ES2198133T3 - Procedimiento y reactivo de ensayo de transferencia de energia. - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula: **FORMULA** donde el grupo ligante Q contiene 1, 2 ó 3 dobles enlaces en conjugación con los anillos que contienen X e Y: los grupos R3, R4, R5 y R6 están unidos a los anillos que contienen X e Y, o eventualmente están unidos a átomos de las estructuras de anillo Z1 y Z2; Z1 y Z2 representan cada uno un enlace o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos fusionados, donde cada anillo tiene cinco o seis átomos seleccionados entre átomos de carbono y, eventualmente, no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre; X e Y son iguales o diferentes y son seleccionados entre carbono substituido con bisalquilo C1-C4 y espiroalquilo C4-C5, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es seleccionado entre hidrógeno, un grupo -(CH2)mR8 donde m es un número entero de 1 a 26 y R8 es seleccionado entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino substituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida substituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo; al menos uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 es el grupo -E-F, donde E es un grupo espaciador que tiene una cadena de 1-60 átomos seleccionados entre el grupo consistente en átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo y F es un grupo de unión blanco, donde dicho grupo de unión blanco contiene un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de un material blanco, o un grupo funcional para reaccionar con un grupo reactivo sobre un material blanco; cualquier grupo R3, R4, R5, R6 y R7 restante es seleccionado independientemente entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C4, OR9, COOR9, nitro, amino, acilamino, amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R9 es seleccionado entre H y alquilo C1-C4; cualquier R1 y R2 restante es seleccionado entre alquilo C1-C10, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, estando el fenilo eventualmente substituido por hasta dos substituyentes seleccionados entre grupos carboxilo, sulfonato y nitro; caracterizado por el hecho de que al menos uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia de dicho tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente; siempre que el grupo ligante Q no sea un sistema de anillo de escuaraino.

Description

Procedimiento y reactivo de ensayo de transferencia de energía.

La presente invención se relaciona con el campo de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. En particular, la invención se relaciona con ensayos fluorogénicos que incluyen una nueva clase de tintes apagadores no fluorescentes y con nuevos de tintes apagadores de los mismos.

La transferencia de energía de resonancia de florescencia (``FRET'') se produce entre los estados electrónicos excitados de dos fluoróforos cuando están en suficiente proximidad entre sí, en donde la energía del estado excitado del fluoróforo donante se transfiere al fluoróforo aceptor. El resultado es una reducción en la duración de vida y un apagamiento de la fluorescencia de la especie donante y un aumento concomitante en la intensidad de fluorescencia de la especie aceptora. En una aplicación de este principio, se hace que un resto fluorescente esté en estrecha proximidad a una molécula apagadora. En esta configuración, la energía del fluoróforo donante excitado se transfiere al apagador y se disipa como calor, más que como energía de fluorescencia.

Es bien conocido el uso de marcajes de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en sistemas biológicos. El principio ha sido utilizado en la detección de fenómenos de unión o de reacciones de escisión en ensayos que emplean transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. En el caso de las reacciones de escisión peptídica, se unen una molécula donante fluorescente y una molécula aceptora fluorescente a un substrato peptídico a cualquier lado del enlace peptídico que se ha de escindir y a tal distancia que tenga lugar la transferencia de energía no radiante entre las especies donante y aceptora. Por ejemplo, EPA 428000 describe un nuevo substrato peptídico fluorogénico que tiene una molécula donante fluorescente y una molécula aceptora apagadora unidas a él. El substrato marcado puede ser usado en la detección y el ensayo de una enzima proteasa vírica, mediante lo cual, si hay enzima presente en una muestra de ensayo, el substrato se escinde y las especies donante y aceptora quedan así separadas. La emisión fluorescente resultante de la especie donante puede ser medida. Como donantes fluorescentes adecuados se incluyen derivados de fluoresceína, cumarinas y ácido 5-((2-aminoetil)amino)naftaleno-1-sulfónico (``EDANS''). Como moléculas apagadoras adecuadas se incluyen 2,4-dinitrofenilo (``DNP'') y ácido 4-(4-dimetilaminofenil)azo-benzoico (``DABCYL'').

También se ha usado la transferencia de energía de fluorescencia en el estudio de la hibridación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, Tyagi y Kramer (Nature Biotechnology, 14, 303-8 (1996)) describen ensayos de hibridación homogéneos que utilizan sondas marcadas fluorescentes. Las sondas en horquilla consisten en una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra que es complementaria del ácido nucleico blanco, junto con una secuencia truncal formada gracias a dos brazos complementarios que flanquean a la secuencia de la sonda. Se une un fluoróforo (EDANS) a un brazo y el resto apagador no fluorescente (DABCYL) se une al brazo complementario. En ausencia de un blanco, el tronco mantiene los grupos fluorescentes y apagadores en estrecha proximidad, haciendo que se apague la fluorescencia del fluoróforo. Cuando se deja que la sonda se una a un blanco de ácido nucleico, ésta sufre un cambio conformacional, formando un híbrido más estable con el blanco y forzando a las secuencias de los brazos (y al fluoróforo y al apagador) a separarse. El fluoróforo emitirá entonces fluorescencia cuando se excita por la acción de la luz de una longitud de onda adecuada.

El éxito de la aproximación de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia depende de la elección del par donante/aceptor apropiado. Si la transferencia de energía entre el donante y el aceptor puede ser optimizado, se minimiza la fluorescencia residual cuando el par donante/apagador están en estrecha proximidad y se puede obtener un gran cambio de señal cuando se separan. Existe una tendencia creciente hacia la miniaturización del ensayo y hacia los ensayos de fluorescencia de alto rendimiento y, como resultado de ello, es beneficioso usar fluoróforos con altos coeficientes de extinción para conseguir los niveles de sensibilidad requeridos. Otro problema asociado con dichos ensayos se debe al apagamiento del color debido a la presencia en el medio de ensayo de muestras coloreadas que tienden a absorber fuertemente en la región de 350-450 nm del espectro.

La presente invención proporciona un tinte aceptor de cianina no fluorescente que puede ser usado como un componente de un par donante/aceptor fluorescente para ensayos que conllevan la detección de los fenómenos de unión y/o escisión en reacciones que implican a moléculas biológicas. El tinte donante fluorescente posee un alto coeficiente de extinción, permitiendo así la detección de bajos niveles del fluoróforo. Más aún, el par de tintes fluorescentes tiene longitudes de onda de excitación y de emisión en un rango substancialmente libre de la autofluorescencia asociada a las muestras biológicas y del apagamiento debido a muestras coloreadas. Adicionalmente, los tintes son relativamente insensibles al pH y poseen un alto grado de solapamiento espectral, permitiendo una transferencia de energía eficaz.

En consecuencia, la presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula (1):

1

donde el grupo ligante Q contiene 1, 2 ó 3 dobles enlaces en conjugación con los anillos que contienen X e Y: los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} están unidos a los anillos que contienen X e Y, o eventualmente están unidos a átomos de las estructuras de anillo Z^{1} y Z^{2};

Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos fusionados, donde cada anillo tiene cinco o seis átomos seleccionados entre átomos de carbono y, eventualmente, no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre;

X e Y son iguales o diferentes y son seleccionados entre carbono substituido con bisalquilo C_{1}-C_{4} y espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es seleccionado entre hidrógeno, un grupo -(CH_{2})_{m}R^{8} donde m es un número entero de 1 a 26 y R^{8} es seleccionado entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino substituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida substituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;

al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} es el grupo -E-F, donde E es un grupo espaciador que tiene una cadena de 1-60 átomos seleccionados entre el grupo consistente en átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo y F es un grupo de unión blanco, donde dicho grupo de unión blanco contiene un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de un material blanco, o un grupo funcional para reaccionar con un grupo reactivo sobre un material blanco;

cualquier grupo R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} restante es seleccionado independientemente entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino, amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9} es seleccionado entre H y alquilo C_{1}-C_{4};

cualquier R^{1} y R^{2} restante es seleccionado entre alquilo C_{1}-C_{10}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, estando el fenilo eventualmente substituido por hasta dos substituyentes seleccionados entre grupos carboxilo, sulfonato y nitro;

caracterizado por el hecho de que al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia de dicho tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente;

siempre que el grupo ligante Q no sea un sistema de anillo de escuaraino.

El grupo ligante Q contiene 1, 2 ó 3 dobles enlaces en conjugación con los anillos que contienen X e Y.

Preferiblemente, Q es el grupo

2

donde los grupos R^{10} son seleccionados entre hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{4}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, o dos o más R^{10}, junto con el grupo

3

forman un sistema de anillo hidrocarbonado substituido con R^{7} y que puede eventualmente contener un heteroátomo seleccionado entre -O-, -S- o >NR^{7}, donde R^{7} es como se ha definido antes, y

n = 1, 2 ó 3.

Adecuadamente, el tinte de cianina no fluorescente para uso en la presente invención es un compuesto que tiene la fórmula (2):

4

donde los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se unen a los anillos que contienen X e Y, o eventualmente se unen a los átomos de las estructuras de anillo Z^{1} y Z^{2} y n es un número entero de 1-3;

Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos fusionados, teniendo cada anillo cinco o seis átomos, seleccionados entre átomos de carbono y eventualmente no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre;

X e Y son iguales o diferentes y son seleccionados entre carbono substituido con bisalquilo C_{1}-C_{4} y con espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es seleccionado entre hidrógeno, un grupo -(CH_{2})_{m}R^{8} donde m es un número entero de 1 a 26 y R^{8} es seleccionado entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino substituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida substituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;

al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} es el grupo -E-F, donde E es un grupo espaciador que tiene una cadena de 1-60 átomos seleccionados entre el grupo consistente en átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo y F es un grupo de unión blanco, donde dicho grupo de unión blanco contiene un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de un material blanco, o un grupo funcional para reaccionar con un grupo reactivo sobre un material blanco; cualquier grupo R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} restante es seleccionado independientemente entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino, amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9} es seleccionado entre H y alquilo C_{1}-C_{4};

cualquier R^{1} y R^{2} restante es seleccionado entre alquilo C_{1}-C_{10}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, estando el fenilo eventualmente substituido por hasta dos substituyentes seleccionados entre grupos carboxilo, sulfonato y nitro;

caracterizado por el hecho de que al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia de dicho tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente.

Adecuadamente, al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} de los tintes según la presente invención tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia del tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente. Adecuadamente, al menos uno de los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} de los tintes de cianina no fluorescentes de las estructuras (1) y (2) es un grupo nitro que puede estar unido directamente a los anillos que contienen X e Y. Como alternativa, se puede unir un grupo bencilo mono- o dinitro-substituido a los anillos que contienen X e Y, que eventualmente pueden estar además substituidos con uno o más grupos nitro unidos directamente a los anillos aromáticos. Preferiblemente, al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} de los tintes de cianina no fluorescentes de las estructuras (1) y (2) tiene al menos un grupo nitro.

El grupo blanco de unión R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} puede ser cualquier grupo adecuado para unir el tinte de cianina no fluorescente a un material blanco, tal como un material vehiculizante o un compuesto biológico, y, como tal, será bien conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el grupo blanco de unión puede ser un grupo reactivo para la reacción con un grupo funcional sobre el material blanco. Alternativamente, el grupo blanco de unión puede ser un grupo funcional y el blanco puede contener el constituyente reactivo.

El grupo blanco de unión tiene la estructura -E-F, donde E es un grupo espaciador y F es el grupo reactivo o funcional. Un grupo reactivo del tinte puede reaccionar en condiciones adecuadas con un grupo funcional de una molécula blanco; un grupo funcional del tinte puede reaccionar en condiciones adecuadas con un grupo reactivo de la molécula blanco, mediante lo cual la molécula blanco queda marcada con el tinte.

Preferiblemente, el grupo reactivo F es seleccionado entre carboxilo, éster succinimidilo, éster sulfosuccinimidilo, isotiocianato, maleimida, haloacetamida, haluro de ácido, hidrazida, vinilsulfona, diclorotriazina y fosforamidita. Preferiblemente, el grupo funcional F es seleccionado entre hidroxi, amino, sulfhidrilo, imidazol, carbonilo, incluyendo aldehído y cetona, fosfato y tiofosfato. En virtud de estos grupos reactivos y funcionales, el tinte de cianina no fluorescente puede reaccionar con materiales blanco y unirse covalentemente a ellos.

Los grupos espaciadores adecuados pueden contener 1-60 átomos de la cadena seleccionados entre el grupo consistente en carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Por ejemplo, el espaciador puede ser: -(CHR')_{p}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-O-(CHR') _{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-NR'-(CHR') _{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-(CH=CH)-(CHR') _{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-Ar-(CHR') _{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-CO-NR'-(CHR') _{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR') _{q}-CO-Ar-NR'-(CHR') _{r}\}_{s}- donde R' es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} que puede estar eventualmente substituido con sulfonato; Ar es fenileno, eventualmente substituido con sulfonato; p es 1-20, preferiblemente 1-10; q es 1-5; r es 0-5, y s es 1-5.

En la Tabla 1, se dan ejemplos específicos de grupos reactivos R^{1}-R^{7} y los grupos con los que R^{1}-R^{7} pueden reaccionar. Alternativamente, R^{1}-R^{7} pueden ser los grupos funcionales de la Tabla 1 que reaccionarían con los grupos reactivos de una molécula blanco.

TABLA 1

Posibles substituyentes reactivos y grupos funcionales reactivos con
los mismos
Grupos reactivos	Grupos funcionales
Ésteres de succinimidilo	Amino primario, amino secundario
Anhídridos, haluros de ácido	Amino primario, amino secundario,
	hidroxilo
Isotiocianato	Grupos amino
Vinilsulfona	Grupos amino
Diclorotriazinas	Grupos amino
Haloacetamidas, maleimidas	Tioles, imidazoles, hidroxilo, aminas
Carboxilo	Amino, hidroxilo, tioles
Fosforamiditas	Grupos hidroxilo

Como grupos reactivos R^{1}-R^{7} particularmente adecuados especialmente útiles para marcar componentes blanco con grupos funcionales amino e hidroxilo disponibles se incluyen:

5

donde m es un número entero de 1 a 10.

Arilo es un substituyente aromático que contiene uno o dos anillos aromáticos fusionados que contienen 6 a 10 átomos de carbono, por ejemplo fenilo o naftilo, estando el arilo eventual e independientemente substituido por uno o más substituyentes, por ejemplo halógeno, grupos alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen 1 a 10 átomos de carbono, aralquilo y alcoxi, por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi y n-butoxi.

\newpage

Heteroarilo es un sistema de anillo aromático mono- o bicíclico de 5 a 10 miembros que contiene al menos uno y no más de 3 heteroátomos seleccionados entre N, O y S y está eventual e independientemente substituido por uno o más substituyentes, por ejemplo halógeno, grupos alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen 1 a 10 átomos de carbono, aralquilo y alcoxi, por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi y n-butoxi.

Aralquilo es un grupo alquilo C_{1}-C_{6} substituido por un grupo arilo o heteroarilo.

Los grupos halogenados o halo son seleccionados entre flúor, cloro, bromo y yodo.

Los tintes de cianina no fluorescentes para uso en la presente invención pueden incluir también constituyentes solubilizadores en agua unidos a los mismos para conferir una característica hidrofílica al tinte. Pueden estar unidos directamente al sistema de anillo aromático del tinte de cianina o pueden estar unidos al grupo espaciador E. Los constituyentes solubilizadores adecuados pueden ser seleccionados entre el grupo consistente en sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato, amonio cuaternario e hidroxilo. Los grupos sulfonato o ácido sulfónico unidos directamente al anillo aromático del tinte apagador no fluorescente han de ser particularmente preferidos. La solubilidad en agua puede ser necesaria cuando se marcan proteínas.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un material biológico marcado con un tinte de cianina no fluorescente.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un material biológico que consiste en dos componentes, uno de los cuales está marcado con un tinte fluorescente que puede actuar como donante de energía de resonancia y el otro con un tinte de cianina no fluorescente que puede actuar como un aceptor de energía de resonancia transferida desde el donante.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con un método de ensayo que consiste en:

i)

separar dos componentes que están en relación de transferencia de energía, estando marcado el primer componente con un tinte donante fluorescente y estando marcado el segundo componente con un tinte aceptor de cianina no fluorescente, y

ii)

detectar la presencia del primer componente midiendo la fluorescencia emitida.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con un método de ensayo que consiste en:

i)

unir un componente de un par de unión específica con un segundo componente de dicho par, estando marcado dicho primer componente con un tinte donante fluorescente y estando marcado dicho segundo componente con un tinte aceptor de cianina no fluorescente, para establecer una relación de transferencia de energía entre dichos primer y segundo componentes, y

ii)

detectar la unión del primer y el segundo componentes midiendo la fluorescencia emitida.

Los tintes de cianina no fluorescentes de la presente invención se emplean como tintes aceptores en métodos de ensayo que utilizan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. Cuando un tinte de cianina no fluorescente de la invención está en relación de transferencia de energía con un tinte donante fluorescente, la emisión de fluorescencia del donante se reduce por apagamiento por el aceptor. Cuando se pierde la transferencia de energía de resonancia por separación del tinte donante fluorescente y el tinte aceptor, la emisión de fluorescencia debida al tinte donante se restaura. Los tintes apagadores no fluorescentes efectivos tienen una baja eficacia para convertir la luz incidente absorbida en fluorescencia y, como tales, son inadecuados como marcajes fluorescentes donde se requiere un alto grado de sensibilidad. La eficacia relativa de los tintes de cianina no fluorescentes como tintes apagadores es ilustrada en la Figura 1, que muestra la emisión de fluorescencia relativa de tintes de cianina no fluorescentes representativos de la invención en comparación con tintes correspondientes de la misma clase y con características de absorción similares en la región visible del espectro.

La fluorescencia intrínseca de los tintes de cianina de la presente invención, cuando se emplean como aceptores de energía, es preferiblemente menor del 10% de la emisión de fluorescencia del tinte donante tras excitación a la longitud de onda de excitación del donante y detección de la emisión a la longitud de onda de emisión del donante. La Figura 3 muestra la disminución de la señal de fondo obtenible mediante el uso del Compuesto II y del Compuesto XI como tintes aceptores en comparación con la de un tinte aceptor de cianina fluorescente correspondiente estándar (Cy5) cuando se mide a la máxima de emisión del tinte donante. La contribución a la fluorescencia de fondo queda por lo tanto minimizada mediante el uso de los tintes de cianina no fluorescentes de la invención como tintes apagadores. Más aún, los presentes tintes están diseñados de tal forma que su solapamiento espectral con un tinte donante fluorescente sea máximo, mejorando así la eficacia del apagamiento.

El material biológico puede ser una molécula biológica que puede ser escindida en las dos partes componentes, o el material biológico puede consistir en dos componentes, como se ha definido aquí anteriormente, que pueden unirse por asociación covalente o no covalente.

La presente invención se relaciona, por lo tanto, con un nuevo substrato fluorogénico y con un método de ensayo para la detección y la medición de la escisión de una molécula en dos partes componentes, estando marcado el primer componente con un tinte donante fluorescente en una relación de transferencia de energía con un tinte aceptor de cianina no fluorescente unido al segundo componente.

Los ensayos pueden ser realizados según la presente invención en aplicaciones de estudio selectivo de alto rendimiento, incluyendo aquéllas en las que los compuestos han de ser estudiados en cuanto a sus efectos inhibitorios, efectos de potenciación o efectos agonistas o antagonistas sobre la reacción investigada. Como ejemplos de dichos ensayos se incluyen, aunque sin restricción, la escisión de un péptido o proteína por una proteasa y la escisión de una molécula de ADN o ARN por una nucleasa. En este formato de ensayo, el substrato enzimático (péptido o ácido nucleico) incluirá una secuencia cuya estructura combina una molécula de tinte donante fluorescente con el tinte aceptor de cianina no fluorescente, unido al substrato en cualquier lado del enlace del substrato que ha de ser escindido. El substrato se une a los restos donantes fluorescentes y a los aceptores en estrecha proximidad. La florescencia intrínseca del donante se reduce por apagamiento por parte del aceptor debido a la transferencia de energía de resonancia entre el par de tintes. La transferencia de energía de resonancia se vuelve insignificante cuando la distancia entre los restos donante y aceptor es mayor de aproximadamente 100 Angstroms. La escisión del substrato da lugar a la separación entre los tintes donante y aceptor y a la pérdida concomitante de transferencia de energía de resonancia. La señal de fluorescencia del tinte fluorescente donante aumenta, permitiendo así la medición exacta de la reacción de escisión.

Resumiendo, un ensayo para la detección de una actividad enzimática proteolítica puede estar configurado como sigue. Se prepara una mezcla de reacción combinando una enzima proteasa y un substrato fluorogénico que combina una molécula de tinte donante fluorescente con un tinte aceptor no fluorescente de fórmula (2) unido al substrato en cualquiera de los lados del enlace del substrato que ha de ser escindido. Se puede incluir eventualmente un compuesto inhibidor de proteasas conocido o supuesto en la mezcla de reacción. Típicamente, la reacción es llevada a cabo en solución tamponada y se deja que la reacción proceda hasta completarse. Se puede seguir el progreso de la reacción observando la emisión de fluorescencia en el estado estable debida al tinte donante fluorescente, que se registra usando un espectrofluorímetro.

Alternativamente, la invención se relaciona con un método de ensayo para detectar y medir la unión, por asociación covalente o no covalente, de un componente de un par ligando/reactivo con un segundo componente de dicho par, estando marcado dicho primer componente con un tinte donante fluorescente y estando marcado dicho segundo componente con un tinte aceptor de cianina no fluorescente. Dichos ensayos son convenientemente categorizados como uno de dos tipos.

i) La primera categoría consiste en ensayos de unión en el equilibrio, en donde un componente de un par de unión específica se une no covalentemente a un segundo componente del par de unión específica. Dichos ensayos de unión en el equilibrio pueden ser aplicados a ensayos de estudio selectivo en los que las muestras que contienen los compuestos que han de ser estudiados son estudiadas en cuanto a su efecto tras la unión del primer componente del par de unión específica (ya sea antagonista o agonista) al segundo componente. Cualquiera de los componentes puede ser marcado con el tinte donante o con el tinte aceptor. En ausencia de unión, los componentes marcados están demasiado separados entre sí como para que se produzca la transferencia de energía de resonancia. Al unirse un componente marcado a su compañero de unión especifica marcado, los restos del marcaje son llevados a una proximidad lo suficientemente estrecha como para que se produzca la transferencia de energía entre las especies donante y aceptora, dando lugar a apagamiento de la fluorescencia del donante y a una reducción en la señal fluorescente del donante.

Por ejemplo, los tintes usados en la presente invención pueden ser usados para marcar sondas tales como las descritas por Tyagi y Kramer (loc. cit.) para uso en la detección e identificación de secuencias únicas de ADN o de genes específicos en una molécula de ADN completa o en mezclas de fragmentos de ácidos nucleicos. Un extremo de la sonda de ácido nucleico es marcado con un tinte fluorescente y el otro extremo con un tinte aceptor de cianina no fluorescente. En ausencia de secuencia blanco específica, las especies fluorescente y apagadora se mantendrán lo suficientemente próximas como para que se produzca la transferencia de energía. En consecuencia, la irradiación del fluoróforo por la luz de excitación dará una señal fluorescente reducida. La interacción de la sonda con una secuencia de ácido nucleico blanco específica causa un cambio conformacional en la sonda, de tal forma que el donante fluorescente y el aceptor se distancian. La excitación del fluoróforo dará lugar a una señal fluorescente que puede ser registrada usando un espectrofluorímetro.

Alternativamente, el ensayo de unión en el equilibrio puede emplear un formato de ensayo en emparedado en el que un componente de un par de unión específica, tal como un primer anticuerpo, reviste los pocillos de una placa de microtitulación. Después de la unión de un antígeno al primer anticuerpo, se añade entonces un segundo anticuerpo específico de antígeno a la mezcla de ensayo, de forma que se una con el complejo antígeno-primer anticuerpo. En este formato, o bien el primer anticuerpo, o bien el antígeno, pueden estar marcados con el tinte donante y el segundo anticuerpo marcado con el tinte aceptor o viceversa. En ausencia de unión del complejo primer anticuerpo-antígeno-segundo anticuerpo, los componentes marcados están demasiado separados para que se produzca la transferencia de energía de resonancia. Al unirse el segundo anticuerpo con el complejo primer anticuerpo-antígeno, los restos del marcaje quedan lo suficientemente próximos como para que se produzca la transferencia de energía entre las especies donante y aceptora, dando lugar a apagamiento de la fluorescencia del donante y a reducción de la señal fluorescente del donante. Se mide la señal de fluorescencia y se puede determinar la concentración de antígeno por interpolación con una curva estándar.

Como ejemplos de pares de unión específica se incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos/antígenos, lectinas/glicoproteínas, biotina/(estrept)avidina, hormona/receptor, enzima/substrato o cofactor, ADN/ADN, ADN/ARN y ADN/proteína de unión. Hay que entender que, en la presente invención, se puede emplear cualquier molécula que posea una afinidad de unión específica, de tal forma que se pueden usar los tintes de transferencia de energía de la presente invención para marcar un componente de un par de unión específica, lo que a su vez puede ser usado en la detección de la unión al otro componente.

ii) En la segunda categoría, el ensayo puede consistir en la detección y medición de la adición de un resto marcado con un tinte donante fluorescente (el reactivo) en solución en el medio de ensayo a un resto marcado con un tinte aceptor no fluorescente (el substrato) o viceversa mediante unión covalente mediada por actividad enzimática. Como ejemplos de tales ensayos se incluyen, aunque sin limitación, la unión de moléculas de ADN o ARN a otras moléculas de ácidos nucleicos por ligasas, la adición de un nucleótido a una molécula de ADN o de ARN por una polimerasa y la transferencia de un resto químico marcado de una molécula a otra por una transferasa, tal como la acetil transferasa. Se puede incluir eventualmente un inhibidor enzimático conocido o supuesto. Hay que entender que se pueden emplear cualesquiera dos restos apropiados de reactivo y substrato. Se puede usar el tinte donante o el tinte aceptor de la presente invención para marcar un resto que, a su vez, puede ser usado en la detección y la medición de la reacción con el substrato.

Por ejemplo, en un ensayo de ligación de ADN, se mezclan entre sí las moléculas de ADN que han de ser unidas en tampón acuoso que contiene ATP en presencia de una ADN ligasa. Después de la incubación, las hebras de ADN se unen covalentemente en la configuración correcta mediante formación de uniones fosfodiéster estándar en ambas hebras del dúplex. Al unirse, los restos de marcaje son llevados a una proximidad lo suficientemente estrecha como para que se produzca la transferencia de energía entre las especies donantes y aceptoras, dando lugar a apagamiento de la fluorescencia del donante y a una reducción de señal, que es proporcional a la cantidad de producto ligado formado.

La invención se relaciona también con métodos de marcaje donde tintes de cianina no fluorescentes de estructuras (1) y (2) que incluyen al menos un grupo reactivo o funcional en las posiciones R^{1}-R^{7} reaccionan covalentemente con los grupos amino, hidroxilo, aldehído, fosforilo, carboxilo, sulfhidrilo u otros grupos reactivos o materiales blanco. Dichos materiales blanco incluyen, aunque sin limitación, el grupo consistente en antígeno, anticuerpo, lípido, proteína, péptido, carbohidrato, nucleótidos que contienen o que han sido derivatizados para contener uno o más grupos amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo, fosfato y tiofosfato, y ácidos oxi- o desoxipolinucleicos que contienen o que han sido derivatizados para contener uno o más grupos amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo, fosfato y tiofosfato, materiales microbianos, fármacos y toxinas.

La selección de pares adecuados de donante fluorescente y aceptor generalmente depende de varios factores.

i)

En primer lugar, los cromóforos donante y aceptor deben tener fuertes transiciones electrónicas en el rango del espectro de desde próximo al UV hasta próximo al IR.

ii)

En segundo lugar, los restos donante y aceptor deben estar lo suficientemente próximos entre sí. Adecuadamente, las especies donante y aceptora deben estar en el rango de 10-100 Angstroms.

iii)

En tercer lugar, debería haber un solapamiento adecuado entre el espectro de emisión del donante y el espectro de absorción del aceptor. Cuando mayor sea el solapamiento entre el espectro de emisión del donante y el espectro de excitación del aceptor, mayor será la transferencia de energía. La transferencia de energía puede producirse entre tintes que comparten un mínimo solapamiento espectral, pero esto sólo se observa cuando los tintes están en estrecha proximidad.

Entre los tintes donantes fluorescentes adecuados que pueden combinarse con los tintes aceptores de cianina no fluorescentes para formar pares de transferencia de energía para la práctica de la presente invención se incluyen los bien conocidos análogos reactivos de los tintes de fluoresceína, rodamina y cianina. Se pueden seleccionar otros tintes fluorescentes de bajo peso molecular entre los derivados de los tintes de difluoruro de bispirrometinoboro, tales como el difluoruro de 3,3',5,5'-tetrametil -2,2'-pirrometino-1,1'-boro, vendido bajo la marca registrada BODIPY por Molecular Probes, Inc. Son particularmente preferidos los tintes de cianina.

Como tintes donantes de fluoresceína adecuados se incluyen: 5- y 6-carboxifluoresceína y 6-carboxi-4',5'dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína. Como tintes de rodamina adecuados se incluyen: 6-carboxirrodamina (Rhodamina 110), 5-carboxirrodamina-6G (R6G-5 o REG-5), 6-carboxirrodamina-6G (R6G-6 o REG-6), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAM-RA o TMR), 6-carboxi-X-rodamina (ROX).

Como tintes donantes de cianina adecuados se incluyen los CyDyes™: Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. (CyDye y Cy son marcas registradas de Amersham Pharmacia Biotech UK Limited). Los tintes de cianina adecuados para uso como componente donante en el ensayo de la presente invención están descritos en la Patente EE.UU. Nº 5268486 (Waggoner y col.), o los tintes de cianina rigidizados, tales como los descritos en la Patente GB Nº 2301832 (Waggoner y col.). Alternativamente, la especie donante fluorescente usada como componente donante puede ser una cassette de tinte de transferencia de energía de fluorescencia. Se pueden encontrar ejemplos de dichas cassettes de tintes de transferencia de energía de fluorescencia en la Patente GB Nº 2301833 (Waggoner y col.).

La Tabla 2 que se da a continuación muestra ejemplos de tintes donantes fluorescentes y de los correspondientes tintes aceptores de cianina no fluorescentes que son adecuados para uso en los métodos según la presente invención.

TABLA 2

Donante	Aceptor
Cy3	2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-
Cy3.5	1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-
	1-etil-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolinio
	(Compuesto I)*
Cy5	2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-
	1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-
	1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-5-nitro-3H-
	indolinio (Compuesto II)*
	1-butil-2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-6-
	sulfo-1,3-dihidro-2H-benzo[e]indol-2-iliden]-
	1,3-pentadienil}-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indoli-
	nio (Compuesto III)*
	1-butil-2-{7-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-
	sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-hep-
	tatrienil-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolinio
	(Compuesto IV)*
Cy5.5	1-butil-2-{7-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-
	sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-hep-
	tatrienil-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolinio
	(Compuesto IV)*
* forma salina, sin definir.

Los tintes de cianina no fluorescentes de las fórmulas (1) y (2) pueden ser preparados mediante un procedimiento consistente en:

a)

hacer reaccionar un primer compuesto que tiene la fórmula (A):

6

donde X, Z^{1}, R^{1}, R^{3} y R^{5} han sido definidos anteriormente,

b)

un segundo compuesto que es el mismo o diferente del primer compuesto y que tiene la fórmula (B):

7

donde Y, Z^{2}, R^{2}, R^{4} y R^{6} han sido definidos anteriormente, y

c)

un tercer compuesto adecuado para formar una unión entre el primer y el segundo compuestos, donde a), c) y b) reaccionan en un proceso de dos o de una etapa para formar los compuestos de las fórmulas (1) y (2).

En el caso de una síntesis en dos etapas, se forma primeramente un compuesto colorante intermediario por reacción de un compuesto de indolenina de estructura (A) con un compuesto adecuado para formar la unión, donde la reacción es llevada a cabo en un solvente polar adecuado, tal como etanol o ácido acético. En la segunda etapa, el tinte intermediario reacciona con el segundo compuesto de indolenina de estructura (B) en un medio tal como piridina, ácido acético y anhídrido acético a temperatura ambiente. Dichas condiciones de reacción son también adecuadas para la preparación de tintes de cianina no fluorescentes de la presente invención por un proceso de una etapa. Los reactivos c) que pueden ser usados para formar la unión entre los restos de indolenina son los que resultan adecuados para formar una cadena de polimetino. Los reactivos y métodos adecuados para formar tintes de cianina que contienen uniones de polimetino son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen ortoformiato de etilo, clorhidrato de malonaldehído bis(fenilimina) y clorhidrato de N-[(5-fenilamino) -2,4-pentadienilidenanilina. (Véase, por ejemplo, Fry D.J., Cyanine Dyes and Related Compounds, en Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier 1977, páginas 369-422).

Los tintes de cianina no fluorescentes de la presente invención pueden ser usados para marcar covalentemente un material blanco, tal como un componente del sistema de ensayo como se ha descrito anteriormente. Se puede conseguir el marcaje covalente usando compuestos de la presente invención con un blanco que tiene al menos un grupo funcional o reactivo como se ha definido anteriormente. El blanco puede ser incubado con una cantidad de un compuesto de la presente invención que tiene al menos uno de R^{1}-R^{7} que incluye un grupo reactivo o funcional como se ha definido anteriormente que puede unirse covalentemente al grupo funcional o reactivo del material blanco. El material blanco y el compuesto de la presente invención son incubados en condiciones y durante un período de tiempo suficientes para permitir que el material blanco se una covalentemente al compuesto de la presente invención.

La invención es además ilustrada haciendo referencia a los siguientes ejemplos y figuras.

Figuras

La Figura 1 ilustra la emisión de fluorescencia relativa de Cy3 y los Compuestos V y VII (Fig. 1a) y de Cy5 y los Compuestos IX y XI (Fig. 1b) según el Ejemplo 12.

La Figura 2 ilustra ensayos de hibridación de ácidos nucleicos en los que se observa una reducción de la señal de fluorescencia como resultado de la unión de un oligonucleótido marcado con Cy3 y su oligonucleótido complementario marcado con un análogo Cy5 no fluorescente (Compuesto II) y con Dabcyl, según el Ejemplo 13.

La Figura 3 ilustra el efecto de la utilización de tintes de cianina no fluorescentes como tintes aceptores sobre el aumento de señal a ruido (y la reducción del fondo) en comparación con un tinte de cianina fluorescente correspondiente estándar (Cy5) en un estudio de hibridación de oligonucleótidos según el Ejemplo 14.

La Figura 4 ilustra el curso de ensayos de escisión con proteasas utilizando el substrato Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys-Compuesto III en presencia y en ausencia de pepsina, medido con respecto al tiempo y a la intensidad de fluorescencia, según el Ejemplo 15.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de 2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro -2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-etil-3,3-dimetil-5-nitro -3H-indolinio, sal (Compuesto I)

8

i) 5-Nitro-2,3,3-trimetilindol

Se disolvió nitrato de sodio (3,84 g, 45,2 mmol) en ácido sulfúrico concentrado (100 ml). Después de enfriar sobre hielo, se añadió esta solución a una solución de 2,3,3-trimetilindol (6,65 g, 41,8 mmol) en ácido sulfúrico concentrado (100 ml), de tal forma que la temperatura se mantuviera en el rango de 0-5ºC. Se agitó la reacción a 0-5ºC durante 90 minutos después de completarse la adición y se dejó luego calentar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante otras 16 horas más. Se vertió la mezcla sobre hielo (200 g) y se basificó después por adición de una solución de hidróxido de sodio acuosa al 50% hasta pH 12 (papel de pH). Se recogió el producto bruto por filtración y se lavó con agua hasta que los lavados fueron neutros (\sim1.000 ml). Se secó el sólido de color amarillo sucio con bomba, se disolvió en acetato de etilo (250 ml) y se secó de nuevo (MgSO_{4}). Se filtró la solución y se evaporó el filtrado rojo rotatoriamente a sequedad. Se disolvió el sólido en cloroformo-acetato de etilo (95:5, 30 ml) y se purificó por cromatografía instantánea en sílice. Esto dio un sólido amarillo obscuro, 5,12 g, 25 mmol, 60% de rendimiento. El análisis UV (metanol) mostró un solo pico con una \lambdamáx = 300 nm. La espectrometría de masas (MALDI-TOF con una matriz de ácido gentísico) dio m/z = 203,8 (para C_{11}H_{12}N_{2}O_{2} = 204,23). H RMN: \delta = 1,97 (s, 6H), 2,95 (s, 3H), 8,58 (d, J=10H, 1Hz), 8,70 (s, 1H), 8,78 (d, J=10Hz, 1H).

ii) Yoduro de 1-etil-5-nitro-2,3,3-trimetilindolio

Se mezclaron 5-nitro-2,3,3-trimetilindol (518 mg, 2,54 mmol) y yoduro de etilo (2,5 ml, 4,85 g, 31 mmol, exceso) y se calentó a reflujo durante 8 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se eliminó el exceso de yoduro de etilo mediante una suave corriente de nitrógeno y se disolvió el residuo en cloroformo y se filtró a través de un tapón de sílice. Se lavó la sílice con cloroformo (1 volumen) y se sometieron los filtrados combinados a evaporación rotatoria, para obtener el producto como un aceite amarillo (486, mg, 1,35 mmol, 53% de rendimiento).

iii) Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-5-sulfo-2,3,3-trimetilindolio

Se añadió a 5-sulfo-2,3-3-trimetilindol (sal potásica) (5,0 g, 18 mmol) ácido 6-bromohexanoico (10,56 g, 53,8 mmol) en 1,2-propanodiol (15 ml) y se calentó a 80ºC durante 72 horas. Se enfrió la mezcla y se diluyó con agua (60 ml) y una solución de NaOH (10% en agua, 60 ml) con agitación. Se purificó el producto usando HPLC preparatoria (Dynamax, columna C_{18}, gradiente de TFA/H_{2}O a TFA/MeCN), para obtener un sólido gris/rosa (2,4 g, 28%).

iv) 2-(4-Anilinobuta-1,3-dienil)-1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil -5-sulfoindolio, sal

Se añadió al producto de la etapa iii) (400 mg, 0,85 mol) malondialdehído bis(fenilimina) HCl (322 mg, 1,24 mmol) en ácido acético (5 ml) y se calentó la mezcla a 140ºC durante 16 horas con agitación. Se purificó el producto por HPLC (columna C4, gradiente de TFA/H_{2}O a TFA/MeCN), para obtener un sólido rojo/gris (194,4 mg, 38%).

v) Síntesis del Compuesto (I)

Se disolvieron yoduro de 1-etil-5-nitro-2,3,3-trimetilindolio (100 mg, 0,277 mmol) y el producto de la etapa iv) (50 mg, 0,104 mmol) en piridina:ácido acético:anhídrido acético (9:9:2, 5 ml) y se dejó reposar a la reacción a temperatura ambiente en obscuridad durante 24 horas. Después de eliminar los solventes mediante una suave corriente de nitrógeno, se disolvió el residuo en agua:acetonitrilo (7:3, 5 ml) y se aisló el producto por HPLC de fase invertida. UV (metanol): \lambdamáx abs = 652 nm, \lambdamáx em = 670 nm. MS: m/z = 621,2 (para C_{33}H_{40}N_{3}O_{7}S = 622,8).

Ejemplo 2 Preparación de 2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo -1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil) -3,3-dimetil-3H-indolinio, sal (Compuesto II)

9

i) Yoduro de 1-(3,5-Dinitrobencil)-2,3,3-trimetilindolio

Se calentaron cloruro de 3,5-dinitrobencilo (100 mg, 0,46 mmol), 2,3,3-trimetilindol (74 \mul, 73,2 mg, 0,46 mmol) y yoduro de sodio (69 mg, 0,46 mmol) a 100ºC en sulfolano (5 ml) durante 16 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se aisló el producto por HPLC de fase invertida (89,7 mg, 0,26 mmol, 57% de rendimiento).

ii) 2-{5-[1-(5-Carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-di-hidro-2H -indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H -indolinio, sal (II)

Se disolvieron yoduro de N-(3,5-dinitrobencil)-2,3,3-trimetilindolio (20 mg, 0,059 mmol) y el producto del Ejemplo 1 iv) (20 mg, 0,041 mmol) enpiridina:ácido acético:anhídrido acético (2:2:1, 2,5 ml) y se dejó reposar a la reacción en la obscuridad a temperatura ambiente durante 16 horas. Se aisló el producto por HPLC de fase invertida, para obtener 17,6 mg, 0,024 mmol, 59% de rendimiento, de Compuesto (II). MS: m/z = 730 (para C_{38}H_{41}N_{4}O_{9}S = 729,8).

iii) 2-{5-[1-(5-Carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H -indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H -indolinio, sal, éster N-hidro-succinimidílico

Se disolvió hexafluorofosfato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N' -bis(tetrametilen)uronio (10 mg, 0,04 mmol) en N,N-dimetilformamida (1 ml) y se añadió N,N-diisopropiletilamina (11 \mul, 0,063 mmol). Se tomaron 100 \mul de esta solución y se añadieron al ácido carboxílico (1 mg) de ii) anterior. Al cabo de 3 horas, el análisis del espectro de masas indicó que se había formado el éster NHS. Se usó el producto sin mayor purificación para marcar. MS: m/z = 797 (para C_{43}H_{49}N_{4}O_{9}S = 797,9).

Ejemplo 3 Preparación de 1-butil-2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-6-sulfo -1,3-dihidro-2H-benzo[e] indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-3,3-dimetil -5-nitro-3H-indolinio, sal (Compuesto III)

10

Se añadió yoduro de 1-butil-5-nitro-2,3,3-trimetilindolio (2,45 mg, 9,37 \mumol) a 2-(2-anilinobutenil)-1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil -6-sulfobenz(e)indolio, sal (5 mg, 9,37 \mumol) en piridina:ácido acético:anhídrido acético (9:9:2, 200 \mul). se guardó la mezcla de reacción a temperatura ambiente en obscuridad durante 4 días. Se eliminaron los solventes a presión reducida y se purificó el residuo por HPLC de fase invertida, para obtener el producto deseado (2,0 mg, 2,85 \mumol, 30% de rendimiento).

Ejemplo 4 Preparación de 1-butil-2-{7-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil -5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrie-nil}-3,3-dimetil -5-nitro-3H-indolio, sal (Compuesto IV)

11

i) Yoduro de 1-butil-5-nitro-2,3,3-trimetilindolio

Se mezclaron 5-nitro-2,3,3-trimetilindol (250 mg, 1,22 mmol) y yodobutano (10 ml, 16,17 g, 87,87 mmol) y se calentó a reflujo durante 16 h. Se eliminó el solvente y se guardó el material impuro a -20ºC para uso en ulteriores reacciones.

ii) 1-butil-2-{7-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3 -dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil}-3,3-dimetil-5-nitro -3H-indolio, sal (IV)

Se disolvieron 1-(5-carboxipentil)-5-sulfo-2,3,3-trimetilindolio, sal (5 mg, 0,0141 mmol), yoduro de 1-butil-5-nitro-2,3,3-trimetilindolio (4,02 mg, 0,0141 mmol) y monoclorhidrato de N-(5-fenilamino)-2,4-penta-dienilidenanilina (3,69 mg, 0,0141 mmol) en piridina:ácido acético:anhídrido acético (9:9:2, 1 ml) y se dejó reposar a la reacción a temperatura ambiente en obscuridad durante 1 semana. El análisis UV a 752 nm a lo largo de la semana indicó que la reacción se había completado al finalizar la semana. Se aisló entonces el producto por HPLC de fase invertida, para obtener un sólido azul (rendimiento = 4,3 mg, 45%). UV (metanol): \lambdamáx abs = 752 nm. MS: m/z = 676 (para C_{37}H_{46}N_{3}O_{7}S = 676,9).

Ejemplo 5 Preparación de 2-{3-[1-(3-aminopropil)-3,3-di-metil-5-sulfo -1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1-propenil}-3-(3,5-dinitrobencil) -1,3-benzotiazol-3-io, sal (Compuesto V)

12

i) Yoduro de 3-(3,5-dinitrobencil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io

Se disolvió 2-metilbenzotiazol (3 ml, 20,1 mmol) en acetona (25 ml), a la que se había añadido yoduro de 3,5-dinitrobencilo (7,4 g, 24,1 mmol) y se calentó con agitación a reflujo durante 15 horas. Se dejó que la reacción se enfriara y se añadió por goteo a éter (500 ml) para producir un sólido amarillo fino, que fue filtrado y secado a peso constante a vacío, para obtener yoduro de 3-(3,5-dinitrobencil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (5 g, 10,9 mmol, 45% de rendimiento). MS: m/z = 328 (C_{15}H_{12}N_{3}O_{4}S = 330,3). ^{1}H RMN (200 MHz - DMSO-d_{6}): \delta 2,85 (s, 1H), 3,7 (s, 3H), 6,35 (s, 2H), 7,37 (m, 2H), 8,23 (d, 1H), 8,53 (d, 1H), 8,62 (s, 2H), 8,8 (s, 1H).

ii) Bromuro de 1-(3-aminopropil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo-3H-indolio

a) Se agitaron 2,3,3-trimetilindolenio-5-sulfato (20 g, 84 mmol) y N-(3-bromopropil)ftalimida (50 g, 186 mmol) en sulfolano (75 ml) a 110ºC durante 28 horas. Se añadieron entonces otras cantidades de N-(3-bromopropil)ftalimida (2,5 g, 84 mmol) al cabo de 28 horas y al cabo de 45 horas. Se calentó la mezcla de reacción durante un total de 65 horas, se enfrió después y se añadió a acetato de etilo (800 ml), formando un precipitado que fue filtrado y lavado con acetato de etilo (3x300 ml) y acetonitrilo (5x400 ml), para obtener un sólido rosa, que fue secado a vacío para obtener bromuro de 2,3,3-trimetil-1-(3-ftalimidopropil)-5-sulfoindolio (25 g, 49 mmol, 59% de rendimiento).

b) Se disolvió bromuro de 2,3,3-trimetil-1-(3-ftalimidopropil)-5-sulfoindolinio (14 g, 27,6 mmol) en HCl concentrado (100 ml) con metanol (50 ml). Se agitó la mezcla de reacción a 100ºC durante 32 h. Se enfrió entonces la mezcla de reacción y se eliminó el solvente a presión reducida y se disolvió en acetonitrilo, formando un precipitado. Se neutralizó la solución con amoníaco concentrado (\sim10 ml) y se filtró el precipitado, se disolvió en una mínima cantidad de agua y se purificó pasando la solución a través de un tapón de 2 g de sílice C18. Se liofilizó el sólido rosa para obtener bromuro de 1-(3-aminopropil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo-3H-indolio (8 g, 21,2 mmol, 77% de rendimiento). UV (metanol): \lambdamáx = 254 nm. MS: m/z = 294 (C_{14}H_{21}N_{2}O_{3}S = 297). ^{1}H RMN (200 MHz - DMSO-d_{6}): \delta 1,5 (2s, 6H), 2,1 (m, 2H), 2,98 (s, 3H, 3,3 (m, 2H), 3,6 (t, 2H), 6,6 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,5 (m, 2H), 8,2 (dd, 1H, J = 4 y 6Hz).

iii) Síntesis de Compuesto V

Se añadió N,N'-difenilformamidina (236 mg, 1,2 mmol) a una solución de yoduro de 3-(3,5-dinitrobencil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (500 mg, 1,09 mmol) y bromuro de 1-(3-aminopropil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo-3H-indolio (412,5 mg, 1,09 mmol) disueltos en piridina (4,5 ml), ácido acético (4,5 ml) y anhídrido acético (1,0 ml). Se calentó la mezcla de reacción a 100ºC durante 3,5 horas, se enfrió después hasta la temperatura ambiente y se purificó por HPLC de fase invertida. Se disolvió entonces el sólido rosa aislado en ácido clorhídrico acuoso (2,0 M) y se sometió a reflujo durante 95 horas. Se enfrió entonces la solución hasta la temperatura ambiente, se evaporó y se volvió a purificar después por HPLC de fase invertida. Se secó el sólido rosa recogido a vacío.

UV (etanol): \lambdamáx = 559 nm. MS: m/z = 638 (C_{30}H_{30}N_{5}S_{2}O_{7} = 636,6).

Ejemplo 6 Preparación de 2-[3-(3-(5-carboxipentil)-1,3-benzotiazol -2(3H)iliden)-1-propenil]-3-(3,5-dinitrobencil)-1,3-benzotiazol-3-io, sal (Compuesto VI)

13

i) Bromuro de 3-(5-carboxipentil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io

A 2-metilbenzotiazol (80 ml, 93,84 g, 0,629 mol) se añadió ácido 6-bromohexanoico (250 g, 1,28 mol). Se agitó la mezcla de reacción a 140ºC durante 24 horas. Se formó un precipitado amarillo. Se dejó que la reacción se enfriara, se disolvió en metanol (350 ml) y se añadió por goteo a acetato de etilo (2 l). Se recogió un precipitado beige y se lavó con acetato de etilo (3x50 ml). Se secó entonces el sólido a peso constante a vacío, para obtener bromuro de 3-(5-carboxipentil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (182,35 g, 0,53 mol, rendimiento del 84%). UV (metanol): \lambdamáx = 237, 277 nm. MS: dio m/z = 262 (C_{14}H_{18}NO_{2}S = 264). ^{1}H RMN (200 MHz - DMSO-d_{6}): \delta 1,49 (m, 4H), 1,9 (m, 2H), 2,24 (t, 2H, J=6,35Hz), 3,32 (s, 3H), 4,72 (t, 2H, J = 7,81 Hz), 7,85 (m, 2H), 8,4 (dd, 2H, J = 8,31 Hz).

ii) 2-(2-Anilinoetenil)-3-(3,5-dinitrobencil)-1,3-benzotiazol-3-io, sal

Se añadió N,N'-difenilformamidina (42,9 mg, 0,29 mmol) a yoduro de 3-(3,5-dinitrobencil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (100 mg, 0,29 mmol) (preparado como en el Ejemplo 5 i)) y acetato de sodio (exceso) en etanol (1 ml). Se agitó la reacción a 40ºC durante 4 horas para obtener una solución roja. Se eliminó el solvente a presión reducida y se purificó el residuo por HPLC de fase invertida, para obtener una goma naranja.

iii) Síntesis del Compuesto (IV)

Se añadió bromuro de 3-(5-carboxipentil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (7,9 mg, 0,02 mmol) a 2-(2-anilinoetenil)-3-(3,5-dinitrobencil)-1,3-benzotiazol -3-io (10 mg, 0,02 mmol) y acetato de sodio (exceso) en etanol (1 ml). Se agitó la reacción a 45ºC y se observó una solución rosa. Se eliminó el solvente a vacío y se purificó el residuo por HPLC de fase invertida para obtener un sólido rosa obscuro. UV (agua/acetonitrilo): \lambdamáx = 558 nm. MS: m/z = 604 (C_{30}H_{27}N_{4}O_{6}S_{2} = 603,7).

Ejemplo 7 Preparación de 3-[4-(carboximetil)bencil]-2-{3-[1-(3,5-dinitrobencil) -3,3-dimetil-4-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1-propenil} -1,3-benzoxazol-3-io, sal (Compuesto VII)

14

i) Bromuro de 3-[4-carboximetil)bencil]-2-metil-1,3-benzoxazol-3-io

Se destiló 2-metilbenzoxazol (amarillo) a vacío para obtener un líquido incoloro (33 ml). Se disolvieron ácido 4-(bromometil)fenilacético (20 g, 87,3 mmol) y 2-metilbenzoxazol (destilado, 33 ml, 278 mmol) en 1,2-diclorobenceno (70 ml). Se calentó la mezcla de reacción a 80ºC durante 2,5 días para producir un precipitado amarillo espeso. Se enfrió entonces la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente, se recogió el precipitado por filtración y se lavó con 1,2-diclorobenceno (3x100 ml) y éter dietílico (4x200 ml). Se secó el sólido crema recogido a vacío para obtener bromuro de 3-[4-(carboximetil)bencil]-2-metil-1,3-benzoxazol-3-io (20 g, 55,3 mmol, 63% de rendimiento). UV (metanol): \lambdamáx = 277 nm. MS: m/z = 282 (C_{17}H_{16}NO_{3} = 282,32). La TLC de fase normal (éter) indicó que el 2-metilbenzoxazol de partida tenía un R_{f} = 0,9 \pm 0,05 y el producto un R_{f} = 0. ^{1}H RMN (200 MHz - DMSO-d_{6}): \delta 1,75 (s, 2H), 3,2 (s, 3H), 5,85 (s, 2H), 7,31 (d, 2H, J = 6,8Hz), 7,53 (d, 2H, J = 6,8Hz), 7,72 (m, 2H, J = 6,3Hz), 7,89 (d, 1H, J = 8,3Hz), 8,17 (d, 1H, J = 7,3Hz), 9,8 (s, 1H).

ii) Bromuro de 1-(3,5-dinitrobencil)-5-sulfo-2,3,3-trimetil-3H -indolio

Se añadieron cloruro de 3,5-dinitrobencilo (22,1 g, 102 mmol) y bromuro de sodio (10,5 g, 102 mmol) a 2,3,3-trimetil-5-sulfoindol, sal potásica, (5,0 g, 20,4 mmol) en sulfolano (25 ml). Se agitó la mezcla entonces a temperatura ambiente y se añadió acetona (300 ml) al matraz de reacción. Se formó un precipitado marrón, que se recogió por filtración y se purificó después por HPLC de fase invertida. Ésta dio un sólido beige, que fue secado a vacío. UV (agua/acetonitrilo): \lambdamáx = 283 nm. MS: m/z = 420 (C_{18}H_{18}N_{3}O_{7}S = 420,4).

iii) 2-(2-Anilinoetenil)-3-[4-(carboximetil)bencil]-1,3-benzoxazol-3-io, sal

Se añadió N-fenilformimidato de etilo (0,94 g, 6,27 mmol) a bromuro de 3-[4-(carboximetil)bencil]-2-metil-1,3-benzoxazol-2-io (1,0 g, 2,76 mmol) disuelto en 2-metoxietanol (10 ml) y se calentó a 100ºC durante 1,5 horas. Se enfrió después la solución hasta la temperatura ambiente y se purificó por HPLC de fase invertida. Se secó el sólido de color amarillo subido así obtenido a vacío.

iv) Síntesis del Compuesto VII

Se añadió bromuro de 1-(3,5-dinitrobencil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo-3H -indolio (130 mg, 0,26 mmol) a bromuro de 2-(2-anilinoetenil) -3-[4-(carboximetil)bencil]-1,3-benzoxazol-3-io (100 mg, 0,26 mmol) disuelto en piridina y anhídrido acético (20:0,6, 10 ml). Se mantuvo la reacción en obscuridad durante 24 horas a temperatura ambiente. Se eliminó luego el solvente y se aisló el producto después de purificar por HPLC de fase invertida. UV (etanol): \lambdamáx = 512 nm. MS: m/z = 714 (C_{36}H_{31}N_{4}O_{10}S = 711,7).

Ejemplo 8 Preparación de 1-(5-carboxipentil)-2-{3-[1-(5-carboxipentil) -3-metil-5-nitro-1,3-dihidro-2H-benzimida-zol-2-iliden] -1-propenil}-3-metil -5-nitro-3H-benzimidazol-1-io, sal (Compuesto VIII)

15

i) Yoduro de 1-(5-carboxipentil)-2,3-dimetil-5-nitro-3H -benzimidazol-1-io

Se añadió ácido 6-yodohexanoico (6,33 g, 26,15 mmol) a 2,3-dimetil -5-nitrobenzimidazol (1,0 g, 5,23 mmol) disuelto en sulfolano (10 ml) y se agitó durante 24 horas a 100ºC. Se enfrió entonces la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente y se añadió por goteo a acetato de etilo (200 ml). Se formó un precipitado amarillo, que fue recogido por filtración y secado a vacío. Éste dio yoduro de 1-(5-carboxipentil)-2,3-dimetil-5-nitro -3H-benzimidazol-1-io como un sólido amarillo (1,77 g, 4,09 mmol, 78% de rendimiento). UV (etanol): \lambdamáx = 285 nm. MS: m/z = 306 (C_{15}H_{20}N_{3}O_{4} = 306). La TLC de fase normal (etanol) indicó el material de partida con R_{f} = 0,6 \pm 0,05 y el producto con R_{f} = 0. ^{1}H RMN (200 MHz - DMSO-d_{6}): \delta 2,3 (m, 8H), 2,95 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 4,6 (t, 2H), 8,24 (d, 1H, J = 9,28Hz), 8,5 (dd, 1H, J = 9,28 y 1,95Hz), 9,09 (d, 1H, J = 1,95Hz).

\newpage

ii) 2-(2-Anilinoetenil)-1-(5-carboxipentil)-3-metil-5-nitro-3H -benzimidazol, sal

Se añadió N-fenilformimidato de etilo (384,9 mg, 2,58 mmol) a yoduro de 1-(5-carboxipentil)-2,3-dimetil-5-nitro-3H-benzimidazol-1-io (500 mg, 1,29 mmol) disuelto en 2-metoxietanol (5 ml). Se calentó la reacción a 100ºC durante 1 hora, se enfrió hasta la temperatura ambiente y se purificó por HPLC de fase invertida. Se secó el sólido amarillo a vacío para su posterior reacción.

iii) Síntesis del Compuesto VIII

Se añadió yoduro de 1-(5-carboxipentil)-2,3-dimetil-5-nitro-3H-benzimidazol -1-io (9,4 mg, 0,024 mmol) a sal de 2-(2-anilinoetenil)-1-(5-carboxipentil) -3-metil-5-nitro-3H-benzimidazol-1-io (10 mg, 0,024 mmol) disuelta en piridina, anhídrido acético y trietilamina (20:0,6:0,7, 2 ml). Se mantuvo la reacción en la obscuridad durante 24 horas. Se evaporó entonces el solvente y se aisló el producto tras la purificación por HPLC de fase invertida. UV: \lambdamáx = 535 nm. MS: m/z = 622 (C_{31}H_{37}N_{6}O_{8} = 621,6).

Ejemplo 9 Preparación de 2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5,7-disulfo-1,3 -dihidro-2H-benzo(e)indol-2-ili-den]-1,3-penta-dienil}-3-(3,5-dinitrobencil) -1,3-benzotiazol-3-io, sal (Compuesto IX)

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i) Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil-5,7-di-sulfo -3H-benzo[e]indolio

Se añadió ácido 6-bromohexanoico (30 g, 0,153 mol) a ácido 2,3,3-trimetil -3H-benzo[e]indol-5,7-disulfónico (50 g, 0,112 mol) en nitrobenceno (200 ml) y se agitó durante 24 horas a 120ºC. Se enfrió la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente. Se formó un precipitado marrón, que fue recogido por filtración y lavado con 2-propanol (250 ml). Se recristalizó entonces el sólido con 2-propanol. Se filtró el sólido y se purificó por HPLC de fase invertida. Ésta dio un sólido gris, que fue secado a vacío. UV (agua/acetonitrilo): \lambdamáx = 273 nm, 283 nm. MS: m/z = 484 (C_{21}H_{26}NO_{8}S_{2} = 484,5). ^{1}H RMN (200MHz - DMSO-d_{6}): \delta 1,7 (m, 14H), 2,2 (t, 2H), 2,9 (s, 2H), 8,2 (d, 1H, J = 9,28Hz), 8,4 (d, 2H, J = 4,39Hz), 9,15 (d, 1H, J = 9,28Hz).

ii) Síntesis del Compuesto IX

Se añadió monoclorhidrato de malonaldehidobisfenilimina (141mg, 0,55 mmol) a bromuro de 1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil-5,7-disulfo -3H-benzo[e]indolio (286 mg, 0,55 mmol) y yoduro de 3-(3,5-dinitrobencil) -2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (200 mg, 0,55 mmol) (preparado como en el Ejemplo 5 i)) disueltos en piridina (18 ml), ácido acético (18 ml) y anhídrido acético (4 ml). Se agitó la reacción a 80ºC durante 4 horas y se enfrió hasta la temperatura ambiente. Se evaporó el solvente y se purificó la mezcla por HPLC de fase invertida. El producto, obtenido como un sólido azul, fue secado a vacío. \lambdamáx = 676 nm. MS: m/z = 853 (C_{39}H_{37}N_{4}O_{12}S_{3} = 849,9).

Ejemplo 10 Preparación de 1-butil-2-[7-(3-(5-carboxipentil)-1,3-benzotiazol -2-iliden)-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolenio, sal (Compuesto X)

17

i) Síntesis del Compuesto X

Se añadió monoclorhidrato de N-[5-(fenilamino)-2,4-pentadieniliden]anilina (18 mg, 0,064 mmol) a yoduro de 1-butil-2,3,3-trimetil-5-nitro-3H-indolio (25 mg, 0,064 mmol) y bromuro de 3-(5-carboxipentil)-2-metil-1,3-benzotiazol-3-io (22 mg, 0,064 mmol) en ácido acético (0,5 ml) y piridina (0,5 ml). Se calentó la reacción a 40ºC durante 4 horas. Se enfrió entonces la solución hasta la temperatura ambiente y se evaporó el solvente a presión reducida. Se disolvió el residuo verde obscuro en sulfóxido de dimetilo y se purificó por HPLC de fase invertida, para obtener un sólido verde. UV (metanol): \lambdamáx = 768 nm. MS: m/z = 587 (C_{34}H_{40}N_{3}O_{4}S = 586,7).

Ejemplo 11 Preparación de 2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo -1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil) -3,3-dimetil-5-sulfo-3H-indolio, sal (Compuesto XI)

18

i) Síntesis del Compuesto XI

Se llevó a cabo la reacción por un método análogo al descrito para el Compuesto IX usando bromuro de 1-(3,5-dinitrobencil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo-3H-indolio (50 mg, 0,12 mmol) y bromuro de 1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil-5-sulfo -3H-indolio (43 mg, 0,12 mmol) en presencia de monoclorhidrato de malonaldehidobisfenilimina (32 mg, 0,12 mmol) en ácido acético (0,9 ml), piridina (0,9 ml) y anhídrido acético (0,2 ml). Se aisló el producto como un sólido azul. UV (etanol): \lambdamáx = 651 nm. MS: m/z = 811 (C_{38}H_{41}N_{4}O_{12}S_{2} = 809,9).

Ejemplo 12 Emisión de fluorescencia relativa de los tintes de cianina no fluorescentes

Se prepararon los Compuestos V, VII, IX y XI como soluciones en etanol (5x10^{-5} M). Para comparar, se prepararon soluciones de los tintes fluorescentes Cy3 y Cy5 en etanol a la misma concentración. Se midió la intensidad de fluorescencia de cada una de las soluciones de tintes usando un lector de placas de fluorescencia. Se hicieron entonces diluciones seriadas (1:1) con etanol de todas las soluciones de tintes y se midió la intensidad de fluorescencia para cada dilución. En la Figura 1 se muestra la emisión de fluorescencia de los tintes de cianina no fluorescentes en relación a los tintes de cianina fluorescentes normales.

Ejemplo 13 Ensayo de hibridación de ácidos nucleicos 13.1. Preparación de las sondas

Se sintetizaron el oligonucleótido A (5'-C6-modificador amino-TAC CCA GAC GAG CAA-biotina-3') y el oligonucleótido complementario B (5'-TTG CTC GTC TGG GTA-C7-modificador amino-3') en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems 391 usando métodos y materiales estándar. Se desprotegieron los oligonucleótidos durante 17 horas a 40ºC y se purificaron por HPLC de fase invertida usando una columna C18 y un gradiente de TEAA 40%/acetonitrilo. Se recogieron los picos deseados, se liofilizaron y se resuspendieron las muestras en H_{2}O estéril.

Se incubaron los oligonucleótidos A y B con un exceso 10 veces molar de tinte Cy3 NHS-tinte y sal de 2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil -5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-1-(3,5 -dinitrobencil)-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolinio (Compuesto II)-NHS-éster, respectivamente, en tampón bicarbonato de sodio 0,1 M (pH 9) durante la noche a 22ºC. A la mañana siguiente, se precipitaron los oligonucleótidos usando etanol y se resuspendieron las pellas resultantes en agua. Se purificaron los oligonucleótidos marcados por HPLC de fase invertida usando una columna C18 y un gradiente de TEAA 60%/acetonitrilo y se recogieron y liofilizaron los picos deseados. Se resuspendieron los residuos en H_{2}O y se determinó la concentración del material recuperado.

Se sintetizó como antes un oligonucleótido control C (5'- TTG CTC GTC TGG GTA-Dabcyl-3'). Se añadió el resto de DABCYL usando una columna de 3'-Dabcyl cpg. Después de la síntesis, se desprotegió el oligonucleótido C durante 17 horas a 40ºC y se purificó por HPLC como se ha descrito.

13.2 Ensayo de unión

Se revistieron los pocillos de una placa negra de 96 pocillos revestida con estreptavidina con oligonucleótido A marcado con Cy3 (100 pmol/pocillo diluidos en 100 \mul de PBS/MgCl_{2} 1 mM) durante 120 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó cualquier material no unido por lavado vigoroso de los pocillos con tampón (PBS/MgCl_{2} 1 mM/BSA 0,1%). Se diluyeron el oligonucleótido B marcado con el Compuesto II y el oligonucleótido C marcado con Dabcyl a 0,1 pmol/\mul en tampón y se incubaron 100 \mul con los pocillos revestidos a temperatura ambiente durante 120 minutos. Se lavaron los pocillos vigorosamente con PBS y se midió la intensidad de fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia usando conjuntos de filtros apropiados para Cy3. Se compararon las señales procedentes de los pocillos revestidos con el oligonucleótido A marcado con Cy3 solo con las de los que estaban revestidos con Cy3-oligonucleótido A y se incubó con oligonucleótido B marcado con compuesto II o con oligonucleótido control C. En la Figura 2 se muestran los resultados. Los pocillos revestidos con Cy3-oligonucleótido A dieron una fuerte señal de fluorescencia. Esta señal se redujo en un 95% después de la hibridación con el oligonucleótido B marcado con el Compuesto II y en un 75% con el oligonucleótido C.

Ejemplo 14 Uso de tintes de cianina no fluorescentes en comparación con un tinte aceptor de cianina fluorescente correspondien-te estándar (Cy5) en un estudio de hibridación de oligonucleótidos

Se unió un oligonucleótido (5'-TAC-CCA-GAC-GAG-CAA-3') marcado en el extremo 3' con biotina y en el extremo 5' con Cy3 a los pocillos de una placa de microtitulación revestida con estreptavidina. Se incubaron entonces los pocillos revestidos con sondas oligonucleotídicas complementarias marcadas individualmente con tintes aceptores de cianina no fluorescentes (Compuesto II y Compuesto XI). Después de la hibridación, se lavaron los pocillos y se midió la fluorescencia relativa tras la excitación del tinte donante Cy3. Se hicieron mediciones de control sobre los oligonucleótidos complementarios no marcados, marcados con Cy5 y marcados con 2,4-dinitrobenzoílo. En la Figura 3 se muestran los resultados. Los datos indican que el uso de los tintes de cianina no fluorescentes (Compuesto II y Compuesto XI) puede aumentar la razón de señal a ruido en un factor de aproximadamente 2 por encima de la obtenida con Cy5.

Ejemplo 15 Ensayo de escisión con proteasas 15.1 Preparación del substrato de las proteasas

Se sintetizó el péptido Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys en un sintetizador peptídico Perkin Elmer 433A usando química Fmoc estándar. Se acopló tinte Cy5-NHS-éster (en un ligero exceso molar) al extremo N del péptido sobre la resina en incubación durante la noche en DMSO que contenía un 2% v/v de diisopropiletilamina. Se lavó secuencialmente la resina con péptido marcado con DMSO (\sim10 ml), metanol (\sim10 ml) y diclorometano (\sim5 ml) y se secó. Una incubación de 90 minutos en TFA 95%/triisopro-pilsilano 2,5%/H_{2}O 2,5% facilitó la desprotección de la cadena lateral y la escisión de la resina. Después de filtrar a través de lana de vidrio, se aisló el péptido como un precipitado azul en éter dietílico helado. Se resuspendió el producto en DMSO y se purificó por HPLC de fase invertida (gradiente: agua + TFA 0,1% a MeCN 70% + TFA 0,1%), siendo recogidas y liofilizadas las fracciones deseadas.

Se incubó Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys con sal de 1-butil-2-{5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-6-sulfo-1,3-dihidro-2H- benzo[e]indol-2-iliden]-1,3-pentadienil}-3,3-dimetil-5-nitro-3H-indolinio (Compuesto III), NHS-

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éster, en un ligero exceso molar en DMSO que contenía un 2% v/v de diisopropiletilamina durante la noche. Se aisló de nuevo el péptido doblemente marcado por HPLC de fase invertida y se liofilizó. Se resuspendió el residuo en H_{2}O y se determinó la concentración. 15.2 Ensayo de enzima proteasa

Se diluyó el substrato de la proteasa (Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys- Compuesto III) a 0,02 unidades de absorbancia/cm (a 650 nm) en tampón citrato (100 mM, pH 3,0). Se añadieron a la solución (1 ml) del substrato marcado en una cubeta 25 ng de pepsina (10 \mul de volumen). Se registraron la línea basal de fluorescencia antes de la adición de la proteasa y el posterior aumento de intensidad a las longitudes de onda apropiadas. Se realizó un experimento control (sin pepsina) de un modo similar. En la Figura 4 se muestran los resultados. El apagamiento eficaz de la fluorescencia de Cy5 en el substrato intacto da lugar a una señal baja. La hidrólisis catalizada por proteasa del substrato elimina este apagamiento, restaurando la fluorescencia de Cy5. El aumento en la intensidad de fluorescencia puede ser monitorizado de forma continua y es proporcional a la actividad de la proteasa.

Claims (18)

1. Un compuesto que tiene la fórmula:

19

donde el grupo ligante Q contiene 1, 2 ó 3 dobles enlaces en conjugación con los anillos que contienen X e Y: los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} están unidos a los anillos que contienen X e Y, o eventualmente están unidos a átomos de las estructuras de anillo Z^{1} y Z^{2};

Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos fusionados, donde cada anillo tiene cinco o seis átomos seleccionados entre átomos de carbono y, eventualmente, no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre;

X e Y son iguales o diferentes y son seleccionados entre carbono substituido con bisalquilo C_{1}-C_{4} y espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es seleccionado entre hidrógeno, un grupo -(CH_{2})_{m}R^{8} donde m es un número entero de 1 a 26 y R^{8} es seleccionado entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino substituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida substituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;

al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} es el grupo -E-F, donde E es un grupo espaciador que tiene una cadena de 1-60 átomos seleccionados entre el grupo consistente en átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo y F es un grupo de unión blanco, donde dicho grupo de unión blanco contiene un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de un material blanco, o un grupo funcional para reaccionar con un grupo reactivo sobre un material blanco;

cualquier grupo R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} restante es seleccionado independientemente entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino, amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9} es seleccionado entre H y alquilo C_{1}-C_{4};

cualquier R^{1} y R^{2} restante es seleccionado entre alquilo C_{1}-C_{10}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, estando el fenilo eventualmente substituido por hasta dos substituyentes seleccionados entre grupos carboxilo, sulfonato y nitro;

caracterizado por el hecho de que al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia de dicho tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente;

siempre que el grupo ligante Q no sea un sistema de anillo de escuaraino.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, donde Q es el grupo:

20

donde los grupos R^{10} son seleccionados entre hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{4}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, o dos o más R^{10}, junto con el grupo

21

forman un sistema de anillo hidrocarbonado substituido con R^{7} y que puede eventualmente contener un heteroátomo seleccionado entre -O-, -S- o >NR^{7}, donde R^{7} es como se ha definido antes, y

n = 1, 2 ó 3.

3. Un compuesto que tiene la fórmula:

22

donde los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se unen a los anillos que contienen X e Y, o eventualmente se unen a los átomos de las estructuras de anillo Z^{1} y Z^{2} y n es un número entero de 1-3;

Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos fusionados, teniendo cada anillo cinco o seis átomos, seleccionados entre átomos de carbono y eventualmente no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre;

X e Y son iguales o diferentes y son seleccionados entre carbono substituido con bisalquilo C_{1}-C_{4} y con espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es seleccionado entre hidrógeno, un grupo -(CH_{2})_{m}R^{8} donde m es un número entero de 1 a 26 y R^{8} es seleccionado entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino substituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida substituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;

al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} es el grupo -E-F, donde E es un grupo espaciador que tiene una cadena de 1-60 átomos seleccionados entre el grupo consistente en átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo y F es un grupo de unión blanco, donde dicho grupo de unión blanco contiene un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de un material blanco, o un grupo funcional para reaccionar con un grupo reactivo sobre un material blanco; cualquier grupo R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} restante es seleccionado independientemente entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino, amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9} es seleccionado entre H y alquilo C_{1}-C_{4};

cualquier R^{1} y R^{2} restante es seleccionado entre alquilo C_{1}-C_{10}, que puede estar sin substituir o substituido con fenilo, estando el fenilo eventualmente substituido por hasta dos substituyentes seleccionados entre grupos carboxilo, sulfonato y nitro;

caracterizado por el hecho de que al menos uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tiene un substituyente que reduce la emisión de fluorescencia de dicho tinte de tal forma que sea esencialmente no fluorescente.

4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el grupo espaciador E es seleccionado entre: -(CHR')_{p}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-O-(CHR')_{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-NR'-(CHR')_{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-(CH=CH)-(CHR')_{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-Ar-(CHR')_{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-CO-NR'-(CHR')_{r}\}_{s}-\belowdisplayskip=.5\baselineskip -\{(CHR')_{q}-CO-Ar-NR'-(CHR')_{r}\}_{s}- donde R' es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} que puede estar eventualmente substituido con sulfonato; Ar es fenileno, eventualmente substituido con sulfonato; p es 1-20, preferiblemente 1-10; q es 1-5; r es 0-5, y s es 1-5.

5. El compuesto según las reivindicaciones 1-4, donde dicho grupo reactivo es seleccionado entre carboxilo, éster succinimidilo, éster sulfosuccinimidilo, isotiocianato, maleimida, haloacetamida, haluro de ácido, hidrazida, vinilsulfona, diclorotriazina y fosforamidita.

6. El compuesto según las reivindicaciones 1-4, donde dicho grupo funcional es seleccionado entre hidroxi, amino, sulfhidrilo, imidazol, carbonilo, incluyendo aldehído y cetona, fosfato y tiofosfato.

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7. El compuesto según las reivindicaciones 1-6, donde al menos uno de los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} es un grupo nitro y/o al menos uno de los grupos R^{1} y R^{2} es un grupo bencilo mono- o dinitro-substituido.

8. Un material biológico marcado con un tinte de cianina no fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un material biológico que consiste en dos componentes, uno de los cuales está marcado con un tinte fluorescente que puede actuar como donante de resonancia y el otro lo está con un tinte de cianina no fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y que puede actuar como un aceptor de energía de resonancia transferida desde el donante.

10. Un material biológico según las reivindicaciones 8 ó 9, seleccionado entre el grupo consistente en antígeno, anticuerpo, lípido, proteína, péptido, carbohidrato, nucleótidos que contienen o que han sido derivatizados para contener uno o más grupos amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo, fosfato y tiofosfato, y ácidos oxi- o desoxipolinucleicos que contienen o que han sido derivatizados para contener uno o más grupos amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo, fosfato y tiofosfato, materiales microbianos, fármacos y toxinas.

11. Un método para detectar la presencia de un material biológico, cuyo método consiste en utilizar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. Un método para marcar un material biológico consistente en:

i)

añadir a un líquido que contiene un material biológico seleccionado entre el grupo consistente en antígenos, anticuerpos, lípidos, proteínas, péptidos, carbohidratos, nucleótidos, materiales microbianos, fármacos, toxinas y sus combinaciones, un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y

ii)

hacer reaccionar a dicho compuesto con dicho material biológico, donde dicho compuesto se une covalentemente a dicho material biológico y lo marca.

13. Un método de ensayo que consiste en:

i)

separar dos componentes que están en relación de transferencia de energía, estando marcado el primer componente con un tinte donante fluorescente y estando marcado el segundo componente con un tinte aceptor de cianina no fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y

ii)

detectar la presencia del primer componente midiendo la fluorescencia emitida.

14. Un método según la reivindicación 13, donde el ensayo es seleccionado entre ensayos de escisión con enzimas proteolíticas y ensayos de escisión con enzimas nucleasas.

15. Un método de ensayo que consiste en:

i)

unir un componente de un par de unión específica con un segundo componente de dicho par, estando marcado dicho primer componente con un tinte donante fluorescente y estando marcado dicho segundo componente con un tinte aceptor de cianina no fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para establecer una relación de transferencia de energía entre dichos primer y segundo componentes, y

ii)

detectar la unión del primer y el segundo componentes midiendo la fluorescencia emitida.

16. Un método según la reivindicación 15, donde dicho par de unión específica es seleccionado entre el grupo consistente en anticuerpos/antígenos, lectinas/glicoproteínas, biotina/(estrept)avidina, hormona/receptor, enzima/substrato o cofactor, ADN/ADN, ADN/ARN y ADN/proteína de unión.

17. Un método según la reivindicación 15, donde dicho ensayo de unión es seleccionado entre el grupo consistente en inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de unión a proteínas, ensayos de unión a receptores hormonales y ensayos enzimáticos.

18. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como tinte aceptor en un método de ensayo que utiliza transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.