JP2006526137A - 内部標準の存在下で色素を標識することによる閉じた膜構造上の細胞表面タンパク質の示差分析 - Google Patents
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Abstract
Description
i)各試料の別々のアリコートを、色素の適合セットから選択される色素と接触させるステップであって、適合セット中の各色素が膜成分を選択的に標識することができ、且つ各色素が、適合セット中の残留色素の放出ルミネッセント光とは著しく異なる特性を有するルミネッセント光を放出するステップと、
ii)各別々のアリコートから色素標識成分の抽出物を調製するステップと、
iii)異なる色素標識成分を分離するステップと、
iv)試料中の異なる色素標識成分間の発光特性の差を検出するステップと
を含み、
2以上の試料のアリコートのプールした混合物からの膜成分の抽出物を含む内部標準の存在下で、分離ステップiii)を実施し、膜構造を含む試料のプールした混合物を、色素の適合セットから選択される異なる色素と接触させることを特徴とする方法を提供する。
a)試薬は細胞膜に浸透してはならない。したがって一般に、色素は、色素の親水性を増大させ、且つ色素分子が細胞膜の疎水性脂質コアを通過するのを阻止する総電荷を有していなければならない。したがって、色素は、親水性の特徴を色素に付与するために、色素発色団に共有結合で結合した1以上の置換基を含むことができる。適切な置換基には、スルホネート、スルホン酸及び四級アンモニウムが含まれる。これらは、色素構造に直接結合していてもよく、或いは、C1〜C6アルキル鎖などのリンカー基を介して結合していてもよい。色素構造に直接結合した1以上のスルホネート又はスルホン酸基が特に好ましい。
nは1〜3の整数であり、
X及びYは同一又は異なるもので、>C(CH3)2、O及びSから選択され、
基R1及びR2の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20アルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
残りの基R1又はR2はC1〜C6アルキル又は基−(CH2)m−Wであり、Wは下記から選択され、
基R3及びR4の1以上はスルホネート又はスルホン酸基であり、R3及びR4基の1つがスルホネート又はスルホン酸基でない場合、残りの基R3又はR4は水素である。
基R1、R2及びR3の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20アルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
基R2又はR3のどちらかが基−E−Fでない場合、それらは独立に、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、アミノ、モノ又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルキル、スルホネート、スルホン酸、四級アンモニウム及び基−(CH2−)n−Zから選択され、
基R1が基−E−Fでない場合、それは水素、C1〜C6アルキル、基(CH2)k−Z(式中、Zはスルホネート、スルホン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、kは1〜6の整数である)から選択される。
nは1〜3の整数であり、
X及びYは同一又は異なるもので、>C(CH3)2、O及びSから選択され、
基R1及びR2の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20のアルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
残りの基R1又はR2はC1〜C6アルキル又は基−(CH2)m−Wであり、Wは下記から選択され、
基R3及びR4の1以上はスルホネート又はスルホン酸基であり、R3及びR4基の1つがスルホネート又はスルホン酸基でない場合、残りの基R3又はR4は水素である。
本発明は、細胞信号伝達に関与するもの(例えばホルモン及び成長因子受容体、Gタンパク質結合受容体)、輸送体タンパク質(例えば糖輸送)、イオンチャンネル(例えばNa−K ATPase、H−ATPase)、エネルギートランスデューサー(例えばATPシンテターゼ)、酵素、抗原受容体、リガンド結合(例えばインスリン受容体)及び細胞骨格などの細胞外タンパク質との結合を有するもの(例えばインテグリン)などの、細胞表面上に存在するか又は発現する受容体を目標にするために使用することもできる。この方法は、異なる細胞刺激などの異なる治療の効果、或いは、膜成分、存在量の変化、タンパク質の細胞の位置又は構造(例えば、遊離チオール又は他の官能基を比較することによって)及びタンパク質の翻訳後変性(特にグリコシル化)に対する異なる環境影響の効果を直接比較するために使用することができる。
色素の合成
i)概略実験手順
1H NMR(δH)スペクトルをJeol JNM−LA300 FT NMR分光計で記録した。化学シフトをδ(ppm)で示す。試料をd4−メタノールなどの適切な重水素溶媒中の溶液として調製した。Unicam UV3 UV/VIS分光計を用いてUV/VIS分光法を実施した。トリメトキシプロペンはKarl Industries Inc.、Ohio、USAから購入した。他のすべての化学品はSigma−Aldrich Company Limited、Dorset、Englandから購入した。
ヒドラジノベンゼンスルホン酸(20.0g)を酢酸(60ml)中に溶解し、次いで3−メチル−2−ブタノン(26.0g)を加えて、3時間加熱還流した。所望の化合物を冷蔵庫中で掻き落としながら冷却して沈澱させ、オフホワイトのスラリーをプロパン−2−オルで希釈し、濾過した(71%)。
2,3,3−トリメチルインドレニン−5−スルホン酸カリウム(1.0g、3.61ミリモル)及びヨードメタン(0.25ml、3.97ミリモル)を窒素雰囲気下でジクロロベンゼン(10ml)と混合した。溶液を、砂浴を用いて100℃で4時間加熱した。固形物が生成し始めたが、tlc(MeOH30%/DCM70%)による分析によって生成物の生成が完全でないことが分かったので、追加的に当量のヨードメタンを加え、反応液をさらに2時間加熱し、次いで室温に冷却した。濾過して固形物を集め、ジクロロベンゼン、ジエチルエーテルで洗浄し、次いで、真空中で乾燥して紫色の固形物を得た(0.89g、98%)。δH(300MHz、CD3OD)8.06(m,1H)、7.94(dd,1H)、7.84(m,1H)、4.02(s,3H)及び1.61(s,6H)。
2,3,3−トリメチルインドレニン−5−スルホン酸カリウム(10.0g、41.97ミリモル)及びヨードエタン(4.0ml、50.35ミリモル)を窒素雰囲気下でジクロロベンゼン(40ml)と混合した。溶液を、砂浴を用いて120℃で16時間加熱して紫色の固形物を生成した。固形物を濾取し、次いでジクロロベンゼン、クロロホルム及びエーテルで洗浄して薄ピンク色の固形物を得た(10.2g、91%)。δH(300MHz、CD3OD)7.98(m,3H)、4.55(q,2H)、1.56(s,6H)及び1.48(t,3H)。
2,3,3−トリメチルインドレニン(6.4g、40ミリモル)をジクロロベンゼン(25ml)中に溶解し、溶液が均一になるまで攪拌した。この溶液に、6−ブロモヘキサン酸(15.6g、80ミリモル)を加え、反応液を砂浴中110℃で6.5時間加熱した。反応液を室温まで冷却させ、そこでフラスコの側部を掻き落とし、次いでフラスコを冷蔵庫の中に1時間に置いた。次いで、紫色の溶液中にベージュ色の固形物が生成したので固形物を濾取し、次いでジクロロベンゼンとエーテルで洗浄してベージュ色の固形物を得た(7.42g、52%)。δH(300MHz、CD3OD)7.91(m,1H)、7.78(m,1H)、7.62(m,2H)、4.52(t,2H)、2.38(t,2H)、2.04(p,2H)、1.88〜2.45(m,4H)及び1.61(s,6H)。
1−エチル−2,3,3−トリメチル−5−スルホニル−インドリウムアイオダイド(2.0g、7.48ミリモル)、N,N′−ジフェニルホルムアミジン(1.5g、7.48ミリモル)及びトリエチルオルトホルメート(1.1g、7.48ミリモル)をエタノール(10ml)中に溶解し、次いで還流下(100℃)で3時間加熱した。反応フラスコの側部に固形物が生成し、UV/VISは408nmに新規のピークを示した。ジエチルエーテルを加え、濾取した沈殿物と固形物をエーテルで洗浄し、真空で乾燥して黄色/橙色の固形物を得た(1.83g、66%)。UV/VIS(MeOH);吸収λmax=408nm。
1,2,3,3−テトラメチル5−スルホニル−インドリウムアイオダイド(5.00g、11.90ミリモル)を酢酸(40ml)とTFA(2ml、18.0ミリモル)の混合液中に懸濁させてすべての固形物を溶解させた。1,3,3−トリメトキシプロペン(12.5ml、95.0ミリモル)を反応液に加え、室温で5時間攪拌した。溶液をピペットで500mlのジエチルエーテル中に取り、沈殿物を濾取した(4.80g、塩を含有)。
2.1 細胞培養、表面タンパク質標識及びタンパク質単離
最初の実験をECACC(ECACC No.85011440 CB No.CB2275)から供給をされたU937細胞(白人の組織球リンパ腫細胞(Human caucasian histiocytic lymphom cell))で実施した。U937細胞を供給業者の奨励するプロトコルによって培養した。竪型フラスコ内で、37℃、5%CO2、RPMI−1640増殖媒体(10%ウシ胎仔血清)中で細胞を増殖させた。細胞をカウントし、細胞濃度を2〜9×105細胞/mlに維持しながら2〜3日毎に継代させた。収集する前日に、細胞を沈降させ、新鮮な媒体中に再懸濁して、生育不能な細胞のレベルを最少にした。
細胞表面に発現したタンパク質を全タンパク質と比較するために、細胞溶解物を調製した。実施例2で説明したようにしてU937細胞を収集した後、細胞を溶解バッファー中に再懸濁した。細胞を超音波処理で溶解させた(6μmの振幅、10サイクルで20秒間、氷水上で1分間冷却)。溶液を遠心分離にかけて、細胞片、及び標準Cy色素DIGE最小標識プロトコル(Ettan DIGE user manual、Amersham Biosciences、Buckinghamshire、UK)で標識したタンパク質(上澄み中の)を小球形にした。
標準的なAmersham Biosciences 2D PAGE装置及びPlusOne(商標)試薬(Buckinghamshire、UK)を用いて2−D電気泳動法を実施した。Immobiline DryStrips(pH3〜10 NL、24cm)を、Immobiline DryStrip再膨潤トレー(Reselling Tray)中でDryStripカバー用流体(Cover Fluid)2.5mlでオーバーレイした、450μl再水和バッファー(尿素7M、チオ尿素2M、CHAPS4重量/容積%、Pharmalytes(pH3〜10)1%、DTT2mg/ml)中で終夜かけて再水和させた。IPGphor等電点電気泳動システムを用いて条片の焦点をあわせた。2次元PAGEの前に、各条片を10ml平衡バッファーA(尿素7M、チオ尿素2M、Tris−HCl pH6.8 100mM、グリセロール30容積/容積%、SDS1重量/容積%、DTT5mg/ml)でロッキングテーブル上で10分間、続いて、10ml平衡バッファーB(尿素7M、チオ尿素2M、Tris−HCl pH6.8 100mM、グリセロール30容積/容積%、SDS1重量/容積%、ヨードアセトアミド45mg/ml)でさらに10分間平衡化させた。次いで、条片を、イソクラティック(isochratic)12.5% Laemmli SDS−PAGEゲルに載せて操作した。
標識タンパク質を、Typhoon 9410スキャナー(Amersham Biosciences、Buckinghamshire、UK)を用いて以下の設定で可視化させた。
細胞膜の異なるフルオールへの浸透度を測定するために、標識細胞を実施例2.1で説明したようにして調製し、無傷細胞をIN Cellアナライザーを用いて分析した。この機器は、>0.5μmの解像度で細胞を可視化することができ、蛍光標識の局在化を測定するために使用できる共焦点蛍光顕微鏡である。タンパク質分解を最少化するため、使用したすべてのバッファーを氷冷し、可能な場合すべてのステップを氷上で実施した。試験した各フルオールについて、細胞を調製し、氷上で標識反応を行った(実施例2.1で説明したように)。所望の時点で、複製のアリコートの標識細胞を取り出した。
Claims (24)
- 閉じた膜構造を含む2以上の試料からの表面膜成分間の差を検出する方法であって、当該方法が、
i)各試料の別々のアリコートを、色素の適合セットから選択される色素と接触させるステップであって、適合セット中の各色素が膜成分を選択的に標識することができ、且つ各色素が、適合セット中の残留色素の放出ルミネッセント光とは著しく異なる特性を有するルミネッセント光を放出するステップと、
ii)各別々のアリコートから色素標識成分の抽出物を調製するステップと、
iii)異なる色素標識成分を分離するステップと、
iv)試料中の異なる色素標識成分間の発光特性の差を検出するステップと
を含み、
2以上の試料のアリコートのプールした混合物からの膜成分の抽出物を含む内部標準の存在下で、分離ステップiii)を実施し、膜構造を含む試料のプールした混合物を、色素の適合セットから選択される異なる色素と接触させることを特徴とする方法。 - 各試料の別々のアリコートを、色素の適合セットから選択される異なる色素と接触させる方法であって、当該方法が、ステップiii)の前に、成分を分離する前にすべての試料からの色素標識成分の抽出物の一部を互いに混合し、且つ、プールした混合物からの色素標識成分の抽出物の一部と混合するステップを含む、請求項1記載の方法。
- 各試料の別々のアリコートを、色素の適合セットから選択される同一色素と接触させる方法であって、当該方法が、ステップiii)の前に、成分を分離する前に各々別の試料からの色素標識成分の抽出物の一部と混合された、プールした抽出物からの色素標識成分の抽出物の一部を提供するステップを含む、請求項1記載の方法。
- 各色素が、その電荷及び分子量特性によって互いに適合している、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 色素の適合セットがフルオレセイン、ローダミン、シアニン色素及びアクリドン色素から選択される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 色素の適合セットが次式の構造を有するシアニン色素から選択される、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
nは1〜3の整数であり、
X及びYは同一又は異なるもので、>C(CH3)2、O及びSから選択され、
基R1及びR2の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20アルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
残りの基R1又はR2はC1〜C6アルキル又は基−(CH2)m−Wであり、Wは下記から選択され、
基R3及びR4の1以上はスルホネート又はスルホン酸基であり、R3及びR4基の1つがスルホネート又はスルホン酸基でない場合、残りの基R3又はR4は水素である。 - 色素の適合セットが以下の構造を有するアクリドン色素から選択される、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
基R1、R2及びR3の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20アルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
基R2又はR3のどちらかが基−E−Fでない場合、それらは独立に、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、アミノ、モノ又はジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルキル、スルホネート、スルホン酸、四級アンモニウム及び基−(CH2−)n−Zから選択され、
基R1が基−E−Fでない場合、それは水素、C1〜C6アルキル、基(CH2)k−Z(式中、Zはスルホネート、スルホン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、kは1〜6の整数である)から選択される。 - セットの各色素が、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル及びアルデヒド基と反応性である反応基である目標結合基Fを有する、請求項6又は請求項7記載の方法。
- 反応基がスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、マレイミド、ハロアセトアミド及びヒドラジドから選択される、請求項8記載の方法。
- 色素の適合セットがジピロメチンボロンジフルオリド色素の誘導体である、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 各色素がその蛍光波長及び/又はその蛍光寿命によって互いに識別可能である、請求項1記載の方法。
- 成分が膜タンパク質又はその断片を含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。
- タンパク質がリンタンパク質を含む、請求項12記載の方法。
- 成分が炭水化物誘導体を含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。
- 分離ステップが電気泳動法による、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 電気泳動法が一次元電気泳動法、二次元電気泳動法、キャピラリーゾーン電気泳動法、キャピラリーゲル電気泳動法又は等電集束法を含む、請求項15記載の方法。
- 分離ステップがクロマトグラフ法による、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- クロマトグラフ法がアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項17記載の方法。
- 発光特性の差を検出するステップが蛍光顕微鏡検査法による、請求項1乃至請求項18のいずれか1項記載の方法。
- 発光特性の差を検出するステップが光学画像形成法による、請求項1乃至請求項18のいずれか1項記載の方法。
- 各色素が、細胞表面成分を選択的に標識することが可能であり、各色素が、他の色素の放出ルミネッセント光とは著しく異なる特性を有するルミネッセント光を放出し、各色素が次の構造(1)を有するシアニン色素から選択される色素の適合対。
nは1〜3の整数であり、
X及びYは同一又は異なるもので、>C(CH3)2、O及びSから選択され、
基R1及びR2の1つは基−E−F(式中、Eは、直鎖又は枝分れC1−20アルキル鎖から選択される1〜20個の連結原子の鎖を有するスペーサ基であり、1以上のエーテル結合、1以上のアミド結合及び1以上の不飽和基を含んでいてもよく、Fは、標識される成分の相補性基と反応することができる目標結合基である)であり、
残りの基R1又はR2はC1〜C6アルキル又は基−(CH2)m−Wであり、Wは下記から選択され、
基R3及びR4の1以上はスルホネート又はスルホン酸基であり、R3及びR4基の1つがスルホネート又はスルホン酸基でない場合、残りの基R3又はR4は水素である。 - 各色素が、色素の一方で標識した成分の分離媒体中の相対的泳動度が、他方の色素で標識した成分の分離媒体中の相対的泳動度と同じであるという特徴を有する、請求項21記載の色素の適合対。
- 各色素が、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル及びアルデヒド基と反応性である反応基である目標結合基を有する、請求項21又は請求項22のいずれか1項記載の色素の適合対。
- 各色素がスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、マレイミド、ハロアセトアミド及びヒドラジドから選択される反応基を有する、請求項23記載の色素の適合対。
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