JPH1088012A - 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 物質の標識および検出に有用な染料を提供す
ること。 【解決手段】 アミン、アルデヒド、スルフヒドリル若
しくはヒドロキシル基を含有する成分と、染料をして該
成分上のアミン、アルデヒド、スルフヒドリル若しくは
ヒドロキシル基と共有反応させる置換基を少なくとも１
個含有するスルホインドレニン基剤ないしナフトスルホ
インドレニン基剤ポリメチン染料よりなる群から選ばれ
る水溶性染料との発光光安定性反応生成物であって、該
反応生成物上の個々の染料分子が少なくとも５０，００
０ｌ／モルｃｍの平均分子吸光計数および少なくとも２
％の平均量子収量を有し、標識成分が水性環境にあると
き最大４００〜８５０ｎｍ範囲の光を吸収および放射す
る生成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発光アリールスル
ホネートシアニン染料を用いた物質の標識および検出に
関する。

【０００２】

【従来の技術】吸光特性を有するシアニンおよび関連染
料は写真フィルムに用いられてきた。斯かる染料は吸光
特性を必要とするが、ルミネッセンス（蛍光若しくは燐
光）特性を必要としない。これまでルミネッセンス特性
を有するシアニン染料は非常に限られた用途しかなかっ
た。斯かる用途に取分け蛋白のスルフヒドリル基を標識
することが含まれる。「スルフヒドリル試薬染料は筋形
質小網嚢（ＳＲ）からの迅速Ｃａ²⁺解放を開始させる
（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｙｅｓ
Ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆ Ｃａ² ｆｒｏｍ Ｓａｃｏｐｌａｓｍｉｃ
Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＳＲ））」と
題する論文で、Ｓａｌａｍａ Ｇ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ
Ａ．Ｓ．Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｊ．は、ヨードアセチル基
を有するシアニン発色団がＣａ²⁺解放を開始させるべく
ｐＨ６．７で筋形質小網蛋白上のスルフヒドリル基と共
有結合を形成するのに用いられたことを報告している
（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、４７、４
５６ａ（１９８５））。この論文はまた、蛍光染料が蛋
白の標識ないし単離に用いられたことを述べている。

【０００３】「レチニリデン結合箇所から離れたロドプ
シン分子領域での配座変化の力学（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ
ｉｎ ａ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｏｄｏ
ｐｓｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌｅＡｗａｙ Ｆｒｏｍ ｔｈ
ｅ Ｒｅｔｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔ
ｅ）」と題する論文で、Ｗａｇｇｏｎｅｒ Ａ．Ｓ．、
ＪｅｎｋｉｎｓＰ．Ｌ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｊ．
Ｐ．およびＧｕｐｔａ Ｒ．は、牛ロドプシンのＦ１領
域上のスルフヒドリル基が６６０ｎｍで吸光度を有する
シアニン染料により共有標識されたことを報告している
〔Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、３３、２
９２ａ（１９８５）〕。ここでも、特に蛋白のスルフヒ
ドリル基を標識するのにシアニン染料を用いたことが報
告されているが、蛍光染料の使用については開示されて
いない。

【０００４】「細胞生物学における問題への蛍光フォト
ブリーチ技法の応用に関する国際ゼミ（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｔｈｅ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ｔｏ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）」と題する記事には蛋白質に複合され得しか
もスペクトルの濃赤領域で励起されうるシアニンタイプ
蛍光プローブに関するＪａｃｏｂｓｏｎ Ｋ．、Ｅｌｓ
ｏｎ Ｅ．、Ｋｏｐｐｅｌ Ｄ．およびＷｅｂｂ Ｗ．
の論文が報告されている（Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．４２：７
２−７９（１９８３））。

【０００５】上記三つの論文のいずれにも記述されてい
る唯一のシアニンプローブは特に蛋白質のスルフヒドリ
ル基に共有結合するものである。記述されている唯一の
特定シアニン化合物はヨードアセチル基を有するもの
で、該基はシアニン染料をスルフヒドリル基と共有反応
させる。上記記事はいずれもシアニン染料と蛋白質以外
の物質又はスルフヒドリル基以外の蛋白質上任意基との
共有反応を開示していない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、多くの
非蛋白質物質はスルフヒドリル基を有さず、また多くの
蛋白質は該基を蛍光探査に有用とする程十分には有して
いない。しかも、スルフヒドリル基（−ＳＨＳＨ−）は
空気の存在でジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）に容易に酸化
し、それによって蛍光プローブへの共有結合に受容され
なくなる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、アミン、アル
デヒド、スルフヒドリル若しくはヒドロキシル基を含有
する成分と、染料をして該成分上のアミン、アルデヒ
ド、スルフヒドリル若しくはヒドロキシル基と共有反応
させる置換基を少なくとも１個含有するスルホインドレ
ニン基剤ないしナフトスルホインドレニン基剤ポリメチ
ン染料よりなる群から選ばれる水溶性染料との発光光安
定性反応生成物であって、該反応生成物上の個々の染料
分子が少なくとも５０，０００ｌ／モルｃｍの平均分子
吸光計数および少なくとも２％の平均量子収量を有し、
標識成分が水性環境にあるとき最大４００〜８５０ｎｍ
範囲の光を吸収および放射する生成物を提供する。好ま
しくは、該成分は、蛋白、ペプチド、薬物、トキシン、
代謝産物、リンフォカイン、炭水化物、脂質、血液細
胞、バクテリア粒子、ウイルス粒子、抗原、ハプテン、
重合体粒子、ガラス表面材および重合体表面材よりなる
群から選ばれる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明に従えば、物質の蛍光ない
し燐光検出のために適当な反応条件下、蛋白質および他
物質上のスルフヒドリル基のみならずアミン（−ＮＨ
₂ ）およびヒドロキシ（ＯＨ）基その他アルデヒド（−
ＣＨＯ）基の如き基と共有反応する置換基を有するシア
ニンおよび関連ポリメチン染料が開発された。本発明
は、従来法のヨードアセチルシアニン染料の使用および
その、スルフヒドリル基との特異反応性よりもかなりの
益をもたらす。アミンおよびヒドロキシ基はスルフヒド
リル基よりも蛋白ないし他の物質中で優勢であり、安定
である。それによって、特定蛋白有無の探査に蛍光シア
ニン染料を用いるとき、被探査蛋白に多くの染料分子が
結合しうるので、より強い蛍光ないし燐光の光度信号が
出される。しかも、アミンないしヒドロキシ基は、当然
スルフヒドリル、アミン若しくはヒドロキシ基を含まな
い重合体粒子の如き標識の所望される成分に、より容易
に付加される。

【０００９】本発明はまた、標識蛋白又は他物質の有無
ないし量が、該標識成分をクロマトグラフィー法で分離
後探査されうるように、アミン若しくはヒドロキシ基又
は他の反応基と共有反応する基を含む発光シアニン染料
を用いて混合物中の染料と反応しうるアミン若しくはヒ
ドロキシ基又は他の基を有する蛋白又は他の原料を標識
する方法に関する。先に引用せる文献に依れば、明らか
にスルフヒドリル基は、特に蛋白分子上のスルフヒドリ
ル基が非常に少なくまた或る場合該基が蛋白の機能で有
意な役割を果たす故に共有反応用に選定された。それ
故、著者が蛋白構造上のスルフヒドリル基の特定位置を
確認する試みは可能であった。また、上記文献で、スル
フヒドリル基は特定蛋白の構造変化を探査し或いは該変
化をもたらすプローブとして用いられた。斯くして、染
料による吸光の変化又は染料結合による解放カルシウム
イオンの変化を判断するために、プローブの結合場所を
知ることが必要であった。

【００１０】大部分の蛋白上のスルフヒドリル基は非常
に少ない故に、探査に十分な全ルミネッセンスをもたら
すのに該スルフヒドリル基数が十分でないことがある。
これとは対照的に、アミンないしヒドロキシ基数は蛋白
分子上に数において有意に多く且つ広く分散しているの
で分子上の多数箇所に蛍光プローブを結合させることが
でき、それによって蛋白検出が容易になるため吸光若し
くは蛍光変化の判断が排除される。

【００１１】本発明は発光ポリメチンシアニンないし関
連ポリメチン染料による蛋白その他、核酸、ＤＮＡ、薬
物、トキシン、血液細胞、微生物物質、粒子、プラスチ
ック若しくはガラス表面材、重合体膜等を含む物質の、
該物質上アミン若しくはヒドロキシ箇所での標識に関す
る。有利なことに、染料は、標識物質を含む水性ないし
他の媒体に可溶である。本発明は標識１段法に加えて標
識２段法に関する。標識２段法では、抗体の如き第一成
分を、該成分上の、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド若
しくはスルフヒドリル箇所を含む箇所で標識しうる。標
識された成分は、抗体が特異な抗原の如き第二成分のプ
ローブとして用いられる。

【００１２】先に記した従来技術では、スルフヒドリル
基と共有反応するプローブを用いることにより、シアニ
ンプローブによる結合箇所の特異性が達成された。本発
明の２段法に従えば、第一段階でシアニンないし関連プ
ローブを抗体の如き第一成分上のアミン、アルデヒド、
スルフヒドリル、ヒドロキシ若しくは他の基と反応させ
ることができ、而して第二ないし染色段階で抗体は抗原
の如き第二成分での所望の特異性を達成しうる。この特
異性は抗体への抗原結合箇所により調べられる。

【００１３】本発明はまた、ターゲット分子上のアミ
ン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスルフヒドリル基
への共有結合を可能にする基を含む発光ポリメチンシア
ニンおよび関連化合物に関する。本発明は抗原のプロー
ブとなりうるこれら発光シアニン化合物で標識された単
一クローン抗体および他の成分に関する。ターゲットが
１種の細胞であるとき、本発明は、該細胞に結合する標
識抗体の量を測定するのに用いることができる。この測
定は、細胞のルミネッセンスの相対的明暗を調べること
によって実施しうる。

【００１４】本発明は、系の特定蛋白若しくは他成分の
濃度を調べるのに用いることができる。もし、プローブ
と反応しうる蛋白上の反応基数が既知なら、分子当りの
蛍光を知ることができ、また系の分子濃度を系の全ルミ
ネッセンス強度によって調べることができる。

【００１５】本方法は、系の蛋白の混合物すべてを標識
し、次いで標識蛋白をクロマトグラフィーの如き任意手
段で分離することにより系の各種の蛋白ないし他の物質
を定量するのに用いることができる。次いで、分離せる
発光性の蛋白量を調べることができ、クロマトグラフィ
ー検出系で、標識物質上の染料位置を確認することがで
きる。

【００１６】本発明はまた、抗体により標識された種々
の細胞数を調べるのに使用しうる。この数の調査は系の
複数種の細胞を標識し次いで標識細胞を系外に分離する
ことにより実施しうる。また、標識細胞は系外の非標識
細胞からも分離することができる。

【００１７】本発明の別の具体化は、抗体の如き別異の
複数第一成分にして、各々が抗原の如き別異の第二成分
に特異な第一成分に夫々結合した複数の発光シアニン若
しくは関連染料を、抗原混合物中複数抗原の各々を同定
するのに用いられるマルチパラメーター方法を含む。こ
の具体化に従えば、各抗体は、他のプローブを標識する
のに用いられる染料とは別異の吸光およびルミネッセン
ス波長特性を有する染料で別個に標識される。次いで、
標識抗体はすべて、夫々特定の標識抗体により染色され
うる抗原の如き第二成分を含むと分析された生物学的調
製物に加えられる。未反応染料物質は、もしそれが分析
を妨げるなら、洗浄によって調製物から全て除去されう
る。生物学的調製物は次いで種々の励起波長に付され
る。用いられる各励起波長は特定の共役染料の励起波長
である。励起波長に相当する発光波長の光度を調べるの
にルミネッセンス顕微鏡又は、励起波長の光を選択し且
つルミネッセンスの波長を選定するフィルター若しくは
モノクロメーターを有するフローシトメター又は蛍光分
光光度計の如き他のルミネッセンス検出系が用いられ
る。特定の共役染料の発光波長に相当する波長でのルミ
ネッセンス強度は、染料が結合する抗体に結合した抗原
の量を示す。或る場合、各々が別異の波長で蛍光を発す
る混合物中の物質２種以上からのルミネッセンスを励起
するのに単一励起波長を用いることができ、その各蛍光
波長における個々の蛍光強度を検出することにより各標
識種の量を測定することができる。所望なら、吸光検出
法を用いることができる。本発明の２段法は、ルミネッ
センス若しくは吸光検出系で第一物質−染料複合物が方
向づけられる別の物質の有無を探査するのに染料と結合
した第一物質を用いる任意系に適用されうる。例えば、
染料はＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片に結合して染料結合Ｄ
ＮＡ若しくはＲＮＡフラグメントを形成し得、次いでそ
れは断片が相補的なＤＮＡ若しくはＲＮＡ主鎖に方向づ
けられる。同じ試験方法はＤＮＡの相補的主鎖の有無を
探査するのに用いることができる。

【００１８】本発明のシアニンおよび関連染料は特に、
広範囲の励起および発光波長を有する特定のシアニンお
よび関連染料が合成されうる故に、種々の励起および発
光波長の染料を必要とする成分混合物分析によく適合す
る。特定の励起および発光波長を有する特定のシアニン
および関連染料は、メチン基の数又はシアニン環構造を
変えることにより合成することができる。このようにし
て、レーザー例えばＨｅＮｅ若しくはダイオードレーザ
ーの如き特定の励起光源に相当する特定励起波長を有す
る染料を合成することができる。

【００１９】本発明は、反応条件下発光性の高いまた吸
光度の高いシアニンおよび関連染料分子を蛋白、ペプチ
ド、炭水化物、核酸、誘導核酸、脂質、他の特定の生物
学的分子、生物学的細胞上のアミン、ヒドロキシ、アル
デヒド、スルフヒドリル若しくは他の基並びに可溶性重
合体、重合体粒子、重合体表面材、重合体膜、ガラス表
面材および他の粒子ないし表面材の如き非生物学的物質
に共有反応させることに関する。ルミネッセンスには高
感度の光学的技法が包含されるので、標識が非常に低い
量で存在するときでさえ染料「標識」の有無を探査定量
することができ、かくして染料標識試薬を用いて標識さ
れた物質の量を測定することができる。最も有用な染料
は吸光度が高く（ε＝７０，０００〜２５０，０００ｌ
ｂ／モルｃｍ又はそれ以上）、非常に発光性であり、少
なくとも５〜８０％以上の量子収量を有する。該量は染
料そのものに当てはまり、また標識物質に結合した染料
にも当てはまる。

【００２０】斯かるカラー標識試薬の重要な適用は発光
性単一クローン抗体の産生である。単一クローン抗体
は、特定の化学的箇所又は細胞表面上若しくは細胞内
「マーカー」に非常に堅く且つ特異的に結合する蛋白分
子である。それ故、これら抗体は、特定細胞種（例えば
ＨＬＡ、Ｔ細胞、バクテリアおよびウイルス等）および
異常細胞を同定するのに莫大な研究と臨床適用とを有す
る。従来、細胞に結合した抗体は種々の方法による抗体
の標識によって計量されており、そして標識は放射性標
識（ラジオイムノアッセイ）、酵素（ＥＬＩＳＡ技法）
又は蛍光染料（通常フルオレセイン、ロダミン、Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（登録商標）若しくは紅藻素）によって遂
行されてきた。臨床的抗体試薬のほとんどの製造業者な
いしユーザーは放射性トレーサーの使用に伴う問題の排
除を望んでおり、そのためルミネッセンスが最も有望な
代替法の一つと考えられている。実際、多くの業者は今
日、単一クローン抗体で標識されたフルオレセイン、Ｔ
ｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ロダミンおよび紅藻素
を市場に出している。

【００２１】近年、細胞上の蛍光抗体を検出する光学的
／電子工学的装置は複雑さを増している。例えば、フロ
ー血球計算法を用いて個々の細胞上の蛍光抗体量を、細
胞５，０００個／秒までの割合で測定することができ、
また顕微鏡および溶液蛍光技法も進歩している。これら
装置は、スペクトルのＵＶ、可視および近ＩＲ領域の多
くの波長で蛍光を励起することができる。今日受容され
る有用な蛍光標識試薬のほとんどは４００〜５８０ｎｍ
スペクトル領域で励起しうる。例外は、蛋白に共有結合
し得且つ若干長い波長で励起しうる。海洋性生物から単
離されたいくつかのフィコビリプロテインタイプ顔料で
ある。それ故、今日市販されている装置で分析される生
物学的ないし非生物学的物質の標識で新たな標識試薬が
有効となることが必要な５８０〜約９００ｎｍ範囲の大
スペクトル窓がある。このスペクトル領域で励起しうる
新しい試薬は、種々の特異性を有する抗体が各々別異の
着色蛍光染料で標識しうる故に細胞上マーカーのマルチ
カラールミネッセンス分析の実施を可能にする。斯くし
て、分析される各細胞に関し同時にいくつかのマーカー
の有無を調べることができる。

【００２２】本発明はまた、生物学的ないし非生物学的
物質に共有結合しうる発光（蛍光若しくは燐光）シアニ
ン、メロシアニンおよびスチリル染料そのものに関す
る。メロシアニンおよびスチリル染料は本発明のための
シアニン染料に関連すると認められる。新しい標識試薬
そのものは、特にそれが標識成分に結合しているとき初
めに定義せる波長の光例えば４５０〜９００ｎｍスペク
トル範囲の波長の光で励起しうる。細胞のバックグラウ
ンド蛍光はより低い波長で概ね生じる。それ故、標識試
薬はバックグラウンド蛍光とは区別される。特に有利な
のは６３３ｎｍの光を吸収する誘導体である。何故な
ら、該誘導体は、安価で、強く、安定で、寿命の長いＨ
ｅＮｅレーザー給源により励起されうるからである。次
いで、標識成分により蛍光ないし燐光放出される、二番
目に定義した波長の光が検出されうる。蛍光若しくは燐
光は一般に励起光より長い波長を有する。検出段階は、
励起波長の散乱光を吸収するための、また検体とともに
用いられる特定の染料標識に相当するルミネッセンスの
対応波長を通過させるためのフィルターを有するルミネ
ッセンス顕微鏡を用いることができる。斯かる光学顕微
鏡については米国特許第４，６２１，９１１号に記述さ
れている。

【００２３】シアニンおよび関連染料がすべて発光性と
いうわけではない。しかしながら、本発明の染料には、
発光性であるシアニンおよび関連染料が含まれる。それ
らは比較的安定性であり、多くは反応溶液好ましくは水
溶液に可溶である。結合染料そのものは、特にそれが標
識成分に結合しているとき少なくとも５０，０００好ま
しくは１００，０００ｌ／モルｃｍの分子吸光係数
（ε）を有する。吸光係数は分子が光を吸収する能力の
尺度である。本発明の結合染料は少なくとも２％好まし
くは少なくとも１０％の量子収量を有する。加えて、本
発明の結合染料は４００〜９００ｎｍ好ましくは６００
〜９００ｎｍスペクトル範囲の光を吸収し且つ発生す
る。

【００２４】アリールスルホン化染料 本明細書に記載の如きアリールスルホネートないしアリ
ールスルホン酸置換染料が、アリールスルホネートない
しアリールスルホン酸基のない類似染料に比べ本質的に
蛍光が強く、改良された光安定性および水溶性を有する
と分かった。用語アリールスルホネートないしアリール
スルホン酸基を本明細書で用いるとき、それは、単一環
芳香族構造又はナフタレン構造の如き融合環構造を含む
芳香族環構造に結合した互換可能なアリールスルホン酸
基若しくはアリールスルホネート基を意味する。単一環
芳香族構造若しくは融合環芳香族構造はポリメチン、シ
アニン、メロシアニン若しくはスチリルタイプ染料中に
存在しうる。

【００２５】通常シアニン染料を含む同一平面分子構造
を有する多くの染料は、特に、緩衝液ないし生理的食塩
水における如く無機塩も亦存在するとき水溶液中で二量
体ないしそれ以上の結合体を形成しやすい。これらの結
合体は通常単量体吸収の短波長側にシフトした吸収バン
ドを有し、概ね非常に弱い蛍光種である。水溶液でのシ
アニン染料の結合体易形成傾向は特に写真工業で周知で
ある〔Ｗｅｓｔ Ｗ．＆ Ｐｉｅｒｃｅ Ｓ．、Ｊ．Ｐ
ｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，６９；１８９４（１９６５）；Ｓ
ｔｕｒｍｅｒ Ｄ．Ｍ．、Ｓｐｅｃ．Ｔｏｐ ｉｎ Ｈ
ｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０
（１９７４）〕。

【００２６】多くの染料分子特にシアニン染料分子は水
溶液中結合体を形成しやすい。然るに、アリールスルホ
ネート染料はこれらの結合体形成傾向を最低限で有する
と分かった。アリールスルホネート染料を蛍光標識試薬
の形成に用いるとき、それは、蛋白又は抗体の如き他の
分子に高い表面密度で結合する場合結合体形成傾向が低
下する。塩溶液（例 １５０ｍＭ塩化ナトリウム）中特
定染料分子が結合体を形成する傾向は、同じ染料分子が
蛋白の表面上で結合体を形成する傾向の尺度として採用
されうる。それ故、染料分子が水性塩溶液中結合体を形
成する傾向が最低限であることが望ましい。第２図に示
すデーターを用いて、特定のアリールスルホネート化染
料が水性塩溶液中高濃度でさえ結合体を形成する傾向が
低いことを例示することができる。

【００２７】第１図は、水性緩衝液に溶解せる典型的シ
アニン染料の単量体吸収スペクトルおよび二量体吸収ス
ペクトルを示す。これらのスペクトルを生じさせるのに
用いられる染料Ｎ，Ｎ’−ジ−スルホブチルインドジカ
ルボシアニンはアリールスルホネート基を有さず、ミリ
モル範囲未満の濃度でさえ二量体を容易に形成する。二
量体スペクトルは濃度の異なる染料スペクトルから算定
された（Ｗｅｓｔ ＆Ｐｅａｒｃｅ、１９６５の方法参
照）。燐酸塩緩衝剤入り食塩溶液中３ミリモルの濃度で
は、単量体および二量体バンドの吸収はほぼ等しかっ
た。

【００２８】改善されたスルホインドジカルボシアニン
Ｎ，Ｎ’−ジエチルインドジカルボシアニン−５，５’
−ジスルホン酸のスペクトルを第２図に示す。この染料
は濃度１０ミリモルまでの食塩溶液中結合体の兆候を何
ら示さなかった。

【００２９】特定の反応染料が抗体の如き蛋白に定義さ
れた反応条件で結合する効率を測定することは常法であ
る。試験染料はＮ，Ｎ’−ジカルボキシペンチルインド
ジカルボシアニン−５，５’−ジスルホン酸のビス−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドであった。第３図は、この
スルホシアニン染料活性エステルがｐＨ９．２の炭酸塩
緩衝液中で羊免疫グロブリンと効率よく反応し、反応溶
液中相対的染料ないし抗体濃度に依って１未満〜２０以
上の範囲にわたる染料：抗体モル比を有する共有標識抗
体分子を形成することを例示する。データーに最小２乗
法を適用して得た勾配は、斯かる条件下この染料の標識
効率が約８０％であることを示している。同様の調査
で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が
約２０％の効率を以て反応した。

【００３０】新規なスルホインドジカルボシアニン染料
の活性エステルの反応性は羊免疫グロブリン（ＩｇＧ）
を標識することによって調べられた。蛋白（４ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．１モル炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）に溶かし
た。無水ジメチルホルムアミドに溶解せる反応性染料の
アリコートを蛋白試料に加えて初期の染料：蛋白モル比
を得た。３０分後、ゲル透過クロマトグラフィー（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０）により羊結合染料から蛋白を
分離した。得られた染料：蛋白モル比を分光光度計で調
べ、これを第３図に示す。

【００３１】低い染料：蛋白比において、標識蛋白の吸
収スペクトルは、遊離単量体染料のスペクトルと密接に
対応するバンドを示す。高度標識され（染料：蛋白比の
高い）或は、水性溶液中凝集傾向の高い染料で標識され
た抗体分子は往々、水性溶液中単量体染料吸収バンドよ
りも短波長で現われる新しい吸収ピークを有することが
見出されている。新しい吸収ピークの波長はしばしば、
染料の二量体吸収スペクトル特性を示す領域に入る（第
１図参照）。

【００３２】抗体の標識度が高いほど短波長：長波長吸
収ピーク比は高い。この、より短い波長吸収ピークは第
４図中約５９０ｎｍで見ることができる。第４図中、よ
り長い波長（６４５ｎｍ）ピークは、抗体に結合した単
量体染料分子による。第４図の抗体吸収スペクトルをも
たらすのに用いた標識試薬Ｎ，Ｎ’−ジカルボブチルイ
ンドジカルボシアニン−５，５’−酢酸のビス−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルはアリールスルホネー
ト基を有さず、水性塩溶液中でまた、それが反応した抗
体上で二量体を容易に形成する。重要なこととして、こ
れら抗体の蛍光励起スペクトルは、短波長ピークでの標
識抗体の励起が、長波長ピークで励起する程多くは蛍光
を比例的に生成しないことを示す。この考察は、短波長
吸収ピークが抗体分子上の非蛍光二量体ないし結合体の
形成によるという概念と調和する。

【００３３】本発明者等は、第３図のデーターを得るの
に使用したアリールスルホネートシアニン染料が、二量
体の特徴的吸収波長におけるはるかにより小さな吸収ピ
ーク（第５図参照）によって判断される如く抗体分子上
で容易には結合しないことを見出した。これは、抗体お
よび他の「非結合性」標識試薬が蛍光のより強い標識蛋
白を産生すべきなので重要である。実際、アリールスル
ホシアニンは平均染料／抗体比が比較的高いときでさえ
鮮明な蛍光抗体を産生する（第６図参照）。

【００３４】第４図にカルボキシインドジカルボシアニ
ン染料で標識された羊免疫グロブリンを示す。第５図
は、新規なスルホインドジカルボシアニン染料と結合し
た蛋白を示す。前者の試料において増加した二量体の存
在（第１図参照）は明らかである。両調製物で染料：蛋
白モル比はほぼ同じであるけれども、第５図に示す蛋白
は第４図に示す試料よりも蛍光が強かった。

【００３５】蛍光染料で標識された鮮明な蛍光性抗体又
は他の蛋白を有するには、蛋白上染料分子当りの平均量
子収量ができるだけ高いことが重要である。一般に、蛋
白上染料分子の表面密度が高くなる（すなわち染料／蛋
白比が増加する）につれ、染料の平均量子収量が低下す
る。この効果は時折、標識度の高い蛋白の表面上染料相
互作用の結果として生じるケンチングに起因してきた。
確かに、蛋白表面上非蛍光二量体の形成はこのケンチン
グに寄与しうる。第６図は、染料／蛋白比が高くなるに
つれアリールスルホシアニン染料の平均量子収量が緩徐
に低下することを示している（菱形印を繋ぐ曲線）。こ
れとは対照的に、丸印を繋ぐ曲線は、染料／蛋白比が高
くなるにつれ非アリールスルホシアニン染料（Ｎ，Ｎ’
−ジ−スルホブチルインドジカルボシアニン−５−イソ
チオシアネート）の結合に関する平均量子収量の非常に
迅速な低下があることを示している。それ故、第６図に
例示されるスルホシアニン染料は、他の染料に比較し
て、特に抗体分子当り染料分子１〜１０個の標識範囲で
より鮮明な蛍光抗体を産生する。

【００３６】標識蛋白上の個々の染料分子の平均蛍光量
子収量はこれら生物分子から得られる蛍光信号の尺度で
ある。燐酸塩緩衝剤入り食塩溶液中の新規なスルホイン
ドジカルボシアニン染料で標識された羊免疫グロブリン
（ＩｇＧ）からのデーターは第６図の菱形印を繋いだ曲
線で示される。第６図の丸印を繋いだ曲線は、比較のた
めインドジカルボシアニン−イソチオシアネート反応性
染料で標識した蛋白を示す。第６図で、染料／蛋白比０
での量子収量は緩衝液中反応性染料（遊離染料）のメチ
ルアミン付加物に関する値を示す。

【００３７】バックグラウンド方法 発光プローブは、分子および細胞を分析分離しまた他物
質を検出定量するのに有用な試薬である。非常に少ない
数の発光分子が最適環境下で検出することができる。Ｂ
ａｒａｋとＷｅｂｂは、ＳＩＴカメラを用いて細胞のＬ
ＤＬ受理に関連した５０個未満の蛍光脂質類似物を可視
化した（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５−６０
４（１９８１）〕。粒子若しくは特定細胞に関連した１
０，０００個未満のフルオレセイン分子の検出にフロー
血球計算法を用いることができる〔Ｍｕｉｒｈｅａｄ、
ＨｏｒａｎおよびＰｏｓｔｅ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ３：３３７−３５６（１９８５）〕。蛍光プロ
ーブ応用のいくつかの特定例は、（１）蛍光フロー血球
計算法、蛍光賦活細胞分類および蛍光鏡検法という技法
による細胞混合物中の細胞の部分母集団の同定および分
離、（２）蛍光免疫アッセイの技法で別の種に結合する
物質（例えば抗原−抗体反応物）の濃度測定および
（３）蛍光染色の技法によるゲルおよび他の不溶性担体
中の物質のローカリゼイションである。これらの技法に
ついては、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ等、「細胞免疫学（Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第３版、
第２２章；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７８（蛍光賦活細胞
分類）およびＧｏｌｄｍａｎ、「蛍光抗体法（Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ）」、ニューヨーク所在Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、１９６８（蛍光鏡検法および蛍光染色（ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇ））並びに Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ、編集Ｔａｉｏｒ等、Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ Ｉ
ｎｃ．、１９８６に記載されている。

【００３８】上記目的に蛍光を用いるとき、蛍光物質の
選定に多くの制約がある。一つの制約は蛍光物質の吸収
および放出特性である。なぜなら、多くのリガンド、受
容体および、検体例えば血液、尿素、脳脊髄液中の物質
は蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確な測定を干渉する
からである。この現象はオートフルオレッセンス又はバ
ックグラウンド蛍光と呼ばれる。別の考慮すべき点は、
蛍光物質の、リガンドおよび受容体並びに他の生物学的
ないし非生物学的物質への結合能力と斯かる蛍光物質に
対する結合の効果である。多くの状況で、別の分子への
結合は蛍光物質の蛍光特性における実質的変化をもたら
し得、或る場合蛍光物質の量子効率を実質的に損ない或
いは低下させる。蛍光物質との結合が、標識分子の機能
を不活性にすることも可能である。三つ目の考慮すべき
点は、鋭敏検出の場合高くあるべき蛍光物質の量子効率
である。四つ目の考慮すべき点は、できるだけ大きくあ
るべき蛍光物質の吸光能又は吸光率である。また、蛍光
分子が近接状態にあるとき互いに干渉してセルフケンチ
ングを生じるか否かが関係する。更に、蛍光物質が他の
化合物と或は該蛍光物質そのものにより或は該物質が結
合している化合物との関連において容器壁と非特異結合
するか否かも関係する。

【００３９】上記方法の適用性および価値はふさわしい
蛍光化合物の入手性と密接に結付く。特に、長波長可視
領域（黄〜近赤外）で発光する蛍光物質が入用である。
なぜなら、これら発色団の励起はオートフルオレッセン
スをあまり生ぜず、またスペクトルの全可視および近赤
外領域を使用しうるとき別異の波長で発光する多数の発
色団が同時分析できるからである。広く用いられている
蛍光化合物フルオレセインは緑領域では有用なエミッタ
ーであるけれども、特定の免疫検定および細胞分析系で
はフロオレセイン吸収波長での励起により生じるバック
グラウンドオートフルオレッセンスが検出感度を制限す
る。しかしながら、慣用の赤蛍光標識ロダミンはフルオ
レセインより効果が低いと分かった。Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ（登録商標）は５７８ｎｍで励起しうる有用な標識試
薬であり、６１０ｎｍで最大限に蛍光を発する。

【００４０】フィコビリプロテインは、その高い吸光率
と高い量子収量の故に重要な貢献をなしてきた。斯かる
発色団含有蛋白は多くの蛋白に共有結合し得、而して鏡
検法およびフロー血球計算法での蛍光抗体アッセイに用
いられる。フィコビリプロテインは、（１）蛋白標識法
が比較的複雑であり、（２）蛋白標識効率が通常高くな
く（典型的には平均０．５フィコビリプロテイン分子／
蛋白）、（３）フィコビリプロテインが天然物で、その
調製および精製が複雑であり、（４）フィコビリプロテ
インが高価であり、（５）６８０ｎｍで最大限蛍光を発
するアロフィコシアニンより更に赤領域スペクトルで蛍
光を発する標識試薬として有効なフィコビリプロテイン
が現存せず、（６）フィコビリプロテインが比較的化学
的に不安定であり、（７）それが比較的容易に光褪色
し、（８）フィコビリプロテインが３３，０００〜２４
０，０００範囲の分子量を持つ大蛋白であり、代謝産
物、薬物、ホルモン、誘導ヌクレオチドおよび、抗体を
含む多くの蛋白の如き標識が望ましい多くの物質より大
きいという欠点を有する。後者の欠点は特に重大であ
る。なぜなら、大きなフィコビリプロテインで標識され
た抗体、アビジン、ＤＮＡハイブリダイゼーションプロ
ーブ、ホルモンおよび小分子は複合錯体の寸法によって
課せられた立体的制限故にそのターゲットに結合し得
ず、またターゲットへの結合物の結合速度が低分子量結
合物に対して緩徐だからである。

【００４１】組織学、細胞学、免疫検定を含む他の技法
も亦、長い波長での高い量子効率、吸収および放出特性
を示し、簡単な結合手段を有し且つ非特異的干渉の事実
上ない蛍光物質の使用から実質的益を受ける。

【００４２】発明のアウトライン 本発明は、標識成分の検定および定量化目的で比較的大
きな吸光率および高い量子収量を有する蛍光アリールス
ルホネート化シアニンおよび関連染料を用いる。蛍光シ
アニンおよび関連染料は、抗体、抗原、アビジン、スト
レプトアビジン、蛋白、ペプチド、誘導ヌクレオチド、
炭水化物、脂質、生物学的細胞、バクテリア、ウイル
ス、血液細胞、組織細胞、ホルモン、リンフォカイン、
トレース生物分子、トキシンおよび薬物の如き生物学的
物質を標識するのに用いることができる。また、蛍光染
料は、可溶性重合体、重合体ないしガラス粒子、薬物、
導体、半導体、ガラスないし重合体表面材、重合体膜お
よび他の固体粒子の如き非生物学的物質を標識するのに
も用いることができる。標識される成分は、他の物質を
含む混合形で存在しうる。標識反応が生じる混合物は液
体混合物特に水混合物でありうる。検出段階は顕微鏡ス
ライドの如き液体若しくは乾燥状態の混合物を以て生じ
うる。

【００４３】本発明は、ターゲット分子に好ましくはア
ミン若しくはヒドロキシ部位或る場合にはスルフヒドリ
ル若しくはアルデヒド部位で共有結合する反応性基のシ
アニン分子への編入により変性すべきシアニン染料を必
要とする。本発明はまた、シアニンおよび関連染料構造
の試験液体への溶解性を高めて（１）標識反応での取扱
いを容易にし、（２）標識される蛋白の表面上での染料
結合の防止を助成し且つ（３）生物学的物質および表面
材ないしアッセイ装置への標識物質の非特異的結合の防
止を助成すべくシアニンおよび関連染料構造の使用ない
し変性を用いる。

【００４４】シアニンおよび関連染料は、現存の蛍光標
識試薬に勝る重要な利点を供する。先ず第一に、４００
〜約１１００ｎｍ範囲のスペクトル領域で吸光ないし発
光するシアニンおよび関連染料が合成される。斯くし
て、これら染料の反応性誘導体は、複数の標識物質を同
時測定することが必要なアッセイ用に調製されうる。こ
の種のマルチカラー（若しくはマルチパラメーター）分
析は簡素化、コスト効果或は、粒子の複雑な混合物中の
各粒子上の異なる標識種の比（例えばマルチパラメータ
ーフロー血球計算法若しくは蛍光顕微鏡による複雑な混
合物中の個々の血液細胞上の抗原マーカーの比）の決定
に望ましい。第二に、多くのシアニンおよび関連染料は
強く光を吸収し且つ蛍光を発する。第三に、多くのシア
ニンおよび関連染料は比較的光安定性で、蛍光顕微鏡下
迅速には漂白しない。第四に、簡単且つ効果的な結合試
薬であるシアニンおよび関連染料誘導体を製造すること
ができる。第五に、多くの構造および合成方法が有効で
あり、またこの種の染料は多目的である。それ故、試薬
を多少水溶性にするのに多くの構造上の変性を行なうこ
とができる。そのチャージは、それが結合する分子をか
き乱さないようまた非特異的結合が低下しうるよう変化
しうる。第六に、フィコビリプロテインとは異なって、
シアニン染料は比較的小さく（分子量＝１，０００）、
そのためその結合域に迅速到達し或はその機能を遂行す
る標識分子能力を目立つほど立体障害しない。

【００４５】斯くして、シアニンタイプ染料標識剤は多
くの潜在的利点を供する。斯かる染料は、液体特に水性
液体中での成分１種ないし２種以上の選択的標識に用い
ることができる。次いで、標識成分は光学的方法又はル
ミネッセンス方法により検出することができる。別法と
して、標識成分は、それが強い親和性を有する別の成分
の染色に用いられ、而して後者の成分は光学的ないしル
ミネッセンス方法で検出される。この場合、染料は標識
成分のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスルフ
ヒドリル基と反応する。例えば、標識成分は抗体であり
得、それが強い親和性を有する染色された成分は生物学
的細胞、抗原若しくはハプテン、又は抗原若しくはハプ
テンを含有する生物学的細胞ないし粒子でありうる。別
の例では、標識成分はアビジンで、染色される成分はビ
オチニル化物質でありうる。また、ポリメチンシアニン
タイプ染料と結合したレクチンを用いて特定の炭水化物
基を検出定量することができる。加えて、発光シアニン
および関連染料はＤＮＡ若しくはＲＮＡフラグメントに
結合しうる。ＤＮＡ若しくはＲＮＡ標識フラグメント
は、ＤＮＡないしＲＮＡを含有する試料中特定の相補ヌ
クレオチド序列の有無および量を調べる蛍光ハイブリダ
イゼーションプローブとして用いることができる。ま
た、該染料はホルモンないしリガンド（例 ホルモン、
蛋白、ペプチド、リンフォカイン、代謝産物）に結合
し、次いで該ホルモンないしリガンドは受容体に結合し
うる。

【００４６】反応性シアニンの他の用途に関する特許の
記述 Ｍｉｒａｈａ等（米国特許第４，３３７，０６３号）並
びにＭａｓｕｄａ等（米国特許第４，４０４，２８９
号、同第４，４０５，７１１号および同第４，４１４，
３２５号）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エス
テル基を有する種々のシアニン染料を合成している。こ
れらの特許は、上記試薬が写真感光剤として用いられう
ることを示している。該試薬の見込まれる蛍光性質は上
記特許に記述されておらず、事実そのプロセスには蛍光
が必要とされない。上記特許に列挙された染料のほとん
どは弱い蛍光しか発せず、特に光安定性でなく、その溶
解特性も、標識物資の蛍光検出を伴う多くの用途に最適
でない。

【００４７】Ｅｘｅｋｉｅｌ等（英国特許第１，５２
９，２０２号）は、共有反応性分子として用いることの
できる多くのシアニン染料誘導体を提示している。この
試薬に用いられる反応性基は、モノ−若しくはジクロロ
トリアジン基が属するアジン基である。該英国特許は写
真フィルム感光剤としての上記試薬の開発および使用に
関する。蛍光はそのプロセスに必要でなく、記述された
試薬のほとんどは蛍光を発しない。この英国特許は、標
識物質を検出ないし定量することを目的とした反応性シ
アニン染料の開発および使用に関するものでない。

【００４８】具体化の説明 本発明は、標識されている物質を、それがルミネッセン
ス検出方法により検出され且つ／或は定量されうるよう
発光性とするため発光シアニンおよびシアニンタイプ染
料を生物学的物質、非生物学的分子および巨大分子並び
に粒子に共有結合させる方法に関する。

【００４９】本発明は、液体中の成分を検出する際、該
液体に可溶の染料で、該染料を成分上のアミンないしヒ
ドロキシ基場合によってアルデヒドないしスルフヒドリ
ル基と共有結合させる置換基を含有するシアニン、メロ
シアニンおよびスチリル染料よりなる群から選ばれる染
料を加えてそれが上記成分を標識するようにする方法に
関する。標識成分はルミネッセンス若しくは光吸収方法
により検出され且つ／或は定量される。標識成分が抗
体、ＤＮＡフラグメント、ホルモン、リンフォカイン又
は薬物であるときは、該標識成分を、それが結合する別
の成分の有無を調べるのに用いることができ、而して該
別の成分を検出し且つ／或は定量することができる。

【００５０】任意の有効なルミネッセンス又は吸光検出
段階を用いることができる。例えば、検出段階は、液体
を初めに定義した波長の光で照明する光学的検出段階と
することができる。次いで、標識成分により蛍光ないし
燐光を発せられる別の定義波長での光が検出される。検
出はまた、光学的吸光によるものとしうる。例えば、検
出段階は、液体に初めの定義波長の光を通し次いで液体
により伝導される光波長を確認することを含む。

【００５１】所望なら、検出段階は、成分へのシアニン
若しくは関連発色団の結合を化学的に検出する化学分析
を含みうる。

【００５２】共有標識試薬を創生すべく変性されうるシ
アニン、メロシアニンおよびスチリル染料の基本構造を
以下に示す：シアニン

【化１】 メロシアニン

【化２】 スチリル

【化３】 下記のものはポリメチンタイプ染料の更に特定した例で
ある：シアニン

【化４】 メロシアニン

【化５】 スチリル

【化６】 シアニン

【化７】 メロシアニン

【化８】 スチリル

【化９】 上記構造において、ＸおよびＹはＯ，Ｓおよび

【化１０】 よりなる群から選ばれ、ＺはＯおよびＳよりなる群から
選ばれ、そして、ｍは１，２，３および４よりなる群か
ら選ばれる整数である。

【００５３】上記式において、メチン基の数は部分的に
励起カラーを決定する。環式アジン構造も亦、部分的に
励起構造を決定しうる。しばしば、ｍのより高い値は増
加ルミネッセンスないし吸光度に寄与する。４より高い
ｍの値では、化合物は不安定になる。そこでは、環構造
での変性により更にルミネッセンスが付与されうる。ｍ
＝２のとき、励起波長は約６５０ｎｍで、該化合物は正
しく蛍光を発生する。最大発光波長は最大励起波長より
概ね１５〜１００ｎｍ大きい。

【００５４】各分子中Ｒ₁ ，Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ ，Ｒ₅ ，
Ｒ₆ およびＲ₇ 基の少なくとも一つ（好ましくは一つの
み場合により二つないし三つ以上）は、染料を標識成分
に結合させるための反応基である。或る試薬に関して
は、各分子上Ｒ₁ ，Ｒ₂ ，Ｒ₃，Ｒ₄ ，Ｒ₅ ，Ｒ₆ およ
びＲ₇ 基の少なくとも一つは、発色団の溶解性を高め或
は標識成分の標識の選択性ないし染料による標識成分の
標識位置に影響する基でありうる。

【００５５】上記式において、Ｒ₈，Ｒ₉（存在時）およ
びＲ₁₀（存在時）の少なくとも一つはスルホネート基の
少なくとも一つを含む。用語スルホネート基はスルホン
酸を含むものとする。なぜなら、スルホネート基はイオ
ン化スルホン酸に過ぎないからである。

【００５６】発色団に直接若しくは間接に結合して
Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆およびＲ₇基を形成しう
る反応基として、イソチオシアネート、イソシアネー
ト、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ
−ないしジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジ−
ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スル
ホニルハリド、酸ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イ
ミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、ア
ジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、
グリオキサルおよびアルデヒドを含有する基の如き反応
部分が含まれうる。

【００５７】有効アミノ、ヒドロキシおよびスルフヒド
リル基を有する成分の標識に特に有用なＲ₁，Ｒ₂，
Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆およびＲ₇基の特定例として次のも
のが含まれる。

【００５８】

【化１１】 （ここで、Ｑ又はＷの少なくとも一つはＩ、Ｂｒ又はＣ
ｌの如き残基である）、

【化１２】 ２段階法で抗体を標識するのに用いることのできる有効
スルフヒドリルを有する成分の標識に特に有用なＲ₁，
Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆およびＲ₇基の特定例は次のも
のである：

【化１３】 （ここで、ＱはＩ又はＢｒの如き残基である）、

【化１４】 および

【化１５】 （ここで、ｎは０又は整数である）。

【００５９】光賦活架橋による成分の標識に特に有用な
Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆およびＲ₇基の特定例と
して

【化１６】 が含まれる。

【００６０】水溶性を高め、或は試料中不適当な成分へ
の標識成分の望ましくない非特異性結合を減じ、或いは
また蛍光のケンチングをもたらしうる標識成分上の反応
性発色団２種以上の相互作用を低下させるために、
Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆およびＲ₇基を周知の極
性ないし帯電化学基から選定することができる。例は−
Ｅ−Ｆであり、ここでＦはヒドロキシ、スルホネート、
スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ又は第四
アミノを示し、Ｅは−（ＣＨ₂）_n（ｎ＝０，１，２，３
又は４）の如きスペーサー基を示す。有用な例にはアル
キルスルホネート−（ＣＨ₂）₃ＳＯ^3-および−（Ｃ
Ｈ₂）₄−ＳＯ^3-が含まれる。

【００６１】本発明の発光染料のポリメチン鎖はまた、
ポリメチン鎖の炭素原子２個以上の間のブリッジを形成
する環式化学基１個以上を含みうる。これらのブリッジ
は染料の化学的安定性若しくは光安定性を高めるのに役
立ち得、また染料の吸光ないし発光波長を変えたり量子
収量の吸光係数を変化させるのに用いられうる。改良さ
れた溶解特性はこの変性によって達成することができ
る。

【００６２】本発明に従えば、標識成分は抗体、蛋白、
ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝
産物、レセプタ、抗原、ハプテン、レクチン、アビジ
ン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、寡糖類、
多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ
核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導
ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬
物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イ
ースト成分、血液細胞、血液細胞成分、生物細胞、非細
胞血液成分、バクテリア、バクテリア成分、天然ないし
合成脂質嚢、合成薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、
重合体粒子、ガラス粒子、ガラス表面材、プラスチック
粒子、プラスチック表面材、重合体膜、導体および半導
体でありうる。

【００６３】或る成分との反応時６３３ｎｍで光を吸収
しうるシアニン又は関連発色団を調製することができ、
而して検出工程は、このスペクトル波長で発光するヘリ
ウムネオンレーザーを用いることができる。また、或る
成分との反応時７００ｎｍと９００ｎｍとの間で最大限
に光を吸収しうるシアニン又は関連染料を調製すること
ができ、而して検出工程は、スペクトルのこの領域で光
を放出するレーザーダイオードを用いることができる。

【００６４】選択性 上に列挙した反応性基は、適当なｐＨ条件を含む適当な
反応条件が用いられる限り蛋白その他生物学的若しくは
非生物学的分子、巨大分子、表面材又は粒子上の特定官
能基を標識するのに比較的特異性である。

【００６５】反応性シアニン、メロシアニンおよびスチ
リル染料並びにそれらの生成物の特性 本発明の染料のスペクトル特性は、本明細書に記載の官
能化によっては認めうるほど変化しない。標識蛋白その
他の化合物のスペクトル特性も亦、蛋白その他の物質に
結合してないベース染料分子とさほど異ならない。単独
若しくは標識物質に結合した本発明に記載の染料は概
ね、大きな吸光係数（ε＝１００，０００〜２５０，０
００）と、或る場合には０．４程度の高い量子収量を有
し、そして４００〜９００ｎｍのスペクトル範囲で光を
発生する。斯くして、それらは発光検出用試薬を標識す
るものとして特に価値がある。

【００６６】光学的検出方法 標識ないし染色成分を検出するのに任意の方法を用いる
ことができる。検出方法は、初めに定義された波長の光
で標識物質を含む混合物を照明する光源を用いることが
できる。該混合物により伝達され或は該混合物により蛍
光ないし発光される第二波長で光を検出する既知装置が
用いられる。斯かる検出装置に蛍光分光計、吸収分光測
光、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡ないしフロー血球計算
器、ファイバーオプチックセンサーおよび免疫検定装置
が含まれる。

【００６７】本発明の方法は、単数ないし複数の標識成
分への染料結合を検出するのに化学的分析方法を用いる
こともできる。化学的分析方法には赤外スペクトロメト
リー、ＮＭＲスペクトロメトリー、吸収スペクトロメト
リー、蛍光スペクトロメトリー、質量スペクトロメトリ
ーおよびクロマトグラフィー方法が含まれうる。

【００６８】

【実施例】例 １ スルホインドジカルボシアニンと蛋白との結合に対する
ｐＨの影響 ０．１Ｍ炭酸塩緩衝液中の羊γ−グロブリン（４ｍｇ／
ｍｌ）試料を室温で１０倍モル過剰の下記スルホインド
ジカルボシアニン活性エステル（ｍ＝２）と室温で混合
した：

【化１７】 ５秒〜３０分範囲の適当な時間、セファデックスＧ−５
０上でのゲル透過クロマトグラフィーにより蛋白試料を
非共有結合染料から分離した。蛋白の最大標識は１０分
後に生じて、ｐＨ８．５、８．９および９．４でインキ
ュベートした試料に関し夫々５．８、６．４および８．
２の最終的染料／蛋白モル比をもたらした。染料／蛋白
比を５とするのに必要な時間および異なるｐＨでの生成
物の量子収量を次表に示す：ｐＨ 時間（ｓｅｃ） 量子収量 ８．５ １１５ ０．０９ ８．９ ５３ ０．０９ ９．４ ６．５ ０．１７ 上記データーは、この染料で標識した蛋白がｐＨ９未満
よりもｐＨ９．４において良好であることを示してい
る。緩衝液のｐＨが高いほど、結合反応は非常に迅速で
あるが、標識効率が優れ、生成物の蛍光度が高い。量子
収率は標識蛋白上の染料分子当りの平均量子収量を表わ
す。

【００６９】例 ２ スルホインドカルボシアニン活性エステルと蛋白との結
合 ｐＨ７．４の燐酸塩緩衝剤入り塩水（ＰＢＳ）に溶解せ
る羊γ−グロブリン（１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ炭酸
ナトリウムを用いてｐＨ９．４に調節した。種々の染料
／蛋白モル比を得るためにこの蛋白溶液のアリコートに
シアニン染料標識剤（例１の構造、ｍ＝１）を加えた。
室温で３０分のインキュベーション後、ＰＢＳを溶離剤
とするセファデックスＧ−５０ゲル透過クロマトグラフ
ィーにより分離した。生成物中蛋白に共有結合した染料
のモル比は、初期染料／蛋白比３、６、１２、２４およ
び３０に関し夫々１．２、３．５、５．４、６．７およ
び１１．２であった。

【００７０】例 ３ スルホインドジカルボシアニンによるＡＥＣＭデキスト
ランの標識 デキストラン分子当り平均１６個のアミノ基を含有する
Ｎ−アミノエチル−カルボキシアミドメチル（ＡＥＣ
Ｍ）デキストランを平均分子量７００００のデキストラ
ンから合成した〔Ｉｎｍａｎ、Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１１４：７０４−７０９（１９７５）〕。ｐＨ
９．４の、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液に溶解せるＡＥＣＭ−
デキストラン（１ｍｇ／２５０μｌ）の一部分をスルホ
インドジカルボシアニン活性エステル（例１の構造、ｍ
＝２）０．２ｍｇに加えて染料／蛋白モル比１０を得
た。混合物を室温で３０分間攪拌した。次いで、溶離緩
衝液として酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）を用いたセフ
ァデックスＧ−５０ゲル透過クロマトグラフィーにより
デキストランを非結合染料から分離した。各デキストラ
ン分子に平均２．２個の染料分子が共有結合した。

【００７１】例 ４ 特異抗体のスルホインドジカルボシアニン活性エステル
標識 １．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のネズミＩｇＧ
（１ｍｇ／ｍｌ）に対し特異な羊γ−グロブリンとスル
ホインドジカルボシアニン活性エステル（例１の構造、
ｍ＝２）とを染料分子／蛋白分子比８で混合した。室温
で３分間のンキュベーション後、標識混合物を、燐酸塩
緩衝剤入り塩水（ｐＨ７．４）で平衡させたセファデッ
クスＧ−５０上でのゲル濾過により分離した。回収され
た蛋白には、各蛋白に共有結合した平均４．４の染料分
子が含まれた。

【００７２】例 ５ 羊抗マウスＩｇＧ抗体に結合したスルホインドジカルボ
シアニン染料によるヒトリンパ球の染色ないし顕微鏡可
視化 新たに単離した抹消血リンパ球をマウス抗−β２−ミク
ログロブリン（０．２５μｇ１０⁶細胞）により０℃で
３０分間処理した。細胞をＤＭＥＭ緩衝液で二回洗浄
し、次いでスルホインドジカルボシアニン標識羊抗−マ
ウスＩｇＧ抗体（１μｇ／１０⁶細胞）で処理した。０
℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を遠心処理
して過剰の抗体を除去し、細胞を再度ＤＭＥＭ緩衝液で
洗浄した。蛍光顕微鏡で分析すべく細胞のアリコートを
スライド上に固定させた。顕微鏡下、スライド上のリン
パ球を６１０〜６３０ｎｍの光で照射し、イメージデジ
タル化装置およびテレビモニターに取付けたＣＯＴＵ赤
色感知性増強テレビカメラによって６５０〜７００ｎｍ
の蛍光を検出した。この方法で染色した細胞は顕微鏡下
蛍光を示した。対照実験で、一次マウス抗−β２−ミク
ログロブリン抗体の使用を省いたほかは上記の如く染色
および分析を行なった。対照試料は顕微鏡下で蛍光を示
さず、而してスルホインドシアニン標識羊抗−マウス抗
体がリンパ球への有意な非特異性結合をもたらさないこ
とを示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１図は、Ｎ，Ｎ’−ジスルホブチルインド
ジカルボシアニン染料の単量体吸収スペクトルおよび二
量体スペクトルを示す。

【図２】 第２図は、Ｎ，Ｎ’−ジエチルインドジカル
ボシアニン−５，５’−ジスルホン酸染料のスペクトル
を示す。

【図３】 第３図は、Ｎ，Ｎ’−ジカルボキシペンチル
インドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホン酸のビ
ス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド染料による羊免疫グ
ロブリンの標識反応における染料／蛋白モル比を示す。

【図４】 第４図は、Ｎ，Ｎ’−ジカルボブチルインド
ジカルボシアニン−５，５’−酢酸のビス−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルで標識された抗体の吸収ス
ペクトルを示す。

【図５】 第５図は、新規なスルホインドジカルボシア
ニン染料と結合した蛋白の吸収スペクトルを示す。

【図６】 第６図は、染料／蛋白比の上昇に伴うアリー
ルスルホシアニン染料の量子収量（菱形印）変化と非ア
リールスルホシアニン染料のそれ（丸印）との比較を示
す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミン、アルデヒド、スルフヒドリル若
   しくはヒドロキシル基を含有する成分と、染料をして該
   成分上のアミン、アルデヒド、スルフヒドリル若しくは
   ヒドロキシル基と共有反応させる置換基を少なくとも１
   個含有するスルホインドレニン基剤ないしナフトスルホ
   インドレニン基剤ポリメチン染料よりなる群から選ばれ
   る水溶性染料との発光光安定性反応生成物であって、該
   反応生成物上の個々の染料分子が少なくとも５０，００
   ０ｌ／モルｃｍの平均分子吸光計数および少なくとも２
   ％の平均量子収量を有し、標識成分が水性環境にあると
   き最大４００〜８５０ｎｍ範囲の光を吸収および放射す
   る生成物。
2. 【請求項２】 前記成分が、蛋白、ペプチド、薬物、ト
   キシン、代謝産物、リンフォカイン、炭水化物、脂質、
   血液細胞、バクテリア粒子、ウイルス粒子、抗原、ハプ
   テン、重合体粒子、ガラス表面材および重合体表面材よ
   りなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１項記載の生
   成物。