ES2250349T3 - Ensayo del gen informador nitrorreductasa utilizando un aumento de flourescencia. - Google Patents
Ensayo del gen informador nitrorreductasa utilizando un aumento de flourescencia.Info
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Abstract
Un método para incrementar la fluorescencia de una molécula de colorante que contiene al menos un grupo NO2 mediante la reducción de dicho al menos un grupo NO2 a NHOH o NH2, caracterizado porque dicho método se lleva a cabo en un ensayo de un gen de nitrorreductasa informador.
Description
Ensayo del gen informador nitrorreductasa
utilizando un aumento de flourescencia.
La presente invención se refiere a métodos para
generar moléculas con una elevada producción de fluorescencias a
partir de moléculas con una fluorescencia menor o despreciable y
que pueden ser catalizados por acción enzimática. En particular, la
invención se refiere a métodos para conseguir la detección de
fluorescencia de analitos mediante la utilización de un medio
enzimático para generar moléculas informadoras fluorescentes.
La utilización de fluorescencia como un modo de
detección en ensayos biológicos está muy extendida y están
disponibles una variedad de procedimientos para generar
fluorescencia en condiciones de ensayo para la detección mediante un
amplio rango de técnicas. Estas técnicas incluyen microscopía de
fluorescencia, inmunoensayos de fluorescencia y citometría de
flujo.
Entre los métodos utilizados para generar una
señal fluorescente están aquéllos que utilizan medios químicos o
enzimáticos para convertir un sustrato no fluorescente en un
producto fluorescente. Así, Katoh (Nippon Acta Radiologica, 1990,
volumen 50(6), pp. 661-668), que se refiere
a células cancerosas, emplea la reducción química de un colorante
nitroacridina para producir una sonda fluorescente en células
hipóxicas como indicador de radiosensibilidad. De manera similar,
Olive (Int. J. Radiation Oncology Biol. Phy., 1985, Vol.
II(II), pp. 1947-1954) describe la
utilización de nitroheterocíclicos que son metabolizados de forma
reductora en células tumorales para producir sondas
fluorescentes.
El enzima puede estar acoplado a un componente
del ensayo, por ejemplo a un anticuerpo en un inmunoensayo o a una
molécula de ácido nucleico en un ensayo de hibridación de ácidos
nucleicos, y es utilizado típicamente para generar una señal
fluorescente a partir de un sustrato no fluorescente. En tales
métodos, la intensidad de la fluorescencia del producto proporciona
la señal del ensayo y está correlacionada con la cantidad de
analito en el ensayo (por ejemplo, un antígeno en un inmunoensayo o
una secuencia de ácido nucleico complementaria en un ensayo de
hibridación de ácidos nucleicos). Ejemplos de tales ensayos con un
método de fluorescencia basado en enzimas están descritos en
"Applications of Fluorescence in Immunoassays", Capítulo 9,
páginas 223-232, I.A. Hemmila, John Wiley &
Sons, New York, 1991 (inmunoensayos) y en "Nonisotopic DNA Probe
Techniques", Capítulo 1, páginas 3-23, L.J.
Kricka, Academic Press Inc., New York, 1992 (ensayos de hibridación
de ácidos nucleicos) y los enzimas utilizados en tales ensayos
incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa
alcalina.
Alternativamente, el enzima puede ser producido
mediante síntesis proteica en el curso del ensayo. Por ejemplo, en
un ensayo de expresión génica in vivo, el enzima es
sintetizado a partir de un gen, denominado normalmente gen
informador, que está insertado en una célula o en un organismo en
el que no existe de forma natural o en el que se encuentra
solamente a niveles bajos, de tal manera que la expresión del gen
informador está ligada a la expresión de un gen celular de interés.
El procesamiento posterior del sustrato no fluorescente del enzima
para dar un producto fluorescente se correlaciona con la expresión
del gen informador y proporciona, por tanto, una medida indirecta
de la expresión del gen celular de interés.
Los enzimas que son sintetizados a partir de
genes informadores y utilizados actualmente en ensayos fluorescentes
para la medida de la expresión génica in vivo incluyen
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y
\beta-lactamasa.
La \beta-galactosidasa es un
enzima bacteriano y ha sido bien caracterizado para su utilización
en tales ensayos de enzima-informador en combinación
con sustratos que pueden ser convertidos en fluorescentes por la
actividad enzimática. La detección de la expresión de
\beta-galactosidasa está descrita en
"Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes", páginas
211-215, J. Svalik, Plenum Press, London, 1996.
Aquí, un sustrato no fluorescente, CMFDG, es microinyectado en
células que expresan el enzima en las cuales es hidrolizado para
dar una forma fluorescente que proporciona una medida de la
actividad del enzima. Sin embargo, como las células de mamífero
presentan cierta actividad \beta-galactosidasa
endógena, se observa cierta fluorescencia de fondo del sustrato
convertido en ensayos in vivo para la determinación de la
expresión génica, incluso en ausencia de señales que dan lugar a la
expresión de \beta-galactosidasa a partir del gen
informador.
Las células de mamífero pueden tener también
cierta actividad del enzima fosfatasa alcalina endógena, dando lugar
de nuevo a un fondo de activación de un sustrato no fluorescente a
su forma fluorescente en ensayos in vivo basados en la
expresión de fosfatasa alcalina. En este caso, el sustrato
fluorescente es típicamente difosfato de fluoresceína. Además, la
actividad fosfatasa alcalina óptima requiere un pH de 9,8, lo cual
limita la utilización de este enzima en ensayos in situ.
Más recientemente, ha sido documentado un
sustrato fluorescente de la \beta-lactamasa (ver
la Patente de EE.UU. Nº 5.955.604, Tsien y col.). El sustrato
descrito en la misma, CCF2, es adecuado para ser utilizado en un
ensayo basado en FRET (según se describe posteriormente), en el que
las moléculas donadoras y aceptoras del sustrato fluorescente son
separadas por la actividad enzimática de la
\beta-lactamasa para generar una señal
fluorescente a partir de la molécula donadora.
Sin embargo, los fluorocromos utilizados en estas
técnicas son, típicamente, fluoresceína y sus derivados (Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6ª
Edición, 1996, o ver www.probes.com). Los fluorocromos
basados en fluoresceína tienen típicamente longitudes de onda de
excitación en la región del UV al azul del espectro y longitudes de
onda de emisión en la región del azul al verde del espectro (esto
es, excitación a 488 nm aproximadamente y emisión a 510 nm
aproximadamente). Estas características confieren ciertas
restricciones a la utilización de estos fluorocromos con materiales
biológicos, ya que estas longitudes de onda coinciden con los
rangos de excitación y emisión de varias moléculas biológicas. Esto
puede dar una alta fluorescencia de fondo en ensayos biológicos con
una sensibilidad de detección resultante reducida.
Además, como todas estas técnicas conocidas
producen señales en la misma región del espectro, existe un ámbito
limitado para el empleo y la lectura simultánea de sistemas de
señalización múltiples.
Los colorantes basados en fluoresceína tienen
otras desventajas varias, incluyendo su tendencia a la
fotodecoloración cuando son iluminados por fuentes de excitación
potentes. Además, algunos productos procedentes de sustratos
enzimáticos basados en estos fluorocromos son sensibles al pH, lo
que puede dar lugar a una variación de la fluorescencia en
diferentes entornos. Pueden producirse problemas al utilizar estos
fluorocromos en ensayos intracelulares, ya que la excitación en la
región UV, que requiere una excitación de alta energía a una
longitud de onda corta, puede dar lugar a un daño celular que a su
vez de lugar a resultados engañosos.
Con el fin de superar estos defectos de los
sustratos de fluorescencia enzimáticos existentes, existe la
necesidad de una molécula (o moléculas) que sea el sustrato de un
enzima no ubicuo y que tenga una fluorescencia cero o baja en una
primera forma y que, después de la reacción con el enzima, produzca
un producto fluorescente estable en el entorno que pueda emitir luz
sobre un amplio rango del espectro. El rango de emisión estaría,
por ejemplo, en el rango de la región de 500-900 nm
del espectro.
Los colorantes de Cianina (referidos algunas
veces como "Cy dye™"), descritos por ejemplo en la Patente de
EE.UU. 5.268.486, son una serie de fluoróforos biológicamente
compatibles que se caracterizan por una elevada emisión de
fluorescencia, estabilidad en el entorno y un rango de longitudes de
onda de emisión que se extiende hacia el infrarrojo cercano, que
pueden ser seleccionadas variando el esqueleto molecular interno
del fluoróforo.
Recientemente, se han desarrollado colorantes de
cianina para utilización en ensayos de Transferencia de Energía de
Resonancia Fluorescente (FRET). El principio del FRET fue descrito
en US 4.996.143 y, más recientemente, en PCT/GB99/01746
(publicación número WO99/64519). Brevemente, los ensayos FRET
dependen de una interacción entre dos fluoróforos, un fluoróforo
donador y un fluoróforo aceptor. Cuando las moléculas donadoras y
aceptoras están en una proximidad suficientemente cercana, la
fluorescencia de la molécula donadora es transferida a la molécula
aceptora, con una disminución de la longevidad y una amortiguación
resultantes de la fluorescencia de la especie donadora y un
incremento concomitante de la intensidad de la fluorescencia de la
especie aceptora. La utilización de marcas FRET en sistemas
biológicos es bien conocida. El principio ha sido utilizado en la
detección de acontecimientos de unión o de reacciones de corte en
ensayos que emplean FRET. En el caso de reacciones de corte de
péptidos, una molécula donadora fluorescente y una molécula aceptora
fluorescente son unidas a un sustrato peptídico a cada lado del
enlace peptídico que va a ser cortado y a una distancia tal que
tenga lugar una transferencia de energía. Una reacción de corte de
un péptido separará las moléculas donadora y aceptora y de este modo
se restaurará la fluorescencia de la molécula donadora.
En un formato de este principio, se hace que un
resto fluorescente esté muy próximo a una molécula
"amortiguadora", de tal manera que la energía procedente del
fluoróforo donador excitado sea transferida al amortiguador y
disipada como calor en lugar de como energía de fluorescencia. En
este caso, la fluorescencia residual es minimizada cuando los dos
componentes del par donador-amortiguador están en
una estrecha proximidad y puede obtenerse un cambio grande de la
señal cuando están separados.
Se han desarrollado colorantes de cianina
adecuados para ser utilizados como moléculas aceptoras o
"amortiguadoras" en un ensayo FRET (ver, PCT/GB99/01746)
realizando ciertas modificaciones en los colorantes de cianina
mediante la introducción de grupos químicos que tengan el efecto de
disminuir o eliminar la fluorescencia de la molécula. Un ejemplo de
tal modificación química es la introducción de grupos -NO_{2}.
Tales colorantes Cy amortiguados son referidos como colorantes
Cy-Q o "colorantes oscuros".
Se ha demostrado que los enzimas bacterianos
denominados nitrorreductasas catalizan la reacción general mostrada
a continuación en el Esquema de Reacción 1:
Esquema de Reacción
1
en el cual, en presencia de NADH o
NADPH, uno o más grupos -NO_{2} en una molécula orgánica son
reducidos a un grupo hidroxilamina que puede ser convertido
posteriormente en un grupo
amina.
Las nitrorreductasas bacterianas han sido
utilizadas en terapia antitumoral para convertir moléculas de
profármaco en sus formas citotóxicas correspondientes (Anlezark y
col., 1995, Biochem-Pharmacol 50(5),
609-18) mediante la eliminación o la reducción de
uno o más grupos NO_{2} en el profármaco sustrato. Tales sustratos
incluyen derivados p-nitrobenciloxicarbonilo de
compuestos citotóxicos. Puede conseguirse una destrucción selectiva
de las células tumorales mediante la vectorización de la expresión
del gen de la nitrorreductasa hacia las células tumorales y la
administración del profármaco al tejido afectado (según se describe
en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.780.585). El profármaco
sustrato es convertido en su forma citotóxica en las células
tumorales que expresan nitrorreductasa, mientras que las células
circundantes (que no contienen la nitrorreductasa) permanecen sin
ser afecta-
das.
das.
Las nitrorreductasas han sido utilizadas también
en procesos de biocorrección para eliminar compuestos
nitroaromáticos que pueden crear peligros ambientales o para la
salud. La Patente de EE.UU. Nº 5.777.190 describe un método
catalítico que implica a nitrorreductasas sensibles a oxígeno para
reducir compuestos nitroaromáticos que pueden ser controlados, para
impedir que la reacción progrese hasta su finalización, mediante la
adición de oxígeno. Los sustratos sugeridos incluyen nitrobenceno,
trinitrotolueno y ortocloronitrobenceno, incluyendo los enzimas
nitrorreductasa sensibles a oxígeno preferidos ferredoxina NADP,
xantina oxidasa y glutation reductasa.
Hasta la fecha, parece que no hay informes de que
una molécula de colorante de cianina modificada conteniendo NO_{2}
pueda actuar como sustrato de una nitrorreductasa para generar una
molécula fluorescente.
La presente invención proporciona un método para
incrementar la fluorescencia de un colorante de cianina modificado
que contenga al menos un grupo NO_{2} (nitro), por ejemplo un
colorante Cy-Q en un ensayo con genes
informadores.
Esto puede conseguirse mediante la conversión
enzimática de un grupo NO_{2} de tal colorante
Cy-Q en NHOH o en NH_{2} por la acción de una
nitrorreductasa (NTR). Dependiendo de la estructura del colorante
Cy-Q, la emisión de fluorescencia del producto de
la reacción Cy-Q/NTR puede tener lugar a través de
un amplio rango de longitudes de onda, típicamente
500-900 nm, en contraste con los informadores
existentes que emiten solamente en la región
azul-verde del espectro. Esta emisión a mayores
longitudes de onda es ventajosa para evitar la fluorescencia de
fondo e incrementar la sensibilidad en sistemas biológicos.
Además, las características de la emisión de
fluorescencia del producto de la reacción Cy-Q/NTR
pueden ser alteradas para adecuar la aplicación mediante la
realización de cambios en la estructura interna de la molécula de
Cy-Q, sin cambiar los extremos de la molécula, por
ejemplo los grupos NO_{2}, que están implicados en la reacción
con la nitrorreductasa. De este modo, pueden proporcionarse
informadores fluorescentes compatibles con la utilización de otros
fluorocromos en sistemas múltiples.
Por consiguiente, la invención proporciona, en un
primer aspecto, un método para incrementar la fluorescencia de una
molécula de colorante que contenga al menos un grupo NO_{2}
mediante la reducción de dicho al menos un grupo NO_{2} para dar
NHOH o NH_{2}, que se caracteriza porque dicho método es llevado a
cabo en un ensayo de genes informadores de nitrorreductasa.
Los colorantes que contienen NO_{2} adecuados
incluyen colorantes fluorescentes tales como derivados de cianina,
Cy-Q (descritos en PCT/GB99/017460), quelatos de
NO_{2}-lantánido (descritos en, por ejemplo,
Latra, M.J., Lumin. 1997, 75, 149-169 y Blasse, G.,
J. Phys. Chem. 1998, 92, 2419-2422) y fluoresceínas
que contienen NO_{2}, pirenos, rodaminas, cumarinas o colorantes
BODIPY™.
En una realización del primer aspecto, la
molécula de colorante que contiene al menos un grupo NO_{2} para
ser utilizada en la presente invención, es un compuesto colorante
de cianina modificado que tiene la Fórmula I:
en la que los grupos R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6} están unidos a los anillos que contienen
X e Y u, opcionalmente, están unidos a átomos de las estructuras de
anillo Z^{1} y Z^{2} y n es un número entero de 1 a
3;
Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace
o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos
fusionados, teniendo cada anillo cinco o seis átomos, seleccionados
de átomos de carbono y, opcionalmente, no más de dos átomos de
oxígeno, nitrógeno y azufre;
X e Y son iguales o diferentes y son
seleccionados de entre carbono sustituido con
bis-alquilo C_{1}-C_{4} y
espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre,
selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es
seleccionado de entre hidrógeno, un grupo
-(CH_{2})_{m}R^{8}, donde m es un número entero de 1 a
26 y R^{8} es seleccionado de entre hidrógeno, amino, aldehído,
acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo,
sulfonato, sulfato, carboxilato, fosfonato, polietilén glicol,
amino sustituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida
sustituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo,
carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;
los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{7} son seleccionados independientemente del grupo que consta
de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4} sustituido o
no sustituido, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino,
amonio cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9}
está sustituido o no sustituido y es seleccionado de entre H,
alquilo C_{1}-C_{4}, amino, aldehído, acetal,
cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato,
sulfato, carboxilato, amino sustituido, amonio cuaternario, nitro,
amida primaria, amida sustituida y grupos reactivos con grupos
amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y
sulfhidrilo;
los grupos R^{1} y R^{2} son seleccionados de
alquilo C_{1}-C_{10} que puede estar sustituido
o no sustituido;
que se caracteriza porque al menos uno de los
grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{7} comprende al menos un grupo nitro que reduce la emisión de
fluorescencia de dicho colorante de tal manera que sea
esencialmente no fluorescente.
Idóneamente, el al menos un grupo nitro
comprendido en los colorantes de Fórmula I puede estar unido
directamente a los anillos que contienen X e Y. Alternativamente,
un grupo bencilo mono o dinitro sustituido puede estar unido a los
anillos que contienen X e Y, que opcionalmente pueden estar además
sustituidos con uno o más grupos nitro unidos directamente a los
anillos aromáticos.
En una realización, R^{1} y R^{2} pueden ser
seleccionados de alquilo C_{1}-C_{10} que puede
estar sustituido con grupos que incluyen NH_{2}, OH, COOH,
SO_{3}H, PO_{4}H, SH, polietilén glicol y fenilo. Cuando el
fenilo está sustituido, puede estar sustituido opcionalmente con
hasta dos sustituyentes seleccionados de entre los grupos
carboxilo, sulfonato y nitro.
Ejemplos de las moléculas de colorante de cianina
no fluorescentes adecuadas para ser utilizadas en la presente
invención tienen la Fórmula II y la Fórmula III:
\vskip1.000000\baselineskip
Son especialmente preferidas las formas de
"colorante oscuro" que contienen NO_{2} de cualquiera de los
colorantes Cy siguientes. Se muestran las características de
excitación (Abs) y emisión (Em) de las moléculas de colorante no
modificadas:
\newpage
| Colorante | Color de la Fluorescencia | Abs (nm) | Em (nm) |
| Cy2 | Verde | 489 | 506 |
| Cy3 | Naranja | 550 | 570 |
| Cy3.5 | Escarlata | 581 | 596 |
| Cy5 | Rojo Lejano | 649 | 670 |
| Cy5.5 | IR Cercano | 675 | 694 |
| Cy7 | IR Cercano | 743 | 767 |
En otra realización del primer aspecto, la
reducción de un grupo NO_{2} está catalizada por una
nitrorreductasa bacteriana.
Y lo que es más importante, esto significa que
los colorantes basados en cianina pueden ser utilizados en tal
reacción enzima-sustrato al mismo tiempo que
cualquiera de las reacciones enzima-sustrato
convencionales que dan una lectura de salida de fluorescencia en la
región azul/verde del espectro. Las medidas pueden ser realizadas
simultáneamente utilizando dos longitudes de onda diferentes; por
ejemplo, las moléculas basadas en fluoresceína podrían ser
detectadas a Abs 488/Em 510, mientras que las moléculas basadas en
cianina reducida, tales como las basadas en Cy5, podrían ser
detectadas a Abs 649/Em 670. Esto permitiría la realización de
ensayos multiplex, esto es la medida de varios efectos in
vitro o in vivo diferentes simultáneamente.
Las moléculas de cianina que contienen NO_{2}
pueden ser descritas como "colorantes no fluorescentes", esto
es, aquellos colorantes que tienen una baja eficacia intrínseca
para convertir la luz incidente absorbida en fluorescencia. La
eficacia de un colorante no fluorescente como un sustrato de la
nitrorreductasa, es el grado al cual puede convertir la luz
incidente en fluorescente después de una reacción de reducción.
Un incremento de la fluorescencia puede ser
medido con relación a una muestra control que comprenda un sustrato
que sea una molécula de colorante basado en cianina conteniendo
NO_{2} en ausencia de un enzima nitrorreductasa.
Las condiciones típicas de la actividad
nitrorreductasa comprenden la incubación de la composición y una
molécula de colorante basado en cianina que contiene al menos un
grupo NO_{2}, a 37ºC aproximadamente en presencia de NADH y
FMN.
Los ensayos basados en células son cada vez más
atractivos que los ensayos bioquímicos in vitro para ser
utilizados en los procesos de selección automatizados de alto
rendimiento (HTS). Esto es debido a que los ensayos basados en
células requieren una manipulación mínima y los resultados pueden
ser examinados en un contexto biológico que remeda con más exactitud
la situación fisiológica normal. Tales ensayos in vivo
requieren capacidad para medir un proceso celular y un medio para
medir su resultado. Por ejemplo, un cambio en el patrón de
transcripción de un número de genes puede ser inducido por señales
celulares desencadenadas, por ejemplo, por la interacción de un
agonista con su receptor en la superficie celular o por
acontecimientos celulares internos tales como un daño al ADN. Los
cambios inducidos en la transcripción pueden ser identificados
mediante la fusión de un gen informador a una región promotora que
se sabe que es sensible a la señal de activación específica.
En los sistemas enzima-sustrato
basados en fluorescencia, un incremento de la fluorescencia da una
medida de la activación de la expresión del gen informador.
Por consiguiente, en otra realización de la
invención, el método comprende:
- a)
- la puesta en contacto de una célula huésped con una molécula de colorante de cianina que es permeable para las células y que comprende al menos un grupo NO_{2}, donde dicha célula huésped ha sido transfectada con una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia que codifica una nitrorreductasa; y
- b)
- la medida de un incremento de la fluorescencia resultante de la reducción de la molécula de colorante de cianina por la nitrorreductasa como una medida de la expresión del gen de la nitrorreductasa.
Los métodos para utilizar una variedad de genes
de enzimas como un gen informador en células de mamífero son bien
conocidos (para una revisión ver Naylor, L.H. (1999) Biochemical
Pharmacology 58, 749-757). El gen informador es
elegido para permitir que el producto del gen sea medible en
presencia de otras proteínas celulares y es introducido en la
célula bajo el control de una secuencia reguladora elegida que es
sensible a cambios de la expresión génica en la célula huésped.
Secuencias reguladoras típicas incluyen las que son sensibles a
hormonas, segundos mensajeros y a otros factores de control y
señalización celular. Por ejemplo, se sabe que la unión de un
agonista a siete receptores transmembranales modula elementos
promotores, incluyendo el elemento sensible a AMPc, NFAT, SRE y AP1;
la activación de la MAP quinasa conduce a la modulación de SRE que
da lugar a la transcripción de Fos y Jun; un daño al ADN da lugar a
la activación de la transcripción de enzimas reparadores del ADN y
del gen p53 supresor de tumores. Mediante la selección de una
secuencia reguladora apropiada, el gen informador puede ser
utilizado para analizar
el efecto de agentes añadidos sobre procesos celulares que involucran a la secuencia reguladora elegida bajo estudio.
el efecto de agentes añadidos sobre procesos celulares que involucran a la secuencia reguladora elegida bajo estudio.
Para ser utilizado como un gen informador, el gen
de la nitrorreductasa puede ser aislado mediante métodos comunes,
por ejemplo mediante amplificación de una biblioteca de ADNc por la
utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 14.5-14.20). Una
vez aislado, el gen de la nitrorreductasa puede ser insertado en un
vector adecuado para ser utilizado con promotores de mamífero
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 16.56-16.57)
junto con, y bajo el control de, la secuencia reguladora del gen
bajo estudio. El vector que contiene el gen de la nitrorreductasa
informador y las secuencias reguladoras asociadas puede ser
introducido posteriormente en la célula huésped mediante
transfección utilizando técnicas bien conocidas, por ejemplo
mediante la utilización de DEAE-Dextrano o Fosfato
de Calcio (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.
16.30-16.46). Otras técnicas adecuadas serán bien
conocidas por los expertos en el oficio.
Se ha demostrado que la nitrorreductasa es
retenida en las células cuando se expresa de esta manera (ver
Bridgewater y col., Eur. J. Cancer 31a,
2362-70).
En una realización preferida de la invención, la
molécula de colorante de cianina que contiene al menos un grupo
NO_{2} es permeable para las células. Preferiblemente, al menos
uno de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5},
R^{6} y R^{7} de la molécula de colorante de cianina de Fórmula
I comprende un grupo permeabilizante de la membrana celular. Los
compuestos que permeabilizan la membrana pueden ser generados
mediante el enmascaramiento de grupos hidrofílicos para proporcionar
compuestos más hidrofóbicos. Los grupos enmascarantes pueden ser
diseñados para que sean cortados del sustrato fluorogénico dentro
de la célula para generar el sustrato derivado intracelularmente.
Como el sustrato es más hidrofílico que el derivado que permeabiliza
la membrana, es posteriormente atrapado en la célula. Los grupos
permeabilizantes de la membrana celular adecuados pueden ser
seleccionados de entre acetoximetil éster, que es fácilmente
cortado por las esterasas intracelulales de mamífero endógenas
(Jansen, A.B.A. y Russell, T.J., J. Chem. Soc.
2127-2132 (1965) y Daehne, W. y col., J. Med. Chem.
13, 697-612 (1970)) y pivaloil éster (Madhu y col.,
J. Ocul. Pharmacol. Ther., 1998, 14, 5, pp.
389-399) aunque otros grupos adecuados, incluyendo
moléculas de reparto (tales como péptidos de reparto) serán
reconocidos por los expertos en la técnica.
En una realización de la invención, se
proporciona un compuesto que contiene NO_{2} de acuerdo con la
Fórmula I, donde dicho compuesto ha sido modificado con el fin de
que se capaz de penetrar en una célula. Por consiguiente, en una
realización particularmente preferida, se proporciona un compuesto
que contiene NO_{2} seleccionado de entre compuestos de Fórmula
IIIa o Fórmula IIIb
Típicamente, con el fin de analizar la actividad
de un agente para activar respuestas celulares a través de la
secuencia reguladora bajo estudio, células transfectadas con el gen
informador de la nitrorreductasa son incubadas con el agente de
ensayo, seguido por la adición de un sustrato colorante de cianina
permeabilizante de la célula, tal como una molécula de colorante de
cianina que comprende al menos un grupo NO_{2}. Después de un
periodo apropiado requerido para la conversión del sustrato
colorante de cianina en una forma que presente mayor fluorescencia,
se mide la emisión de fluorescencia por las células a una longitud
de onda apropiada para el colorante de cianina elegido. Por
ejemplo, para el compuesto Cy-Q F (mostrado en la
Figura 1a), la emisión de fluorescencia sería monitorizada a 690 nm
con excitación a 650 nm. La medida de la fluorescencia puede ser
realizada fácilmente mediante la utilización de un rango de
instrumentos de detección, incluyendo microscopios de fluorescencia
(por ejemplo LSM 410, Zeiss), lectores de microplacas (por ejemplo,
CytoFluor 4000 Perkin Elmer), sistemas de producción de imágenes
CCD (por ejemplo, LEADseeker™, Amershan Pharmacia Biotech) y
citómetros de flujo (por ejemplo, FACScalibur, Becton
Dickinson).
La fluorescencia medida es comparada con la
fluorescencia procedente de células control no expuestas al agente
de ensayo y los efectos, si es que hay alguno, del agente de ensayo
sobre la expresión génica modulada a través de la secuencia
reguladora son determinados a partir de la relación entre la
fluorescencia en las células de ensayo y la fluorescencia en las
células control.
Cuando sea apropiado, puede prepararse un
extracto celular utilizando métodos convencionales.
Por consiguiente, en una realización preferida de
la invención, el método comprende:
- a)
- la puesta en contacto de un extracto de la célula huésped con una molécula de colorante de cianina que contiene al menos un grupo NO_{2}, donde dicha célula huésped ha sido transfectada con una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia que codifica una nitrorreductasa; y
- b)
- la medida de un incremento de la fluorescencia resultante de la reducción de la molécula de colorante de cianina por la nitrorreductasa como una medida de la expresión del gen de la nitrorreductasa.
Idóneamente, el colorante de cianina es un
compuesto de Fórmula I según se describió en la presente
anteriormente.
En una realización de cualquiera de los aspectos
previos de la invención, la fluorescencia incrementada de la
molécula de colorante de cianina es identificada mediante un
análisis de la emisión de fluorescencia en el rango de 500 a 900 nm,
preferiblemente 550-780 nm y, muy preferiblemente
665-725 nm.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona un kit para un sistema informador que comprende un medio
para expresar un enzima nitrorreductasa y una molécula de colorante
que contiene al menos un grupo NO_{2}.
Los medios adecuados para la expresión de un
enzima nitrorreductasa incluyen un plásmido de expresión u otra
construcción para la expresión. Los métodos para preparar tales
construcciones de expresión son bien conocidos por los expertos en
la técnica.
Con fines de claridad, se describirán a
continuación ciertas realizaciones de la presente invención a manera
de ejemplo con referencia a las figuras siguientes:
La Figura 1a muestra la estructura química del
compuesto de Fórmula II denominado Cy-Q F.
La Figura 1b muestra un espectro de emisión de
fluorescencia de Cy-Q F incubada durante varios
tiempos en presencia de nitrorreductasa B de E. coli.
La Figura 2a muestra la estructura química del
compuesto de Fórmula III denominado Cy-Q G.
La Figura 2b muestra un espectro de emisión de
fluorescencia de Cy-Q G incubada durante varios
tiempos en presencia de nitrorreductasa B de E. coli.
La Figura 3a muestra el análisis por HPLC de
Cy-Q G.
La Figura 3b muestra el análisis por HPLC de
Cy-Q G tratada con nitrorreductasa.
La Figura 4a muestra un análisis de
Cy-Q G mediante Espectrometría de Masas
MALDI-TOF.
La Figura 4b muestra un análisis de
Cy-Q G tratada con nitrorreductasa mediante
Espectrometría de Masas MALDI-TOF.
La Figura 5 muestra la espectroscopía de
absorción de infrarrojos de Cy-Q G y
Cy-Q G tratada con nitrorreductasa.
La Figura 6 muestra la estructura química de
Cy5Q.
La Figura 7 muestra la emisión de fluorescencia
de diferentes concentraciones de Cy5Q en presencia de
nitrorreductasa.
La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo
de unión in vitro con nitrorreductasa.
La Figura 9 muestra la detección de la actividad
nitrorreductasa en lisados celulares de células transfectadas y
control mediante la detección de la fluorescencia de Cy5.
La Figura 10 muestra la fluorescencia de Cy3 en
células que expresan nitrorreductasa y en células control.
La Figura 11 muestra la fluorescencia de Cy5 en
células que expresan nitrorreductasa y en células control.
La Figura 12 muestra la medida de la actividad
nitrorreductasa celular mediante citometría de flujo.
La Figura 13 muestra el espectro de emisión de
fluorescencia de un casete Cy5Q-Cascade Blue®, a=1
a 649 nm en agua, posteriormente diluido 100 microlitros + 3 ml de
agua, excitación a 450 nm.
La Figura 14 muestra el espectro de emisión de
fluorescencia del ácido
8-hidroxi-pireno-1,3,6-trisulfónico,
a=0,2 a 455 nm en agua, diluido posteriormente 100 microlitros + 3
ml de agua, excitación a 450 nm.
La Figura 15 muestra el casete de
Cy5Q-Cascade Blue® después del tratamiento con una
solución de NaOH, a=1 a 650 nm en agua, diluido posteriormente 100
microlitros + 3 ml de agua, excitación a 450 nm.
La Figura 16 muestra la fluorescencia relativa
del casete Cy5Q-Cascade Blue® en presencia o
ausencia de lisado/NTR.
Se preparó una mezcla de reacción que contenía
0,8 mg/ml de nitrorreductasa B de E. coli, NADH 1 mM, FMN 0,4
\muM y Cianina-Q F (Cy-Q F, Figura
1a) 0,05 mM en solución salina tamponada con fosfato sobre hielo.
Se retiró inmediatamente una muestra para el análisis mediante
espectroscopía de fluorescencia, y muestras adicionales fueron
recogidas para análisis después de la incubación de la mezcla de
reacción a 37ºC durante 1, 2 y 5 horas.
El análisis de la emisión de fluorescencia en el
rango de 665 nm a 725 nm producida a partir de la excitación a 650
nm, reveló un notable incremento de la fluorescencia con el tiempo
de incubación de Cy-Q F con nitrorreductasa (Figura
1b), con una emisión máxima a 690 nm.
Se preparó una mezcla de reacción que contenía
0,8 mg/ml de nitrorreductasa B de E. coli, NADH 1 mM, FMN 0,4
\muM y Cianina-Q G (Cy-Q G, Figura
2a) 0,05 mM en solución salina tamponada con fosfato sobre hielo.
Se retiró inmediatamente una muestra para el análisis mediante
espectroscopía de fluorescencia, y muestras adicionales fueron
recogidas para análisis después de la incubación de la mezcla de
reacción a 37ºC durante 1, 2 y 5 horas.
El análisis de la emisión de fluorescencia en el
rango de 660 nm a 720 nm producida a partir de la excitación a 650
nm, reveló un notable incremento de la fluorescencia con el tiempo
de incubación de Cy-Q G con nitrorreductasa (Figura
2b), con una emisión máxima a 675 nm.
Se analizaron muestras de Cy-Q G
incubada en presencia y ausencia de nitrorreductasa mediante HPLC.
Los resultados de HPLC (Figura 3a y 3b) indican que el tratamiento
con nitrorreductasa de la Cy-Q produce >95% de
conversión de Cy-Q G en un producto con un tiempo
de retención en HPLC de 30,5 minutos, en comparación con un tiempo
de retención de 43,2 minutos del material de partida. Los picos
principales del análisis por HPLC fueron sometidos a un análisis
posterior mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF (Figura 4a y 4b). Este análisis mostró una
masa principal de 620,3 para el producto de reacción, comparada con
650,1 para el material de partida Cy-Q G, siendo
este cambio de masa consistente con la conversión de un grupo
-NO_{2} en un grupo -NH_{2}, y es consistente con el mecanismo
de la reacción enzimática propuesto. Esto se confirmó mediante un
análisis posterior utilizando espectroscopía de absorción de
infrarrojos (Figura 5), que mostró la desaparición de una banda de
absorción de un enlace N=O potente después del tratamiento
enzimático, consistente con la reducción enzimática del grupo
-NO_{2} de Cy-Q G para dar un grupo amina.
Se incubó nitrorreductasa B de E. coli
(500 ng) en presencia de concentraciones crecientes de Cy5Q (Figura
6) en 200 \mul de Tris-HCl 10 mM pH 7,5
conteniendo NADH 1 mM, a temperatura ambiente durante 30
minutos.
Se midió la fluorescencia de cada reacción en un
lector de placas CytoStar (PerSeptive Biosystems) utilizando filtros
de excitación de 610/20 nm y de emisión de 670/40 nm. Los
resultados fueron corregidos por la fluorescencia en ausencia del
enzima nitrorreductasa (Figura 7) y se calculó un valor de la
K_{m} de 8,6\pm0,7 \muM utilizando un programa de ordenador
para el ajuste de curvas (Prism).
Se marcó nitrorreductasa (400 \mug, 16,7
nmoles) con 334 nmoles de
Sulfo-NHS-biotina (Pierce) en PBS pH
8,0 durante 2 horas sobre hielo. La biotina libre fue eliminada
mediante diálisis durante una noche frente a PBS pH 7,4 a 4ºC.
Se añadieron concentraciones crecientes de
biotina (Sigma) de 0-100 nmoles/pocillo a pocillos
duplicados de una placa de microvaloración revestida con
estreptavidina (Pierce) en 100 \mul de PBS pH 7,4, seguido por 100
\mul de PBS conteniendo 0,5 \mug de nitrorreductasa
biotinilada, y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente.
Después de la incubación, la placa fue lavada
tres veces con PBS para eliminar el enzima no unido y se añadieron
a todos los pocillos 100 \mul de Cy5Q 5 \muM en PBS que
contenía NADH 1 mM.
Después de incubación durante 35 minutos a
temperatura ambiente para permitir la reacción entre la
nitrorreductasa unida y la Cy5Q añadida, la placa fue analizada en
un lector de placas Cytofluor (PerSeptive) utilizando un filtro de
excitación a 610/20 nm y un filtro de emisión a 670/40 nm. La
Figura 8 muestra una elevada fluorescencia de Cy5 en presencia de
la nitrorreductasa unida. La unión de la nitrorreductasa a la placa
fue desplazada a concentraciones elevadas de biotina libre, por lo
tanto la Cy5Q no había sido reducida y mostraba una fluorescencia
baja.
El gen de la nitrorreductasa B de E. coli
fue clonado en el vector de expresión de mamífero
p-Target (Promega) bajo el control de un promotor de
CMV y transfectado en células CHO utilizando el reactivo de
transfección Effectene (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de
los proveedores.
Después del crecimiento de las células durante 24
horas, se prepararon lisados celulares a partir de células
transfectadas y de células control no transfectadas mediante
sonicación en solución salina tamponada con fosfato. La actividad
nitrorreductasa fue determinada por la adición de Cy5Q 2 \muM e
incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos, seguido por
la medida de la fluorescencia en un lector de placas CytoStar
(PerSeptive Biosystems) (Figura 9) utilizando filtros de excitación
de 610/20 nm y de emisión de 670/40 nm. Los resultados mostraron un
potente incremento de la fluorescencia en las muestras de lisado
procedentes de las células que expresaban nitrorreductasa, que era
proporcional a la cantidad de lisados celulares analizada.
Se sintetizaron dos derivados etil-éster de
colorantes de cianina amortiguados con nitro, Cy3Qee (Fórmula IIIa)
y Cy5Qee (Fórmula IIIb).
Se añadió yoduro de metilo (3 ml, 48,19 mmoles) a
una solución de ácido
2,3,3-trimetil-3H-indol-5-il-acético
(2,5 g, 11,52 mmoles) en sulfolano (15 ml). La reacción fue
calentada a 48ºC durante 18 horas, enfriada posteriormente hasta
temperatura ambiente. La mezcla de reacción bruta fue añadida gota a
gota a un exceso de éter dietílico y el precipitado fue recogido
mediante filtración y secado in vacuo para obtener el
producto como un sólido de color beige (3,27 g, 79% de rendimiento).
^{1}H RMN (d_{6}-DMSO): \deltaH 7,85 (d, 1H),
7,70 (s, 1H), 7,50 (d, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,75 (s, 2H), 2,75 (s,
3H), 1,50 (s, 6H). MALDI-TOF, m/z = 232 (M^{+}=
232 para C_{14}H_{18}NO_{2}).
Se añadió cloruro de
3,5-dinitrobencilo (12,46 g, 57,5 mmoles) a una
solución de ácido
2,3,3-trimetil-3H-indol-5-il-acético
(2,5 g, 11,5 mmoles) con bromuro de sodio (5,92 g, 57,5 mmoles) en
sulfolano (10 ml). La reacción fue calentada a 100ºC durante 20
horas, posteriormente enfriada a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción bruta fue añadida gota a gota a un exceso de acetato de
etilo y el sólido marrón oscuro fue extraído por filtración y
disuelto en dimetilsulfóxido antes de la purificación mediante
cromatografía de fase reversa. El producto fue aislado como un
sólido de color beige (54% de rendimiento). ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO): \deltaH 8,75 (s, 1H), 8,45 (s,
2H), 7,15 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,70 (d, 2H), 5,10 (s, 2H), 3,95
(s, 2H), 3,45 (s, 3H), 1,40 (s, 6H). MALDI-TOF, m/z
= 398 (M^{+}= 398 para C_{20}H_{20}N_{3}O_{6}).
Se disolvieron yoduro de
1,2,3,3-tetrametil-3H-indolio
(1) (50 mg, 0,139 mmoles) y bromuro de
1-(3,5-dinitrobencil)-5-(carboximetil)-3H-indolio
(2) (66 mg, 0,139 mmoles) en ácido acético (3,15 ml), piridina
(3,15 ml) y anhídrido acético (0,7 ml) con monoclorhidrato de
malonaldehídobis(fenilimina) (358 mg, 1,39 mmoles). La
reacción fue calentada a 70ºC durante 2 horas. La solución fue
añadida posteriormente gota a gota a un exceso de éter dietílico y
el sólido azul fue extraído por filtración y purificado mediante
cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético
0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0,1% como eluyente). El
producto fue aislado como un polvo azul oscuro (33,3 mg, 31% de
rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)= 646 nm. ^{1}H RMN
(d_{6}-DMSO): \deltaH 8,75 (s, 1H), 8,45 (s,
2H), 8,35 (m, 2H), 7,5 (m, 6H), 6,55 (m, 2H), 6,25 (d, 1H), 5,6 (s,
2H), 3,7 (m, 7H), 1,8 (s, 3H), 1,7 (s, 2H). FAB^{+}: m/z = 665
(M^{+}= 665 para C_{37}H_{37}N_{4}O_{8}).
Se disolvió
5-(carboximetil)-2-{(1E,3E)-5-[6-(carboximetil)-1,1,3-trimetil-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]-1,3-
pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H-indolio (3) (4,5 mg, 0,0058 mmoles) en etanol (2 ml) con ácido clorhídrico concentrado (20 \mul) y se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. El solvente fue eliminado bajo presión reducida y el residuo purificado mediante cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético 0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoracético 0,1% como eluyente) para aislar el producto como un sólido azul (4,1 mg, 85% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)= 647 nm. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltaH 8,95 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 7,85 (m, 2H), 7,3 (m, 6H), 6,85 (d, 1H), 6,5 (m, 2H), 5,5 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,7 (s, 4H), 3,65 (s, 3H), 1,8 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,25 (t, 6H). FAB^{+}: m/z = 721 (M^{+}= 721 para C_{41}H_{46}N_{4}O_{8}).
pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H-indolio (3) (4,5 mg, 0,0058 mmoles) en etanol (2 ml) con ácido clorhídrico concentrado (20 \mul) y se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. El solvente fue eliminado bajo presión reducida y el residuo purificado mediante cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético 0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoracético 0,1% como eluyente) para aislar el producto como un sólido azul (4,1 mg, 85% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)= 647 nm. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltaH 8,95 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 7,85 (m, 2H), 7,3 (m, 6H), 6,85 (d, 1H), 6,5 (m, 2H), 5,5 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,7 (s, 4H), 3,65 (s, 3H), 1,8 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,25 (t, 6H). FAB^{+}: m/z = 721 (M^{+}= 721 para C_{41}H_{46}N_{4}O_{8}).
A una solución de
5-(carboximetil)-2-{(1E,3E)-5-[6-(carboximetil)-1,1,3-trimetil-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]-1,3-pentadienil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H-indolio
(3) (10 mg, 0,015 mmoles) en acetonitrilo anhidro (2 ml) con
N,N-diisopropiletilamina (4,7 mg, 0,0375 mmoles) se
añadió acetato de bromometilo (23 mg, 0,150 mmoles). La reacción fue
agitada a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno
durante 24 horas. El solvente fue evaporado posteriormente bajo
presión reducida y el residuo azul fue purificado mediante
cromatografía de fase reversa (HPLC). El producto fue aislado como
un polvo azul (10,6 mg, 83% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)=
643 nm. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltaH 9,05 (s, 1H), 8,5 (s,
2H), 8,35 (m, 1H), 7,35 (m, 6H), 7,2 (m, 1H), 7,0 (m, 1H), 6,45 (m,
1H), 6,15 (m, 1H), 5,75 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,7 (s, 4H), 2,1 (s,
3H), 1,05 (s, 3H), 1,75 (s, 6H), 1,70 (s, 6H). FAB^{+}: m/z = 809
(M^{+}= 809 para C_{43}H_{45}N_{4}O_{12}).
Se disolvieron yoduro de
1,2,3,3-tetrametil-3H-indolio
(1) (100 mg, 0,28 mmoles) y bromuro de
1-(3,5-dinitrobencil)-5-(carboximetil)-3H-indolio
(2) (133 mg, 0,28 mmoles) en ácido acético (2,25 ml), piridina
(2,25 ml) y anhídrido acético (0,25 ml) con
N,N'-difenilformamidina (55 mg, 0,28 mmoles). La
reacción fue calentada a 70ºC durante 2 horas. La solución fue
añadida posteriormente gota a gota a un exceso de éter dietílico y
el sólido rojo fue filtrado y purificado posteriormente mediante
cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético
0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0,1% como eluyente). El
producto fue aislado como un polvo de color rosa oscuro (16,5 mg,
8% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O) = 553 nm.
MALDI-TOF: m/z = 640 (M^{+} = 639 para
C_{35}H_{35}N_{4}O_{8}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
5-(carboximetil)-2-{(1E)-3-[6-(carboximetil)-1,1,3-trimetil-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]-1-prope-
nil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H-indolio (6) (4 mg, 0,00531 mmoles) en etanol (2 ml) con ácido clorhídrico concentrado (50 \mul) y se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 20 horas. El solvente fue eliminado bajo presión reducida y el residuo fue purificado mediante cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético 0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0,1% como eluyente) para aislar el producto como un sólido de color rosa (3,2 mg, 74% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)= 549 nm. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltaH 9,0 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 8,45 (m, 1H), 7,3 (m, 6H), 6,9 (d, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,6 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,75 (s, 4H), 3,7 (s, 3H), 1,85 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,3 (t, 6H). MALDI-TOF: m/z = 696 (M^{+}= 695 para C_{39}H_{43}N_{4}O_{8}).
nil}-1-(3,5-dinitrobencil)-3,3-dimetil-3H-indolio (6) (4 mg, 0,00531 mmoles) en etanol (2 ml) con ácido clorhídrico concentrado (50 \mul) y se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 20 horas. El solvente fue eliminado bajo presión reducida y el residuo fue purificado mediante cromatografía de fase reversa (HPLC con agua/ácido trifluoroacético 0,1% y acetonitrilo/ácido trifluoroacético 0,1% como eluyente) para aislar el producto como un sólido de color rosa (3,2 mg, 74% de rendimiento). UV_{máx} (H_{2}O)= 549 nm. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltaH 9,0 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 8,45 (m, 1H), 7,3 (m, 6H), 6,9 (d, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,6 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,75 (s, 4H), 3,7 (s, 3H), 1,85 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,3 (t, 6H). MALDI-TOF: m/z = 696 (M^{+}= 695 para C_{39}H_{43}N_{4}O_{8}).
Cy3Qee (Fórmula IIIa) y Cy5Qee (Fórmula IIIb)
fueron evaluados como sustratos de fluorescencia permeables para las
células para la medida de nitrorreductasa en células vivas. Células
que expresaban nitrorreductasa y células control fueron cultivadas
a 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en medio de
cultivo de tejidos que contenía un 10% de suero de ternera fetal e
incubadas a 37ºC en presencia de Cy3Qee 10 \muM o Cy5Qee 30
\muM. Las medidas de fluorescencia fueron realizadas utilizando
un lector de placas CytoStar (PerSeptive Biosystems) utilizando
filtros de excitación de 530/25 nm y de emisión de 580/50 nm para
Cy3Qee y filtros de excitación de 610/20 mm y de emisión de 670/40
nm para Cy5Qee.
Las medidas de la fluorescencia mostraron un
incremento de la fluorescencia significativo dependiente del tiempo
en las células que expresaban nitrorreductasa, con cambios mínimos
en la fluorescencia de las células control, indicando que Cy3Qee
(Figura 10) y Cy5Qee (Figura 11) son ambos sustratos permeables para
las células eficaces para la medida de la actividad nitrorreductasa
en células vivas.
Se incubaron células que expresaban
nitrorreductasa y células control durante 2 horas a 37ºC en medio de
cultivo de tejidos que contenía Cy3Qee 30 \muM. Después de la
incubación, las células fueron lavadas con solución salina tamponada
con fosfato y tripsinizadas con el fin de producir suspensiones
celulares para el análisis mediante citometría de flujo.
Las células fueron analizadas utilizando un
citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson) utilizando un
filtro de excitación láser de 488 nm y un filtro de emisión de
585/42 nm. Los resultados (Figura 12) muestran un incremento
significativo de la fluorescencia en las células que expresan
nitrorreductasa (fluorescencia media 169,9) en comparación con las
células control (fluorescencia media 18,2).
La sal de potasio del ácido libre mono de Cy5Q
(obtenida de Amersham Pharmacia Biotech Ltd) (5 mg, 0,006 mmoles)
Cascade Blue® (Molecular Probes) (sal sódica del ácido
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico
(8,8 mg, 0,018 mmoles (Fluka)),
N,N-diisopropilcarbodiimida (10 \mul, 0,065
mmoles), 1-hidroxibenzotriazol (1 mg, 0,007
mmoles), 4-(dimetilamino)piridina (0,9 mg, 0,007 mmoles) y
polvo de tamices moleculares activados (250 mg) fueron agitados
juntos en N,N-dimetilformamida anhidra (2 ml) a
temperatura ambiente durante 12 horas. Se observó la mancha de un
producto nuevo mediante TLC (C_{18} FR, MeOH:agua 1:1), rf = 0,8
(en comparación con Cy5Q libre; rf = 0,72). Los tamices moleculares
fueron extraídos por filtración y el producto fue precipitado en
éter dietílico. El precipitado fue extraído por filtración, lavado
con acetato de etilo y secado. El producto fue purificado mediante
cromatografía instantánea en columna C_{18} FR. La sal sódica del
ácido
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico
que no había reaccionado fue eluida de la columna con agua y el
producto eluido posteriormente con acetonitrilo 5%/agua. Se
recogieron las fracciones que contenían el producto puro y la mayor
parte del solvente fue eliminada bajo presión reducida. El residuo
fue liofilizado para dar el producto como un polvo de color cian (1
mg, 11%).
\lambdamáx (Agua) 648 nm (Cy5Q) 354, 372 nm
(pireno).
MS MALDI-TOF; encontrado 1246
(MH^{+}); [teórico (C_{54}H_{44}N_{4}O_{21}S_{5})
1245].
Fluorescencia; el casete
Cy5Q-Cascade Blue® ligados por un éster tenía una
emisión despreciable a 510 nm (Figura 13); 510 nm es la emisión
máxima para la sal sódica el ácido
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico
libre en agua (Figura 14). Esto indica una transferencia eficaz de
energía desde el Cascade Blue® a Cy5Q y la amortiguación de la
fluorescencia del resto de Cascade Blue® cuando está unido a Cy5Q en
el casete. Cuando se trató con una solución de hidróxido de sodio
se observó una emisión de fluorescencia a 510 nm (Figura 15),
indicando la hidrólisis química del enlace éster y la liberación
del resto
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico
fluorescente.
El casete Cy5Q-Cascade Blue® (0,8
mM en tampón acetato pH 5,0) fue diluido hasta 8 \muM en PBS pH
7,4 que contenía NADH 1 mM. Se preparó un lisado celular a partir
de 2 x 10^{7} células SKOV mediante resuspensión de las células
levantadas mediante rascado en 5 ml de PBS a 4ºC y el pase repetido
a través de una aguja de jeringa de calibre 25. Se incubaron
alícuotas (1 ml) de Cy5Q-Cascade Blue® con 500
\mul del lisado celular o de PBS durante 20 minutos a 37ºC.
Después de la incubación, se añadieron 100 \mul de una solución
de 1 ng/\mul de nitrorreductasa B de E. coli a una muestra
y la incubación continuó durante 5 minutos. Posteriormente, se
dispensaron alícuotas (100 \mul) por cuadruplicado de cada
muestra a una placa de 96 pocillos para medir la fluorescencia en
un lector de placas Cytofluor utilizando filtros de excitación de
450 nm/emisión de 530 nm para el Cascade Blue® y de excitación de
610 nm/emisión de 670 nm para Cy5.
La Figura 16 muestra un incremento de la emisión
de fluorescencia a 530 nm (esto es, Cascade Blue®) cuando el casete
es incubado en presencia del lisado celular y un incremento de la
emisión de fluorescencia a 670 nm (esto es, de Cy5) cuando está
presente el enzima nitrorreductasa.
Claims (13)
1. Un método para incrementar la fluorescencia de
una molécula de colorante que contiene al menos un grupo NO_{2}
mediante la reducción de dicho al menos un grupo NO_{2} a NHOH o
NH_{2}, caracterizado porque dicho método se lleva a cabo
en un ensayo de un gen de nitrorreductasa informador.
2. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 1, en el que dicha molécula de colorante que contiene
al menos un grupo NO_{2} es un colorante de cianina.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la molécula de colorante de cianina que contiene al menos
un grupo NO_{2} tiene la fórmula I:
en la que los grupos R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6} están unidos a los anillos que contienen
X e Y u, opcionalmente, están unidos a átomos de las estructuras de
anillo Z^{1} y Z^{2} y n es un número entero de 1 a
3;
Z^{1} y Z^{2} representan cada uno un enlace
o los átomos necesarios para completar uno o dos anillos aromáticos
fusionados, teniendo cada anillo cinco o seis átomos, seleccionados
de átomos de carbono y, opcionalmente, no más de dos átomos de
oxígeno, nitrógeno y azufre;
X e Y son iguales o diferentes y son
seleccionados de entre carbono sustituido con
bis-alquilo C_{1}-C_{4} y
espiroalquilo C_{4}-C_{5}, oxígeno, azufre,
selenio, -CH=CH- y N-W, donde N es nitrógeno y W es
seleccionado de entre hidrógeno, un grupo
-(CH_{2})_{m}R^{8}, donde m es un número entero de 1 a
26 y R^{8} es seleccionado de entre hidrógeno, amino, aldehído,
acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo,
sulfonato, sulfato, carboxilato, fosfonato, polietilén glicol, amino
sustituido, amonio cuaternario, nitro, amida primaria, amida
sustituida y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo,
carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;
los grupos R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{7} son seleccionados independientemente del grupo que consta de
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4} sustituido o no
sustituido, OR^{9}, COOR^{9}, nitro, amino, acilamino, amonio
cuaternario, fosfato, sulfonato y sulfato, donde R^{9} está
sustituido o no sustituido y es seleccionado de entre H, alquilo
C_{1}-C_{4}, amino, aldehído, acetal, cetal,
halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato,
carboxilato, amino sustituido, amonio cuaternario, nitro, amida
primaria, amida sustituida y grupos reactivos con grupos amino,
hidroxilo, carbonilo, carboxilo, fosforilo y sulfhidrilo;
los grupos R^{1} y R^{2} son seleccionados de
alquilo C_{1}-C_{10} que puede estar sustituido
o no sustituido;
caracterizada porque al menos uno de los
grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{7} comprende al menos un grupo nitro que reduce la emisión de
fluorescencia de dicho colorante de tal manera que sea esencialmente
no fluorescente.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, en el que la molécula de colorante de cianina que contiene al
menos un grupo NO_{2} es un compuesto de Fórmula II o de Fórmula
III, o sales de los mismos.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha nitrorreductasa es una
nitrorreductasa bacteriana.
6. Un método de ensayo que comprende:
- a)
- la puesta en contacto de una célula huésped con una molécula de colorante de cianina que es permeable para las células y que contiene al menos un grupo NO_{2}, donde dicha célula huésped ha sido transfectada con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia que codifica una nitrorreductasa; y
- b)
- la medida del incremento de fluorescencia resultante de la reducción de dicha molécula de colorante de cianina por dicha nitrorreductasa como una medida de la expresión del gen de la nitrorreductasa.
7. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 6, en el que la molécula de colorante de cianina es
un compuesto de Fórmula I.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que al menos uno de R^{1} a R^{7} de la molécula de
colorante de cianina de Fórmula I contiene un grupo permeabilizante
de la membrana celular.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha molécula de colorante de
cianina es seleccionada de entre los compuestos de Fórmula IIIa o de
Fórmula IIIb, o sales de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 que comprende:
- a)
- la puesta en contacto de un extracto de una célula huésped con una molécula de colorante de cianina que contiene al menos un grupo NO_{2}, donde dicha célula huésped ha sido transfectada con una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia que codifica una nitrorreductasa; y
- b)
- la medida de un incremento de la fluorescencia resultante de la reducción de dicha molécula de colorante de cianina por dicha nitrorreductasa como una medida de la expresión del gen de la nitrorreductasa.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la fluorescencia incrementada de
la molécula de colorante de cianina es medida mediante un análisis
de la emisión de fluorescencia en el rango de
500-900 nm.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que la fluorescencia incrementada de la molécula de
colorante de cianina es medida mediante un análisis de la emisión de
fluorescencia en el rango de 665 nm a 725 nm.
13. Un kit para un sistema informador que
comprende un medio para expresar un enzima nitrorreductasa y una
molécula de colorante de cianina que contiene al menos un grupo
NO_{2}.
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