DE19856152A1 - Pyridin- und Chinolinfarbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere und Arzneistoffe - Google Patents

Pyridin- und Chinolinfarbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere und Arzneistoffe

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche Markerfarbstoffe, welche sich vom Pyridin-Heterocyclus ableiten. Sie sind in der Lage, Bindungen mit Biomolekülen wie z. B. Proteinen, Lipiden, Polynucleotiden, DNA, Arzneistoffen oder Pharmaka sowie mit Polymer-Partikeln einzugehen. Sie dienen der Anfärbung, insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die so markierten Moleküle bzw. Partikel können dann in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Verfahren beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.

Description

Die Fluoreszenzmarkierung von Biomolekülen mit Farbstoffen, deren Absorptionen und Emissionen im roten (<600 nm) und nahem infraroten (<700 nm) Spektralbereich liegen, findet u. a. Anwendungen in der Biotechnologie und medizinischen Diagnostik [Methods Enzymol. 246 (1995) 362-73]. Gegenwärtig werden dazu oft reaktive Cyaninfarbstoffe (Polymethine) verwendet, die im Chromophor symmetrisch sind. Das heißt, die beiden heterocyclischen Endgruppen der Polymethinkette sind identisch bzw. unterscheiden sich nur in der Art der Stickstoffsubstituenten. Auch werden fast ausschließlich Hetero-Inden- Derivate als Endgruppen verwendet. Dazu gehören u. a. die Ringysteme des 3,3- Dialkylindols, Benzothiazols, Benzoxazols und ihre benzoanellierten Analoga [US Patent 5 569 766] [US Patent 5 800 995] [WO 97/40104]. Um mit solchen Endgruppen eine Absorption bei über 600 nm zu erreichen; sind aber mindestens 5 C-Atome in der exocyclischen Polymethinkette notwendig. Eine derart lange Polymethinkette vermindert allerdings die Stabilität des Farbstoff-Chromophors.
Pyridinium- und Chinolinium-Farbstoffe mit Funktionalitäten, die sie als Interkalatoren für DNA und RNA geeignet machen, sind aus dem US-Patent 5 410 030 und WO 97/17076 bekannt. Interkalatoren sind aber als Reaktivfarbstoffe ungeeignet.
Pease beschreibt pentamethinartige Quadratsäure-Farbstoffe, die als fluoreszente Marker verwendet werden können [US Patent 5 416 214] [US Patent 5 310 992] [US Patent 4 830 786]. Dabei sind die Endgruppen aus der Reihe der Fünfring-Hetero-Indene bzw. der Aniline ausgewählt.
Problem
Die bisher beschriebenen Marker-Farbstoffe weisen in ihrer Gesamtheit einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:
  • - ungenügende Photo- oder Lagerstabilität
  • - aufwendige Synthese- bzw. Reinigungsschritte
  • - geringe Absorptionskoeffizienten bzw. Fluoreszenzquantenausbeuten
  • - unerwünschte Änderung der optischen Eigenschaften in Gegenwart von - oder nach - Bindung an Proteine oder Nucleinsäureoligomere.
Lösung
Die anspruchsgemäßen Verbindungen sind - in unterschiedlichem Ausmaß - von den genannten Nachteilen frei. So sind Synthesebausteine, die zur Darstellung der erfindungsgemäßen Farbstoffe erforderlich sind, kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Lepidin, Chinaldin, 2-Picolin, 4-Picolin, 9-Methylacridin, Benzothiazol, 2,3,3-Trimethylindolenin und 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indol. Andere lassen sich durch Ringschlußreaktionen (2-Methylchinolin-6-sulfonsäure, 4-Methylchinolin-6- sulfonsäure, 2,3,3-Trimethylindol-5-sulfonsäure u. a.) bzw. Sufonierungsreaktionen (monosulfoniertes 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indol, 4-Methylchinolin-6-sulfonsäure u. a.) relativ einfach herstellen.
Die Einführung weiterer hydrophiler und reaktiver Gruppen kann über die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs (R14, R15) mit geeigneten Reagenzien, z. B. ω- Halogenalkansäuren, ω-Halogenalkylacetaten, Sultonen, ω-Halogenalkylphosphonsäuren bzw. deren Ester ebenfalls leicht erfolgen.
Über einen weiteren Reaktionsschritt wird dann an die reaktive Methylgruppe des Heterocyclus ein C1, C3 oder C5-Baustein angefügt. Dies geschieht beispielsweise durch Umsetzung mit N,N'-Diphenylformamidin, Orthocarbonsäureestern, Malondialdehyd- Dianil, Malondialdehyd-Tetraacetal, Quadratsäure (bzw. deren Derivaten), Glutacondialdehyd-Dianil oder Anwendung der Vilsmeier-Formylierung, wobei der C1, C3 bzw. C5-Baustein weitere Substituenten tragen kann (R11, R12, R13), einschließlich geeigneter Ringsysteme. In einem nächsten Schritt wird die zweite Endgruppe ankondensiert, und man erhält schließlich einen symmetrischen bzw. unsymmetrischen Polymethinfarbstoff, der üblicherweise eine reaktive Gruppe (R1 . . . R15) trägt.
Eventuell sind noch weitere Reaktionsschritte nötig, um die reaktive Gruppe in eine Form zu bringen, in der sie an ein Biomolekül, Partikel oder einen Arzneistoff bindet.
Um die durch chemische Reaktion erhaltenen Farbstoffe aus den Reaktiongemischen zu isolieren, werden Verfahren wie Kristallisation, selektive Extraktion oder Chromatographie eingesetzt.
Nach der Umsetzung und Aufarbeitung des Farbstoffs mit dem entsprechenden Biomolekül, Partikel oder Arzneistoff absorbiert und fluoresziert das entstandene Produkt im Spektralbereich oberhalb von 450 nm. Somit ist seine Fluoreszenz mit Diodenlichtquellen anregbar und das Fluoreszenzsignal über eine geeignete optische Einrichtung detektierbar.
Das beschriebene Herstellungsverfahren kann insbesondere für die Darstellung substituierter Chinolin- und Pyridinderivate der allgemeinen Formel (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb)
wobei Z für
  • - X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. ein Struktruelement NR, C(CH3)2 oder CH=CH steht;
  • - zumindest einer der Substituenten R1 bis R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht. Die reaktive Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder Iodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruckstücke. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 18 annehmen kann;
  • - n für die Zahlenwerte 1, 2, oder 3 steht;
  • - die Substituenten R11 und R12 auch eine Verbrückung über vier-, fünf und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich auch an dieser reaktive Gruppen befinden können. Solche. Ringverbrückungen der Polymethinkette sind im Folgenden gezeigt. So kann die Struktureinheit
    stehen für
    Die Struktureinheit
    kann stehen für
    wobei die Substituenten A, B, C, D, E, F und G die gleichen Funktionalitäten wie R1 bis R15 besitzen können. Zusätzlich können A, B und C für O, S, C(CN)2 bzw. N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2 stehen kann. D kann weiterhin für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem stehen, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten analog zu R1 bis R15 angebracht sind;
  • - zumindest einer der Substituenten R1 bis R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten wie SO3 -, PO3 -, COO- oder NR3 + darstellt, der die hydrophilen Eigenschaften dieses Farbstoffes bestimmt;
  • - und die Substituenten R1 bis R10 auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.
Diese substituierten Chinolin- oder Pyridinderivate der allgemeinen Formel (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb) können als Farbstoffe zur optischen Markierung von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren oder Pharmaka verwendet werden.
Die funktionellen Gruppen der Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb) vermögen kovalent an eine OH-NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren oder Pharmaka.
Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb) und daraus hergestellte Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch-Durchsatz-Screenings eingesetzt werden.
Erreichte Vorteile
Durch synthesechemische Variation der beiden heterocyclischen Endgruppen der Trimethine lassen sich Absorption und Emission der Farbstoffe nahezu beliebig steuern und sogar an die Emissionslinien von roten und NIR-Laserdioden anpassen. Tabelle 1 zeigt die Breite der durch Variation der Substituenten erzielbaren Wellenlängen.
Ausführungsbeispiele 1. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (1)
10,0 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 15,6 g (0,08 mol) 6-Bromhexansäure wurden in 200 ml 1,2-Dichlorbenzol 72 Stunden unter Stickstoff bei 110°C refluxiert. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel abdekantiert und der Rückstand durch Behandlung mit 2-Propanol auskristallisiert. Das Produkt wurde mit Aceton gewaschen und im Exsikkator über CaCl2 getrocknet.
2. Darstellung von 2-Methyl-3-(4-sulfonatobutyl)-benzothiazolium-Betain (2)
10,0 g (0,067 mol) 2-Methylbenzothiazol und 9,1 g (0,067 mol) Butansulton wurden 3 Stunden unter Stickstoff bei 130°C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und 3 Stunden im Vakuum getrocknet.
3. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3)
2,0 g (6 mmol) 1-(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (1) und 1,2 g (6 mmol) N,N'-Diphenylformamidin wurden in Acetanhydrid 30 min unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung gefällt. Die erhaltene ölige Substanz wurde vakuumgetrocknet und ohne weitere Reinigungsschritte weiterverarbeitet. Ausbeute: 83%.
4. Darstellung von 1-(3-(4-sulfonatobutyl)-benzothiazol-2 yl)-3-(1-(5-carboxypentyl)- <4<chinolyl)-trimethinium-betain (PB-630)
0,5 g 2-Methyl 3-(4-Sulfonatobutyl)-benzothiazolium-Betain (2) und 0,85 g 1-(5- Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3) wurden 20 Minuten in Pyridin unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Rohprodukt mit Diethylether gefällt. Die Aufarbeitung erfolgte durch Chromatographie auf einer präparativen Kieselgelplatte (Fa. Merck, Kieselgel 60,2 mm) (Eluent: CHCl3/MeOH 1 : 1). Ausbeute: 13%.
5. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyl­ uronium-tetrafluoroborat (TSTU)
35 mg PB-630 wurden in einem Gemisch aus 1 ml DMF, 1 ml 1,4-Dioxan und 0,5 ml Wasser gelöst. Dazu gab man 25 mg TSTU und 11 µl Diisopropylethylamin. Die Reaktionsmischung wurde dann 50 Min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
6. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N,N'-Dicyclo­ hexylcarbodiimid (DCC)
15 mg PB-630, 14 mg DCC und 4 mg NHS wurden in 1 ml trockenem DMF gelöst. Dann gab man 10 µl Triethylamin zu. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Dieser Schritt verlief quantitativ.
7. Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen
Die Proteinmarkierungen wurden in einem 50 mmol/l Bicarbonatpuffer (pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mg Reaktivfarbstoff (z. B. PB-630-NHS- ester) in 100 µl DMF hergestellt. 10 mg Protein wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf verschiedene Mengen an Farbstoff aus der Stammlösung hinzugegeben wurden. Dann wurde das Reaktionsgemisch 20-24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der freie Farbstoff wurde vom markierten Protein entweder durch Gelchromatographie oder duch Dialyse abgetrennt. Der Markierungsgrad des Farbstoff-Konjugates wurde mit einem BCA Protein Assay Kit von Pierce, Rockford bestimmt und lag bei Humanserum-Albumin (HSA) zwischen 1,2 und 4,9 Molekülen Farbstoff pro Proteinmolekül.
8. Markierung von polyclonalem anti-HSA mit PB-630-NHS-ester
385 µl anti-HSA (c = 5,2 mg/ml) wurden in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. 1 mg PB-630-NHS-ester wird in 50 µl DMF gelöst, und die Farbstofflösung wurde langsam unter Rühren in die Proteinlösung gegeben, wonach noch weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Der markierte Antikörper wurde vom freien Farbstoff durch Gelchromatographie getrennt. Als stationäre Phase diente Sephadex G50, als Laufmittel wurde Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) verwendet. Die blaue Bande des markierten Antikörpers wurde dabei zuerst eluiert.
9. Markierung von HSA mit PB-630-NHS-ester
PB-630-NHS-ester (ca. 0,5 mg) wurden in 50 µl DMF gelöst. 5 mg HSA wurden in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,0) gelöst. Die Farbstofflösung wurde langsam zu der Proteinlösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gegen einen Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) unter Verwendung einer Dialysemembran (1500 FT, Union Carbide) mit cut-off von 10.000 dialysiert.
10. Fluoreszenzspektren von gelöstem und gebundenem PB-630
Die Abb. 2 zeigt die Fluoreszenzspektren von gelöstem PB-630 und von kovalent an BSA gebundenem PB-630 (Konjugat hergestellt nach Beispiel 7). Die integrale Fluoreszenzintensität stieg beim Binden an das Protein auf das Sechsfache.
11. Darstellung von 2-Methyl-1-(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain
10 g (0,07 mol) 2-Methylchinolin und 9,5 g (0,07 mol) Butansulton wurden drei Stunden unter Stickstoff bei 130°C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 50%.
12. Darstellung von 1-(5-Acetoxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid
10 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 14,6 g (0,07 mol) 5-Bromoamylacetat wurden vier Stunden unter Stickstoff bei 120°C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde das viskose Öl mehrmals mit Ether behandelt und danach im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 60%.
13. Darstellung von 1-(4-sulfonatobutyl)-2-acetanilidovinylchinolinium-Betain
2 g (7 mmol) 2-Mehtyl-1-(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain und 1,4 g (7 mmol) N,N'-Diphenylformamidin wurden in Acetanhydrid 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das ölige Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung ausgefällt und danach mehrmals mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 78%.
14. Darstellung von OB-657 OH
0,5 g (1,4 mmol) 1-(5-Acetoxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid und 0,6 g (1,4 mmol) 1-(4-sulfonatobutyl)-2-acetanilidovinylchinolinium-Betain wurden in 10 ml Pyridin 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt, wobei sich die Reaktionslösung tief blau färbte. Nach dem Abkühlen wurde die noch acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 250 mg Natriumcarbonat gegeben. Danach wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und mit Ether gefällt. Die Reinigung des Produktes erfolgte über eine präparative Säule (C18- Kieselgel, Methanol/Wasser 1 : 1). Ausbeute: 19%.
15. Darstellung von OB-657 phosphoramidit
200 mg OB-657-OH wurden in trockenem DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,15 ml N,N-Diisopropylamin und im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 µl 2-Cyanoethyl-N,N- Diisopropylchlorophosphoramidit hinzugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde dünnschicht­ chromatographisch verfolgt. Nach quantitativem Ablauf der Reaktion kann die Lösung direkt zur Markierung von DNA eingesetzt werden.
16. Allgemeine Vorschrift zum Färben von Polystyren-Mikropartikeln
500 µl einer 8%igen Lösung der Mikropartikel (DC, Portland, Oregon) wurden in einer Mischung aus 12 ml bidestilliertem Wasser und 12,5 ml Methanol suspendiert.
Unter kräftigem Rühren mit einem glasummantelten Magnetrührer wurde der Partikelsuspension im Verlauf mehrerer Stunden eine Lösung des gewünschten Farbstoffs, z. B. 1-(3-Methyl-benzothiazol-2-yl)-3-(1-octadecyl-<4<chinolyl)-trimethinium-perchlorat, (10 mg in 1 ml Toluen) in 20 µl-Portionen hinzugefügt. Dabei wurde darauf geachtet, daß erst dann eine weitere Portion hinzugegeben wurde, wenn sich die vorherige Portion vollständig gelöst hatte und sich nicht mehr auf der Oberfläche der gerührten Suspension befand.
Nach Beendigung der Farbstoffzugabe wurde noch weitere 10 Stunden gerührt.
Anschließend wurden die gefärbten Partikel durch Zentrifungation abgetrennt und durch mehrmaliges Waschen mit bidestilliertem Wasser und Zentrifugation gereinigt.
Die so erhaltenen Partikel weisen nach Anregung mit einem 635 nm Diodenlaser oder einem 633 nm He-Ne-Laser eine Fluoreszenz mit einem Maximum bei 652 nm auf.

Claims (12)

1. Substituierte Chinolinium- bzw. Pyridiniumderivate der allgemeinen Formeln (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb)
wobei Z für
steht,
  • - X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. ein Struktruelement NR, C(CH3)2 oder CH=CH steht;
  • - zumindest einer der Substituenten R1 bis R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht. Die reaktive Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder Iodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruckstücke. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 18 annehmen kann;
  • - n für die Zahlenwerte 1, 2, oder 3 steht;
  • - die Substituenten R11 und R12 auch eine Verbrückung über vier-, fünf und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich auch an dieser reaktive Gruppen befinden können. Solche Ringverbrückungen der Polymethinkette sind im Folgenden gezeigt. So kann die Struktureinheit
    stehen für
    Die Struktureinheit
    kann stehen für
    wobei die Substituenten A, B, C, D, E, F und G die gleichen Funktionalitäten wie R1 bis R15 besitzen können: Zusätzlich können A, B und C für O, S, C(CN)2 bzw N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2 steht. D kann weiterhin für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem stehen, an dem reaktive Substituenten analog zu R1 bis R15 angebracht sind;
  • - zumindest einer der Substituenten R1 bis R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten wie SO3 -, PO3-, COO- oder NR3 + darstellen kann;
  • - und die Substituenten R1 bis R10 auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.
2. Verfahren zur Herstellung der substituierten Chinolin- oder Pyridiniumderivate der allgemeinen Formel (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb), dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein para-Methyl- oder ortho-Methyl-Pyridin- oder Chinolin-Heterocyclus am Stickstoffatom geeignet alkyliert wird und das entstandene Salz oder innere Salz an der para- oder ortho-Methylgruppe mit einem C1- oder C3- oder C5-Baustein versehen wird. Der Polymethinfarbstoff wird anschließend durch Umsetzung des Produktes mit einem weiterem, vorher durch Alkylierung erhaltenen heterocyclischen Salz oder inneren Salz dargestellt. Weitere Reaktionsschritte sind gegebenenfalls notwendig, um einen oder mehrere der Substituenten R1 bis R15 in eine reaktive Form zu bringen, so daß er an Biomoleküle konjugiert oder an Partikel gebunden werden kann.
3. Verwendung der substituierten Chinolin- oder Pyridinderivate der allgemeinen Formeln (Ia) oder (Ib) oder (IIa) oder (IIb) als Farbstoffe zur optischen Markierung von Proteinen, Nucleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln.
4. System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nucleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka oder Polymerpartikeln, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen der Verbindungen nach Anspruch 1 kovalent an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion der zu bestimmenden Substanzen gekoppelt werden.
5. System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsreaktion in wäßriger Lösung durchgeführt wird.
6. System nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalent gekoppelte Verbindung fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
7. Verwendung der Verbindungen und Systeme nach Anspruch 1 bis 6 in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch-Durchsatz-Screenings.
8. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 zur kovalenten oder nicht-kovalenten Anfärbung von anorganischen oder organischen Polymerpartikeln.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dergestalt, daß ein oder mehrere Farbstoffe in die Polymerpartikel eingebracht werden.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dergestalt, daß der Farbstoff oder das farbstoffmarkierte Biomolekül an der Oberfläche oder im Inneren des Partikels kovalent oder nicht-kovalent aufgebracht wird.
11. Verwendung nach den Ansprüchen 9 und 10, dergestalt, daß die Partikel einen Durchmesser von 10 nm bis 5 µm besitzen und aus organischem oder anorganischem Polymer bestehen und gegebenenfalls magnetische Kerne besitzen.
12. Verwendung der Partikel nach den Ansprüchen 8, 9, 10 und 11 in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch-Durchsatz-Screenings.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111812229A (zh) * 2020-06-19 2020-10-23 广电计量检测(合肥)有限公司 一种气相色谱-质谱测定土壤/沉积物中2-甲基苯并噻唑的分析方法

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