DE69907185T2

DE69907185T2 - Verfahren und reaktiv für einen energietransfer-assay

Info

Publication number: DE69907185T2
Application number: DE69907185T
Authority: DE
Inventors: Alan L. Amersham HAMILTON; Martyn N. Rudry BIRCH; Malcolm J. Watford Farm HATCHER; Nigel Danescourt BOSWORTH; Brian Scott
Original assignee: Amersham Biosciences UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2019-06-03
Also published as: JP5008044B2; EP1086179B1; CA2330974A1; ATE238392T1; GB9812596D0; AU749437B2; US6828116B1; EP1086179A1; ES2198133T3; WO1999064519A1; JP2003532745A; DE69907185D1; DK1086179T3; AU4156899A; CA2330974C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung. Insbesondere betrifft die Erfindung fluorogene Assays, welche eine neue Klasse von nichtfluoreszierenden Auslöschungsfarbstoffen einschließen, und neue Auslöschungsfarbstoffverbindungen hiervon.
Die Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET) findet zwischen den Anregungszuständen von Elektronen zweier Fluorophore statt, wenn sie in ausreichender Nachbarschaft zueinander vorliegen, wobei die Energie des Anregungszustandes des Donor-Fluorophors auf den Akzeptor-Fluorophor übertragen wird. Das Ergebnis ist eine Verringerung der Lebensdauer und eine Auslöschung der Fluoreszenz der Donorspezies sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Fluoreszenzintensität der Akzeptorspezies. Bei einer Anwendung dieses Prinzips wird bewirkt, daß sich eine fluoreszierende Gruppe in enger Nachbarschaft zu einem auslöschenden Molekül befindet. In dieser Anordnung wird die Energie von dem angeregten Donor-Fluorophor auf das Auslöschungsmittel übertragen und als Wärme anstatt als Fluoreszenzenergie abgegeben.
Die Verwendung von Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET)-Markierungen in biologischen Systemen ist gut bekannt. Das Prinzip ist beim Nachweis von Bindungsereignissen oder Spaltungsreaktionen in Assays angewendet worden, welche die Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung verwenden. Im Falle von Peptidspaltungsreaktionen sind ein fluoreszierendes Donormolekül und ein fluoreszierendes Akzeptormolekül an ein Peptidsubstrat auf beiden Seiten der zu spaltenden Peptidbindung gebunden, und in einem solchen Abstand, daß eine strahlungsfreie Energieübertragung zwischen der Donorund der Akzeptorspezies erfolgt. Zum Beispiel offenbart EPA-428000 ein neues fluorogenes Peptidsubstrat, das ein fluoreszierendes Donormolekül und ein auslöschendes Akzeptormolekül einschließt, welche daran gebunden sind. Das markierte Substrat kann beim Nachweis und in einem Assay auf ein virales Proteaseenzym verwendet werden, wodurch, falls das Enzym in einer Testprobe vorhanden ist, das Substrat gespalten wird und die Donor- und die Akzeptorspezies dadurch getrennt werden. Die resultierende Fluoreszenzemission der Donorspezies kann gemessen werden. Geeignete fluoreszierende Donatoren schließen Fluoresceinderivate, Cumarine und 5-((2-Aminoethyl)amino)-naphthalin-l-sulfonsäure (EDANS) ein. Geeignete auslöschende Akzeptoren schließen 2,4-Dinitrophenyl (DNP) und 4-(4-Dimethylaminophenyl)azobenzoesäure (DABCYL) ein.
Die Fluoreszenz-Energieübertragung ist auch bei der Untersuchung der Nucleinsäurehybridisierung angewendet worden. Zum Beispiel offenbaren Tyagi und Kramer (Nature Biotechnology 14 (1996), 303–308) homogene Hybridisierungsassays, welche fluoreszenzmarkierte Sonden verwenden. Die U-förmigen Sonden umfassen eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz, die zu der Ziel-Nucleinsäure komplementär ist, zusammen mit einer Stammsequenz, gebildet aus zwei komplementären Armen, welche die Sondensequenz umgeben. Ein Fluorophor (EDANS) ist an einen Arm gebunden, und die nichtfluoreszierende Auslöschungsmittelgruppe (DABCYL) ist an den komplementären Arm gebunden. In Abwesenheit des Zielmoleküls behält die Stammsequenz die Fluoreszenz bei, und die auslöschenden Gruppen in unmittelbarer Nachbarschaft bewirken, daß die Fluoreszenz des Fluorophors ausgelöscht wird. Wenn die Sonde an ein Nucleinsäure-Zielmolekül binden kann, macht sie eine Konformationsänderung durch, wodurch ein stabileres Hybrid mit dem Zielmolekül gebildet wird und bewirkt wird, daß die Armsequenzen (und der Fluorophor und das Auslöschungsmittel) voneinander getrennt werden. Der Fluorophor emittiert dann bei der Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge eine Fluoreszenz.
Der Erfolg der Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung hängt von der Wahl des geeigneten Donor/Akzeptor-Paares ab. Falls die Energieübertragung zwischen dem Donor und dem Akzeptor optimiert werden kann, wird die Restfluoreszenz minimiert, wenn das Donor/Auslösungsmittel-Paar in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander vorliegt, und eine starke Signaländerung kann erhalten werden, wenn sie voneinander getrennt werden. Es gibt eine zunehmende Entwicklung hin zu einer Assay-Miniaturisierung und zu Screeningassays mit einem hohen Durchsatz; und als Ergebnis erweist sich die Verwendung von Fluorophoren mit hohen Extinktionskoeffizienten als vorteilhaft, um die erforderlichen Empfindlichkeitsgrade zu erzielen. Ein weiteres Problem, das mit solchen Assays verbunden ist, ist auf die Farbauslöschung zurückzuführen, welche durch das Vorhandensein von gefärbten Proben in dem Testmedium verursacht wird, welche dazu neigen, im Bereich von 350–450 nm des Spektrums stark zu absorbieren.
Die vorliegende Erfindung stellt einen nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff bereit, der als Komponente eines fluoreszierenden Donor/Akzeptor-Paares für Assays verwendet werden kann, die den Nachweis von Bindungs- und/oder Spaltungsereignissen bei Reaktionen in Verbindung mit biologischen Molekülen einschließen. Der fluoreszierende Donorfarbstoff besitzt einen hohen Extinktionskoeffizienten, wodurch der Nachweis von geringen Mengen des Fluorophors ermöglicht wird. Außerdem weist das fluoreszierende Farbstoffpaar Anregungs- und Emissionswellenlängen in einem Bereich auf, der im wesentlichen frei von einer Autofluoreszenz, die mit biologischen Proben verbunden ist, und von einer Auslöschung aufgrund von gefärbten Proben ist. Außerdem sind die Farbstoffe relativ pH-unempfindlich, und sie besitzen einen hohen Grad der Spektralüberlappung, wodurch eine effiziente Energieübertragung ermöglicht wird.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (1):
worin die Verbindungsgruppe Q eine, zwei oder drei Doppelbindungen in Konjugation mit den X und Y enthaltenden Ringen enthält;
die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind oder wahlweise an die Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind;
Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome bedeuten, welche notwendig sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als zwei Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen;
X und Y gleich oder verschieden sind und gewählt sind aus Bis-C₁-C₄-Allcyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substiuiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selenium, -CH=CH- und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R⁸ gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reaktiv sind;
mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ die Gruppe -E-F ist, worin E eine Abstandsgruppe mit einer Kette aus 1–60 Atomen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Ziel-Bindungsgruppe ist, wobei die Ziel-Bindungsgruppe eine reaktive Gruppe für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe eines Zielmaterials oder eine funktionelle Gruppe für die Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt;
irgendwelche verbleibenden Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulfonat und Sulfat, worin R⁹ aus H und C₁-C₄-Alkyl gewählt ist;
irgendwelche verbleibenden Gruppen R¹ und R² gewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, welches unsubstituiert oder mit Phenyl substituiert sein kann, wobei das Phenyl wahlweise mit bis zu zwei Substituenten substituiert ist, gewählt aus Carboxyl-, Sulfonat- und Nitrogruppen;
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ einen Substituenten umfaßt, welcher die Fluoreszenzemission des Farbstoffes verringert, so daß er im wesentlichen nichtfluoreszierend ist;
mit der Maßgabe, daß die Verbindungsgruppe Q kein Squarain-Ringsystem ist.
Die Verbindungsgruppe Q enthält eine, zwei oder drei Doppelbindungen in Konjugation mit den X und Y enthaltenden Ringen.
Vorzugsweise ist Q die Gruppe:
worin die Gruppen R¹⁰ gewählt sind aus Wasserstoff und C₁-C₄-Alkyl, das unsubstituiert oder mit Phenyl substituiert sein kann, oder zwei oder mehrere R¹⁰-Gruppen zusammen mit der Gruppe:
ein Kohlenwasserstoff-Ringsystem bilden, welches mit R⁷ substituiert ist und welches wahlweise ein Heteroatom enthalten kann, gewählt aus -O-, -S- oder >NR⁷, worin R⁷ wie oben definiert ist: und
n = 1, 2 oder 3 ist.
Geeigneterweise ist der nichtfluoreszierende Cyanin-Farbstoff zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung einer Verbindung mit der Formel (2):
worin die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind oder wahlweise an die Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind, und n eine ganze Zahl von 1–3 ist;
Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome bedeuten, welche notwendig sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als zwei Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen;
X und Y gleich oder verschieden sind und gewählt sind aus Bis-C₁-C₄-Alkyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substiuiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selenium, -CH=CH- und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R⁸ gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reaktiv sind;
mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ die Gruppe -E-F ist, worin E eine Abstandsgruppe mit einer Kette aus 1–60 Atomen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Ziel-Bindungsgruppe ist, wobei die Ziel-Bindungsgruppe eine reaktive Gruppe für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe eines Zielmaterials oder eine funktionelle Gruppe für die Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt;
irgendwelche verbleibenden Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulfonat und Sulfat, worin R⁹ aus H und C₁-C₄-Alkyl gewählt ist;
irgendwelche verbleibenden Gruppen R¹ und R² gewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, welches unsubstituiert oder mit Phenyl substituiert sein kann, wobei das Phenyl wahlweise mit bis zu zwei Substituenten substituiert ist, gewählt aus Carboxyl-, Sulfonat- und Nitrogruppen;
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ einen Substituenten umfaßt, welcher die Fluoreszenzemission des Farbstoffes verringert, so daß er im wesentlichen nichtfluoreszierend ist.
Geeigneterweise umfaßt mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ der erfindungsgemäßen Farbstoffe einen Substituenten, welcher die Fluoreszenzemission des Farbstoffes verringert, so daß er im wesentlichen nichtfluoreszierend ist. Geeigneterweise ist mindestens eine der Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ der nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe der Strukturen (1) und (2) eine Nitrogruppe, welche direkt an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sein kann. Alternativ kann eine Mono- oder Dinitro-substituierte Benzylgruppe an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sein, welche wahlweise weiterhin mit einer oder mehreren Nitrogruppen substituiert sein können, die direkt an. die aromatischen Ringe gebunden sind. Vorzugsweise umfaßt mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ der nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe der Strukturen (1) und (2) mindestens eine Nitrogruppe.
Die Ziel-Bindungsgruppe R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ kann eine beliebige Gruppe sein, welche zur Bindung des nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffes an ein Zielmaterial, wie ein Trägermaterial oder eine biologische Verbindung, geeignet ist und als solche den Fachleuten gut bekannt ist. Beispielsweise kann die Ziel-Bindungsgruppe eine reaktive Gruppe für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf dem Zielmaterial sein. Alternativ kann die Ziel-Bindungsgruppe eine funktionelle Gruppe sein, und das Zielmaterial kann die reaktive Komponente enthalten.
Die Ziel-Bindungsgruppe besitzt die Struktur -E-F, worin E eine Abstandsgruppe ist und F die reaktive oder funktionelle Gruppe ist. Eine reaktive Gruppe des Farbstoffes kann unter geeigneten Bedingungen mit einer funktionelle Gruppe eines Zielmoleküls reagieren; eine funktionelle Gruppe des Farbstoffes kann unter geeigneten Bedingungen mit einer reaktiven Gruppe des Zielmoleküls reagieren, wodurch das Zielmolekül mit dem Farbstoff markiert wird.
Vorzugsweise ist die reaktive Gruppe F gewählt aus Carboxyl, Succinimidylester, Sulfosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid, Halogenacetamid, Säurehalogenid, Hydrazid, Vinylsulfon, Dichlortriazin und Phosphoramidit. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe F gewählt aus Hydroxy, Amino, Sulfhydryl, Imidazol, Carbonyl einschließlich Aldehyd und Keton, Phosphat und Thiophosphat. Auf Grund der reaktiven und funktionellen Gruppen kann der nichtfluoreszierende Cyanin-Farbstoff mit Zielmaterialien umgesetzt und daran kovalent gebunden werden.
Geeignete Abstandsgruppen können eine Kette aus 1–60 Atomen enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor. Beispielsweise kann die Abstandsgruppe bedeuten: -(CHR')_p- -{(CHR')_q-O-(CHR')_r}_s- -{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s- -{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s- -{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r-}_s- -{(CHR')_q CO-NR'-(CHR')_r-}_s- -{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r-}_s- worin R' Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl ist, welches wahlweise mit Sulfonat substituiert sein kann; Ar Phenylen bedeutet, wahlweise substituiert mit Sulfonat; p 1–20 ist, vorzugsweise 1–10; q 1–5 ist; r 0–5 ist; und s 1–5 ist.
Spezifische Beispiele für die reaktiven Gruppen R^l-R⁷ und die Gruppen, mit denen die Gruppen R^l-R⁷ reagieren können, sind in Tabelle 1 angegeben. Alternativ können die Gruppen R^l-R⁷ die funktionellen Gruppen aus Tabelle 1 sein, welche mit den reaktiven Gruppen eines Zielmoleküls reagieren würden. Tabelle 1 Mögliche reaktive Substituenten und funktionelle Gruppe, welche damit reaktiv sind
Besonders geeignete reaktive Gruppen R¹-R⁷, welche zur Markierung von Zielkomponenten mit zugänglichen funktionellen Amino- und Hydroxylgruppen besonders geeignet sind, schließen ein:
worin m eine ganze Zahl von 1–10 ist.
Aryl ist ein aromatischer Substituent, enthaltend einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe, welche 6 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, zum Beispiel Phenyl oder Naphthyl, wobei das Aryl wahlweise und unabhängig substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, zum Beispiel Halogen, gerade oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl und Alkoxy, beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy und n-Butoxy.
Heteroaryl ist ein mono- oder bicyclisches, 5- bis 10-gliedriges Ringsystem, enthaltend mindestens ein Heteroatom und nicht mehr als 3 Heteroatome, welche gewählt sein können aus N, O und S, und ist wahlweise und unabhängig substituiert mit einem oder mehreren Substituenten, zum Beispiel Halogen, gerade oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl und Alkoxy, beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy und n-Butoxy.
Aralkyl ist eine C₁-C₆-Alkylgruppe, welche mit einer Aryl- oder Heteroarylgruppe substituiert ist.
Halogen und Halogengruppen sind aus Fluor, Chlor, Brom und Iod gewählt.
Die nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können auch daran gebundene wassersolubilisierende Komponenten einschließen, um dem Farbstoff einen hydrophilen Charakter zu verleihen. Sie können direkt an das aromatische Ringsystem des Cyanin-Farbstoffes gebunden sein, oder sie können an die Abstandsgruppe E gebunden sein. Geeignete solubilisierende Komponenten können ge wählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Hydroxyl. Sulfonat- oder Sulfonsäuregruppen, welche direkt an den aromatischen Ring des nichtfluoreszierenden Auslöschungsfarbstoffes gebunden sind, werden besonders bevorzugt. Eine Wasserlöslichkeit kann bei der Markierung von Proteinen notwendig sein.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein biologisches Material, welches mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoff markiert ist.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein biologisches Material, welches zwei Komponenten umfaßt, wobei eine hiervon mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist, der als Resonanzenergie-Donor wirksam sein kann, und wobei die andere mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoff markiert ist, der als Akzeptor für die Resonanzenergie dienen kann, welche von dem Donor übertragen wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Assayverfahren, umfassend:

i) Trennen zweier Komponenten, welche in einer Energieübertragungsbeziehung stehen, wobei die erste Komponente mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist und die zweite Komponente mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff markiert ist; und
ii) Nachweisen des Vorhandenseins der ersten Komponente durch Messen der emittierten Fluoreszenz.

Unter einem zusätzlichen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Assayverfahren, umfassend:

i) Binden einer Komponente eines spezifischen Bindungspaares mit einer zweiten Komponente des Paares, wobei die erste Komponente mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist und die zweite Komponente mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff markiert ist, um eine Energieübertragungsbeziehung zwischen der ersten und der zweiten Komponente hervorzubringen; und
ii) Nachweisen der Bindung der ersten und der zweiten Komponente durch Messen der emittierten Fluoreszenz.

Die erfindungsgemäßen nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe werden als Akzeptorfarbstoffe in Assayverfahren unter Anwendung der Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung verwendet. Wenn ein erfindungsgemäßer nichtfluoreszierender Cyanin-Farbstoff in einer Energieübertragungsbeziehung zu einem fluoreszierenden Donorfarbstoff steht, wird die Fluoreszenzemission des Donors durch die Auslöschung durch den Akzeptor verringert. Wenn bei der Resonanzenergieübertragung ein Verlust durch die Trennung des fluoreszierenden Donorfarbstoffes und des Akzeptorfarbstoffes auftritt, wird die Fluoreszenzemission infolge des Donorfarbstoffes wiederhergestellt. Wirksame nichtfluoreszierende Auslöschungsfarbstoffe besitzen eine geringe Effizienz zur Umwandlung des absorbierten einfallenden Lichtes in eine Fluoreszenz und sind somit als Fluoreszenzmarkierungen ungeeignet, wenn ein hoher Empfindlichkeitsgrad erforderlich ist. Die relative Wirksamkeit der nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe als Auslöschungsmittelfarbstoffe ist in 1 veranschaulicht, welche die relative Fluoreszenzemission der repräsentativen erfindungsgemäßen nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe im Vergleich zu den entsprechenden Farbstoffen der gleichen Klasse und mit ähnlichen Absorptionseigenschaften im sichtbaren Bereich des Spektrums zeigt.
Die Eigenfluoreszenz der erfindungsgemäßen Cyanin-Farbstoffe beträgt bei deren Verwendung als Energieakzeptoren vorzugsweise weniger als 10% der Fluoreszenzemission des Donorfarbstoffes bei der Anregung mit der Donor-Anregungswellenlänge und beim Nachweis der Emission bei der Donor-Emissionswellenlänge. 3 zeigt die Reduktion des Hintergrundsignals, welche durch die Verwendung von Verbindung II und Verbindung XI als Akzeptorfarbstoffe erhältlich ist, verglichen mit der eines üblichen übereinstimmenden fluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoffes (Cy5), gemessen bei den Emissionsmaxima des Donorfarbstoffes. Der Beitrag zur Hintergrundfluoreszenz wird somit durch die Verwendung der erfindungsgemäßen nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe als Auslöschungsmittelfarbstoffe minimiert. Außerdem sind die vorliegenden Farbstoffe derart ausgelegt, daß ihre Spektralüberlappung mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff maximiert ist, wodurch die Auslöschungswirksamkeit verbessert wird.
Das biologische Material kann ein biologisches Molekül sein, welches in die zwei Komponententeile gespalten werden kann; oder das biologische Material kann zwei Komponenten umfassen, wie vorstehend definiert, welche entweder durch kovalente oder nichtkovalente Assoziation gebunden sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein neues fluorogenes Substrat und ein Assayverfahren für den Nachweis und die Messung der Spaltung eines Moleküls in zwei Komponententeile, wobei die erste Komponente mit fluoreszierenden Donorfarbstoff in einer Energieübertragungsbeziehung mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff, gebunden an die zweite Komponente, markiert ist.
Die Assays können erfindungsgemäß bei Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz durchgeführt werden, einschließlich solchen, wobei Verbindungen auf ihre Hemmwirkungen, Potenzierungseffekte, agonistische oder antagonistische Wirkungen auf die zu untersuchende Reaktion durchmustert werden sollen. Beispiele solcher Assays schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die Spaltung eines Peptids oder Proteins durch eine Protease und die Spaltung eines DNA- oder RNA-Moleküls durch eine Nuclease ein. In dieser Assayanordnung schließt das Enzymsubstrat (Peptid oder Nucleinsäure) eine Sequenz ein, deren Struktur ein fluoreszierendes Donorfarbstoffmolekül mit dem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff gebunden an das Substrat auf beiden Seiten des Substrats, welches zur Spaltung gebunden wird, kombiniert. Das Substrat verbindet die fluoreszierenden Donor- und die Akzeptorgruppen in unmittelbarer Nachbarschaft. Die Eigenfluoreszenz des Donors wird durch die Auslöschung durch den Akzeptor infolge der Resonanzenergieübertragung zwischen dem Paar aus Farbstoffen verringert. Die Resonanzenergieübertragung wird unbedeutend, wenn der Abstand zwischen den Donor- und den Akzeptorgruppen größer als etwa 10 Ångström beträgt. Die Spaltung des Substrats resultiert in der Trennung zwischen den Donor- und den Akzeptorfarbstoffen und einem gleichzeitigen Verlust der Resonanzenergieübertragung. Das Fluoreszenzsignal des fluoreszierenden Donorfarbstoffes erhöht sich, wodurch eine genaue Messung der Spaltungsreaktion ermöglicht wird.
Kurz zusammengefaßt kann ein Assay für den Nachweis einer proteolytischen Enzymaktivität wie folgt angeordnet sein. Ein Reaktionsgemisch wird durch Kombinieren eines Proteaseenzyms und eines fluorogenen Substrats, welches ein fluoreszierendes Donorfarbstoffmolekül mit einem nichtfluoreszierenden Akzeptorfarbstoff der Formel (2), gebunden an das Substrat auf beiden Seite des Substrats, welches zur Spaltung gebunden wird, kombiniert. Eine bekannte oder eine mutmaßliche Proteaseinhibitorverbindung kann wahlweise in dem Reaktionsgemisch eingeschlossen sein. Typischerweise wird die Reaktion in einer gepufferten Lösung durchgeführt, und die Reaktion kann bis zum Reaktionsendpunkt voranschreiten. Das Voranschreiten der Reaktion kann überwacht werden durch Beobachten der Gleichgewichtsfluoreszenzemission infolge des fluoreszierenden Donorfarbstoffes, die unter Verwendung eines Spektrofluorimeters aufgezeichnet wird.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Assayverfahren zum Nachweis und zur Messung einer Bindung durch kovalente oder nichtkovalente Assoziation einer Komponente eines Ligand/Reaktant-Paares mit einer zweiten Komponente des Paares, wobei die erste Komponente mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist und die zweite Komponente mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff markiert ist. Solche Assays werden geeigneterweise in eine von zwei Kategorien eingeteilt.

i) Die erste Kategorie umfaßt Gleichgewichts-Bindungsassays, wobei eine Komponente eines spezifischen Bindungspaares nichtkovalent an eine zweite Komponente des spezifischen Bindungspaares bindet. Solche Gleichgewichts-Bindungsassays können für Screeningassays verwendet werden, wobei Proben, welche die zu durchmusternden Verbindungen enthalten, auf ihre Wirksamkeit bei der Bindung der ersten Komponente des spezifischen Bindungspaares (entweder antagonistisch oder agonistisch) an die zweite Komponente getestet werden. Jede Komponente kann mit dem Donorfarbstoff oder dem Akzeptorfarbstoff markiert sein. In Abwesenheit einer Bindung sind die markierten Komponenten zu weit voneinander entfernt, um eine Resonanzenergieübertragung hervorzubringen. Bei der Bindung einer markierten Komponente an deren markierten spezifischen Bindungspartner werden die markierten Gruppen in eine ausreichend enge Nachbarschaft gebracht, um eine Resonanzenergieübertragung zwischen der Donor- und der Akzeptorspezies hervorzubringen, welche in einer Auslöschung der Donor-Fluoreszenz und einer Verringerung des Donor-Fluoreszenzsignals resultiert.

Beispielsweise können die erfindungsgemäß eingesetzten Farbstoffe verwendet werden, um Sonden, wie die durch Tyagi und Kramer (oben angeführt) beschriebenen, zur Verwendung beim Nachweis und der Identifizierung von einzigartigen DNA-Sequenzen oder spezifischen Genen in einem vollständigen DNA-Molekül oder in Mischungen von Nucleinsäurefragmenten zu markieren. Ein Ende der Nucleinsäuresonde ist mit einem fluoreszierenden Farbstoff und das andere Ende mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff markiert. In Abwesenheit einer spezifischen Zielsequenz werden die fluoreszierende und die auslöschende Spezies ausreichend nahe beieinander gehalten, um eine Energieübertragung hervorzubringen. Folglich ergibt die Bestrahlung des Fluorophors mit Erregerlicht ein verringertes Fluoreszenzsignal. Die Wechselwirkung der Sonde mit einer spezifischen Ziel-Nucleinsäuresequenz ruft eine Konformationsänderung in der Sonde hervor, so daß der fluoreszierende Donor und der Akzeptor räumlich voneinander getrennt werden. Die Anregung des Fluorophors ergibt ein Fluoreszenzsignal, das unter Verwendung eines Spektrofluorimeters aufgezeichnet werden kann.
Alternativ kann der Gleichgewichts-Bindungsassay eine Sandwich-Assayanordnung verwenden, wobei eine Komponente eines spezifischen Bindungspaares, wie ein erster Antikörper, auf die Wände der Vertiefungen einer Mikrotitervertiefungsplatte aufgetragen ist. Nach der Bindung eines Antigens an den ersten Antikörper wird anschließend ein zweiter antigenspezifischer Antikörper zu dem Assaygemisch zugegeben, um an den Antigen-erster Antikörper-Komplex zu binden. In dieser Anordnung kann entweder der erste Antikörper oder das Antigen mit dem Donorfarbstoff und der zweite Antikörper mit dem Akzeptorfarbstoff oder umgekehrt markiert sein. In Abwesenheit einer Bindung des erster Antikörper-Antigen-zweiter Antikörper-Komplexes sind die markierten Komponenten zu weit voneinander entfernt, um eine Resonanzenergieübertragung hervorzubringen. Bei der Bindung des zweiten Antikörpers an den erster Antikörper-Antigen-Komplex werden die markierten Gruppen in eine ausreichend enge Nachbarschaft gebracht, um eine Energieübertragung zwischen der Donor- und der Akzeptorspezies hervorzubringen, die in einer Auslöschung der Donor-Fluoreszenz und einer Verringerung des Donor-Fluoreszenzsignals resultiert. Das Fluoreszenzsignal wird gemessen, und die Konzentration des Antigens kann durch Interpolation aus einer Standardkurve bestimmt werden.
Beispiele für spezifische Bindungspaare schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Antikörper/Antigene, Lectine/Glykoproteine, Biotin/(Strept)avidin, Hormon/Rezeptor, Enzym/Substrat oder Co-Faktor, DNA/DNA, DNA/RNA und DNA/Bindungsprotein ein. Es sollte selbstverständlich sein, daß erfindungsgemäß beliebige Moleküle verwendet werden können, welche eine spezifische Bindungsaffinität besitzen, so daß die erfindungsgemäßen Energietransfer-Farbstoffe zur Markierung einer Komponente eines spezifischen Bindungspaares verwendet werden können, welche wiederum beim Nachweis der Bindung an die andere Komponente verwendet werden kann.

i) In der zweiten Kategorie kann der Assay den Nachweis und die Messung der Zugabe einer Gruppe, die mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist (der Reaktant), gelöst in dem Assaymedium, zu einer Gruppe, die mit einem nichtfluoreszierenden Akzeptorfarbstoff markiert ist (das Substrat), oder umgekehrt; durch kovalente Bindung, vermittelt durch die Enzymaktivität, umfassen. Beispiele für solche Assays schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die Verknüpfung von DNAoder RNA-Molekülen mit anderen Nucleinsäuremolekülen durch Ligasen, die Addition eines Nucleotids an ein DNA- oder RNA-Molekül durch eine Polymerase und die Übertragung einer markierten chemischen Einheit von einem Molekül auf ein anderes durch eine Transferase wie Acetyltransferase ein. Ein bekannter oder ein mutmaßlicher Enzyminhibitor kann wahlweise in dem Reaktionsgemisch eingeschlossen sein. Es sollte selbstverständlich sein, daß zwei beliebige geeignete Reaktant- und Substratgruppen verwendet werden können. Es können entweder die Donor- oder die Akzeptorfarbstoffe der vorliegenden Erfindung zur Markierung einer Gruppe verwendet werden, welche wiederum beim Nachweis und bei der Messung der Reaktion mit dem Substrat verwendet werden kann.

Beispielsweise können in einem DNA-Ligierungsassay zu verknüpfende DNA-Moleküle in einem wäßrigen Puffer, enthaltend ATP, in Abwesenheit einer DNA-Ligase zusammengemischt werden. Nach der Inkubation sind die DNA-Stränge in der richtigen Anordnung durch die Bildung üblicher Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen des Doppelstrangs kovalent verknüpft. Bei der Verknüpfung werden die markierten Gruppen in eine ausreichend enge Nachbarschaft gebracht, um eine Energieübertragung zwischen der Donor- und Akzeptorspezies hervorzubringen, welche in einer Auslöschung der Donor-Fluoreszenz und einer Signalverringerung resultiert, die zur Menge des gebildeten Ligationsprodukts proportional ist.
Die Erfindung betrifft auch Markierungsverfahren, wobei die nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe der Strukturen (1) und (2), einschließend mindestens eine reaktive oder funktionelle Gruppe in den R¹-R⁷-Positionen, kovalent mit Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Phosphoryl-, Carboxyl-, Sulfhydryl- oder anderen reaktiven Gruppen auf den Zielmaterialien reagieren. Solche Zielmaterialien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die Gruppe ein, bestehend aus Antigen, Antikörper, Lipid, Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Nucleotiden, welche enthalten oder derivatisiert sind, um zu enthalten eine oder mehrere aus einer Amino-, Sulfhydryl-, Carbonyl-, Hydroxyl und Carboxyl-, Phosphat- und Thiophosphatgruppe, sowie Oxy- oder Desoxypolynucleinsäuren, welche enthalten oder derivatisiert sind, um zu enthalten eine oder mehrere aus einer Amino-, Sulfhydryl-, Carbonyl-, Hydroxyl und Carboxyl-, Phosphat- und Thiophosphatgruppe, mikrobiellen Materialien, Arzneistoffen und Toxinen.
Die Wahl der geeigneten Paare aus einem fluoreszierendem Donor und einem Akzeptor hängt im allgemeinen von mehreren Faktoren ab.

i) Erstens sollten die Donor- und die Akzeptor-Chromophoren starke Elektronenübergänge im nahen UV-bis nahen IR-Spektralbereich aufweisen.
ii) Zweitens sollten die Donor- und die Akzeptorgruppen in relativ enger Nachbarschaft zueinander vorliegen. Geeigneterweise sollten die Donor- und die Akzeptorspezies im Bereich von 10–100 Ångström vorliegen.
iii) Drittens sollte eine geeignete Überlappung zwischen dem Donor-Emissionsspektrum und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors vorhanden sein. Je größer die Überlappung zwischen dem Donor-Emissionsspektrum und dem Anregungsspektrum des Akzeptors ist, desto größer ist die Energieübertragung. Die Energieübertragung kann zwischen Farbstoffen erfolgen, welche eine minimale Spektralüberlappung gemeinsam haben, aber diese wird nur beobachtet, wenn die Farbstoffe in enger Nachbarschaft vorliegen.

Geeignete fluoreszierende Donorfarbstoffe, die mit den nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoffen kombiniert werden können, um Energieübertragungspaare zur Durchführung der vorliegenden Erfindung zu bilden, schließen die gut bekannten reaktiven Analoge der Fluorescein-, Rhodamin- und Cyanin-Farbstoffe ein. Andere niedermolekulargewichtige fluoreszierende Farbstoffe können gewählt sein aus den Derivaten der Bis-pyrromethinborondifluorid-Farbstoffe, wie 3,3',5,5'-Tetramethyl-2,2'-pyrromethin-1,1'-borondifluorid, vertrieben unter dem Warenzeichen BODIPY durch Molecular Probes Inc. Besonders bevorzugt werden die Cyanin-Farbstoffe.
Geeignete Fluorescein-Donorfarbstoffe schließen ein: 5- und 6-Carboxyfluorescein und 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein. Geeignete Rhodamin-Farbstoffe schließen ein: 6-Carboxyrhodamin (Rhodamin 110), 5-Carboxyrhodamin-6G (R6G-5 oder REG-5), 6-Carboxyrhodamin-6G (R6G-6 oder REG-6), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAM-RA oder TMR) und 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX). Geeignete Cyanin-Donorfarbstoffe schließen die CyDyes^TM ein: Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7 (CyDye und Cy sind Warenzeichen von Amersham Pharmacia Biotech UK Limited). Cyanin-Farbstoffe, welche zur Verwendung als Donorkomponente in dem erfindungsgemäßen Assay geeignet sind, sind in US-Patent Nr. 5268486 (Waggoner et al.) offenbart, oder verstärkte Cyanin-Farbstoffe, wie die in dem GB-Patent Nr. 2301832 (Waggoner et al.) offenbarten. Alternativ kann die als Donorkomponente verwendete fluoreszierende Donorspezies eine Fluoreszenz-Energieübertragungsfarbstoff-Kassette sein. Beispiele für solche Fluoreszenz-Energieübertragungsfarbstoff-Kassetten sind in dem GB-Patent Nr. 2301832 (Waggoner et al.) zu finden.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt Beispiele für fluoreszierende Donorfarbstoffe und entsprechende nichtfluoreszierende Cyanin-Akzeptorfarbstoffe an, welche zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Tabelle 2
Die nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe der Formeln (1) und (2) können durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend:

a) Umsetzen einer ersten Verbindung der Formel (A):
worin X, Z¹, R¹, R³ und R⁵ wie oben definiert sind,
b) einer zweiten Verbindung, welche gleich oder verschieden ist von der ersten Verbindung und die Formel (B) besitzt:
worin Y, Z², R², R⁴ und R⁶ wie oben definiert sind, und
c) einer dritten Verbindung, welche geeignet ist, um eine Verbindung zwischen der ersten und der zweiten Verbindung zu bilden, wobei a), c) und b) entweder in einem zwei- oder einstufigen Verfahren umgesetzt werden, um die Verbindungen der Formeln (1) und (2) zu bilden.

Im Fall einer Zweistufensynthese wird zuerst eine Farbstoffzwischenverbindung durch Umsetzen einer Indoleninverbindung der Struktur (A) mit einer zur Bildung der Verknüpfung geeigneten Verbindung gebildet, wobei die Umsetzung in einem geeigneten polaren Lösungsmittel wie Ethanol oder Essigsäure durchgeführt wird. Im zweiten Schritt wird die Farbstoffzwischenverbindung mit der zweiten Indoleninverbindung der Struktur (B) in einem Medium wie Pyridin, Essigsäure und Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur umgesetzt. Solche Reaktionsbedingungen sind auch für die Herstellung der erfindungsgemäßen nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe durch ein Einstufenverfahren geeignet. Reagenzien c), die zur Bildung der Verknüpfung zwischen den Indolenineinheiten verwendet werden können, sind solche, welche zur Bildung einer Polymethinkette geeignet sind. Reagenzien und Verfahren, welche zur Bildung von Polymethinbindungen enthaltenden Cyanin-Farbstoffen geeignet sind, sind den Fachleuten gut bekannt und schließen Triethylorthoformiat, Malondialdehyd-bis-(phenylimin)hydrochlorid und N-[(5-Phenylamino)-2,4-pentadienylidenelanilin]hydrochlorid ein. (Vgl. zum Beispiel Fry D. J., Cyanine Dyes and Related Compunds, in Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier 1977, Seite 369–422).
Die erfindungsgemäßen nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffen können verwendet werden, um ein Zielmaterial, wie eine Komponente des Assaysystems, wie oben beschrieben, kovalent zu markieren. Die kovalente Markierung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit einem Zielmaterial erreicht werden, welches mindestens eine funktionelle oder eine reaktive Gruppe, wie oben definiert, besitzt. Das Zielmaterial kann mit einer Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung inkubiert werden, welche mindestens eine der Gruppen R^l-R⁷ aufweist, die eine reaktive oder eine funktionelle Gruppe einschließt, wie oben definiert, welche kovalent an die funktionelle oder die reaktive Gruppe des Zielmaterials binden kann. Das Zielmaterial und die erfindungsgemäße Verbindung werden unter Bedingungen und für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, welche ermöglichen, daß das Zielmaterial kovalent an die erfindungsgemäße Verbindung gebunden wird.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren weiter veranschaulicht.
Figuren
1 veranschaulicht die relative Fluoreszenzemission von Cy3 und der Verbindungen V und VII (1a) sowie von Cy5 und der Verbindungen IX und XI (1b) gemäß Beispiel 12.
2 veranschaulicht Nucleinsäure-Hybridisierungsassays, wobei eine Verringerung des Fluoreszenzsignals beobachtet wird, welche aus der Bindung eines Cy3-markierten Oligonucleotids und dessen komplementären Oligonucleotids, markiert mit einem nichtfluoreszierenden Cy5-Analog (Verbindung II) und mit DABCYL gemäß Beispiel 13, resultiert.
3 veranschaulicht die Wirkung der Verwendung nichtfluoreszierender Cyanin-Farbstoffe als Akzeptorfarbstoffe auf die Signal-Rausch-Erhöhung (und Hintergrundreduktion), verglichen mit einem üblichen übereinstimmenden fluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff (Cy5) in einer Oligonucleotid-Hybridisierungsstudie gemäß Beispiel 14.
4 veranschaulicht den Verlauf von Protease-Spaltungsassays unter Verwendung des Substrats Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys-Verbindung III in Anwesenheit und in Abwesenheit von Pepsin, gemessen im Hinblick auf die Zeit und die Fluoreszenzintensität, gemäß Beispiel 15.
Beispiele
Beispiel 1 Herstellung von 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-1-ethyl-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolinium, Salz (Verbindung I)
i) 5-Nitro-2,3,3-trimethylindol
Natriumnitrat (3,84 g, 45,2 mmol) wurde in konzentrierter Schwefelsäure (100 ml) gelöst. Nach Kühlen in Eis wurde diese Lösung zu einer Lösung von 2,3,3-Trimethylindol (6,65 g, 41,8 mmol) in konzentrierter Schwefelsäure (100 ml) zugegeben, so daß die Temperatur im Bereich von 0–5°C gehalten wurde. Die Reaktion wurde nach Beendigung der Zugabe bei 0–5°C für 90 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und weitere 16 Stunden gerührt. Die Mischung wurde auf Eis (200 g) gegossen, dann alkalisch gemacht durch die Zugabe einer 50%igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf pH 12 (pH-Papier). Das Rohprodukt wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis die Waschlösungen neutral waren (100 ml). Der gebrochen gelbe Feststoff wurde durch Absaugen getrocknet, in Ethylacetat (250 ml) gelöst und weiter getrocknet (MgSO₄). Die Lösung wurde filtriert, und das rote Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft. Der Feststoff wurde in Chloroform : Ethylacetat (95 : 5, 30 ml) gelöst und durch Silica-Flashchromatographie gereinigt. Auf diese Weise wurde ein dunkelgelber Feststoff erhalten; 5,12 g, 25 mmol, Ausbeute 60%. Die UV-Analyse (Methanol) zeigte einen einzigen Peak mit λmax = 300 nm. Die Massenspektroskopie (MALDI-TOF mit einer Gentisinsäure-Matrix) ergab m/z = 203,8 (für C₁₁H₁₂N₂O₂ = 204,23). H-NMR: δ = 1,97 (s, 6H); 2,95 (s, 3H); 8,58 (d, J = 10 Hz, 1H); 8,70 (s, 1H); 8,78 (d, J = 10 Hz, 1H).
ii) 1-Ethyl-5-nitro-2,3,3-trimethylindoliumiodid
5-Nitro-2,3,3-trimethylindol (518 mg, 2,54 mmol) und Ethyliodid (2,5 ml, 4,85 g, 31 mmol, Überschuß) wurden vermischt und für 8 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das überschüssige Ethyliodid durch einen schwachen Stickstoffstrom entfernt, und der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und durch einen Silicapfropfen filtriert. Das Silica wurde mit Chloroform (1 Volumenteil) gewaschen; und die vereinigten Filtrate wurden rotationsverdampft, wobei das Produkt als ein gelbes Öl erhalten wurde (486 mg, 1,35 mmol, Ausbeute 53%).
iii) 1-(5-Carboxypentyl-5-sulpho-2,3,3-trimethylindoliumbromid
Zu 5-Sulpho-2,3,3-trimethylindol (Kaliumsalz)(5,0 g, 18 mmol) wurde 6-Bromhexansäure (10,56 g, 53,8 mmol) in 1,2-Propandiol (15 ml) zugegeben und bei 80°C für 72 Stunden erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt und mit Wasser (60 ml) und einer NaOH-Lösung (10% in Wasser, 60 ml) unter Rühren verdünnt. Das Produkt wurde unter Anwendung einer präparativen HPLC (Dynamax, C18-Säule, Gradient von TFA/H₂O zu TFA/MeCN) gereinigt, wobei ein grau/rosa Feststoff (2,4 g, 28%) erhalten wurde.
iv) 2-(4-Anilinobuta-1,3-dienyl)-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-indolium, Salz
Zu dem Produkt aus Schritt iii) (400 mg, 0,85 mmol) wurde Malondialdehyd-bis(phenylimin)-HCl (322 mg, 1,24 mmol) in Essigsäure (5 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei 140°C für 16 Stunden unter Rühren erhitzt. Das Produkt wurde mittels HPLC (C4-Säule, TFA/H₂O-zu-TFA/MeCN-Gradient) gereinigt, wobei ein rot/grüner Feststoff (194,4 mg, 38%) erhalten wurde.
v) Synthese von Verbindung (I)
1-Ethyl-5-nitro-2,3,3-trimethylindoliumiodid (100 mg, 0,277 mmol) und das Produkt aus Schritt iv) (50 mg, 0,104 mmol) wurden in Pyridin : Essigsäure : Essigsäureanhydrid (9 : 9 : 2, 5 ml) gelöst, und die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur im Dunkeln für 24 Stunden stehen. Nach Entfernen der Lösungsmittel durch einen schwachen Stickstoffstrom wurde der Rückstand in Wasser : Acetonitril (7 : 3,5 ml) gelöst, und das Produkt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert. UV (Methanol): λmax abs. = 652 nm, λmax em. = 670 nm. MS: m/z = 621,2 (für C₃₃H₄₀N₃O₇S = 622,8).
Beispiel 2 Herstellung von 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolinium, Salz (Verbindung II)
i) 1-(3 5-Dinitrobenzyl)-2,3,3-trimethylindoliumiodid
3,5-Dinitrobenzylchlorid (100 mg, 0,46 mmol), 2,3,3-Trimethylindol (74 μl, 73,2 mg, 0,46 mmol) und Natriumiodid (69 mg, 0,46 mmol) wurden bei 100°C in Sulpholan (5 ml) für 16 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Produkt mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert (89,7 mg, 0,26 mmol, Ausbeute 57%).
ii) 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-l,3-dihydro-2H-indol-2-ylidenl-l,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolinium, Salz (II)
N-(3,5-Dinitrobenzyl)-2,3,3-trimethylindoliumiodid (20 mg, 0,059 mmol) und das Produkt aus Beispiel 1 iv) (20 mg, 0,041 mmol) wurden in Pyridin : Essigsäure : Essigsäureanhydrid (2 : 2 : 1, 2,5 ml) gelöst, und die Reaktion ließ man im Dunkeln bei Raumtemperatur für 16 Stunden stehen. Das Produkt wurde mittels Umkehrphasen-HLPC isoliert, wobei 17,6 mg (0,024 mmol, Ausbeute 59%) der Verbindung (II) erhalten wurden. MS: m/z = 730 (für C₃₈H₄₁N₄O₉S = 729,8).
iii) 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden}- 1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl-3,3-dimethyl-3H-indolinium, Salz, N-Hydroxysuccinimidylester
O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-bis-(tetramethylen)-uronium-hexafluorphosphat (10 mg, 0,04 mmol) wurde in N,N-Dimethylformamid (1 ml) gelöst, und N,N-Diisopropylethylamin (11 μl, 0,063 mmol) wurde zugegeben. Dieser Lösung wurden 100 μl entnommen und zur Carbonsäure (1 mg) aus dem obigen Schritt ii) zugegeben. Nach 3 h zeigte eine Massenspektrumanalyse, daß der NHS-Ester gebildet worden war. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung zur Markierung verwendet. MS: m/z = 797 (für C₄₃H₄₉N₄O₉S = 797,9).
Beispiel 3 Herstellung von 1-Butyl-2-{5-[1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-6-sulpho-1,3-dihydro-2H-benzo[e]indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolinium, Salz (Verbindung III)
1-Butyl-5-nitro-2,3,3-trimethylindoliumiodid (2,45 mg, 9,37 μmol) wurde zu 2-(2-Anilinobutenyl)-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-6-sulpho-ben(e)indolium, Salz (5 mg, 9,37 μmol), in Pyridin : Essigsäure : Essigsäureanhydrid (9 : 9 : 2, 200 μl) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln für 4 Tage aufbewahrt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei das gewünschte Produkt (2,0 mg, 2,85 μmol, Ausbeute 30%) erhalten wurde.
Beispiel 4 Herstellung von 1-Butyl-2-{7-[1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-l,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3,5-heptatrienyl}-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolinium, Salz (Verbindung-IV)
i) 1-Butyl-5-nitro-2,3,3-trimethylindoliumiodid
5-Nitro-2,3,3-trimethylindol (250 mg, 1,22 mmol) und Iodbutan (10 ml, 16,17 g, 87,87 mmol) wurden vermischt und für 16 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und das unreine Material wurde zur Verwendung in folgenden Reaktionen bei –20°C gelagert.
ii) 1-Butyl-2-{7-[1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3,5-heptatrienyl}-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolium, Salz (IV)
1-(5-Carboxypentyl)-5-sulpho-2,3,3-trimethylindolium, Salz (5 mg, 0,0141 mmol), 1-Butyl-5-nitro-2,3,3-trimethylindoliumiodid (4,02 mg, 0,0141 mmol) und N-[(5-Phenylamino)-2,4-pentadienylidenelanilin]-monohydrochlorid (3,69 mg, 0,0141 mmol) wurden in Pyridin : Essigsäure : Essigsäureanhydrid (9 : 9 : 2,1 ml) gelöst, und die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Woche stehen. Die UV-Analyse bei 752 nm über die Woche zeigte, daß die Umsetzung am Ende der Woche beendet war. Das Produkt wurde dann mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert, wobei ein blauer Feststoff (Ausbeute = 4,3 mg, 45%) erhalten wurde. UV (Methanol): λmax abs. = 752 nm. MS: m/z = 676 (für C₃₇H₄₆N₃O₇S = 676,9).
Beispiel 5 Herstellung von 2-{3-[1-(3-Aminopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-l-propenyl}-3-(3,5-dinitrobenzyl)-1,3-benzothiazol-3-ium, Salz Verbindung V)
i) 3-(3,5-Dinitrobenzyl)-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-iodid
2-Methylbenzothiazol (3 ml, 20,1 mmol) wurde in Aceton (25 ml) gelöst, dazu wurde 3,5-Dinitrobenzyliodid (7,4 g, 24,1 mmol) zugesetzt und unter Rühren für 15 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die Reaktion konnte abkühlen und wurde zu Ether (500 ml) zugetropft, wobei ein feiner gelber Feststoff hergestellt wurde, der abfiltriert und unter vermindertem Druck bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet wurde, um 3-(3,5-Dinitrobenzyl)-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-iodid (5 g, 10,9 mmol, Ausbeute 45%) zu erhalten. MS: m/z = 328 (C₁₅H₁₂N₃O₄S = 330,3). ¹H-NMR (200 MHz – DMSO-d₆): δ 2,85 (s, 1H); 3,7 (s, 3H); 6,35 (s, 2H); 7,37 (m, 2H); 8,23 (d, 1H); 8,53 (d, 1H); 8,62 (s, 2H); 8,8 (s, 1H).
ii) 1-(3-Aminopropyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid

a) 2,3,3-Trimethylindolenium-5-sulfat (20 g, 84 mmol) und N-(3-Brompropyl)phthalimid (50 g, 186 mmol) wurden in Sulpholan (75 ml) bei 110°C für 28 Stunden gerührt. Weitere Mengen an N-(3-Brompropyl)phthalimid (2,5 g, 84 mmol) wurden dann nach 28 Stunden und nach 45 Stunden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde insgesamt für 65 Stunden erhitzt, dann gekühlt und zu Ethylacetat (800 ml) zugesetzt, wobei sich ein Niederschlag bildete, welcher abfiltriert und mit Ethylacetat (3 × 300 ml) und Acetonitril (5 × 400 ml) gewaschen wurde, um einen rosafarbenen Feststoff zu erhalten, der unter vermindertem Druck getrocknet wurde, wobei 2,3,3-Trimethyl-1-(3-phthalimidopropyl)-5-sulpho-indoliumbromid (25 g, 49 mmol, Ausbeute 59%) erhalten wurde.
b) 2,3,3-Trimethyl-1-(3-phthalimidopropyl)-5-sulpho-indoliniumbromid (14 g, 27,6 mmol) wurde in konzentrierter HCl (100 ml) mit Methanol (50 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 32 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann gekühlt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Acetonitril gelöst, wobei sich ein Niederschlag bildete. Die Lösung wurde mit konzentriertem Ammoniak (–10 ml) neutralisiert, und der Niederschlag wurde abfiltriert, in einer minimalen Menge an Wasser gelöst und gereinigt, indem man die Lösung durch einen 2 g-Pfropfen von C18-Silica laufen ließ. Der rosafarbene Feststoff wurde gefriergetrocknet, wobei 1-(3-Aminopropyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid (8 g, 21,2 mmol, Ausbeute 77%) erhalten wurde. UV (Methanol): λmax = 254 nm. MS: m/z = 294 (C₁₄H₂₁N₂O₃S = 297). ¹H-NMR (200 MHz – DMSO-d₆): δ 1,5 (2s, 6H); 2,98 (s, 3H); 3,3 (m, 2H); 3,6 (t, 2H); 6,6 (d, 1H, J = 7,8 Hz); 7,5 (m, 2H); 8,2 (dd, 1H, J = 4 und 6 Hz).

iii) Synthese von Verbindung V
N,N'-Diphenylformamidin (236 mg, 1,2 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-(3,5-Dinitrobenzyl)-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-iodid (500 mg, 1,09 mmol) und 1-(3-Aminopropyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid (412,5 mg, 1,09 mmol) gelöst in Pyridin (4,5 ml), Essigsäure (4,5 ml) und Essigsäureanhydrid (1,0 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 100°C für 3,5 Stunden erhitzt, dann auf Raumtemperatur gekühlt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Der isolierte rosafarbene Feststoff wurde dann in wäßriger Salzsäure (2,0 M) gelöst und für 95 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die Lösung wurde anschließend auf Raumtemperatur gekühlt, eingedampft und dann mittels Umkehrphasen-HPLC wieder gereinigt. Der gesammelte rosafarbene Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet.
UV (Ethanol): λmax = 559 nm. MS: m/z = 638 (C₃₀H₃₀N₅S₂O₇ = 636,6).
Beispiel 6 Herstellung von 2-[3-(3-(5-Carboxypentyl)-1,3-benzothiazol-2(3H)-yliden)-1-propenyl]-3-(3,5-dinitrobenzyl)-1,3-benzothiazol-3-ium, Salz (Verbindung VI)
i) 3-(5-Carboxypentyl)-2-methyl-1,3-benxothiazol-3-ium-bromid
Zu 2-Methylbenzothiazol (80 ml, 93,84 g, 0,629 mol) wurde 6-Bromhexansäure (250 g, 1,28 mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 140°C für 24 Stunden gerührt. Ein gelber Niederschlag wurde gebildet. Die Reaktion konnte sich abkühlen, wurde in Methanol (350 ml) gelöst und zu Ethylacetat (2 1) zugetropft. Ein beiger Niederschlag wurde gesammelt und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) gewaschen. Der Feststoff wurde dann unter vermindertem Druck bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, um 3-(5-Carboxypentyl)-2-methyl-l,3-benxothiazol-3-ium-bromid (182,35 g, 0,53 mol, Ausbeute 84%) zu erhalten. UV (Methanol): λmax = 237, 277 nm. MS: m/z = 262 (C₁₄H₁₈NO₂S = 264). ¹H-NMR (200 MHz – DMSO-d₆): δ 1,49 (m, 4H); 1,9 (m, 2H); 2,24 (t, 2H, J = 6,35 Hz); 3,32 (s, 3H); 4,72 (t, 2H, J = 7,81 Hz); 7,85 (m, 2H); 8,4 (dd, 2H, J = 8,31).
ii) 2-(2-Anilinoethenyl)-3-(3,5-dinitrobenzyl)-1,3-benzothiazol-3-ium, Salz
N,N'-Diphenylformamidin (42,9 mg, 0,29 mmol) wurde zu 3-(3,5-Dinitrobenzyl-2-methyl-l,3-benzothiazol-3-ium-iodid (100 mg, 0,29 mmol) (hergestellt wie in Beispiel 5 i) und Natriumacetat (Überschuß) in Ethanol (1 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 40°C für 4 Stunden gerührt, wobei eine rote Lösung erhalten wurde. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei ein oranges Gummi erhalten wurde.
iii) Synthese von Verbindung VI
3-(5-Carboxypentyl)-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-bromid (7,9 mg, 0,02 mmol) wurde zu 2-(2-Anilinoethenyl)-3-(3,5-dinitrobenzyl)-1,3-benzothiazol-3-ium, Salz (10 mg, 0,02 mmol), und Natriumacetat (Überschuß) in Ethanol (1 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 45°C gerührt, und eine rosafarbene Lösung wurde beobachtet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei ein dunkelrosa Feststoff erhalten wurde. UV (Wasser/Acetonitril): λmax = 558 nm. MS: m/z = 604 (C₃₀H₂₇N₄O₆S₂ = 603,7).
Beispiel 7 Herstellung von 3-[4-(Carboxymethyl])benzyl]-2-{3-[1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1-propenyl}-1,3-benzoxazol-3-ium, Salz (Verbindung VII)
i) 3-[4-(Carboxymethyl)benzyl]-2-methyl-1,3-benzoxazol-3-ium-bromid
2-Methylbenzoxazol (gelb) wurde unter vermindertem Druck destilliert, um eine farblose Flüssigkeit (33 ml) zu erhalten. 4-(Brommethyl)phenylessigsäure (20 g, 87,3 mmol) und 2-Methylbenzoxazol (destilliert, 33 ml, 278 mmol) wurden in 1,2-Dichlorbenzol (70 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde bei 80°C für 2,5 Tage erhitzt, wobei ein dicker gelber Niederschlag hergestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt; der Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt und mit 1,2-Dichlorbenzol (3 × 100 ml) und Diethylether (4 × 200 ml) gewaschen. Der gesammelte cremige Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet, um 3-[4-(Carboxymethyl)benzyl]-2-methyl-l,3-benzoxazol-3-ium-bromid (20 g, 55,3 mmol, Ausbeute 63%) zu erhalten. UV (Methanol): λmax = 277 nm. MS: m/z = 282 (C₁₇H₁₆NO₃ = 282,32). Eine übliche Phasen-TLC (Ether) zeigte, daß das Ausgangsmaterial 2-Methylbenzoxazol einen R_f= 0,9 ± 0,05 und das Produkt einen R_f= 0 aufwiesen. ¹H-NMR (200 MHz – DMSO-d₆): δ 1,75 (s, 2H); 3,2 (s, 3H); 5,85 (s, 2H); 7,31 (d, 2H, J = 6,8 Hz); 7,53 (d, 2H, J = 6,8 Hz); 7,72 (m, 2H, J = 6,3 Hz); 7,89 (d, 1H, J = 8,3 Hz); 8,17 (d, 1H, J = 7,3 Hz); 9,8 (s, 1H).
ii) 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-sulpho-2,3,3-trimethyl-3H-indoliumbromid
3,5-Dinitrobenzylchlorid (22,1 g, 102 mmol) und Natriumbromid (10,5 g, 102 mmol) wurden zu 2,3,3-Trimethyl-5-sulpho-indol, Kaliumsalz (5,0 g, 20,4 mmol), in Sulpholan (25 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt, und Aceton (300 ml) wurde zu dem Reaktionskolben zugesetzt. Ein brauner Niederschlag wurde gebildet, welcher mittels Filtration gesammelt und dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde. Auf diese Weise wurde ein beiger Feststoff erhalten, der unter vermindertem Druck getrocknet wurde. UV (Wasser/Acetonitril): λmax = 283 nm. MS: m/z = 420 (C₁₈H₁₈N₃O₇S = 420,4).
iii) 2-(2-Anilinoethenyl)-3-[4-(carboxymethyl)benzyl]-l,3-benzoxazol-3-ium, Salz
Ethyl-N-phenylformimidat (0,94 g, 6,27 mmol) wurde zu 3-[4-(Carboxymethyl)benzyl]-2-methyl-l,3-benzoxazol-3-ium-bromid (1,0 g, 2,76 mmol) gelöst in 2-Methoxyethanol (10 ml) zugegeben und bei 100°C für 1,5 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Der erhaltene hellgelbe Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet.
iv) Synthese von Verbindung VII
1-(3,5-Dinitrobenzyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid (130 mg, 0,26 mmol) wurde zu 2-(2-Anilinoethenyl)-3-[4-(carboxymethyl)benzyl]-1,3-benzoxazol-3-ium-bromid (100 mg, 0,26 mmol) gelöst in Pyridin und Essigsäureanhydrid (20 : 0,6, 10 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde im Dunkeln für 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann entfernt, und das Produkt wurde nach Reinigung mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert. UV (Ethanol): λmax = 512 nm. MS: m/z = 714 (C₃₅H₃₁N₄O₁₀S = 711,7).
Beispiel 8 Herstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-2-{3-[1-(5-carboxypentyl)-3-methyl-5-nitro-l,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-yliden]-1-propenyl}-3-methyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium Salz Verbindung VIII)
i) 1-(5-Carboxypentyl)-2,3-dimethyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium-iodid
6-Iodhexansäure (6,33 g, 26,15 mmol) wurde zu 2,3-Dimethyl-5-nitrobenzimidazol (1,0 g, 5,23 mmol) gelöst in Sulpholan (10 ml) zugegeben und für 24 Stunden bei 100°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und zu Ethylacetat (200 ml) zugetropft. Ein gelber Niederschlag wurde gebildet, welcher durch Filtration gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet wurde. Auf diese Weise wurde 1-(5-Carboxypentyl)-2,3-dimethyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium-iodid als gelber Feststoff (1,77 g, 4,09 mmol) erhalten. UV (Ethanol): λmax = 285 nm. MS: m/z = 306 (C₁₅H₂₀N₃O₄ = 306). Eine übliche Phasen-TLC (Ether) ergab für das Ausgangsmaterial einen R_f= 0,6 ± 0,05 und für das Produkt einen R_f = 0. ¹H-NMR (200 MHz - DMSO-d₆): δ 2,3 (m, 8H); 2,95 (s, 3H); 4,0 (s, 3H); 4,6 (t, 2H); 8,24 (d, 1H, J = 9,28 Hz); 8,5 (dd, 1H, J = 9,28 und 1,95 Hz); 9,09 (d, 1H, J = 1,95 Hz).
ii) 2-(2-Anilinoethenyl)-1-(5-carboxypentyl)-3-methyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium, Salz
Ethyl-N-phenylformimidat (384,9 mg, 2,58 mmol) wurde zu 1-(Carboxypentyl)-2,3-dimethyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium-iodid (500 mg, 1,29 mmol) gelöst in 2-Methoxyethanol (5 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 100°C für 1 Stunde erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Der gelbe Feststoff wurde zur weiteren Umsetzung unter vermindertem Druck getrocknet.
iii) Synthese von Verbindung VIII
1-(5-Carboxypentyl)-2,3-dimethyl-5-nitro-3H-benzimidazol-1-ium-iodid (9,4 mg, 0,024 mmol) wurde zu 2-(2-Anilinoethenyl)-1-(5-carboxypentyl)-3-methyl-5-nitro-3Hbenzimidazol-1-ium, Salz (10 mg, 0,024 mmol), gelöst in Pyridin, Essigsäureanhydrid und Triethylamin (20 : 0,6 : 0,7, 2 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde für 24 Stunden im Dunkeln gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft, und das Produkt wurde nach Reinigung mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert. UV: λmax = 535 nm. MS: m/z = 622 (C₃₁H₃₇N₆O₈ = 621,6).
Beispiel 9 Herstellung von 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5,7-disulpho-l,3-dihydro-2Hbenzo(e)indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-3-(3,5-dinitrobenzyl)-1,3-benzothiazol-3-ium, Salz (Verbindung XI)
i) 1-(5 Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-5,7-disulpho-3H-benzo(e)indolium-bromid
6-Bromhexansäure (30 g, 0,153 mol) wurde zu 2,3,3-Trimethyl-3H-benzo(e)indol-5,7-disulfonsäure (50 g, 0,112 mol) in Nitrobenzol (200 ml) zugegeben und für 24 Stun den bei 120°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt. Ein brauner Niederschlag wurde gebildet, welcher mittels Filtration gesammelt und mit 2-Propanol (250 ml) gewaschen wurde. Der Feststoff wurden dann aus 2-Propanol umkristallisiert. Der braungraue Feststoff wurde abfiltriert und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Auf diese Weise wurde in grauer Feststoff erhalten, welcher unter vermindertem Druck getrocknet wurde. UV (Wasser/Acetonitril): λmax = 273 nm und 283 nm. MS: m/z = 484 (C₂₁H₂₆NO₈S₂ = 484,5). ¹H-NMR (200 MHz - DMSO-d₆): δ 1,7 (m, 14H); 2,2 (t, 2H); 2,9 (s, 2H); 8,2 (d, 1H, J = 9,28 Hz); 8,4 (d, 2H, J = 4,39 Hz); 9,15 (d, 1H, J = 9,28 Hz).
ii) Synthese von Verbindung IX
Malonaldehydbisphenyliminmonohydrochlorid (141 mg, 0,55 mmol) wurde zu 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-5,7-disulpho-3H-benzo(e)indolium-bromid (286 mg, 0,55 mmol) und 3-(3,5-Dinitrobenzyl)-2-methyl-1,3-benzthiazol-3-ium-bromid (200 mg, 0,55 mmol) (hergestellt wie in Beispiel 5 i) gelöst in Pyridin (18 ml), Essigsäure (18 ml) und Essigsäureanhydrid (4 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 80°C für 4 Stunden gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und die Mischung wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das Produkt, erhalten als blauer Feststoff, wurde unter vermindertem Druck getrocknet. UV (Ethanol): λmax = 676 nm. MS: m/z = 853 (C₃₉H₃₇N₄O₁₂S₃ = 849,9).
Beispiel 10 Herstellung von 1-Butyl-2-[7-(3-(5-carboxypentl)-1,3-benzothiazol-2-yliden)-1,3,5-heptatrienyl-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolenium Salz (Verbindung X)
i) Synthese von Verbindung X
N-[5-(Phenylamino)-2,4-pentadienyliden]anilinmonohydrochlorid (18 mg, 0,064 mmol) wurde zu 1-Butyl-2,3,3-trimethyl-5-nitro-3H-indoliumbromid (25 mg, 0,064 mmol) und 3-(5-Carboxypentyl)-2-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-bromid (22 mg, 0,064 mmol) in Essigsäure (0,5 ml) und Pyridin (0,5 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 40°C für 4 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der dunkelgrüne Rückstand wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei ein grüner Feststoff erhalten wurde. UV (Methanol): λmax = 768 nm. MS: m/z = 587 (C₃₄H₄₀N₃O₄S = 586,7).
Beispiel 11 Herstellung von 2-{5-[1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-3H-indolium, Salz (Verbindung XI)
i) Synthese von Verbindung XI
Die Reaktion wurde durch ein Verfahren, welches zu dem für Verbindung IX beschriebenen analog war, unter Verwendung von 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid (50 mg, 0,12 mmol) und 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulpho-3H-indoliumbromid (43 mg, 0,12 mmol) in Gegenwart von Malonaldehydbisphenyliminmonohydrochlorid (32 mg, 0,12 mmol) in Essigsäure (0,9 ml), Pyridin (0,9 ml) und Essigsäureanhydrid (0,2 ml) ausgeführt. Das Produkt wurde als blauer Feststoff isoliert. UV (Ethanol): λmax = 651 nm. MS: m/z = 811 (C₃₈H₄₁N₄O₁₂S₂ = 809,9).
Beispiel 12
Relative Fluoreszenzemission nichtfluoreszierender Cyanin-Farbstoffe
Die Verbindungen V, VII, IX und XI wurden als Lösungen in Ethanol hergestellt (5 × 10^-5 M). Zum Vergleich wurden Lösungen der fluoreszierenden Farbstoffe Cy3 und Cy5 in Ethanol in der gleichen Konzentration hergestellt. Die Fluoreszenzintensität jeder Farbstofflösung wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts gemessen. Verdünnungsreihen (1 : 1) mit Ethanol von allen Farbstofflösungen wurden dann hergestellt, und die Fluoreszenzintensität wurde für jede Verdünnung gemessen. Die Fluoreszenzemission der nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe im Verhältnis zu den normalen fluoreszierenden Cyanin-Farbstoffen ist in 1 gezeigt.
Beispiel 13
Nucleinsäure-Hybridisierungsassay
13.1 Sondenherstellung
Oligonucleotid A (5'-C6-Amino-Modifizierer-TAC CCA GAC GAG CAA-Biotin-3') und das komplementäre Oligonucleotid B (5'-TTG CTC GTC TGG GTA-Amino-Modifizierer-3') wurden mit einem Applied Biosystems 391 DNA-Synthesegerät unter Anwendung üblicher Verfahren und Materialien synthetisiert. Die Schutzgruppen der Oligonucleotide wurden während 17 Stunden bei 40°C abgespalten, und die Oligonucleotide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule und eines 40% TEAA/Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die gewünschten Peaks wurden gesammelt, gefriergetrocknet, und die Proben wurden in sterilem H₂O resuspendiert.
Die Oligonucleotide A und B wurden mit einem 10fachen molaren Überschuß an Cy3-NHS-Ester-Farbstoff bzw. 2-{5-(1-(5-Carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolinium-Salz (Verbindung II)-NHS-Ester in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 9) über Nacht bei 22°C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Oligonucleotide unter Verwendung von Ethanol gefällt, und die erhaltenen Pellets wurden in Wasser resuspendiert. Markierte Oligonucleotide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule und eines 60% TEAA/Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die gewünschten Peaks wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Die Rückstände wurden in H₂O resuspendiert, und die Konzentration des gewonnenen Materials wurde bestimmt.
Ein Kontroll-Oligonucleotid C (5'-TTG CTC GTC TGG GTA-DABCYL-3') wurde wie oben synthetisiert. Die DABCYL-Gruppe wurde unter Verwendung einer 3'-DABCYL-cpg-Säule angehängt. Nach der Synthese wurde die Schutzgruppe des Oligonucleotids C während 17 Stunden bei 40°C abgespalten, und das Oligonucleotid wurde mittels HPLC, wie beschrieeben, gereinigt.
13.2 Bindungsassay
Die Vertiefungen einer schwarzen, Streptavidin-beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen wurden mit dem Cy3-markierten Oligonucleotid A (100 pmol/Vertiefung, verdünnt in 100 μl PBS/1 mM MgCl₂) für 120 Minuten bei Umgebungstemperatur beschichtet. Jegliches ungebundenes Material wurde durch gründliches Waschen der Vertiefungen mit Puffer (PBS/1 mM MgCl₂/0,1% BSA) entfernt. Das mit Verbindung II markierte Oligonucleotid B und das DABCYL-markierte Oligonucleotid C wurden auf 0,2 pmol/μl in Puffer verdünnt, und 100 μl wurden mit den beschichteten Vertiefungen bei Umgebungstemperatur für 120 Minuten inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gründlich gewaschen, und die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät unter Verwendung von für Cy3 geeigneten Filtersätzen gemessen. Die Signale aus Vertiefungen, welche mit dem Cy3-markierten Oligonucleotid A allein beschichtet worden waren, wurden mit denjenigen verglichen, welche aus Vertiefungen erhalten wurden, die mit dem Cy3-Oligonucleotid A beschichtet und mit entweder dem Verbindung II-markierten Oligonucleotid B oder dem Kontroll-Oligonucleotid C inkubiert worden waren. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die mit dem Cy3-Oligonucleotid A beschichteten Vertiefungen ergaben ein starkes Fluoreszenzsignal. Dieses Signal wurde nach der Hybridisierung mit dem Verbindung II-markierten Oligonucleotid B um 95% und mit dem Oligonucleotid C um 75% reduziert.
Beispiel 14
Verwendung von nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffen im Vergleich zu einem üblichen übereinstimmenden fluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff (Cy5) in einer Oligonucleotid-Hybridisierungstudie
Ein Oligonucleotid (5'-TAC-CCA-GAC-GAG-CAA-3'), markiert am 3'-Ende mit Biotin und am 5'-Ende mit Cy3, wurde an die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte gebunden. Die beschichteten Vertiefungen wurden dann mit komplementären Oligonucleotidsonden inkubiert, welche einzeln mit nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoffen (Verbindung II und Verbindung XI) markiert worden waren. Nach der Hybridisierung wurden die Vertiefungen gewaschen, und die relative Fluoreszenz wurde nach Anregung des Cy3-Donorfarbstoffes gemessen. Kontrollmessungen wurden mit komplementären nichtmarkierten, Cy5-markierten und 2,4-Dinitrobenzoyl-markierten Oligonucleotiden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Daten zeigen, daß die Verwendung der nichtfluoreszierenden Cyanin-Farbstoffe (Verbindung 1 und Verbindung XI) das Signal-Rausch-Verhältnis um etwa einen Faktor von 2 erhöhen kann, verglichen mit demjenigen, welches mit Cy5 erhalten wird.
Beispiel 15
Protease-Spaltungsassay
15.1 Herstellung des Proteasesubstrats
Das Peptid Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys wurde mit einem Perkin Elmer 433A Peptidsynthesegerät unter Anwendung der üblichen Fmoc-Chemie synthetisiert. Der Cy5-NHS-Ester-Farbstoff (in einem geringen molaren Überschuß) wurde an den N-Terminus des Peptids auf dem Harz während der Inkubation über Nacht in DMSO, enthaltend 2% Vol./Vol. Diisopropylethylamin, gekoppelt. Das markierte Peptidharz wurde aufeinanderfolgend mit DMSO (~10 ml), Methanol (~10 ml) und Dichlormethan (~5 ml) gewaschen und getrocknet. Eine 90-minütige Inkubation in 95% TFA/2,5% Triisopropylsilan/2,5% H₂O erleichterte die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppe und die Abspaltung von dem Harz. Nach dem Filtrieren durch Glaswolle wurde das Peptid als ein blauer Niederschlag in eiskaltem Diethylether isoliert. Das Produkt wurde in DMSO resuspendiert und mittels Umkehrphasen-HPLC (Gradient: Wasser + 0,1% TFA zu 70% MeCN + 0,1% TFA) gereinigt. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys wurde mit dem NHS-Ester von 1-Butyl-2-{5-[1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-6-sulpho-1,3-dihydro-2H-indol-benzo[e]indol-2-yliden]-1,3-pentadienyl}-3,3-dimethyl-5-nitro-3H-indolinium, Salz (Verbindung IIII) in einem geringen molaren Überschuß in DMSO, enthaltend 2% Vol./Vol. Diisopropylethylamin, über Nacht inkubiert. Das doppelt markierte Peptid wurde mittels Umkehrphasen-HPLC wieder isoliert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in H₂O resuspendiert, und die Konzentration wurde bestimmt.
15.2 Assay für ein Proteaseenzym
Das Proteasesubstrat (Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys-Verbindung III) wurde auf 0,02 Absorptionseinheiten/cm (bei 650 nm) in Citratpuffer (100 mM, pH 3,0) verdünnt. Zu der Lösung (1 ml) des markierten Substrats in einer Küvette wurden 25 ng Pepsin (10 μl-Volumen) zugegeben. Die Fluoreszenz-Basislinie vor der Proteasezugabe und die anschließende Erhöhung der Intensität wurden bei geeigneten Wellenlängen aufgezeichnet. Ein Kontrollexperiment (ohne Pepsin) wurde in einer ähnlichen Art und Weise durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Die wirksame Auslöschung der Cy5-Fluoreszenz in dem intakten Substrat ergab ein geringes Signal. Die Protease-katalysierte Hydrolyse des Substrats hebt diese Auslöschung auf, wobei die Cy5-Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität kann fortlaufend überwacht werden und ist proportional zur Proteaseaktivität.

Claims

Verbindung der Formel:
worin die Linkergruppe Q 1, 2 oder 3 Doppelbindungen in Konjugation mit den X und Y enthaltenden Ringen enthält; die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind oder wahlweise an die Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind; Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome bedeuten, welche notwending sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als 2 Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen; X und Y gleich oder verschieden sind und gewählt sind aus Bis-C₁-C₄-Alkyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selenium, -CH=CH- und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R⁸ gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulphydrylgruppen reaktiv sind; mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ die Gruppe -E-F ist, worin E eine Abstandsgruppe mit einer Kette von 1–60 Atomen ist, gewählt aus der Gruppe; bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefelund Phosphoratomen, und F eine Ziel-Bindungsgruppe ist, wobei die Ziel-Bindungsgruppe eine reaktive Gruppe für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst, oder eine funktionelle Gruppe für die Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial; irgendwelche verbleibenden Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig ge wählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulfonat und Sulfat, worin R⁹ aus H und C₁-C₄-Alkyl gewählt ist; irgendwelche verbleibenden R¹ und R² gewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, das unsubstituiert oder substituiert sein kann mit Phenyl, wobei das Phenyl wahlweise substituiert ist mit bis zu zwei Substituenten, gewählt aus Carboxyl-, Sulfonat- und Nitrogruppen; dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ mindestens eine Nitrogruppe umfasst, welche die Fluoreszenzemission der Verbindung reduziert, sodass sie im Wesentlichen nichtfluoreszierend ist; mit der Maßgabe, dass die Linkergruppe Q kein Squarain-Ringsystem ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Q die Gruppe ist:
worin die Gruppen R¹⁰ gewählt sind aus Wasserstoff und C₁-C₄-Alkyl, das unsbustituiert oder substituiert sein kann mit Phenyl, oder zwei oder mehr von R¹⁰ zusammen mit der Gruppe
ein Kohlenwasserstoff-Ringsystem bilden, das mit R⁷ substituiert ist, und das wahlweise ein Heteroatom enthalten kann, gewählt aus -O-, -S- oder > NR⁷, worin R⁷ wie oben definiert ist; und n = 1,2 oder 3.
Verbindung der Formel:
worin die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind oder wahlweise an die Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen ge bunden sind, und n eine ganze Zahl von 1–3 ist; Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome bedeuten, welche notwendig sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als 2 Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen; X und Y gleich oder verschieden sind und gewählt sind aus Bis-C₁-C₄-Akyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selenium, -CH=CH- und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R⁸ gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulphydrylgruppen reaktiv sind; mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ die Gruppe -E-F ist, worin E eine Abstandsgruppe mit einer Kette von 1–60 Atomen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefelund Phosphoratomen, und F eine Ziel-Bindungsgruppe ist, wobei die Ziel-Bindungsgruppe eine reaktive Gruppe für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst, oder eine funktionelle Gruppe für die Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial; irgendwelche verbleibenden Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulfonat und Sulfat, worin R9 aus H und C₁-C₄-Alkyl gewählt ist; irgendwelche verbleibenden R¹ und R² gewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, das unsubstituiert oder substituiert sein kann mit Phenyl, wobei das Phenyl wahlweise substituiert ist mit bis zu zwei Substituenten, gewählt aus Carboxyl-, Sulfonat- und Nitrogruppen; dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ mindestens eine Nitrogruppe umfasst, welche die Fluoreszenzemission der Verbindung reduziert, sodass sie im Wesentlichen nichtfluoreszierend ist.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, wobei die Abstandsgruppe E gewählt ist aus: -(CHR')_p- -{(CHR')_q-O-(CHR')_r-}_s- -{(CHR')_q-NR'-(CHR')_r}_s- -{(CHR')_q-(CH=CH)-(CHR')_r}_s- -{(CHR')_q-Ar-(CHR')_r-}_s- -{(CHR')_q-CO-NR'-(CHR')_r-}_s- -{(CHR')_q-CO-Ar-NR'-(CHR')_r}_s- worin R' Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl ist, das wahlweise mit Sulfonat substituiert sein kann, Ar Phenylen ist, wahlweise substituiert mit Sulfonat, p 1–20 ist, vorzugsweise 1–10, q 1–5 ist, r 0–5 ist und s 1–5 ist.
Verbindung nach den Ansprüchen 1–4, wobei die reaktive Gruppe gewählt ist aus Carboxyl, Succinimidylester, Sulfosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid, Halogenacetamid, Säurehalogenid, Hydrazid, Vinylsulfon, Dichlortriazin und Phosphoramidit.
Verbindung nach den Ansprüchen 1–4, wobei die funktionelle Gruppe gewählt ist aus Hydroxy, Amino, Sulphydryl, Imidazol, Carbonyl, einschließlich Aldehyd und Keton, Phosphat und Thiophosphat.
Verbindung nach den Ansprüchen 1–6, wobei mindestens eine der Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ eine Nitrogruppe und/oder mindestens eine der Gruppen R¹ und R² eine mono- oder di-nitro-substituierte Benzylgruppe ist.
Biologisches Material, markiert mit einem nichtfluoreszierenden Cyaninfarbstoff nach mindestens einem der Ansprüche 1–7.
Biologisches Material, das zwei Komponenten umfasst, wobei eine hiervon mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist, der als ein Resonanzenergie-Donor wirken kann; und die andere mit einem nichtfluoreszierenden Cyaninfarbstoff nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, und welcher als ein Akzeptor für von dem Donor übertragene Resonanzenergie wirken kann.
Biologisches Material nach den Ansprüchen 8 oder 9, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigen, Antikörper, Lipid, Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Nucleotiden, welche enthalten oder derivatisiert sind, um zu enthalten eine oder mehrere aus einer Amino-, Sulphydryl-, Carbonyl-, Hydroxyl- und Carboxyl, Phosphat- und Thiophosphatgruppen, und Oxy- oder Desoxypolynucleinsäuren, welche enthalten oder derivatisiert sind, um zu enthalten eine oder mehrere aus einer Amino-, Sulphydryl-, Carbonyl-, Hydroxyl- und Carboxyl-, Phosphat- und Thiophosphatgruppen, mikrobiellen Materialien, Arzneimitteln und Toxinen.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines biologischen Materials, welches Verfahren die Verwendung einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1–7 umfasst.
Verfahren zum Markieren eines biologischen Materials, umfassend: i) Zugeben zu einer Flüssigkeit, welche ein biologisches Material enthält, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, Antikörper, Lipid, Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Nucleotiden, mikrobiellen Materialien, Arzneimitteln, Toxinen und Kombinationen hiervon, einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1–7; ii) Umsetzen der Verbindung mit dem biologischen Material, wobei die Verbindung kovalent an das biologische Material bindet und dieses markiert.
Assayverfahren, umfassend: i) Trennen zweier Komponenten, welche in einer Energieübertragungsbeziehung stehen, wobei die erste Komponente mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist und die zweite Komponente mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff nach mindestens einem der Ansprüche 1–7 markiert ist, und ii) Nachweisen des Vorhandenseins der ersten Komponente durch Messen der emittierten Fluoreszenz.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Assay gewählt ist aus proteolytischen Enzymspaltungsassays und Nuclease-Enzymspaltungsassays.
Assayverfahren, umfassend: i) Binden einer Komponente eines spezifischen Bindungspaares mit einer zweiten Komponente des Paares, wobei die erste Komponente mit einem fluoreszierenden Donorfarbstoff markiert ist und die zweite Komponente mit einem nichtfluoreszierenden Cyanin-Akzeptorfarbstoff nach mindestens einem der Ansprüche 1–7 markiert ist, um so eine Energieübertragungsbeziehung zwischen der ersten und der zweiten Komponente hervorzubringen; und ii) Nachweisen der Bindung der ersten und der zweiten Komponente durch Messen der emittierten Fluoreszenz.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das spezifische Bindungspaar gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Antikörpern/Antigenen, Lectinen/Glykoproteinen, Biotin/(Strept)avidin, Hormon/Rezeptor, Enzym/Substrat oder Co-Faktor, DNA/DNA, DNA/RNA und DNA/Bindungsprotein.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Bindungsassay gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Immunoassays, Nucleinsäure-Hybridisierungsassays, Proteinbindungsassays, Hormonrezeptorbindungsassays und Enzymassays.
Verwendung einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1–7 als ein Akzeptorfarbstoff in einem Assayverfahren unter Anwendung von Fluoreszenz-Resonanzenergieübertragung.