外の必要な分析情報も保持している。

データ保持部２４は、例えばＥＰＲＯＭで構成されている。なお、データ保持部２４はマイクロコンピュータ外部の記憶媒体に記憶されていてもよい。この記憶媒体は、適切なカラム流量とキャリアガス流量の関係を示すデータを保持できるものであればよく、例えば、ＨＤＤ（Hard disk drive）、ＳＳＤ（solid state drive）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、不揮発性メモリカードなどである。

算出部２６は、検出器１６からの検出信号とデータ保持部２４に保持されている測定対象リファレンスの濃度情報に基づいて測定対象フラグメントの濃度を算出する。算出部２６による測定対象フラグメントの濃度の算出は、例えばＣＰＵのプログラムにより実現される。具体的な算出処理は後述される。

入力部２０は、測定対象リファレンスの濃度情報や、測定対象フラグメント、測定対象リファレンス、マーカーフラグメント、マーカーリファレンスに標識された色素情報などの分析情報を入力するためのものである。例えば、入力部２０から入力された分析情報は算出部２６によって表示部２２に表示される。なお、入力部２０は、上記分析情報以外の情報を入力することも可能である。

図１は、キャピラリー電気泳動による試料分析方法の一実施形態を説明するためのフローチャートである。

試料として、測定対象フラグメントと、測定対象リファレンスと、２つのマーカーフラグメントと、マーカーリファレンスと、を含むものを調製する（ステップＳ１）。

測定対象フラグメントは、濃度測定の対象であり、かつ第１色素で標識されている。また、測定対象リファレンスは、第１色素とは異なる第２色素で標識され、かつ濃度が既知のフラグメントである。例えば、測定対象フラグメントと測定対象リファレンスは、標識を除いて同じフラグメントである。

なお、測定対象フラグメントと測定対象リファレンスは互いに異なるフラグメントであってもよい。測定対象フラグメントと測定対象リファレンスは、それらの検出信号が測定対象フラグメントの濃度算出の際に比較されるため、検出される泳動時間位置が互いに近傍になるものであることが好ましい。さらに、測定対象フラグメントの電気泳動移動度と測定対象リファレンスの電気泳動移動度が同程度であることが好ましい。

２つのマーカーフラグメントは、ともに第１色素で標識され、互いに電気泳動移動度が異なり、かつ測定対象フラグメントとは異なる電気泳動移動度をもつものである。また、マーカーリファレンスは、第２色素で標識され、かつ一方のマーカーフラグメントとの濃度比が既知のものである。例えば、一方のマーカーフラグメントとマーカーリファレンスは、標識を除いて同じフラグメントであり、かつ濃度が同じである。

なお、一方のマーカーフラグメントとマーカーリファレンスは、互いに異なるフラグメントであってもよい。ここで、一方のマーカーフラグメントとマーカーリファレンスは、それらの検出信号が測定対象フラグメントの濃度算出の際に比較されるため、検出される泳動時間位置が互いに近傍になるものであることが好ましい。さらに、一方のマーカーフラグメントの電気泳動移動度とマーカーリファレンスの電気泳動移動度は同程度であることが好ましい。

また、一方のマーカーフラグメントとマーカーリファレンスは、濃度比が既知であれば互いに濃度が異なっていてもよい。

第１色素と第２色素は互いに異なるものである。第１色素と第２色素は、例えば、上記のｄＲ１１０、ｄＲ６Ｇ、ｄＴＡＭＵＲＡ及びｄＲＯＸのうちのいずれかである。

入力部２０から試料情報を入力してデータ保持部２４に保持する。また、試料を試料容器１２に収容してオートサンプラー１０に配置する（ステップＳ２）。

制御部１８の制御によって電源装置８及びオートサンプラー１０を動作させて、エレクトロカイネティック法により試料をキャピラリー流路２の一端に導入する（ステップＳ３）。

キャピラリー流路２の一端が泳動バッファ液４ａに浸された後、制御部１８の制御によって電源装置８を動作させて試料に含まれる成分をキャピラリー流路２内で電気泳動させる。検出位置まで泳動された試料成分を検出器１６によって検出する（ステップＳ４）。検出器１６の検出信号は制御部１８の算出部２６に送られる。

図５は、この試料分析方法の実施形態における検出信号の一例を示した図である。縦軸は検出信号強度を示す。横軸は泳動時間を示す。

第１色素系列（実線）において、一方のマーカーの検出信号ＭＡ、測定対象フラグメントの検出信号Ｓ、他方のマーカーの検出信号ＭＢがそれぞれ現れている。第２色素系列（波線）において、測定対象リファレンスの検出信号ＳＲ、マーカーリファレンスの検出信号ＭＡＲが現れている。

例えば、測定対象フラグメントと測定対象リファレンスは標識を除いて同じフラグメントなので、それらの電気泳動移動度は同程度である。この場合、測定対象フラグメントの検出信号Ｓと測定対象リファレンスの検出信号ＳＲはほぼ同じ泳動時間位置に現れる。

また、例えば、一方のマーカーフラグメントとマーカーリファレンスは標識を除いて同じフラグメントなので、それらの電気泳動移動度は同程度である。この場合、マーカーフラグメントの検出信号ＭＡとマーカーリファレンスの検出信号ＭＡＲはほぼ同じ泳動時間位置に現れる。両端のマーカーフラグメントの検出信号ＭＡ，ＭＢは移動度の補正に使用するものである。

算出部２６は、マーカーフラグメントとマーカーリファレンスとの濃度比とマーカーフラグメントの検出信号とマーカーリファレンスの検出信号とによって得られる第１色素と第２色素の検出信号強度比と、測定対象フラグメントの検出信号と測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて測定対象フラグメントの濃度を算出する（ステップＳ５）。

例えば、測定対象フラグメントの濃度Ｃ_Sは次の式（１）で算出され得る。
Ｃ_S ＝｛（Ｓ_S×Ｓ_MAR）／（Ｓ_SR×Ｓ_MA）｝×Ｃ_SR …（１）
上記式（１）において、Ｓ_Sは測定対象フラグメントの検出信号Ｓの面積である。Ｓ_SRは測定対象リファレンスの検出信号ＳＲの面積である。Ｓ_MAはマーカーフラグメントの検出信号ＭＡの面積である。Ｓ_MARはマーカーリファレンスの検出信号ＭＡＲの面積である。Ｃ_SRは測定対象リファレンスの既知濃度である。

ここで、検出信号ＭＡで検出されたマーカーフラグメントと、検出信号ＭＡＲで検出されたマーカーリファレンスは例えば濃度が同じである。したがって、上記式（１）において、（Ｓ_MAR／Ｓ_MA）は第１色素と第２色素の検出信号強度比を表す。なお、マーカーフラグメントとマーカーリファレンスについて、濃度は互いに異なっているが濃度比が既知である場合は、検出信号強度比（Ｓ_MAR／Ｓ_MA）に濃度比を積算又は除算することによって第１色素と第２色素の検出信号強度比が得られる。

このように、このキャピラリー電気泳動による試料分析方法の実施形態は、エレクトロカイネティック法によってキャピラリー流路２に試料が導入された場合であっても測定対象フラグメントの定量性を向上させることができる。

また、同濃度の第１色素と第２色素を検出したときの検出信号強度比が予めわかっている場合は、試料にマーカーリファレンスを混入しなくても測定対象フラグメントの濃度を算出できる。この実施形態を説明する。

図６は、キャピラリー電気泳動による試料分析方法の他の実施形態を説明するためのフローチャートである。

試料として、測定対象フラグメントと、測定対象リファレンスと、２つのマーカーフラグメントと、を含むものを調製する（ステップＳ１１）。これらのフラグメントは、例えば図１を参照して説明した実施形態におけるフラグメントと同じである。ただし、各フラグメントに標識される第１色素又は第２色素について、第１色素と第２色素が同濃度である場合の第１色素の検出信号と第２色素の検出信号の検出信号強度比は既知である。

入力部２０から試料情報を入力してデータ保持部２４に保持する。このとき、試料情報の一部として、第１色素の検出信号と第２色素の検出信号の検出信号強度比も入力及び保持される。また、試料を試料容器１２に収容してオートサンプラー１０に配置する（ステップＳ１２）。

図１を参照して説明した上記ステップＳ３と同様にして、エレクトロカイネティック法により試料をキャピラリー流路２の一端に導入する（ステップＳ１３）。図１を参照して説明した上記ステップＳ４と同様にして、試料に含まれる成分をキャピラリー流路２内で電気泳動させて検出器１６によって検出する（ステップＳ１４）。検出器１６の検出信号は制御部１８の算出部２６に送られる。

図７は、この試料分析方法の実施形態における検出信号の一例を示した図である。縦軸は検出信号強度を示す。横軸は泳動時間を示す。

図７において、図５についての説明と同様に、第１色素系列（実線）において一方のマーカーの検出信号ＭＡ、測定対象フラグメントの検出信号Ｓ、他方のマーカーの検出信号ＭＢがそれぞれ現れている。また、第２色素系列（波線）において測定対象リファレンスの検出信号ＳＲが現れている。ただし、この実施形態における試料には混入されていないマーカーリファレンスの検出信号は現れていない。

算出部２６は、第１色素と第２色素の既知検出信号強度比と、測定対象フラグメントの検出信号と測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて測定対象フラグメントの濃度を算出する（ステップＳ１５）。

例えば、測定対象フラグメントの濃度Ｃ_Sは次の式（２）で算出され得る。
Ｃ_S ＝ｋ（Ｓ_S／Ｓ_SR）×Ｃ_SR …（２）
上記式（２）において、Ｓ_Sは測定対象フラグメントの検出信号Ｓの面積である。Ｓ_SRは測定対象リファレンスの検出信号ＳＲの面積である。ｋは第１色素と第２色素の既知検出信号強度比である。Ｃ_SRは測定対象リファレンスの既知濃度である。

キャピラリー電気泳動による試料分析方法の実施形態で用いられるキャピラリー電気泳動装置は図２に示された装置に限定されない。他のキャピラリー電気泳動装置の構成例について説明する。

図８は、キャピラリー電気泳動装置の他の実施形態の構成例を説明するための概略的な構成図である。図８において、図２と同じ機能を果たす部分には同じ符号が付されている。このキャピラリー電気泳動装置では複数のキャピラリー流路が形成されたプレートが用いられる。

例えばガラスからなる基板２８内に複数のキャピラリー流路２が互いに交差しないように配列されている。キャピラリー流路２の寸法は、例えば幅が９０μｍ、深さが４０μｍある。キャピラリー流路２は基板２８の長手方向に延び、アノード側からカソード側に向かって広がる放射状の領域に互いに交差しないように複数本、例えば３８４本が配列されている。

基板２８の表面に、キャピラリー流路２のカソード側の端部の位置に対応してバッファ液容器４が取りつけられている。また、キャピラリー流路２のアノード側の端部の位置に対応してバッファ液容器６が取りつけられている。

バッファ液容器４，６は上部が開口した容器を構成している。バッファ液容器４，６はそれぞれ泳動バッファ液を収容し、底部において泳動バッファ液を介してキャピラリー流路２の端部と電気的に導通するようになっている。

カソード側のバッファ液容器４はその底部にキャピラリー流路２の一端につながる複数個の開口２ａが配置されている（図８（Ｂ）及び（Ｃ）を参照。）。この例では開口２ａの数は３８４個である。開口２ａはそれぞれ試料分注位置を構成する。バッファ液容器４は全ての開口２ａが配置されている領域を囲む１つの容器となっている。アノード側のバッファ液容器６もその底部でキャピラリー流路２の他端とつながっている。

基板２８の材質は例えば石英ガラス又はホウ珪酸系ガラスである。また、基板２８の材質として、ガラスに替えて樹脂などの他の材質のものを用いることもできる。ここでは泳動分離された成分を光学的に検出するので、基板２８の材質として光透過性を有するものが選択される。ただし、光学的検出器以外の検出手段を使用する場合は、基板２８の材質は光透過性を有するものに限定されない。

例えば、基板２８は２枚のガラス板を張り合わせたものとすることができる。キャピラリー流路２は一方のガラス板の接合面に写真製版技術とエッチング技術（ウエットエッチング又はドライエッチング）によって形成することができる。また、開口２ａなどは、同じガラス板又は他方のガラス板に対して、キャピラリー流路２の両端の位置に対応する位置に、例えばエッチングやサンドブラスト、レーザドリルなどの方法により貫通穴として形成することができる。

キャピラリー流路２のアノード側のバッファ液容器６側の検出位置に例えばレーザ励起蛍光検出器などの検出器１６が配置されている。検出器１６は標識されたフラグメントをキャピラリー流路２ごとに検出可能なものである。また、図２を参照して説明したキャピラリー電気泳動装置と同様に、電源装置８、制御部１８、入力部２０及び表示部２２が設けられている。

このキャピラリー電気泳動装置の動作について簡単に説明する。
泳動に先立ちキャピラリー流路２の一端に試料を注入するために、例えばピペッタ機構によって試料が試料分注用の開口２ａに注入される。その後、開口２ａに注入されている試料にそれぞれ電極の先端が浸され、アノード側のバッファ液容器６の泳動バッファ液に浸された電極との間に所定の電圧が印加され、エレクトロカイネティック法によって試料がキャピラリー流路２内に導入される。

試料分注用開口２ａ内に残留している試料が例えばアスピレータなどの吸引機構により吸引して除去される。その後、カソード側のバッファ液容器４内に泳動バッファ液が供給される。電源装置８によってキャピラリー流路２の両端に泳動バッファ液を介して電圧が印加され、キャピラリー流路２内で試料に含まれる成分が電気泳動される。検出位置まで泳動された試料成分が検出器１６によってキャピラリー流路２ごとに検出される。制御部１８の算出部２６は、例えば図１又は図７を参照して説明した試料分析方法の実施形態での説明と同様にして、キャピラリー流路２ごと測定対象フラグメントの濃度を算出する。

以上、本発明の実施形態を説明したが、実施形態における構成、配置、数値、材料等は一例であり、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で種々の変更が可能である。

例えば上記実施形態では、ピーク面積に基づいて測定対象フラグメントの濃度が算出されているが、ピーク高さ又はピーク面積及びピーク高さに基づいて測定対象フラグメントの濃度が算出されてもよい。

なお、本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置及びキャピラリー電気泳動による試料分析方法は、試料の導入がクロスインジェクション法によって行われる場合にも有効である。

また、本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置は上記試料を分析するための専用装置に限定されない。本発明の実施形態のキャピラリー電気泳動装置は、上記試料を分析可能な機能に加えて、上記試料とは異なる試料を電気泳動によって分析可能な機能を備えていてもよい。

２キャピラリー流路
１６検出器
２８算出部

Claims

キャピラリー流路に試料を導入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動装置であって、
前記試料として、
第１色素で標識された測定対象成分と、
前記第１色素とは異なる第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、
前記第１色素で標識され、かつ前記測定対象成分とは異なる電気泳動移動度をもつマーカー成分と、
前記第２色素で標識され、かつ前記マーカー成分との濃度比が既知のマーカーリファレンスと、を含むものが用いられるときに、
前記測定対象成分、前記測定対象リファレンス、前記マーカー成分及び前記マーカーリファレンスをそれぞれ検出する検出器と、
前記マーカー成分と前記マーカーリファレンスとの濃度比と前記マーカー成分の検出信号と前記マーカーリファレンスの検出信号とによって得られる前記第１色素と前記第２色素の検出信号強度比と、前記測定対象成分の検出信号と前記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、前記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて前記測定対象成分の濃度を算出する算出部と、を備えたキャピラリー電気泳動装置。
キャピラリー流路に試料を導入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動装置であって、
前記試料として、
第１色素で標識された測定対象成分と、
前記第１色素とは異なる色素でありかつ同濃度の前記第１色素との検出信号強度比が既知の第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、を含むものが用いられるときに、
前記測定対象成分及び前記測定対象リファレンスをそれぞれ検出する検出部と、
前記第１色素と前記第２色素の既知検出信号強度比と、前記測定対象成分の検出信号と前記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、前記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて前記測定対象成分の濃度を算出する算出部と、を備えたキャピラリー電気泳動装置。
前記算出部は、前記検出信号の強度としてピークの面積もしくはピークの高さ又はその両方を用いる請求項１又は２に記載のキャピラリー電気泳動装置。
キャピラリー流路に試料を導入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動による試料分析方法であって、
前記試料として、
第１色素で標識された測定対象成分と、
前記第１色素とは異なる第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、
前記第１色素で標識され、かつ前記測定対象成分とは異なる電気泳動移動度をもつマーカー成分と、
前記第２色素で標識され、かつ前記マーカー成分との濃度比が既知のマーカーリファレンスと、を含むものを用い、
前記測定対象成分、前記測定対象リファレンス、前記マーカー成分及び前記マーカーリファレンスをそれぞれ検出するステップと、
前記マーカー成分と前記マーカーリファレンスとの濃度比と前記マーカー成分の検出信号と前記マーカーリファレンスの検出信号とによって得られる前記第１色素と前記第２色素の検出信号強度比と、前記測定対象成分の検出信号と前記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、前記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて前記測定対象成分の濃度を算出するステップと、を含むキャピラリー電気泳動による試料分析方法。
キャピラリー流路に試料を導入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料に含まれる成分を電気泳動させて検出するキャピラリー電気泳動による試料分析方法であって、
前記試料として、
第１色素で標識された測定対象成分と、
前記第１色素とは異なる色素でありかつ同濃度の前記第１色素との検出信号強度比が既知の第２色素で標識され、かつ濃度が既知の成分である測定対象リファレンスと、を含むものを用い、
前記測定対象成分及び前記測定対象リファレンスをそれぞれ検出するステップと、
前記第１色素と前記第２色素の既知検出信号強度比と、前記測定対象成分の検出信号と前記測定対象リファレンスの検出信号の検出信号強度比と、前記測定対象リファレンスの既知濃度と、に基づいて前記測定対象成分の濃度を算出するステップと、を含むキャピラリー電気泳動による試料分析方法。
前記検出信号の強度は、ピークの面積もしくはピークの高さ又はその両方である請求項４又は５に記載のキャピラリー電気泳動による試料分析方法。