JP2757965B2 - 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 - Google Patents

発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 吸光特性を有するシアニンおよび関連染料は写真フィ
ルムに用いられてきた。斯かる染料は吸光特性を必要と
するが、ルミネッセンス（蛍光若しくは燐光）特性を必
要としない。これまでルミネッセンス特性を有するシア
ニン染料は非常に限られた用途しかなかった。斯かる用
途に取分け蛋白のスルフヒドリル基を標識することが含
まれる。「スルフヒドリル試薬染料は筋形質称網嚢（S
R）からの迅速Ca2+解放を開始させる（Sulfhydryl Reag
ent Dyes Trigger the Rapid Release of Ca2 from Sac
oplasmic Reticulum Vesicles（SR）」と題する論文
で、Salama G.Waggoner A.S.Abramson J.は、ヨードア
セチル基を有するシアニン発色団がCa2+解放を開始させ
るべくpH6.7で筋形質称網蛋白上のスルフヒドリル基と
共有結合を形成するのち用いられたことを報告している
（Biophysical Journal、47、456a（1985））。この論
文はまた、蛍光染料が蛋白の標識ないし単離に用いられ
たことを述べている。
「レチニリデン結合箇所から離れたロドプシン分子領
域での配座変化の力学（Kinetics of Conformational C
hanges in a Region of the Rhodopsin Molecule Away
From the Retinylidene Binding Site）」と題する論文
で、Waggoner A.S.、Jenkins P.L.、Carpenter J.P.お
よびGupta R.は、牛ロドプシンのF1領域上のスルフヒド
リル基が660nmで吸光度を有するシアニン染料により共
有標識されたことを報告している［Biophysical Journa
l、33、292a（1985）］。ここでも、特に蛋白のスルフ
ヒドリル基を標識するのにシアニン染料を用いたことが
報告されているが、蛍光染料の使用については開示され
ていない。
「細胞生物学における問題への蛍光フォトブリーチ技
法の応用に関する国際ゼミ（International Workshop o
n the Application of Fluorescence photobleaching T
echniques to Problems in Cell Biology）」と題する
記事には蛋白質に複合され得しかもスペクトルの濃赤領
域で励起されうるシアニンタイプ蛍光プローブに関する
Jacobson K.、Elson E.、Koppel D.およびWebb W.の論
文が報告されている（Fed.Proc.42:72−79（1983））。
上記三つの論文のいずれにも記述されている唯一のシ
アニンプローブは特に蛋白質のスルフヒドリル基に共有
結合するものである。記述されている唯一の特定シアニ
ン化合物はヨードアセチル基を有するもので、該基はシ
アニン染料をスルフヒドリル基と共有反応させる。上記
記事はいずれもシアニン染料と蛋白質以外の物質又はス
ルフヒドリル基以外の蛋白質上任意基との共有反応を開
示していない。
しかしながら、多くの非蛋白質物質はスルフヒドリル
基を有さず、多くの蛋白質は該基を蛍光探査に有用とす
る程十分には有していない。しかも、スルフヒドリル基
（−SHSH−）は空気の存在でジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）に容易に酸化し、それによって蛍光プローブへの共
有結合に受容されなくなる。
発明の概要 本発明に従えば、物質の蛍光ないし隣光検出のために
適当な反応条件下、蛋白質および他物質上のスルフヒド
リル基のみならずアミン（−NH2）およびヒドロキシ（O
H）基その他アルデヒド（−CHO）基の如き基と共有反応
する置換基を有するシアニンおよび関連ポリメチン染料
が開発された。本発明は、従来法のヨードアセチルシア
ニン染料の使用およびその、スルフヒドリル基との特異
反応性よりもかなりの益をもたらす。アミンおよびヒド
ロキシ基はスルフヒドリル基よりも蛋白ないし他の物質
中で優勢であり、安定である。それによって、特定蛋白
有無の探査に蛍光シアニン染料を用いるとき、被探査蛋
白に多くの染料分子が結合しうるので、より強い蛍光な
いし隣光の光度信号が出される。しかも、アミンないし
ヒドロキシ基は、当然スルフヒドリル、アミン若しくは
ヒドロキシ基を含まない重合体粒子の如き標識の所望さ
れる成分に、より容易に付加される。
本発明はまた、標識蛋白又は他物質の有無ないし量
が、該標識成分をクロマトグラフィー法で分離後探査さ
れうるように、アミン若しくはヒドロキシ基又は他の反
応基と共有反応する基を含む発光シアニン染料を用いて
混合物中の染料と反応しうるアミン若しくはヒドロキシ
基又は他の基を有する蛋白又は他の原料を標識する方法
に関する。先に引用せる文献に依れば、明らかにスルフ
ヒドリル基は、特に蛋白分子上のスルフヒドリル基が非
常に少なくまた或る場合該基が蛋白の機能で有意な役割
を果たす故に共有反応用に選定された。それ故、著者が
蛋白構造上のスルフヒドリル基の特定位置を確認する試
みは可能であった。また、上記文献で、スルフヒドリル
基は特定蛋白の構造変化を探査し或は該変化をもたらす
プローブとして用いられた。斯くして、染料による吸光
の変化又は染料結合による解放カルシウムイオンの変化
を判断するために、プローブの結合場所を知ることが必
要であった。
大部分の蛋白上のスルフヒドリル基は非常に少ない故
に、探査に十分な全ルミネッセンをもたらすのに該スル
フヒドリル基数が十分でないことがある。これとは対照
的に、アミンないしヒドロキシ基数は蛋白分子上に数に
おいて有意に多く且つ広く分散しているので分子上の多
数箇所に蛍光プローブを結合させることができ、それに
よって蛋白検出が容易になるため吸光若しくは蛍光変化
の判断が排除される。
本発明は発光ポリメチンシアニンないし関連ポリメチ
ン染料による蛋白その他、核酸、DNA、薬物、トキシ
ン、血液細胞、微生物物質、粒子、プラスチック若しく
はガラス表面材、重合体膜等を含む物質の、該物質上ア
ミン若しくはヒドロキシ箇所での標識に関する。有利な
ことに、染料は、標識物質を含む水性ないし他の媒体に
可溶である。本発明は標識１段法に加えて標識２段法に
関する。標識２段法では、抗体の如き第一成分を、該成
分上の、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスル
フヒドリル箇所を含む箇所で標識しうる。標識された成
分は、抗体が特異な抗原の如き第二成分のプローブとし
て用いられる。
先に記した従来技術では、スルフヒドリル基と共有反
応するプローブを用いることにより、シアニンプローブ
による結合箇所の特異性が達成された。本発明の２段法
に従えば、第一段階でシアニンないし関連プローブを抗
体の如き第一成分上のアミン、アルデヒド、スルフヒド
リル、ヒドロキシ若しくは他の基と反応させることがで
き、而して第二ないし染色段階で抗体は抗原の如き第二
成分での所望の特異性を達成しうる。この特異性は抗体
への抗原結合箇所により調べられる。
本発明はまた、ターゲット分子上のアミン、ヒドロキ
シ、アルデヒド若しくはスルフヒドリル基への共有結合
を可能にする基を含む発光ポリメチンシアニンおよび関
連化合物に関する。本発明は抗原のプローブとなりうる
これら発光シアニン化合物で標識された単一クローン抗
体および他の成分に関する。ターゲットが１種の細胞で
あるとき、本発明は、該細胞に結合する標識抗体の量を
測定するのに用いることができる。この測定は、細胞の
ルミネッセンスの相対的明暗を調べることによって実施
しうる。
本発明は、系の特定蛋白若しくは他成分の濃度を調べ
るに用いることができる。もし、プローブと反応しうる
蛋白上の反応基数が既知なら、分子当りの蛍光を知るこ
とができ、また系の分子濃度を系の全ルミネッセンス強
度によって調べることができる。
本方法は、系の蛋白の混合物すべてを標識し、次いで
標識蛋白をクロマトグラフィーの如き任意手段で分離す
ることにより系の各種の蛋白ないし他の物質を定量する
のに用いることができる。次いで、分離せる発光性の蛋
白量を調べることができ、クロマトグラフィー検出系
で、標識物質上の染料位置を確認するとができる。
本発明はまた、抗体により標識された種々の細胞数を
調べるのに使用しうる。この数の調査は系の複数種の細
胞を標識し次いで標識細胞を系外に分離することにより
実施しうる。また、標識細胞は系外の非標識細胞からも
分離することができる。
本発明の別の具体化は、抗体の如き別異の複数第一成
分にして、各々が抗原の如き別異の第二成分に特異な第
一成分に夫々結合した複数の発光シアニン若しくは関連
染料を、抗原混合物中複数抗原の各々を同定するのに用
いられるマルチパラメーター方法を含む。この具体化に
従えば、各抗体は、他のプローブを標識するのに用いら
れる染料とは別異の吸光およびルミネッセンス波長特性
を有する染料で別個に標識される。次いで、標識抗体は
すべて、夫々特定の標識抗体により染色されうる抗原の
如き第二成分を含むと分析された生物学的調製物に加え
られる。未反応染料物質は、もしそれが分析を妨げるな
ら、洗浄によって調製物から全て除去されうる。生物学
的調製物は次いで種々の励起波長に付される。用いられ
る各励起波長は特定の共役染料の励起波長である。励起
波長に相当する発光波長の光度を調べるのにルミネッセ
ンス顕微鏡又は、励起波長の光を選択し且つルミネッセ
ンスの波長を選定するフィルター若しくはモノクロメー
ターを有するフローシトメター又は蛍光分光光度計の如
き他のルミネッセンス検出系が用いられる。特定の共役
染料の発光波長に相当する波長でのルミネッセンス強度
は、染料が結合する抗体に結合した抗原の量を示す。或
る場合、各々が別異の波長で蛍光を発する混合物中の物
質２種以上からのルミネッセンスを励起するのに単一励
起波長を用いることができ、その各蛍光波長における個
々の蛍光強度を検出することにより各標識種の量を測定
することができる。所望なら、吸光検出法を用いること
ができる。本発明の２段法は、ルミネッセンス若しくは
吸光検出系で第一物質−染料複合物が方向づけられる別
の物質の有無を探査するのに染料と結合した第一物質を
用いる任意系に適用されうる。例えば、染料はDNA若し
くはRNA断片に結合して染料結合DNA若しくはRNAフラグ
メントを形成し得、次いでそれは断片が相補的なDNA若
しくはRNA主鎖に方向づけられる。同じ試験方法はDNAの
相補的主鎖の有無を探査するのに用いることができる。
本発明のシアニンおよび関連染料は特に、広範囲の励
起および発光波長を有する特定のシアニンおよび関連染
料が構成されうる故に、種々の励起および発光波長の染
料を必要とする成分混合物分析によく適合する。特定の
励起および発光波長を有する特定のシアニンおよび関連
染料は、メチン基の数又はシアニン環構造を変えること
により合成することができる。このようにして、レーザ
ー例えばHeNe若しくはダイオードレーザーの如き特定の
励起光源に相当する特定励起波長を有する染料を合成す
ることができる。
本発明は、反応条件下発光性の高いまた吸光度の高い
シアニンおよび関連染料分子を蛋白、ペプチド、炭水化
物、核酸、誘導核酸、脂質、他の特定の生物学的分子、
生物学的細胞上のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド、ス
ルフヒドリル若しくは他の基並びに可溶性重合体、重合
体粒子、重合体表面材、重合体膜、ガラス表面材および
他の粒子ないし表面材の如き非生物学的物質に共有反応
させることに関する。ルミネッセンスには高感度の光学
的技法が包含されているので、標識が非常に低い量で存
在するときでさえ染料「標識」の有無を探査定量するこ
とができ、かくして染料標識試薬を用いて標識された物
質の量を測定することができる。最も有用な染料は吸光
度が高く（ε＝70,000〜250,000b/モルcm又はそれ以
上）、非常に発光性であり、少なくとも５〜80％以上の
量子収量を有する。該量は染料そのものに当てはまり、
また標識物質に結合した染料にも当てはまる。
斯かるカラー標識試薬の重要な適用は発光性単一クロ
ーン抗体の産生である。単一クローン抗体は、特定の化
学的箇所又は細胞表面上若しくは細胞内に「マーカー」
に非常に堅く且つ特異的に結合する蛋白分子である。そ
れ故、これら抗体は、特定細胞種（例えばHLA、Ｔ細
胞、バクテリアおよびウィルス等）および異常細胞を同
定するのに莫大な研究と臨床適用とを有する。従来、細
胞に結合した抗体は種々の方法による抗体の標識によっ
て計量されており、そして標識は放射性標識（ラジオイ
ミノアッセイ）、酵素（ELISA技法）又は蛍光染料（通
常フルオセイン、ロダミン、Taxas Red 若しくは紅藻
素）によって遂行されてきた。臨床的抗体試薬のほとん
どの製造業者ないしユーザーは放射性トレーサーの使用
に伴う問題の排除を望んでおり、そのためルミネッセン
スが最も有望な代替法の一つと考えられている。実際、
多くの業者は今日、単一クローン抗体で標識されたフル
オレセイン、Taxas Red 、ロダミンおよび紅藻素を市
場に出している。
近年、細胞上の蛍光抗体を検出する光学的／電子工学
的装置は複雑さを増している。例えば、フロー血球計算
法を用いて個々の細胞上の蛍光抗体量を、細胞5,000個
／秒までの割合で測定することができ、また顕微鏡およ
び溶液蛍光技法も進歩している。これら装置は、スペク
トルのUV、可視および近IR領域の多くの波長で蛍光を励
起することができる。今日受容される有用な蛍光標識試
薬のほとんどは400〜580nmスペクトル領域で励起しう
る。例外は、蛋白に共有結合し得且つ若干長い波長で励
起しうる、海洋性生物から単離されたいくつかのフィコ
ビリプロテインタイプ顔料である。それ故、今日市販さ
れている装置で分析される生物学的ないし非生物学的物
質の標識で新たな標識試薬が有効となることが必要な58
0〜約900nm範囲の大スペクトル窓がある。このスペクト
ル領域で励起しうる新しい試薬は、種々の特異性を有す
る抗体が各々別異の着色蛍光染料で標識しうる故に細胞
上マーカーのマルチカラールミネッセンス分析の実施を
可能にする。斯くして、分析される各細胞に関し同時に
いくつかのマーカーの有無を調べることができる。
本発明はまた、生物学的ないし非生物学的物質に共有
結合しうる発光（蛍光若しくは燐光）シアニン、メロシ
アニンおよびスチリル染料そのものに関する。メロシア
ニンおよびスチリル染料は本発明のためのシアニン染料
に関連すると認められる。新しい標識試薬そのものは、
特にそれが標識成分に結合しているとき初めに定義せる
波長の光例えば450〜900nmスペクトル範囲の波長の光で
励起しうる。細胞のバックグラウンド蛍光はより低い波
長で概ね生じる。それ故、標識試薬はバックグラウンド
蛍光とは区別される。特に有利なのは633nmの光を吸収
する誘導体である。何故なら、該誘導体は、安価で、強
く、安定で、寿命の長いHeNeレーザー給源により励起さ
れうるからである。次いで、標識成分により蛍光ないし
隣光放出される、二番目に定義した波長の光が検出され
うる。蛍光若しくは隣光は一般に励起光より長い波長を
有する。検出段階は、励起波長の散乱光を吸収するため
の、また検体とともに用いられる特定の染料標識に相当
するルミネッセンスの対応波長を通過させるためのフィ
ルターを有するルミネッセンス顕微鏡を用いることがで
きる。斯かる光学顕微鏡については米国特許第4,621,91
1号に記述されている。
シアニンおよび関連染料がすべて発光性というわけで
ない。しかしながら、本発明の染料には、発光性である
シアニンおよび関連染料が含まれる。それらは比較的光
安定性であり、多くは反応溶液好ましくは水溶液に可溶
である。結合染料そのものは、特にそれが標識成分に結
合しているとき少なくとも50,000好ましくは100,000
／モルcmの分子吸光係数（ε）を有する。吸光係数は分
子が光を吸収する能力の尺度である。本発明の結合染料
は少なくとも２％好ましくは少なくとも10％の量子収量
を有する。加えて、本発明の結合染料は400〜900nm好ま
しくは600〜900nmスペクトル範囲の光を吸収し且つ発生
する。
アリールスルホン化染料 本明細書に記載の如きアリールスルホネートないしア
リールスルホン酸置換染料が、アリールスルホネートな
いしアリールスルホン酸基のない類似染料に比べ本質的
に蛍光が強く、改良された光安定性および水溶性を有す
ると分かった。用語アリールスルホネートないしアリー
ルスルホン酸基を本明細書で用いるとき、それは、単一
環芳香族構造又はナフタレン構造の如き融合環構造を含
む芳香族環構造に結合した互換可能なアリールスルホン
酸基若しくはアリールスルホネート基を意味する。単一
環芳香族構造若しくは融合環芳香族構造はポリメチン、
シアニン、メロシアニン若しくはスチリルタイプ染料中
に存在しうる。
通常シアニン染料を含む同一平面分子構造を有する多
くの染料は、特に、緩衝液ないし生理的食塩水における
如く無機塩も亦存在するとき水溶液中で二量体ないしそ
れ異常の結合体を形成しやすい。これらの結合体は通常
単量体吸収の短波長側にシフトした吸収バンドを有し、
概ね非常に弱い蛍光種である。水溶液でのシアニン染料
の結合体易形成傾向は特に写真工業で周知である［West
W.＆ Pierce S.、J.Phys.Chem．、69:1984（1965）;St
urmer D.M.、Spec.Top in Heterocyclic Chemistry、30
（1974）］。
多くの染料分子特にシアニン染料分子は水溶液中結合
体を形成しやすい。然るに、アリールスルホネート染料
はこれらの結合体形成傾向を最低限で有すると分かっ
た。アリールスルホネート染料を蛍光標識試薬の形成に
用いるとき、それは、蛋白又は抗体の如き他の分子に高
い表面密度で結合する場合結合体形成傾向が低下する。
塩溶液（例 150mM塩化ナトリウム）中特定染料分子が
結合体を形成する傾向は、同じ染料分子が蛋白の表面上
で結合体を形成する傾向の尺度として採用されうる。そ
れ故、染料分子が水性塩溶液中結合体を形成する傾向が
最低限であることが望ましい。第２図に示すデーターを
用いて、特定のアリールスルホネート化染料が水性塩溶
液中高濃度でさえ結合体を形成する傾向が低いことを例
示することができる。
第１図は、水性緩衝液に溶解せる典型的シアニン染料
の単量体吸収スペクトルおよび二量体吸収スペクトルを
示す。これらのスペクトルを生じさせるのに用いられる
染料N,N′−ジ−スルホブチルインドジカルボシアニン
はアリールスルホネート基を有さず、ミリモル範囲未満
の濃度でさえ二量体を容易に形成する。二量体スペクト
ルは濃度の異なる染料スペクトルから算定された（West
＆ Pearce、1965の方法参照）。燐酸塩緩衝剤入り食塩
溶液中３ミリモルの濃度では、単量体および二量体バン
ドの吸収はほぼ等しかった。
改善されたスルホインドジカルシアニンN,N′−ジエ
チルインドジカルボボシアニン−5,5′−ジスルホン酸
のスペクトルを第２図に示す。この染料は濃度10ミリモ
ルまでの食塩溶液中結合体の兆候を何ら示さなかった。
特定の反応染料が抗体の如き蛋白に定義された反応条
件で結合する効率を測定することは常法である。試験染
料はN,N′−ジカルボキシペンチルインドジカルボシア
ニン−5,5′−ジスルホン酸のビス−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドであった。第３図は、このスルホシアニン
染料活性エステルがpH9.2の炭酸塩緩衝液中で羊免疫グ
ロブリンと効率よく反応し、反応溶液中相対的染料ない
し抗体濃度に依って１未満〜20以上の範囲にわたる染
料：抗体モル比を有する共有標識抗体分子を形成するこ
とを例示する。データーに最小２乗法を適用して得た勾
配な、斯かる条件下この染料の標識効率が約80％である
ことを示している。同様の調査で、フルオレセインイソ
チオシアネート（FITC）が約20％の効率を以て反応し
た。
新規なスルホインドジカルボシアニン染料の活性エス
テルの反応性は羊免疫グロブリン（IgG）を標識するこ
とによって調べられた。蛋白（4mg/ml）を0.1モル炭酸
塩緩衝液（pH9.2）に溶かした。無水ジメチルホルムア
ミドに溶解せる反応性染料のアリコートを蛋白試料に加
えて初期の染料：蛋白モル比を得た。30分後、ゲル透過
クロマトグラフィー（Sephadex G−50）により羊結合染
料から蛋白を分離した。得られた染料：蛋白モル比を分
光光度計で調べ、これを第３図に示す。
低い染料：蛋白比において、標識蛋白の吸収スペクト
ルは、遊離単量体染料のスペクトルと密接に対応するバ
ンドを示す。高度標識され（染料：蛋白比の高い）或
は、水性溶液中凝集傾向の高い染料で標識された抗体分
子は往々、水性溶液中単量体染料吸収バンドよりも短波
長で現われる新しい吸収ピークを有することが見出され
ている。新しい吸収ピークの波長はしばしば、染料の二
量体吸収スペクトル特性を示す領域に入る（第１図参
照）。
抗体の標識度が高いほど短波長：長波長吸収ピーク比
は高い。この、より短い波長吸収ピークは第４図中590n
mで見ることができる。第４図中、より長い波長（645n
m）ピークは、抗体に結合した単量体染料分子による。
第４図の抗体吸収スペクトルをもたらすのに用いた標識
試薬N,N′−ジカルボブチルインドジカルボシアニン−
5,5′−酢酸のビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルはアリールスルホネート基を有さず、水性塩溶液
中でまた、それが反応した抗体上で二量体を容易に形成
する。重要なこととして、これら抗体の蛍光励起スペク
トルは、短波長ピークでの標識抗体の励起が、長波長ピ
ークで励起する程多くは蛍光を比例的に生成しないこと
を示す。この考察は、短波長吸収ピークが抗体分子上の
非蛍光二量体ないし結合体の形成によるという概念と調
和する。
本発明者等は、第３図のデーターを得るのに使用した
アリールスルホネートシアシン染料が、二量体の特徴的
吸収波長におけるはるかにより小さな吸収ピーク（第５
図参照）によって判断される如く抗体分子上で容易には
結合しないことを見出した。これは、抗体および他の
「非結合性」標識試薬が蛍光のより強い標識蛋白を産生
すべきなので重要である。実際、アリールスルホシアニ
ンは平均染料／抗体比が比較的高いときでさえ鮮明な蛍
光抗体を産生する（第６図参照） 第４図にカルボキシインドジカルボシアニン染料で標
識された羊免疫グロブリンを示す。第５図は、新規なス
ルホインドジカルボシアニン染料と結合した蛋白を示
す。前者の試料において増加した二量体の存在（第１図
参照）は明らかである。両調製物で染料：蛋白モル比は
ほぼ同じであるけれども、第５図に示す蛋白は第４図に
示す試料よりも蛍光が強かった。
蛍光染料で標識された鮮明な蛍光性抗体又は他の蛋白
を有するには、蛋白上染料分子当りの平均量子収量がで
きるだけ高いことが重要である。
一般に、蛋白上染料分子の表面密度が高くなる（すな
わち染料／蛋白比が増加する）につれ、染料の平均量子
収量が低下する。この効果は時折、標識度の高い蛋白の
表面上染料相互作用の結果として生じるケンチングに起
因してきた。確かに、蛋白表面上非蛍光二量体の形成は
このケンチングに寄与しうる。第６図は、染料／蛋白比
が高くなるにつれアリールスルホシアニン染料の平均量
子収量が緩徐に低下することを示している（菱形印を繋
ぐ曲線）。これとは対照的に、丸印を繋ぐ曲線は、染料
／蛋白比が高くなるにつれ非アリールスルホシアニン染
料（N,N′−ジ−スルホブチルインドジカルボシアニン
−５−イソチオシアネート）の結合に関する平均量子収
量の非常に迅速な低下があることを示している。それ
故、第６図に例示されるスルホシアニン染料は、他の染
料に比較して、特に抗体分子当り染料分子１〜10個の標
識範囲でより鮮明な蛍光抗体を産生する。
標識蛋白上の個々の染料分子の平均蛍光量子収量はこ
れら生物分子から得られる蛍光信号の尺度である。燐酸
塩緩衝剤入り食塩溶液中の新規なスルホインドジカルボ
シアニン染料で標識された羊免疫グロブリン（IgG）か
らのデーターは第６図の菱形印を繋いだ曲線で示され
る。第６図の丸印を繋いた曲線は、比較のためインドジ
カルボシアニン−イソチオシアネート反応性染料で標識
した蛋白を示す。第６図で、染料／蛋白比０での量子収
量は緩衝液中反応性染料（遊離染料）のメチルアミン付
加物に関する値を示す。
バックグラウンド方法 発光プローブは、分子および細胞を分析分離しまた他
物質を検出定量するのに有用な試薬である。非常に少な
い数の発光分子が最適環境下で検出することができる。
BarakとWebbは、SITカメラを用いて細胞のLDL受理に関
連した50個未満の蛍光脂質類似物を可視化した［J.Cell
Biol.90:595−604（1981）］。粒子若しくは特定細胞
に関連した10,000個未満のフルオレセイン分子の検出に
フロー血球計算法を用いることができる［Muirhead、Ho
ranおよびPoste、Bio/Technology 3:337−356（198
5）］。蛍光プローブ応用のいくつかの特定例は、
（１）蛍光フロー血球計算法、蛍光賦活細胞分類および
蛍光鏡検法という技法による細胞混合物中の細胞の部分
母集団の同定および分離、（２）蛍光免疫アッセイの技
法で別の種に結合する物質（例えば抗原−抗体反応物）
の濃度測定および（３）蛍光染色の技法によるゲルおよ
び他の不溶性担体中の物質のローカリゼイションであ
る。これらの技法については、Herzenberg等、「細胞免
疫学（Cellular Immunology）」、第３版、第22章;Blac
kwell Scientific Publications、1978（蛍光賦活細胞
分類）およびGoldman、「蛍光抗体法（Fluorescence An
tibody Methods）」、ニューヨーク所在Academic Pres
s、1968（蛍光鏡検法および蛍光染色（fluorescence mi
croscopy and fluorescence staining）並びにApplicat
ions of Fluorescence in the Biomedical Sciences、
編集Talor等、Alan Liss Inc.、1986に記載されてい
る。
上記目的に蛍光を用いるとき、蛍光物質の選定に多く
の制約がある。一つの制約は蛍光物質の吸収および放出
特性である。なぜなら、多くのリガンド、受容体およ
び、検体例えば血液、尿素、脳脊髄液中の物質は蛍光を
発し、蛍光標識の蛍光の正確な測定を干渉するからであ
る。この現象はオートフルオレッセンス又はバックグラ
ウンド蛍光と呼ばれる。別の考慮すべき点は、蛍光物質
の、リガンドおよび受容体並びに他の生物学的ないし非
生物学的物質への結合能力と斯かる蛍光物質に対する結
合の効果である。多くの状況で、別の分子への結合は蛍
光物質の蛍光特性における実質的変化をもたらし得、或
る場合蛍光物質の量子効率を実質的に損ない或は低下さ
せる。蛍光物質との結合が、標識分子の機能を不活性に
することも可能である。三つ目の考慮すべき点は、鋭敏
検出の場合高くあるべき蛍光物質の量子効率である。四
つ目の考慮すべき点は、できるだけ大きくあるべき蛍光
物質の吸光能又は吸光率である。また、蛍光分子が近接
状態にあるとき互いに干渉してセルフケンチングを生じ
るか否かが関係する。更に、蛍光物質が他の化合物と或
は該蛍光物質そのものにより或は該物質が結合している
化合物との関連において容器壁と非特異結合するか否か
も関係する。
上記方法の適用性および価値はふさわしい蛍光化合物
の入手性と密接に結付く。特に、長波長可視領域（黄〜
近赤外）で発光する蛍光物質が入用である。なぜなら、
これら発色団の励起はオートフルオレッセンスをあまり
生ぜず、またスペクトルの全可視および近赤外領域を使
用しうるとき別異の波長で発光する多数の発色団が同時
分析できるからである。広く用いられている蛍光化合物
フルオレセインは縁領域では有用なエミッターであるけ
れども、特定の免疫検定および細胞分析系ではフロオレ
セイン吸収波長での励起により生じるバックグラウンド
オートフルオレッセンスが検出感度を制限する。しかし
ながら、慣用の赤蛍光標識ロダミンはフルオレセインよ
り効果が低いと分かった。Taxas Red は578nmで励起
しうる有用な標識試薬であり、610nmで最大限に蛍光を
発する。
フィコビリプロテインは、その高い吸光率と高い量子
収量の故に重要な貢献をなしてきた。斯かる発色団含有
蛋白は多くの蛋白に共有結合し得、而して鏡検法および
フロー血球計算法での蛍光抗体アッセイに用いられる。
フィコビリプロテインは、（１）蛋白標識法が比較的複
雑であり、（２）蛋白標識効率が通常高くなる（典型的
には平均0.5フィコビリプロテイン分子／蛋白）、
（３）フィコビリプロテインが天然物で、その調製およ
び精製が複雑であり、（４）フィコビリプロテインが高
価であり、（５）680nmで最大限蛍光を発するアロフィ
コシアニンより更に赤領域スペクトルで蛍光を発する標
識試薬として有効なフィコビリプロテインが現存せず、
（６）フィコビリプロテインが比較的化学的に不安定で
あり、（７）それが比較的容易に光褐色し、（８）フィ
コビリプロテインが33,000〜240,000範囲の分子量を持
つ大蛋白であり、代謝産物、薬物、ホルモン、誘導ヌク
レオチドおよび、抗体を含む多くの蛋白の如き標識が望
ましい多くの物質より大きいという欠点を有する。後者
の欠点は特に重大である。なぜなら、大きなフィコビリ
プロテインで標識された抗体、アビジン、DNAハイブリ
ダイゼーションプローブ、ホルモンおよび小分子は複合
錯体の寸法によって課せられた立体的制限故にそのター
ゲットに結合し得ず、またターゲットへの結合物の結合
速度が低分子量結合物に対して緩徐だからである。
組織学、細胞学、免疫検定を含む他の技法も亦、長い
波長での高い量子効率、吸収および放出特性を示し、簡
単な結合手段を有し且つ非特異的干渉の事実上ない蛍光
物質の使用から実質的益を受ける。
発明のアウトライン 本発明は、標識成分の検定および定量化目的で比較的
大きな吸光率および高い量子収量を有する蛍光アリール
スルホネート化シアニンおよび関連染料を用いる。蛍光
シアニンおよび関連染料は、抗体、抗原、アビジン、ス
トレプトアビジン、蛋白、ペプチド、誘導ヌクレオチ
ド、炭水化物、脂質、生物学的細胞、バクテリア、ウイ
ルス、血液細胞、組織細胞、ホルモン、リンフォカイ
ン、トレース生物分子、トキシンおよび薬物の如き生物
学的物質を標識するのに用いることができる。また、蛍
光染料は、可溶性重合体、重合体ないしガラス粒子、薬
物、導体、半導体、ガラスないし重合体表面材、重合体
膜および他の固体粒子の如き非生物学的物質を標識する
のにも用いることができる。標識される成分は、他の物
質を含む混合形で存在しうる。標識反応が生じる混合物
は液体混合物特に水混合物でありうる。検出段階は顕微
鏡スライドの如き液体若しくは乾燥状態の混合物を以て
生じうる。
本発明は、ターゲット分子に好ましくはアミン若しく
はヒドロキシ部位或る場合にはスルフヒドリル若しくは
アルデヒド部位で共有結合する反応性基のシアニン分子
への編入により変性すべきシアニン染料を必要とする。
本発明はまた、シアニンおよび関連染料構造の試験液体
への溶解性を高めて（１）標識反応での取扱いを容易に
し、（２）標識される蛋白の表面上での染料結合の防止
を助成し且つ（３）生物学的物質および表面材ないしア
ッセイ装置への標識物質の非特異的結合の防止を助成す
べくシアニンおよび関連染料構造の使用ないし変性を用
いる。
シアニンおよび関連染料は、現存の蛍光標識試薬に勝
る重要な利点を供する。先ず第一に、400〜約1100nm範
囲のスペクトル領域で吸光ないし発光するシアニンおよ
び関連染料が合成される。斯くして、これら染料の反応
性誘導体は、複数の標識物質を同時測定することが必要
なアッセイ用に調製されうる。この種のマルチカラー
（若しくはマルチパラメーター）分析は簡素化、コスト
効果或は、粒子の複雑な混合物中の各粒子上の異なる標
識種の比（例えばマルチパラメーターフロー血球計算法
若しくは蛍光顕微鏡による複雑な混合物中の個々の血液
細胞上の抗原マーカーの比）の決定に望ましい。第二
に、多くのシアニンおよび関連染料は強く光を吸収し且
つ蛍光を発する。第三に、多くのシアニンおよび関連染
料は比較的光安定性で、蛍光顕微鏡下迅速には漂白しな
い。第四に、簡単且つ効果的な結合試薬であるシアニン
および関連染料誘導体を製造することができる。第五
に、多くの構造および合成方法が有効であり、またこの
種の染料は多目的である。それ故、試薬を多少水溶性に
するのに多くの構造上の変性を行なうことができる。そ
のチャージは、それが結合する分子をかき乱さないよう
また非特異的結合が低下しうるよう変化しうる。第六
に、フィコビリプロテインとは異なって、シアニン染料
は比較的小さく（分子量＝1,000）、そのためその結合
域に迅速到達し或はその機能を遂行する標準分子能力を
目立つほど立体障害しない。
斯くして、シアニンタイプ染料標識剤は多くの潜在的
利点を供する。斯かる染料は、液体等に水性液体中での
成分１種ないし２種以上の選択的標識に用いることがで
きる。次いで、標識成分は光学的方法又はルミネッセン
ス方法により検出するとができる。別法として、標識成
分は、それが強い親和性を有する別の成分の染色に用い
られ、而して後者の成分は光学的ないしルミネッセンス
方法で検出される。この場合、染料は標識成分のアミ
ン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスルフヒドリル基
と反応する。例えば、標識成分は抗体であり得、それが
強い親和性を有する染色された成分は生物学的細胞、抗
原若しくはハプテン、又は抗原若しくはハプテンを含有
する生物学的細胞ないし粒子でありうる。別の例では、
標識成分はアビジンで、染色される成分はビオチニル化
物質でありうる。また、ポリメチンシアニンタイプ染料
と結合したレクチンを用いて特定の炭水化物基を検出定
量することができる。加えて、発光シアニンおよび関連
染料はDNA若しくはRANフラグメントに結合しうる。DNA
若しくはRNA標識フラグメントは、DNAないしRNAを含有
する試料中特定の相補ヌクレオチド序列の有無および量
を調べる蛍光ハイドリジゼーションプローブとして用い
ることができる。また、該染料はホルモンないしリガン
ド（例 ホルモン、蛋白、ペプチド、リンフォカイト、
代謝産物）に結合し、次いで該ホルモンないしリガンド
は受容体に結合しうる。
反応性シアニンの他の用途に関する特許の記述 Miraha等（米国特許第4,337,063号）並びにMasuda等
（米国特許第4,404,289号、同第4,405,711号および同第
4,414,325号）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性
エステル基を有する種々のシアニン染料を合成してい
る。これらの特許は、上記試薬が写真感光剤として用い
られうることを示している。該試薬の見込まれる蛍光性
質は上記特許に記述されておらず、事実そのプロセスに
は蛍光が必要とされない。上記特許に列挙された染料の
ほとんどは弱い蛍光しか発せず、特に光安定性ではな
く、その溶解特性も、標識物質の蛍光検出を伴う多くの
用途に最適でない。
Exekiel等（英国特許第1,529,202号）は、共有反応性
分子として用いることのできる多くのシアニン染料誘導
体を提示している。この試薬に用いられる反応性基は、
モノ−若しくはジクロロトリアジン基が属するアジン基
である。該英国特許は写真フィルム感光剤としての上記
試薬の開発および使用に関する。蛍光はそのプロセスに
必要でなく、記述された試薬のほとんどは蛍光を発しな
い。この英国特許は、標識物質を検出ないし定量するこ
とを目的とした反応性シアニン染料の開発および使用に
関するものでない。
具体化の説明 本発明は、標識されている物質を、それがルミネッセ
ンス検出方法により検出され且つ／或は定量されうるよ
う発光性とするため発光シアニンおよびシアニンタイプ
染料を生物学的物質、非生物学的分子および巨大分子並
びに粒子に共有結合させる方法に関する。
本発明は、液体中の成分を検出する際、該液体に可溶
の染料で、該染料を成分上のアミンないしヒドロキシ基
場合によってアルデヒドないしスルフヒドリル基と共有
結合させる置換基を含有するシアニン、メロシアニンお
よびスチリル染料よりなる群から選ばれる染料を加えて
それが上記成分を標識するようにする方法に関する。標
識成分はルミネッセンス若しくは光吸収方法により検出
され且つ／或は定量される。標識成分が抗体、DNAフラ
グメント、ホルモン、リンフォカイト又は薬物であると
きは、該標識成分を、それが結合する別の成分の有無を
調べるのに用いることができ、而して該別の成分を検出
し且つ／或は定量することができる。
任意の有効なルミネッセンス又は吸光検出段階を用い
ることができる。例えば、検出段階は、液体を初めに定
義した波長の光で照明する光学的検出段階とすることが
できる。次いで、標識成分により蛍光ないし燐光を発せ
られる別の定義波長での光が検出される。検出はまた、
光学的吸光によるものとしうる。例えば、検出段階は、
液体に初めの定義波長の光を通し次いで液体により伝導
される光波長を確認することを含む。
所望なら、検出段階は、成分へのシアニン若しくは関
連発色団の結合を化学的に検出する化学分析を含みう
る。
共有標識試薬を創生すべく変性されうるシアニン、メ
ロシアニンおよびスチリル染料の基本構造を以下に示
す： 下記のものはポリメチンタイプ染料の更に特定した例
である： 上記構造において、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ＺはＯおよびＳよりなる群から選ばれ、そして ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数
である。
上記式において、メチン基の数は部分的に励起カラー
を決定する。環式アジン構造も亦、部分的に励起構造を
決定しうる。しばしば、ｍのより高い値は増加ルミネッ
センスないし吸光度に寄与する。４より高いｍの値で
は、化合物は不安定になる。そこでは、環構造での変性
により更にルミネッセンスが付与されうる。ｍ＝２のと
き、励起波長は約650nmで、該化合物は正しく蛍光を発
生する。最大発光波長は最大励起波長より概ね15〜100n
m大きい。
各分子中R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の少なく
とも一つ（好ましくは一つのみ場合により二つないし三
つ以上）は、染料を標識成分に結合させるための反応基
である。或る試薬に関しては、各分子上R1、R2、R3、
R4、R5、R6およびR7基の少なくとも一つは、発色団の溶
解性を高め或は標識成分の標識の選択性ないし染料によ
る標識成分の標識位置に影響する基でありうる。
上記式において、R8、R9（存在時）およびR10（存在
時）の少なくとも一つはスルホネート基の少なくとも一
つを含む。用語スルホネート基はスルホン酸を含むもの
とする。なぜなら、スルホネート基はイオン化スルホン
酸に過ぎないからである。
発色団に直接若しくは間接に結合してR1、R2、R3、
R4、R5、R6およびR7基を形成しうる反応基として、イソ
チオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジ
ン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジハロゲン置換
ピリジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ジアジン、マ
レイミド、アジリジン、スルホニルハリド、酸ハリド、
ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホ
スクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジ
ン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサルおよびアル
デヒドを含有する基の如き反応部分が含まれうる。
有効アミノ、ヒドロキシおよびスルフヒドリル基を有
する成分の標識に特に有用なR1、R2、R3、R4、R5、R6お
よびR7基の特定例として次のものが含まれる： （ここで、Ｑ又はＷの少なくとも一つはＩ、Br又はClの
如き残基である）、 ２段階法で抗体を標識するのに用いることのできる有
効スルフヒドリルを有する成分の標識に特に有用なR1、
R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の特定例は次のものであ
る： （ここで、ＱはＩ又はBrの如き残基である）、 （ここで、ｎは０又は整数である）。
光賦活架橋による成分の標識に特に有用なR1、R2、
R3、R4、R5、R6およびR7基の特定例として が含まれる。
水溶性を高め、或は試料中不適当な成分への標識成分
の望ましくない非特異性結合を減じ、或はまた蛍光のケ
ンチングをもたらしうる標識成分上の反応性発色団２種
以上の相互作用を低下させるために、R1、R2、R3、R4、
R5、R6およびR7基を周知の極性ないし帯電化学基から選
定することができる。例は−Ｅ−Ｆであり、ここでＦは
ヒドロキシ、スルホネート、スルフェート、カルボキシ
レート、置換アミノ又は第四アミノを示し、Ｅは−（CH
2）ｎ（ｎ＝０、１、２、３又は４）の如きスペーサー
基を示す。有用な例にはアルキルスルホネート−（C
H2）3SO3-および−（CH2）４−SO3-が含まれる。
本発明の発光染料のポリメチン鎖はまた、ポリメチン
鎖の炭素原子２個以上の間のブリッジを形成する環式化
学基１個以上を含みうる。これらのブリッジは染料の化
学的安定性若しくは光安定性を高めるのに役立ち得、ま
た染料の吸光ないし発光波長を変えたり量子収量を吸光
係数を変化させるのに用いられうる。改良された溶解特
性はこの変性によって達成することができる。
本発明に従えば、標識成分は抗体、蛋白、ペプチド、
酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセ
プタ、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプ
タビジン、トキシン、炭水化物、寡糖類、多糖類、核
酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、DNA
フラグメント、RNAフラグメント、誘導DNAフラグメン
ト、誘導RNAフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、
バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細
胞、血液細胞成分、生物細胞、非細胞血液成分、バクテ
リア、バクテリア成分、天然ないし合成脂質嚢、合成薬
物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス
粒子、ガラス表面材、プラスチック粒子、プラスチック
表面材、重合体膜、導体および半導体でありうる。
或る成分との反応時633nmで光を吸収しうるシアニン
又は関連発色団を調製することができ、而して検出工程
は、このスペクトル波長で発光するヘリウムネオンレー
ザーを用いることができる。また、或る成分との反応時
700nmと900nmとの間で最大限に光を吸収しうるシアニン
又は関連染料を調製することができ、而して検出工程
は、スペクトルのこの領域で光を放出するレーザーダイ
オードを用いることができる。
選択性 上に列挙した反応性基は、適当なpH条件を含む適当な
反応条件が用いられる限り蛋白その他生物学的若しくは
非生物学的分子、巨大分子、表面材又は粒子上の特定官
能基を標識するのに比較的特異性である。
反応性シアニン、メロシアニンおよびスチリル染料並び
にそれらの生成物の特性 本発明の染料のスペクトル特性は、本明細書に記載の
官能化によっては認めるうるほど変化しない。標識蛋白
その他の化合物のスペクトル特性も亦、蛋白その他の物
質に結合していないベース染料分子とさほど異ならな
い。単独若しくは標識物質に結合した本発明に記載の染
料は概ね、大きな吸光係数（ε＝100,000〜250,000）
と、或る場合には0.4程度の高い量子収量を有し、そし
て400〜900nmのスペクトル範囲で光を発生する。斯くし
て、それらは発光検出用試薬を標識するものとして特に
価値がある。
光学的検出方法 標識ないし染色成分を検出するに任意の方法を用いる
ことができる。検出方法は、初めに定義された波長の光
で標識物質を含む混合物を照明する光源を用いることが
できる。該混合物により伝達された或は該混合物により
蛍光ないし発光される第二波長で光を検出する既知装置
が用いられる。斯かる検出装置に蛍光分光計、吸収分光
測定光、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡ないしフロー血球計
算器、ファイバーオプチックセンサーおよび免疫検定装
置が含まれる。
本発明の方法は、単数ないし複数の標識成分への染料
結合を検出するのに化学的分析方法を用いることもでき
る。化学的分析方法には赤外スペクトロメトリー、NMR
スペクトロメトリー、吸収スペクトロメトリー、蛍光ス
ペクトロメトリー、質量スペクトロメトリーおよびクロ
マトグラフィー方法が含まれうる。
例 １ スルホインドジカルボシアニンと蛋白との結合に対する
pHの影響 0.1M炭酸縁緩衝液中の羊γ−グロブリン（4mg/ml）試
料を室温で10倍モル過剰の下記スルホインドジカルボシ
アニン活性エステル（ｍ＝２）と室温で混合した： ５秒〜30分範囲の適当な時間、セファデックスＧ−50上
でのゲル透過クロマトグラフィーにより蛋白試料を非共
有結合染料から分離した。蛋白の最大標識は10分後に生
じて、pH8.5、8.9および9.4でインキュベートした試料
に関し夫々5.8、6.4および8.2の最終的染料／蛋白モル
比をもたらした。染料／蛋白比を５とするのに必要な時
間および異なるpHでの生成物の量子収量を次表に示す： pH 時間（sec） 量子収量 8.5 115 0.09 8.9 53 0.09 9.4 6.5 0.17 上記データーは、この染料で標識した蛋白がpH9未満よ
りもpH9.4において良好であることを示している。緩衝
液のpHが高いほど、結合反応は非常に迅速であるが、標
識効率が優れ、生成物の蛍光度が高い。量子収率は標識
蛋白上の染料分子当りの平均量子収量を表わす。
例 ２ スルホインドカルボシアニン活性エステルと蛋白との結
合 pH7.4の燐酸縁緩衝剤入り塩水（PBS）に溶解させる羊
γ−グロブリン（1mg/ml）を、0.1M炭酸ナトリウムを用
いてpH9.4に調節した。種々の染料／蛋白モル比を得る
ためにこの蛋白溶液のアリコートにシアニン染料標識剤
（例１の構造、ｍ＝１）を加えた。室温で30分のインキ
ュベーション後、PBSを溶離剤とするセファデックスＧ
−50ゲル透過クロマトグラフィーにより分離した。生成
物中蛋白に共有結合した染料のモル比は、初期染料／蛋
白比3.6、12、24および30に関し夫々1.2、3.5、5.4、6.
7および11.2であった。
例 ３ スルホインドジカルボシアニンによるAECMデキストラン
の標識 デキストラン分子当り平均16個のアミノ基を含有する
Ｎ−アミノエチル−カルボキシアミドメチル（AECM）デ
キストランを平均分子量70000のデキストランから合成
した［Inman、J.K.、J.Immunol.114:704〜709（197
5）］。pH9.4の、0.1M炭酸塩緩衝液に溶解せるAECM−デ
キストラン（1mg/250μ）の一部分をスルホインドジ
カルボシアニン活性エステル（例１の構造、ｍ＝２）0.
2mgに加えて染料／蛋白モル比10を得た。混合物を室温
で30分間撹拌した。次いで、溶離緩衝液として酢酸アン
モニウム（50mM）を用いたセファデックスＧ−50ゲル透
過クロマトグラフィーによりデキストランを非結合染料
から分離した。各デキストラン分子に平均2.2個の染料
分子が共有結合した。
例 ４ 特異抗体のスルホインドジカルボシアニン活性エステル
標識 1.1M炭酸塩緩衝液（pH9.4）中のネズミ1gG（1m/ml）
に対し特異な羊γ−グロブリンとスルホインドカルボシ
アニン活性エステル（例１の構造、ｍ＝２）とを染料分
子／蛋白分子比８で混合した。室温で30分間のインキュ
ベーション後、標識混合物を、燐酸塩緩衝剤入り塩水
（pH7.4）で平衡させたセファデックスＧ−50上でのゲ
ル過により分離した。回収された蛋白には、各蛋白に
共有結合した平均4.4の染料分子が含まれた。
例 ５ 羊抗マウス1gG抗体に結合しスルホインドジカルボシア
ニン染料によるヒトリンパ球の染色ないし顕微鏡可視化 新たに単離した抹消血リンパ球をマウス抗−β２−ミ
クログロブリン（0.25μg106細胞）により０℃で30分間
処理した。細胞をDMEM緩衝液で二回洗浄し、次いでスル
ホインドカルボシアニン標識羊抗−マウス1gG抗体）
（１μg/106細胞）で処理した。０℃で30分間のインキ
ュベーション後、細胞を遠心処理して過剰の抗体を除去
し、細胞を再度DMEM緩衝液で洗浄した。蛍光顕微鏡で分
析すべく細胞のアリコートをスライド上に固定させた。
顕微鏡下、スライド上のリンパ球を610〜630nmの光で照
明し、イメージデジタル化装置およびテレビモニターに
取付けたCOTU赤色感知性増強テレビカメラによって650
〜700nmの蛍光を検出した。この方法で染色した細胞は
顕微鏡下蛍光を示した。対照実験で、一次マウス抗−β
２−ミクログロブリン抗体の使用を省いたほかは上記の
如く染色および分析を行なった。対照試料は顕微鏡下で
蛍光を示さず、而してスルホインドシアニン標識羊抗−
マウス抗体がリンパ球への有意な非特異性結合をもたら
さないことを示した。
前掲特許請求の範囲の実施態様を以下に付記します： （１）染料がスルホン酸基若しくはスルホネート基１個
以上を含有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（２）スルホン酸基若しくはスルホネート基が染料の水
溶性を高める、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）スルホン酸基若しくはスルホネート基が、蛍光ケ
ンチングを誘発する染料間の相互作用を低下させる、特
許請求の範囲第１項記載の方法。
（４）染料がシアニン染料である、特許請求の範囲第１
項記載の方法。
（５）染料がメロシアニン染料である、特許請求の範囲
第１項記載の方法。
（６）検出工程がレーザーによる光励起を含む、特許請
求の範囲第４項記載の方法。
（７）検出工程が蛍光鏡検法を用いる、特許請求の範囲
第４項記載の方法。
（８）検出工程がフロー血球計算法を用いる、特許請求
の範囲第４項記載の方法。
（９）検出成分が計量される、特許請求の範囲第４項記
載の方法。
（10）染料がスチリル染料である、特許請求の範囲第１
項記載の方法。
（11）染料がスルホン酸基若しくはスルホネート基を１
個より多く含有する、特許請求の範囲第６項記載の方
法。
（12）染料がスルホン酸基若しくはスルホネート基を１
個より多く含有する、特許請求の範囲第７項記載の方
法。
（13）第１成分がレクチンであり、第２成分が、炭水化
物、炭水化物担持巨大分子および炭水化物担持細胞より
なる群から選ばれる物質である、特許請求の範囲第７項
記載の方法。
（14）第１成分が、抗体、核酸フラグメント、薬物、ト
キシン、ホルモン、代謝産物、生物細胞、バクテリア、
ウイルス粒子、抗原およびハプテンよりなる群の物質を
含有する重合体粒子であり、第２成分が対応する抗原、
相補核酸序列、抗体又はレセプタである、特許請求の範
囲第７項記載の方法。
（15）染料がシアニン染料であって、第１成分上のアミ
ン又はヒドロキシ基と反応する、特許請求の範囲第７項
記載の方法。
（16）染料がシアニン染料であって、第１成分上のアル
デヒド若しくはスルフヒドリル基と反応する、特許請求
の範囲第７項記載の方法。
（17）第２成分が、血液細胞、組織細胞、バクテリア、
ウイルス、染料体、DNA、RNA、トキシン、薬物、ホルモ
ンおよび重合体粒子よりなる群から選ばれる、特許請求
の範囲第７項記載の方法。
（18）成分が抗体である、特許請求の範囲第10項記載の
生成物。
（19）第２成分がDNAないしRNAフラグメントである、特
許請求の範囲第８項記載の方法。
（20）水溶性である特許請求の範囲第16項記載の発光染
料。
（21）水中少なくとも50,000／モルcmの分子吸光係数
および少なくとも２％の量子収量を有し、且つ400〜850
nm分光範囲の光を吸収ないし放出する、特許請求の範囲
第16項記載の発光染料。
（22）水中少なくとも100,000／モルcmの分子吸光係
数および少なくとも10％の量子収量を有し、600〜900nm
分光範囲の光を吸収ないし放出する、特許請求の範囲第
16項記載の発光染料。
（23）スルホシアニン染料標識物質が抗体又はDNAハイ
ブリダイゼイションプローブである、特許請求の範囲第
21項記載の方法。
【図面の簡単な説明】
第１図は、N,N′−ジスルホブチルインドジカルボシア
ニン染料の単量体吸収スペクトルおよび二量体スペクト
ルを示す。第２図は、N,N′−ジエチルインドジカルボ
シアニン−5,5′−ジスルホン産染料のスペクトルを示
す。第３図は、N,N′−ジカルボキシペンチルインドジ
カルボシアニン−5,5′−ジスルホン酸のビス−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド染料による羊免疫グロブリンの
標識反応における染料／蛋白モル比を示す。第４図はN,
N′ジカルボブチルインドジカルボシアニン−5,5′−酢
酸のビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで標
識された抗体の吸収スペクトルを示す。第５図は、新規
なスルホインドジカルボシアニン染料と結合した蛋白の
吸収スペクトルを示す。第６図は、染料／蛋白比の上昇
に伴うアリールスルホシアニン染料の量子収量（菱形
印）変化と非アリールスルホシアニン染料のそれ（丸
印）との比較を示す。

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】水性液体中の成分を標識するに際して、 （ａ） 該成分を含有する前記液体に、芳香族核に結合
    したスルホン酸基若しくはスルホネート基少なくとも１
    個を有するシアニン、メロシアニン、およびスチリル染
    料よりなる群から選ばれる発光染料を加え、 （ｂ） 該染料が前記成分を標識するように該染料と前
    記成分とを反応させることを含み、 前記染料が、 ［ここで、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数で
    あり、 R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基は、独立して、水
    素、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロ
    トリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジハロ
    ゲン置換ピリジン、モノ−ないし−ハロゲン置換ジアジ
    ン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハリド、酸ハ
    リド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシ
    スルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒド
    ラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピ
    リジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサルおよび
    アルデヒドよりなる群から選ばれ、ただし、これらの基
    の少なくとも１つは水素ではなく、 R8およびR9基は、独立して、アリールスルホニルもしく
    はアリールスルホネート基であり、そして 点線はそれぞれ前記シアニン、メロシアニン、およびス
    チリル染料を形成するのに必要な炭素原子を表す］ よりなる群から選ばれることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の少な
    くとも一つが、 （ここで、ＱおよびＷはCl、 BrおよびＩよりなる群から選ばれ、ｎは０又は任意の整
    数である） よりなる群から選ばれる少なくとも一つの基を含有す
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の少な
    くとも一つが、 よりなる群から選ばれる少なくとも一つの基を含有す
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の少な
    くとも一つが、ヒドロキシ、スルホネート、スルフェー
    ト、カルボキシレートおよび置換アミンないし第四アミ
    ン基よりなる群から選ばれる少なくとも一つの基をも含
    有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 ［ここで、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数で
    あり、 R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基は、独立して、水
    素、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロ
    トリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジハロ
    ゲン置換ピリジン、モノ−ないしジ−ハロゲン置換ジア
    ジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハリド、酸
    ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキ
    シスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒ
    ドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−
    ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサルおよ
    びアルデヒドよりなる群から選ばれ、ただし、これらの
    基の少なくとも１つは水素ではなく、 R8およびR9基は、独立して、アリールスルホニルもしく
    はアリールスルホネート基であり、そして 点線はそれぞれ前記シアニン、メロシアニン、およびス
    チリル染料を形成するのに必要な炭素原子を表す］ よりなる群から選ばれる発光染料。
  6. 【請求項６】 ［ここで、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ＺはＯおよびＳよりなる群から選ばれ、 ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数で
    あり、 R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基は、独立して、水
    素、 （ここで、ＱおよびＷは、Ｉ、 ClおよびBrよりなる群から選ばれ、ｎは０又は整数であ
    る） よりなる群から選ばれ、ただし、これらの基の少なくと
    も１つは水素ではなく、 R8およびR9基（存在時）の少なくとも一つはスルホネー
    ト基である］ よりなる群から選ばれる発光染料。
  7. 【請求項７】 ［ここで、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ＺはＯおよびＳよりなる群から選ばれ、 ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数で
    あり、 R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基は、独立して、水
    素、 （ここで、ｎは０又は整数であり、 R8、R9、R10（存在時）およびR11（存在時）の少なくと
    も一つはスルホン酸基若しくはスルホネート基の少なく
    とも一つを含む） よりなる群から選ばれ、ただし、これらの基の少なくと
    も１つは水素ではない］ よりなる群から選ばれる発光染料。
  8. 【請求項８】 ［ここで、 ＸおよびＹはＯ、Ｓおよび よりなる群から選ばれ、 ｍは１、２、３および４よりなる群から選ばれる整数で
    あり、 R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基は、独立して、水
    素、 よりなる群から選ばれ、ただし、これらの基の少なくと
    も１つは水素ではなく、 R8およびR9基の少なくとも一つはアリールスルホン酸基
    若しくはアリールスルホネート基少なくとも一つを含
    み、そして 点線はそれぞれ前記シアニン、メロシアニン、およびス
    チリル染料を形成するのに必要な炭素原子を表す］ よりなる群から選ばれる発光染料。
  9. 【請求項９】R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7基の少な
    くとも一つが、ヒドロキシ、スルホネート、スルフェー
    ト、カルボキシレートおよび置換アミンないし第四アミ
    ン基よりなる群から選ばれる、水溶性の高め且つ非特異
    結合を低下させるための基をも含有する、特許請求の範
    囲第５項記載の発光染料。
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