Pyridin- und Chinolin-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere, Arzneistoffe und Partikel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Chinolinium- bzw. Pyridiniumderivate, die insbesondere als Marker für Biomoleküle, Polymere, Arzneistoffe und Partikel geeignet sind.
Die Fluoreszenzmarkierung von Biomolekülen mit Farbstoffen, deren Absorptionen und Emissionen im roten ( > 600 nm) und nahem infraroten ( > 700 nm) Spektralbereich liegen, findet u.a. Anwendungen in der Biotechnologie und medizinischen Diagnostik [Methods Enzymol. 246 ( 1 995) 362-73] . Gegenwärtig werden dazu oft reaktive Cyaninfarbstoffe (Polymethine) verwendet, die im Chromophor symmetrisch sind. Das heißt, die beiden heterocyclischen Endgruppen der Polymethinkette sind identisch bzw. unterscheiden sich nur in der Art der Stickstoffsubstituenten. Auch werden fast ausschließlich Hetero-Inden-Derivate als Endgruppen verwendet. Dazu gehören u.a. die Ringysteme des 3,3-Dialkylindols,
Benzothiazols, Benzoxazols und ihre benzoanellierten Analoga (siehe z.B. US
- Patent 5569766; US Patent 5800995; WO 97/40104) . Um mit solchen
Endgruppen eine Absorption bei über 600 nm zu erreichen, sind aber mindestens 5 C-Atome in der exocyclischen Polymethinkette notwendig. Eine derart lange Polymethinkette vermindert allerdings die Stabilität des Farbstoff-Chromophors.
Pyridinium- und Chinolinium-Farbstoffe mit Funktionalitäten, die sie als Interkalatoren für DNA und RNA geeignet machen, sind aus dem US-Patent 541 0030 und WO 97/1 7076 bekannt. Interkalatoren sind aber als Reaktivfarbstoffe ungeeignet.
Pease beschreibt polymethinartige Quadratsäure-Farbstoffe, die als fluoreszierende Marker verwendet werden können (US Patent 541 6214; US Patent 531 0992; US Patent 4830786) . Dabei sind die Endgruppen aus der Reihe der Fünfring-Hetero-Indene bzw. der Aniline ausgewählt.
Die bisher beschriebenen Marker-Farbstoffe weisen in ihrer Gesamtheit einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf: ungenügende Photo- oder Lagerstabilität aufwendige Synthese- bzw. Reinigungsschritte geringe Absorptionskoeffizienten bzw. Fluoreszenzquantenausbeuten unerwünschte Änderung der optischen Eigenschaften in Gegenwart von - oder nach -Bindung an Proteine oder Nucleinsäureoiigomere.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand deshalb darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die als Marker-Farbstoffe verwendet werden können und mit denen die Nachteile der bekannten Marker-Farbstoffe zumindest teilweise ausgeräumt werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Chinolinium- oder Pyridiniumderivat der allgemeinen Formel (la), (Ib), (Ha) oder (llb):
(la) Ob)
(Ha) (üb) worin Z für eine Gruppe
steht, worin X ein Element ausgewählt aus der Gruppe O, S, Se oder ein Struktureiement ausgewählt aus NR17, C(CH3)2 oder CH = CH darstellt; mindestens einer der Reste R, bis R15 und gegebenenfalls R17 eine reaktive Gruppe umfasst, die eine kovalente Verknüpfung mit einem Trägermolekül ermöglicht und insbesondere ausgewählt ist aus Isothiocyanaten, Isocyanaten , Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen,
Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleimiden, lodacetamiden und Phosphoramiditen; mindestens einer der Reste R- bis R15 und gegebenenfalls R17 eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfasst und die übrigen Reste R1 bis R15 sowie der Rest R17 bei jedem Auftreten unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, C C18-Alkoxy, CrC18-Alkyl, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann, CτC-8-Acyl, Nitro, Cyano und (Dialkyl)amino, wobei die Reste R und R12 auch vier-, fünf- oder sechsgliedrige Ringsysteme bilden können und einer oder mehrere Reste R. bis R10 auch kondensierte aromatische oder/und heterocyclische Ringe bilden können und m für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 steht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind - in unterschiedlichem Ausmaß - von den genannten Nachteilen der Marker des Standes der Technik frei. So weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine hervorragende Foto- sowie Lagerstabilität auf. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie im Folgenden beschrieben, ausgehend von kommerziell erhältlichen Ausgangsprodukten in hohen Ausbeuten mittels einfacher Syntheseschritte erhalten werden. Die Verbindungen weisen zudem hohe Extinktionskoeffizienten bzw. Fluoreszenzquantenausbeuten auf. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Chinolin- bzw. Pyridinderivate besteht darin, dass die optischen Eigenschaften, wie etwa das Absorptionsverhalten, in Gegenwart von und insbesondere nach einer Bindung an Trägermoleküle, wie etwa Proteine oder Nukleinsäuren im allgemeinen nicht verschlechtert werden. Wie beispielsweise der Figur 1 zu entnehmen ist, kann teilweise sogar eine Verbesserung der optischen Eigenschaften, beispielsweise der Absorption bzw. der Fluoreszenz für Konjugate aus Protein und erfindungsgemäßer Verbindung im Vergleich zur nicht gebundenen Verbindung erhalten werden. So können die Fluoreszenzeigenschaften des Konjugats deutlich erhöht sein, was die
erfindungsgemäßen Verbindungen insbesondere zur Verwendung als Fluoreszenzmarkerstoffe geeignet macht.
Alle erfindungsgemäßen Verbindungen weisen einen Stickstoff enthaltenden 6-Ring-Heterozyklus als einen der Substituenten an der Polymethingruppierung auf. Der Rest Z umfasst die Polymethingruppierung sowie die zweite auxochrome Gruppe.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Reaktivfarbstoffe, d.h. um Farbstoffe, die neben der farbgegebenden chromophoren Komponente mindestenseine Reaktivkomponente umfassen, über die sie durch Reaktion mit funktionellen Gruppen an Trägersubstanzen kovalent gebunden werden können. Entsprechend umfasst mindestens einer der Reste R- bis R15 eine reaktive Gruppe, die eine kovalente Verknüpfung mit einem Trägermolekül ermöglicht. Die Reste R- bis R15 können dabei selbst die reaktive Gruppe darstellen. Bevorzugt weist der mindestens eine
Rest R-, bis R15, der eine reaktive Gruppe umfasst, jedoch die
Zusammensetzung -W-V auf, worin V die reaktive Gruppe bezeichnet und
W eine Spacergruppe darstellt, über die die reaktive Gruppe am eigentlichen Chromophor gebunden ist. Die Spacergruppe weist bevorzugt die allgemeine
Summenformel -(CH2)n- auf, wobei n Werte von 1 bis 1 8 annehmen kann.
- Die Spacergruppe kann geradkettig oder verzweigt sein. Die reaktive Gruppe kann aber auch über andere Spacergruppen an das Chromophor gebunden sein.
Die reaktive Gruppe kann eine kovalente Bindung an Amin- oder/und Hydroxy-Funktionen der Trägersubstanz ermöglichen, wofür insbesondere die funktioneilen Gruppen Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Aziridin, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imidoester, Glyoxal oder Aldehyd geeignet sind. Falls das erfinduπgsgemäße Chinolin- oder Pyridinderivat zur Bindung an eine Trägersubstanz vorgesehen ist, die eine Thiolfunktion aufweist, wird die reaktive Gruppe bevorzugt aus
Maleiimid oder lodazetamid ausgewählt. Die reaktive Gruppe Phosphoramidit ist insbesondere für die Markierung von Nukleinsäuren, wie etwa DNA oder RNA, oder deren Bruchstücke geeignet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen mindestens eine reaktive Gruppe. Während theoretisch jeder der Reste R- bis R15 eine reaktive Gruppe umfassen kann, sind Farbstoffe mit höchstens drei, mehr bevorzugt höchstens zwei reaktiven Gruppen bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Verbindungen, in denen genau ein Rest R, bis R15 eine reaktive Gruppe enthält.
Weiterhin umfasst mindestens einer der Reste R. bis R15 der Verbindungen eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe. Diese ionisierbare oder ionisierte Gruppe bestimmt die hydrophilen Eigenschaften des Farbstoffs. Bevorzugt wird dieser mindestens eine Rest so ausgewählt, dass ein wasserlöslicher Farbstoff erhalten wird, wobei bereits eine geringe Wasserlöslichkeit ausreicht, bei der der Farbstoff nicht aus einer wässrigen Lösung ausfällt, lonisierbare Gruppen sind insbesondere Gruppen, welche in wässrigen Umgebungen Ionen bilden, beispielsweise durch Abspaltung oder Aufnahme eines Protons. Bevorzugt wird die ionisierbare oder ionisierte Gruppe ausgewählt aus S03 ", PO3 2', COO" und N(R16)3 + , wobei Gruppen, die zu
- Anionen ionisierbar bzw. als Anionen ionisiert sind, bevorzugt sind. R16 bedeutet C.-C^-Alkyl. Es ist möglich, dass der mindestens eine Rest R-, bis
R15 selbst die ionisierbare oder ionisierte Gruppe darstellt. Es ist auch möglich, dass ein eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe enthaltender Rest R, bis R15 die allgemeine Formel W-l aufweist, worin I die ionisierbare oder ionisierte Gruppe und W eine Spacergruppe, wie oben definiert, darstellt.
Die übrigen Reste R, bis R15, die keine reaktive Gruppe oder ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfassen, werden bei jedem Auftreten unabhängig voneinander aus den folgenden Gruppen ausgewählt: Wasserstoff,
Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder lod,
CT-C-g-Alkoxy, C^C-s-Alky! oder C C18-Acyl, wobei es sich bei den
Kohlenwasserstoffketten um unverzweigte oder verzweigte Ketten handeln kann, die gegebenenfalls ein oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten, wobei die Kohlenwasserstoffketten bevorzugt 1 bis 6 und am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen,
C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere ausgewählt aus N, 0 oder/und S enthalten kann, wobei Phenyl- und Naphthylreste besonders bevorzugt sind, Nitro,
Cyano und
(Dialkyl)amino, wobei es sich bevorzugt um primäre oder sekundäre Aminogruppen handelt und es sich bei den Alkylresten jeweils unabhängig voneinander um einen
insbesondere einen C.,-C
6-Alkyl und besonders bevorzugt um einen C
1-C
4-Alkylrest handelt, der geradkettig oder verzweigt sein kann und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten kann.
Die Reste R und R12 können, zusammen mitden Polymethin-Kohlenstoffen, an die sie gebunden sind, auch 4-, 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme bilden, die eine Verbrückung des Polymethinsystems bilden. Die an den Resten R^ - bis R15 enthaltene mindestens eine reaktive Gruppe kann dann auch an diese
Ringsysteme gebunden vorliegen. Weiterhin ist es möglich, dass einer oder mehrere der Reste R bis R10, die an die auxochromen Ringsysteme der erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden sind, mit diesen höher kondensierte aromatische oder/und heterocyclische Ringe bilden.
m kann schließlich für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 stehen, woraus sich dann jeweils drei, fünf bzw. sieben kohlenstoffatomige Polymethinketten ergeben.
Für den Fall, dass die Reste R und R12 eine Ringverbrückung bilden, steht die Struktureinheit
bevorzugt für
oder die Struktureinheit
bevorzugt für
worin die Reste A, B, C, D, E, F und G unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
Wasserstoff,
Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder Jod, C.-C-g-Alkoxy, C C18-Alkyl, CrC18-Acyl, wobei die Alkylketten geradkettig oder verzweigt sein können und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten können, wobei die Kohlenwasserstoffreste bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere N,
O oder/und S enthalten kann, wobei Phenyl- und Naphtylreste bevorzugt sind,
Nitro, Cyano und
(Dialkyl)amino, wobei der (Dialkyl)aminorest bevorzugt primäre oder sekundäre Aminogruppen umfasst und die Alkylreste jeweils bevorzugt 1 bis
1 8, mehr bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome enthalten, geradkettig oder verzweigt sein können und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten aufweisen können.
Gegebenenfalls kann mindestens einer der Reste A, B, C, D, E, F und G eine reaktive Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einer Trägersubstanz
- ermöglicht und insbesondere ausgewählt ist aus Isothiocyanaten,
Isocyanaten , Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen,
Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleimiden, lodacetamiden und Phosphoramiditen oder/und eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe, wie oben beschrieben, umfassen.
A, B und C können weiterhin einen Rest darstellen, ausgewählt aus O, S,
C(CN)2 oder N-R18, worin R18 einen Ci-C-g-aliphatischen oder C4-C14- aromatischen Rest darstellt, der gegebenenfalls substituiert sein kann.
Geeignete Substituenten sind z.B. die oben genannten reaktiven oder
ionisierbareπ oder ionisierten Gruppen. Bevorzugt steht R für den Rest (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2.
D kann weiterhin Cl oder ein C4-C14-aromatisches oder ein C C18- aliphatisches Ringsystem darstellen, welche gegebenenfalls mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus Isothiocyanaten, Isocyanaten, Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Azeridinen, Sulfonylhalogeniden, N- Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleiimiden, lodazetamiden und Phosphoramiditen substituiert sein können.
Insbesondere betrifft die Erfindung substituierte Chinolin- und Pyridinderivate der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder(lla) oder (Mb)
(la) (Ib)
oder
steht,
- X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. ein Struktruelement NR17, C(CH3)2 oder CH = CH steht; - zumindest einer der Substituenten R- bis R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit einem Trägermolekül ermöglicht. Die reaktive Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N- Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder lodacetamide für Thiol- Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruckstücke. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer- Gruppen der allgemeinen Summenformel -(CH2)n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 1 8 annehmen kann;
- m für die Zahlenwerte 1 , 2, oder 3 steht;
- die Substituenten R und R12 auch eine Verbrückung über vier-, fünf- und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich auch an dieser eine oder mehrere der oben genannten reaktiven Gruppen befinden können. Solche Ringverbrückuπgen der Polymethinkette sind im Folgenden gezeigt. So kann die
Stru tureinlieit stehen für oder
Die Struktureinheit kann stehen für
wobei die Substituenten A, B, C, D, E, F und G die gleichen Funktionalitäten wie RT bis R15 besitzen können. Zusätzlich können A, B und C für O, S, C(CN)2 bzw N-R-g stehen, wobei R18 in N-R18 für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einen reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH2)πCOOH oder (CH2)nNH2 stehen kann. D kann weiterhin für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem stehen, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten analog zu R- bis R15 angebracht sind;
- zumindest einer der Substituenten R, bis R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten wie S03 ', PO3 2", COO" oder N(R16)3 + darstellt, der die hydrophilen Eigenschaften dieses Farbstoffes bestimmt;
- und die Substituenten R- bis R10 auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.
Die Definitionen für die Reste sind dabei jeweils wie hierin zuvor beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen insbesondere eine Absorption bzw. eine Fluoreszenz in einem Bereich > 400 nm, bevorzugt > 450 nm, besonders bevorzugt > 600 nm und am meisten bevorzugt > 630 nm und von bis zu bevorzugt 900 nm auf. Die Verwendung von Markerstoffen mit einer Absorption im Bereich > 600 nm ermöglicht hohe Eindringtiefen im Gewebe, da in diesem Wellenlängenbereich keine störende Absorption durch das Gewebe auftritt. Weiterhin ist es möglich durch geeignete Wahl der Ringsysteme bzw. der Substituenten die erfindungsgemäßen Farbstoffe passend für alle Diodenlichtquellen einzustellen.
Durch die Wahl der erfindungsgemäßen Substituenten, insbesondere die Wahl der Chinolinium- bzw. Pyridiniumreste, bei denen es sich um Sechsring-Heterozyklen handelt, weisen die erfindungsgemäße Farbstoffe bei gleicher Polymethinkettenlänge ein Absorptionsmaximum auf, das im Vergleich zu herkömmlich substituierten Polymethinfarbstoffen im langwelligeren Bereich liegt. Auf diese Weise ist es möglich, im langwelligen Bereich absorbierende Farbstoffe mit relativ kurzen Polymethinkettenlängen herzustellen. Da gerade längere Polymethinketten anfällig gegenüber einem Abbau sind, kann dadurch eine höhere Stabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe erhalten werden.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines reaktiven substituierten Chinolin- oder Pyridiniumderivats nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Pyridin- oder Chinolinheterozyklus, der in ortho- para-Position einen Methylsubstituenten aufweist, b) Alkylieren des ortho- oder para-Methyl-substituierten Pyridin- oder Chinolinheterozyklus am Stickstoffatom, wobei ein Salz oder ein inneres Salz gebildet wird, c) Anfügen eines C , C3- oder C5-Bausteins an die ortho- oder para- Methylgruppe,
d) Bilden eines reaktiven Polymethinfarbstoffes durch Umsetzen mit einem weiteren heterocyclischen Salz oder inneren Salz.
Die Alkylierung des ortho- oder para-Methyl-substituierten Pyridin- oder Chinolinheterozyklus am Stickstoffatom wird bevorzugt bei einer Temperatur von 1 1 0 bis 1 50 °C durchgeführt, wobei alle herkömmlichen Alkylierungsreagenzien verwendet werden können. Die Alkylierung kann sowohl lösungsmittelfrei als auch mit üblichen für die Alkylierung verwendeten Lösungsmitteln durchgeführt werden.
Das Anfügen eines C , C3- oder C5-Bausteins an die ortho- oder para- Methylgruppe erfolgt bevorzugt in der Siedehitze (unter Rückfluss) unter Verwendung eines Lösungsmittels. Bevorzugte Lösungsmittel sind Alkohole, wie etwa Ethanol oder Methanol sowie ein Gemisch aus Butanol und Toluol.
Die Bildung eines Polymethinfarbstoffs durch Umsetzen mit einem weiteren heterocyclischen Salz oder inneren Salz erfolgt ebenfalls bevorzugt in einem Lösungsmittel, insbesondere einem Alkohol, wie etwa Ethanol oder Methanol oder einem Butanol/Toluol-Gemisch.
Gegebenenfalls wird die reaktive Gruppe von einem oder mehreren der - Substituenten R, bis R15 nach Herstellung des Polymethinfarbstoffs aktiviert. Die Aktivierung wird bevorzugt in einem Lösungsmittel, wie etwa DMF, DMSO, einem leicht alkalischen Puffer, wie etwa PBS oder einem Bicarbonatpuffer bei Raumtemperatur, bevorzugt bei 1 0 °C bis 50 °C, durchgeführt.
Bei dem in Schritt d) eingesetzten Salz oder inneren Salz handelt es sich bevorzugt um einen Stickstoff-enthaltenden Heterozyklus, wobei der Stickstoff eine positive Ladung trägt.
Synthesebausteine, die zur Darstellung der erfindungsgemäßen Farbstoffe erforderlich sind, sind kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Lepidin, Chinaldin, 2-Picolin, 4-Picolin, 9-Methylacridin, Benzothiazol, 2,3,3- Trimethylindolenin und 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indol. Andere lassen sich durch Ringschlußreaktionen (2-Methylchinolin-6-sulfonsäure, 4- Methylchinolin-6-sulfonsäure, 2,3,3-Trimethylindol-5-sulfonsäure u.a.) bzw. Sufonierungsreaktionen (monosulfoniertes 2,3,3-Trimethyl-4, 5-benzo-3H- indol, 4-Methylchinolin-6-sulfonsäure u.a.) relativ einfach herstellen.
Die Einführung weiterer hydrophiler und reaktiver Gruppen kann über die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs (R14, R15) mit geeigneten Reagenzien, z.B. ω-Halogenalkansäuren, ω-Halogenalkyiacetaten, Sultonen, ω-Halogenalkylphosphonsäuren bzw. deren Ester ebenfalls leicht erfolgen.
Über einen weiteren Reaktionsschritt wird dann an die reaktive Methylgruppe des Heterocyclus ein C,, C3 oder C5-Baustein angefügt. Dies geschieht beispielsweise durch Umsetzung mit N,N'-Diphenylformamidin, Orthocarbonsäureestern, Malondialdehyd-Dianil oder dessen Hydrochlorid, Malondialdehyd-Tetraacetal, Quadratsäure (bzw. deren Derivaten), Glutacondialdehyd-Dianil oder dessen Hydrochlorid oder Anwendung der
Vilsmeier-Formylierung, wobei der C, , C3 bzw. C5-Baustein weitere
- Substituenten tragen kann (R , R12, R13), einschließlich geeigneter
Ringsysteme. In einem nächsten Schritt wird die zweite Endgruppe ankondensiert, und man erhält schließlich einen symmetrischen bzw. unsymmetrischen Polymethinfarbstoff, der üblicherweise eine reaktive Gruppe (R^ ... R15) trägt.
Eventuell sind noch weitere Reaktionsschritte nötig, um die reaktive Gruppe in eine Form zu bringen, in der sie an ein Biomolekül, Partikel oder einen Arzneistoff bindet.
Ein bevorzugter Syntheseweg ist in den Ausführungsbeispielen beschrieben. Dabei wird eine durch Alkylierung eines Paramethylchinolin bei 1 1 0 °C bis 1 50 °C erhaltene Verbindung ( 1 ), welche ein Salz darstellt, zunächst mit einem C Baustein unter Rückfluss in Ethanol/Methanol oder Butanol/Toluol umgesetzt. Dabei wird der C Baustein an die Methylgruppe angehängt, sodass die Verbindung (3) zwei (von den schließlichen drei) C-Atomen der Polymethinkette aufweist. Die Verbindung (3) wird dann in einem Alkohol mit einem, heterocyclischen inneren Salz (Verbindung 2), welches zudem eine ionisierte Gruppe (S03 ) enthält, umgesetzt. In diesem Schritt wird die Verbindung PB-630 gebildet. PB-630 wird dann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel, wie etwa DMF, aktiviert, wobei der PB-630-NHS-Ester gebildet wird.
Um die durch chemische Reaktion erhaltenen Farbstoffe aus den Reaktiongemischen zu isolieren, können Verfahren wie Kristallisation, selektive Extraktion oder Chromatographie eingesetzt werden.
Nach der Umsetzung und Aufarbeitung des Farbstoffs mit dem entsprechenden Biomolekül, Partikel oder Arzneistoff absorbiert und fluoresziert das entstandene Produkt im Spektralbereich oberhalb von 400 nm, insbesondere oberhalb von 450 nm. Somit ist seine Fluoreszenz mit - Diodenlichtquellen anregbar und das Fluoreszenzsignal über eine geeignete optische Einrichtung detektierbar.
Die substituierten Chinolin- oder Pyridinderivate der aligemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) können als Farbstoffe zur optischen Markierung von Trägersubstanzen, insbesondere von Proteinen, Nukleinsäuren wie etwa DNA oder RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren oder Pharmaka verwendet werden.
Die funktionellen Gruppen der Verbindungen der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) sind bei entsprechender Auswahl der reaktiven
Gruppe in der Lage, kovalent an eine OH- NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nukleinsäuren wie etwa DNA oder RNA, biologischen Zellen, Lipiden, organischen oder anorganischen Polymeren oder Pharmaka.
Diese Kopplungsreaktion kann in wässriger, bevorzugt in überwiegend wässriger . Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur, insbesondere zwischen 1 0 °C und 50 °C durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat, welches bevorzugt fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) und daraus hergestellte Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch- Durchsatz-Screenings eingesetzt werden.
Durch synthesechemische Variation der beiden heterocyclischen Endgruppen der Trimethine lassen sich Absorption und Emission der
Farbstoffe nahezu beliebig steuern und sogar an die Emissionslinien von
- roten und NIR-Laserdioden anpassen. Tabelle 1 zeigt die Breite der durch
Variation der Substituenten erzielbaren Wellenlängen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere zur Verwendung als Farbstoff zur optischen Markierung einer Trägersubstanz geeignet. Bevorzugt erfolgt die Markierung durch kovalente Kopplung der Verbindung an eine geeignete funktioneile Gruppe der Trägersubstanz, beispielsweise eine OH-, NH2- oder SH-Gruppe. Die Trägersubstanz wird bevorzugt ausgewählt aus Biomoleküien, wie etwa Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, wie etwa DNA oder RNA und Lipiden sowie aus organischen, biologischen
und/oder anorganischen Oligomeren oder Polymeren sowie aus Arzneimitteln, biologischen Zellen und auch aus Polymerpartikeln.
Bevorzugt werden zur Markierung 1 bis 1 0, besonders bevorzugt 1 bis 7 Farbstoffmoleküle pro Mol der Trägersubstanz kovalent gekoppelt. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zum Anfärben von anorganischen oder organischen Polymerpartikeln eingesetzt werden, wobei die Anfärbung sowohl kovalent als auch nicht-kovalent, beispielsweise durch Einlagerung erfolgen kann. Die farbgebende Verbindung kann dabei in die Polymerpartikel eingebracht oder auf der Oberfläche der Polymerpartikel angeordnet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsformen werden Polymerpartikel mit einem Durchmesser von 1 0 nm bis 5 μm angefärbt. Besonders bevorzugt werden magnetische Partikel, insbesondere Polymerpartikel mit einem magnetischen Kern angefärbt oder markiert, da mit solchen Partikeln zahlreiche Nachweis- bzw. Separationsverfahren auf einfache Weise durchgeführt werden können.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine den Analyten enthaltende Probe mit einem Chinolin- oder Pyridinderivat gemäß der Erfindung umsetzt und dabei das Chinolin- oder - Pyridinderivat über die reaktive Gruppe kovalent an den Analyten koppelt und das Konjugat aus Chinolin- oder Pyridinderivat und Analyt bestimmt.
Aufgrund der hervorragenden Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich hierbei um ein hochsensitives Verfahren. Daneben ist es selbstverständlich auch möglich, ein Nachweisreagenz, welches selbst mit dem zu bestimmenden Analyten bindet, mit einer erfindungsgemäßen Markierung zu kennzeichnen und ein derartiges Konjugat zum Nachweis des Analyten einzusetzen. Der Analyt wird bevorzugt ausgewählt aus biologischen Molekülen, wie etwa Proteinen,
Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, Lipiden, Arzneimitteln, anorganischen oder organischen Oligomeren oder/und Polymeren, biologischen Zellen und Polymerpartikeln. Für den Fall der direkten Kopplung weist der Analyt bevorzugt eine OH-, NH2- oder SH-Funktion auf, an die das Chinolin- bzw. Pyridinderivat kovalent gekoppelt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein spezifisches Bindereagenz, beispielsweise eine Nukleinsäurehybridisierungssonde, ein Antikörper bzw. ein Antigen oder ein Partner eines spezifischen Bindepaares, etwa Biotin oder Avidin mit dem erfindungsgemäßen Farbstoff gekoppelt und dann das Konjugat aus gekoppeltem Bindepartner und Analyt nachgewiesen.
Aufgrund der Löslichkeitseigenschaften können die erfindungsgemäßen Verbindungen in wässriger Lösung eingesetzt werden, sodass die Kopplungsreaktion bevorzugt in wässriger Lösung durchgeführt wird.
Durch geeignete Wahl der auxochromen Gruppen können die optischen Eigenschaften, insbesondere die Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe eingestellt werden (vgl. z.B. Tabelle 1 in Figur 2) . Bevorzugt werden die optischen Eigenschaften derart eingestellt, dass das Konjugat aus Farbstoff und Analyt fluoreszierende Eigenschaften aufweist. Zur Bestimmung der markierten Konjugate können optische, insbesondere fluoreszenzoptische Bestimmungsverfahren verwendet werden, beispielsweise Immunotests, Hybridisierungsverfahren, chromatographische oder elektrische Verfahren und Hoch-Durchsatz- Screening.
Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche Markerfarbstoffe, welche sich vom Pyridin-Heterocyclus ableiten. Sie sind in der Lage, Bindungen mit Biomolekülen wie z. B. Proteinen, Lipiden, Polynucleotiden, DNA, Arzneistoffen oder Pharmaka sowie mit Polymer-Partikeln einzugehen. Sie dienen der Anfärbung, insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die so markierten Moleküle bzw. Partikel können dann in
optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Verfahren beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies. Die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen Reagenzien können in Form eines Reagenzienkits bereitgestellt werden. Ein solcher Reagenzienkit enthält z.B. einen Reaktivfarbstoff zur Kopplung an einen Analyten sowie geeignete Puffer oder einen mit einem Reaktivfarbstoff gekoppelten Bindepartner für den gesuchten Analyten und geeignete Puffer sowie gegebenenfalls weitere Hilfsreagenzien.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Figur 1 zeigt die Absorptions- (linke Seite) bzw. Fluoreszenzspektren
(rechte Seite) von PB-630-NHS-Ester in freier Form bzw. in kovalent an HSA (humanes Serumalbumin) gebundener Form. Es ist eine Erhöhung der Absorption und eine beträchtliche Erhöhung der Fluoreszenz zu sehen.
Figur 2 zeigt die Tabelle 1 in der die Absorptionsmaxima von verschiedenen erfindungsgemäßen Trimethinverbindungen für verschiedene Endgruppen dargestellt sind. Die Trimethinverbindungen in Tabelle 1 , in denen beide Endgruppen über einen Heterofünfring an die Methineinheit gebunden sind, sind als Vergleichsbeispiele angegeben.
A usführungsbeispiele
1. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (1)
1 0,0 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 1 5,6 g (0,08 mol) 6- Bromhexansäure wurden in 200 ml 1 ,2-Dichlorbenzol 72 Stunden unter
Stickstoff bei 1 10 °C refluxiert. Nach dem Abkühlen wurde das
Lösungsmittel abdekantiert und der Rückstand durch Behandlung mit 2-
Propanol auskristaliisiert. Das Produkt wurde mit Aceton gewaschen und im Exsikkator über CaCI2 getrocknet.
2. Darstellung von 2-Methyl 3-(4-sulfonatobutyl)- benzothiazolium-Betain (2) 5 1 0,0 g (0,067 mol) 2-Methylbenzothiazol und 9, 1 g (0,067 mol) Butansulton wurden 3 Stunden unter Stickstoff bei 1 30 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und 3 Stunden im Vakuum getrocknet.
o .Darstellungvon l-(5-Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3)
2,0 g (6 mmol) 1 -(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid ( 1 ) und 1 ,2 5 g (6 mmol) N,N'-Diphenylformamidin-Hydrochlorid wurden in Acetanhydrid 30 min unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung gefällt. Die erhaltene ölige Substanz wurde vakuumgetrocknet und ohne weitere Reinigungsschritte weiterverarbeitet. Ausbeute: 83 %. 0
4. Darstellung von l-(5-carboxypentyl)-4- < 3-(3-(4-sulfonatobutyl)-3H- benzothiazol-2-yliden)-propenyl> -chinolinium-Betain (PB-630)
0,5 g 2-Methyl 3-(4-Sulfonatobutyl)- benzothiazolium-Betain (2) und 0,85 g 1 -(5-Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3) wurden 20 Minuten in Pyridin unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Rohprodukt mit Diethylether gefällt. Die Aufarbeitung erfolgte durch Chromatographie auf einer präparativen Kieselgelplatte (Fa. Merck, Kieselgel 60, 2mm) (Eluent: CHCI3/MeOH 1 : 1 ) . Ausbeute: 1 3 %.
5. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit 0-(N-Succinimidyl)-NrN,N'rNr- tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat (TSTU)
35 mg PB-630 wurden in einem Gemisch aus 1 ml DMF, 1 ml 1 ,4-Dioxan und 0,5 ml Wasser gelöst. Dazu gab man 25 mg TSTU und 1 1 p\ Diisopropylethylamin. Die Reaktionsmischung wurde dann 50 Min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
6. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N,Nr- Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC)
1 5 mg PB-630, 1 4 mg DCC und 4 mg NHS wurden in 1 ml trockenem DMF gelöst. Dann gab man 10 μ\ Triethylamin zu. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Dieser Schritt verlief quantitativ.
7. Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen Die Proteinmarkierungen wurden in einem 50 mmol/l Bicarbonatpuffer (pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mg Reaktivfarbstoff (z. B. PB-630-NHS-ester) in 1 00 μl DMF hergestellt. 1 0 mg Protein wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf verschiedene Mengen an Farbstoff aus der Stammlösung hinzugegeben wurden. Dann wurde das Reaktionsgemisch 20 - 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der freie Farbstoff wurde vom markierten Protein entweder durch Gelchromatographie oder duch Dialyse abgetrennt. Der Markierungsgrad des Farbstoff-Konjugates wurde mit einem BCA Protein Assay Kit von Pierce, Rockford bestimmt und lag bei Humanserum-Albumin (HSA) zwischen 1 ,2 und 4,9 Molekülen Farbstoff pro Proteinmolekül.
8. Markierung von polyclonalem anti-HS A mit PB-630-NHS-ester 385 μl anti-HSA (c = 5,2 mg/ml) wurden in 750 μl Bicarbonatpuffer (0, 1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. 1 mg PB-630-NHS-ester wird in 50 μl DMF gelöst, und die Farbstofflösung wurde langsam unter Rühren in die Proteinlösung gegeben, wonach noch weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Der markierte Antikörper wurde vom freien Farbstoff durch Gelchromatographie getrennt. Als stationäre Phase diente Sephadex G50, als Laufmitτel wurde Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) verwendet. Die blaue Bande des markierten Antikörpers wurde dabei zuerst eluiert.
9. Markierung von HSA mit PB-630-NHS-ester
PB-630-NHS-ester (ca. 0,5 mg) wurdenin 50 μl DMF gelöst. 5 mg HSA wurden in 750 μl Bicarbonatpuffer (0, 1 mol/l, pH 9,0) gelöst. Die Farbstofflösung wurde langsam zu der Proteinlösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gegen einen Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) unter Verwendung einer Dialysemembran ( 1 500 FT, Union Carbide) mit cut-off von 1 0.000 dialysiert.
10. Absorptions- und Fluoreszenzspektren von gelöstem und gebundenem
PB-630
- Die Abbildung 1 zeigt die Fluoreszenzspektren von gelöstem PB-630 und von kovalent an HSA gebundenem PB-630 (Konjugat hergestellt nach
Beispiel 7) . Die integrale Fluoreszenzintensität stieg beim Binden an das Protein auf das Sechsfache.
7 7. Darstellung von 2-Methyl- 1-(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain (4) 1 0 g (0,07 mol) 2-Methylchinolin und 9,5 g (0,07 mol) Butansulton wurden drei Stunden unter Stickstoff bei 1 30 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 50 %.
72. Darstellung von 1-(5-Acetoxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (5) 1 0 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 14,6 g (0,07 mol) 5-Bromoamylacetat wurden vier Stunden unter Stickstoff bei 1 20 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde das viskose Öl mehrmals mit Ether behandelt und danach im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 60 %.
13. Darstellung von 1-(4-sulfonatobutyl)-2-acetaniiidovinylchinolinium-Betain (6)
2 g (7 mmol) 2-Mehtγl-1 -(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain und 1 ,4 g (7 mmoI) N,N'-Diphenylformamidin-Hydrochlorid wurden in Acetanhydrid 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das ölige Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung ausgefällt und danach mehrmals mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 78 %.
14. Darstellung von 0B-657-0H
,5 g ( 1 ,4 mmol) 1 -(5 und 0,6 g (1 ,4 mmol) 1 -(4-suifonatobutγl)-2-acetanilidovinylchinolinium-Betain wurden in 1 0 ml Pyridin 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt, wobei sich die Reaktionslösung tief blau färbte. Nach dem Abkühlen wurde die noch
acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefällt, im Vakuum getrocknet und in 1 0 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 250 mg Natriumcarbonat gegeben. Danach wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und mit Ether gefällt. Die Reinigung des Produktes erfolgte über eine präparative Säule (C1 8-Kieselgei, Methanol/Wasser 1 : 1 ). Ausbeute: 1 9 % .
15. Darstellung von OB-657 -phosphoramidit
200 mg OB-657-OH wurden in trockenem DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0, 1 5 ml N,N-Diisoprσpylamin und im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 μl 2-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylchlorophosphoramidit hinzugegeben. Der Reaktionsverlauf wurd dünnschicht-chromatographisch verfolgt. Nach quantitativem Ablauf der Reaktion kann die Lösung direkt zur Markierung von DNA eingesetzt werden. Absorptionsmaximum (Methanol) : 657 nm.
16. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-(3-(1-(5-carboxypentyl)- l H- chinolin-4-yliden)-propenyl)-chinoliniumbromid (PB710)
Man löst 338 mg (1 mmol) 1 -(5-Pentylcarbonsäure)-lepidiniumbromid in 3 ml Pyridin, gibt 2 ml Orthoameisensäuremethylester zu und refluxiert die Lösung 2 h lang. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur versetzt man die Reaktionsmischung mit 20 ml Diethylether und saugt das ausgefallene Produkt ab. Zur chromatographischen Reinigung wird das erhaltenene Rohprodukt in Chloroform / Methanol 1 : 1 gelöst und auf die Säule aus Kieselgel-60 aufgetragen. Man eluiert zuerst mit Methanol / Chloroform 1 : 1 bis sich die vorauslaufende blaue Zone von den Verunreinigungen absetzt, dann mit Methanol. Für die Weiterverarbeitung zum Aktivester kann jedoch auch das Rohprodukt verwendet werden.
Ausbeute: 48 mg (0,08 mmol, 1 6 %)
17. Darstellung von PB-710-NHS-ester
Man löst 1 07 mg (0, 1 8 mmol) PB-710-Vorstufe (Rohprodukt), 83 mg (0,72 mmol) NHS, 149 mg DCC (0,72 mmol) in 4 ml DMF und gibt 60 μL Triethylamin zu. Die Reaktioπsmischung wird unter Lichtausschluß 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend filtriert man durch Glaswolle und zieht das DMF am Rotationsverdampfer ab. Das Rohprodukt wird chromatographisch auf Kieselgel-60 mit Chlorform / Methanol 7:3 gereinigt. tiefblaue Kristalle, C37H40BrN3O6 (M = 702.65 g/mol)
Ausbeute: 1 8, 1 mg (0,026 mmol, 14 %) Schmelzpunkt: 67°C
18. Allgemeine Vorschrift zum Färben von Polystyren-Mikropartikeln
500 μl einer 8 %-igen Lösung der Mikropartikel (IDC, Portland, Oregon) wurden in einer Mischung aus 1 2 ml bidestilliertem Wasser und 1 2,5 ml Methanol suspendiert.
Unter kräftigem Rühren mit einem glasummantelten Magnetrührer wurde der Partikelsuspension im Verlauf mehrerer Stunden eine Lösung des gewünschten Farbstoffs, z. B. 1 -(3-Methyl-benzothiazol-2-yl)-3-( 1 -octadecyl-
< 4 > chinolyl)-trimethinium-perchlorat, ( 1 0 mg in 1 ml Toluen) in 20 μl- Portionen hinzugefügt. Dabei wurde darauf geachtet, daß erst dann eine weitere Portion hinzugegeben wurde, wenn sich die vorherige Portion vollständig gelöst hatte und sich nicht mehr auf der Oberfläche der gerührten Suspension befand.
Nach Beendigung der Farbstoffzugabe wurde noch weitere 1 0 Stunden gerührt. Anschließend wurden die gefärbten Partikel durch Zentrifungation abgetrennt und durch mehrmaliges Waschen mit bidestilliertem Wasser und Zentrifugation gereinigt.
Die so erhaltenen Partikel weisen nach Anregung mit einem 635nm Diodenlaser oder einem 633 nm He-Ne-Laser eine Fluoreszenz mit einem Maximum bei 652 nm auf.