CN103073909B

CN103073909B - 水溶性不对称吲哚菁荧光染料及其制备方法

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Publication number: CN103073909B
Application number: CN201310036394.1A
Authority: CN
Inventors: 张付利; 汤昆; 贾春辉; 胡海廷; 邱娜; 张潇晗; 王运聚
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103073909A

Abstract

水溶性不对称吲哚菁荧光染料，通式为

Description

水溶性不对称吲哚菁荧光染料及其制备方法

技术领域

本发明属于有机化学领域，具体涉及一种含醚链结构的水溶性不对称吲哚菁荧光染料，同时还涉及该荧光染料的制备方法。

背景技术

Williams于1856年发现了菁染料(亦称花菁)，1873年，Vogel发现该类染料具有异常灵敏的感光能力，从此，菁类染料在生物分析、化学分析、光谱增感、太阳能电池等方面的应用研究日新月异。菁类染料具有光谱范围广（550nm～1200nm）、摩尔消光系数高（可达10⁵L·mol^-1·cm^-1）、荧光量子产率较高、选择性高以及灵敏度高等良好的特性。随着生物技术和荧光标示技术的飞速发展，菁染料已在DNA、蛋白质及核酸的分析检测中有广泛应用。此类化合物中最具代表性的当属荧光发射波长不同、含有磺酸基的一系列水溶性菁染料，AmershanPharmacia Biotech公司首先将其商标注册为Cy3、Cy5和Cy7，目前已作为新一代商品化荧光标示剂，在生物芯片、分子信标等方面都得到了重要应用。

但是，水溶性不对称菁染料仍存在很多不足之处，比如：1）不对称水溶性吲哚菁染料的分子极性通常较大，合成时副反应多；副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。2）市售商品大都依赖国外进口，价格昂贵。3）菁染料的光稳定性受染料的结构、氧气及氧浓度的大小影响。在氧的存在下，菁染料很容易发生光氧化反应而褪色。在吲哚菁染料中，分子的共轭甲川链越长，染料的稳定性越差。三甲川吲哚菁染料在20℃下可保存四年之久，而对称五甲川和不对称五甲川菁染料暴露在空气中颜色很容易由蓝变紫，最后消失；七甲川菁染料的稳定性更差。染料的光稳定性差，影响了生物分析的可靠性，也不利于储存。4）染料的水溶性对其荧光标示性能有较大影响。染料的水溶性越小，染料在水中自聚集倾向越大，从而引起荧光猝灭，使染料在水中的荧光强度下降，荧光量子产率降低，不利于水相中生物分子的荧光标记。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种水溶性不对称吲哚菁荧光染料，同时还提供了相应的制备方法。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：水溶性不对称吲哚菁荧光染料，具有如下通式：

其中n=1，2，3。

所述水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚：将2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有机钾盐、3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴依次加入醇溶剂中，在惰性气体保护下回流反应20-40h，反应结束后蒸出溶剂，以甲醇/二氯甲烷混合溶剂为洗脱剂、用硅胶分离柱分离产物，得红色固体；

（2）合成目标产物：将N-羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚以及缩合剂溶于乙酸/乙酸酐混合溶剂中，加入吡啶或嘧啶，惰性气体保护下反应1-6h，反应温度控制在60-100℃，反应结束后冷却，加醇溶剂稀释后加入乙酸乙酯析出沉淀，抽滤，以甲醇/乙腈混合溶剂为洗脱剂、用反相硅胶填料分离柱分离产物，分出三个色带，接收第二个色带，即得目标产物；所述缩合剂为N,N′-二苯基二甲脒、β-苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸盐或戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐。

所述步骤（1）中2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有机钾盐以及3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴的摩尔比为1:1-3:1-3。

所述步骤（2）中N-羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚及缩合剂的摩尔比为1:1:1。

所述醇溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。

步骤（1）所用有机钾盐为乙酸钾。

步骤（1）中所用洗脱剂为体积比1﹕2的甲醇/二氯甲烷混合溶剂。

步骤（2）中所用洗脱剂为体积比1﹕4-5的甲醇/乙腈混合溶剂。

本发明在吲哚菁的“N”原子上引入了具有醚链结构的水溶性有机基团，获得了一种全新的化合物，其结构已得到质谱和核磁共振的确认，而其荧光特性有荧光发射光谱可予以确证。水溶性有机基团的引入赋予了吲哚菁良好的水溶性，而与其它同类材料相比，本发明提供的化合物又具有一定的脂溶性，对细胞具有很好的保护作用，因此在生物标示领域更具优势。同时，引入水溶性有机基团后，产物在水中的自聚集倾向降低，具备了更强的光稳定性和荧光强度以及较高的荧光量子产率；引入水溶性有机基团后，产物与副产物的极性差别增大，使得产物的分离变得更加容易，利用反相硅胶柱就可分离得到高纯水溶性吲哚菁染料。

对于这种水溶性不对称吲哚菁荧光染料，本发明还提供了相应的制备方法，其合成与分离过程简单易操作，对促进Cy3、Cy5和Cy7的推广应用和实现国产化具有重要的现实意义。

具体而言，本发明具有以下技术效果：

1）提高了标示生物分子时的标示率

荧光标示物对生物分子的标示，其标示率取决于两大因素：（1）标示物中的活性基团与生物分子中氨基等基团的结合能力；（2）活性基团遇水的分解速度。对于本发明的不对称吲哚菁荧光染料，其水溶性有机基团中的醚链与水可以形成分子间氢键，有一定的亲水性，而醚链又具有较好的亲脂性；水溶性有机基团引入以后，不但使化合物具有良好的水溶性，而且和同类产品相比又有较好的脂溶性，这样就提高了化合物中活性基团与生物分子中氨基等基团的结合能力，降低了遇水分解反应的反应速度，提高了标示率。所合成的Cy5-671与同类化合物（N-对羧卞基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚-N-磺酸丙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚五甲川）在同样条件下标示牛血清白蛋白，前者D/P值为：1.57；而后者D/P值为：1.23。标示率显著提高。

2）简化了化合物的纯化分离方法

由于不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难，需采用HPLC纯化，国内实验室一般没有相应的条件。本发明化合物中带有长醚链有机基团，增大了产物与副产物的极性差别，利用C18反相硅胶填料分离柱即可分离得到纯品。该方法操作简单，后续分离简便。

3）提高了荧光染料的稳定性、荧光强度及荧光量子产率

水溶性有机基团中醚链的扇形结构可以屏蔽化合物分子中的带电基团，降低染料在水中的自聚集倾向，使其具有相对较高的光稳定性、较强的荧光强度及较高的荧光量子产率。所合成的荧光染料Cy5-671与同类化合物（N-对羧卞基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚-N-磺酸丙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚五甲川）相比，前者的摩尔消光系数为：1.6×10⁵L·mol^-1·cm^-1，最大荧光发射波长为：671nm，最大荧光发射强度为：358330，荧光量子产率为：0.20；后者的摩尔消光系数为：1.3×10⁵L·mol^-1·cm^-1，最大荧光发射波长为：668nm，最大荧光发射强度为：293049，荧光量子产率为：0.15。可见：Cy5-671的荧光强度显著增强，荧光量子产率增大。

附图说明

图1是实施例1的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy5-671的质谱图；

图2是实施例1的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy5-671的HNMR谱图；

图3是实施例1的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy5-671的荧光发射光谱；

图4是实施例2的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy3-567的质谱图；

图5是实施例2的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy3-567的HNMR谱图；

图6是实施例2的水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy3-567的荧光发射光谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1

水溶性不对称吲哚菁荧光染料（Cy5-671），其结构为：

以下是该化合物的合成路线图和具体制备方法：

（一）合成路线图

(二)制备方法

（1）中间体A2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚的合成

向50mL三颈瓶中依次加入20mL乙酸、5.0g（0.026mol）4-磺酸基苯肼和6.0mL（0.052mol）3-甲基-2-丁酮，氩气保护下于80℃反应2.0h，减压蒸出乙酸，用20mL甲醇溶解后加100mL丙酮析出粉红色固体，即为中间体A，收率约为57％。

（2）中间体B N-对羧苄基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚的合成

往50mL三颈瓶中依次加入20mL甲苯、1.0g(0.0042mol)中间体A、0.4g（0.0042mol）乙酸钾及0.9g（0.0042mol）对溴甲基苯甲酸，氩气保护下回流反应4.0h，反应结束后加入60mL甲醇，过滤得粉红色固体，即为中间体B。收率约为55％。

（3）中间体F3，5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴的合成

取29.0g对甲基苯磺酰氯（0.15mol）溶入40mLTHF中备用；将250mL三颈瓶置于冰水浴中，加入25.0g三乙二醇单甲醚（0.15mol）和10％NaOH溶液60mL，边搅拌边滴加溶有对甲基苯磺酰氯的THF，0°C下反应5.0h，反应结束后用氯仿萃取，用无水硫酸钠干燥，蒸出氯仿，即得中间体C（4-甲基苯磺酸(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙酯），收率：92%。

在100mL三颈瓶中加入4.4g(0.026mol)3,5-二羟基苯甲酸甲酯、16.5g(约0.052mol)中间体C、30mL DMF和少量固体K₂CO₃，氩气保护下于50°C反应16.0h。反应结束后，用100mL丙酮稀释，静置，过滤出无机盐，减压蒸馏除去丙酮及DMF，产物用氯仿溶解并用NaOH水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸出氯仿，得中间体D（3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苯甲酸甲酯），收率：83%。

在250mL三颈瓶中加入1.17g（0.030mol）LiAlH4和50mLTHF，置于冰水浴中搅拌溶解；将7.0g（0.015mol）中间体D溶于50mL THF，并将此溶液慢慢滴加至上述溶液中，室温反应3.0h。反应结束后，慢慢加入乙酸乙酯反应掉剩余的LiAlH4，加水稀释，用氯仿萃取，无水硫酸钠干燥，蒸出氯仿，得中间体E（3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄醇），收率：81%。

在100mL三颈瓶中加入7.0g（0.015mol）中间体E和20mL甲苯，置于冰水浴中，边搅拌边滴加8.1g（0.030mol）PBr₃，反应4.0h。反应结束后，加入50mL冰水稀释，用甲苯萃取，减压蒸馏除去甲苯，即得中间体F（3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴），收率为78％。

（4）中间体HN-(3，5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚的合成

向50mL三颈瓶中依次加入30mL甲醇、1.0g(0.0042mol)中间体A、0.4g（0.0042mol）乙酸钾及2.1g（约0.0042mol）中间体F，氩气保护下回流反应36h，反应结束后，旋蒸出甲醇，以体积比为1﹕2的甲醇/二氯甲烷混合溶剂为洗脱剂，用硅胶填料分离柱对粗产品进行分离，所得红色固体即为中间体H，收率61％。

（5）合成最终产品Cy5-671

在50mL三颈瓶中依次加入6.0mL乙酸、6.0mL乙酸酐（乙酸、乙酸酐体积比1:1）、0.56g（0.0015mol）中间体B、0.39g（0.0015mol）β-苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸盐、0.98g（0.0015mol）中间体H和3mL吡啶，氩气保护下于90℃反应2.0h。反应结束后冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯析出固体，抽滤，用C18反相硅胶填料分离柱分离（甲醇﹕乙腈=1﹕5），分为三个色带，接收第二个色带，所得到深蓝色固体即为产品Cy5-671，收率41％。

（三）产品的确认及性能测定

3.1产品的确认

对所得产品Cy5-671进行质谱分析和核磁共振分析，图1是该化合物的质谱图，图2是其HNMR谱图，相应的HNMR和质谱数据如下：

¹HNMR(400MHZ,D-DMSO)：δ:8.40(t，2H，βproton ofthe bridge)，7.91(m，4H，4,4′-H，-OOC-Ar-H)，7.59(m，2H，6,6′-H)，7.24(m，4H，7,7′-H，-OOC-Ar-H)，6.40(m，6H，Ar-H，α，γproton ofthe bridge)，5.54(s，2H，CH₂-Ar-COOH)，5.28(s，2H，CH₂-Ar-O)，3.40(t，4H，Ar-O-CH₂)，3.67(t，4H，Ar-O-CH₂CH₂)，3.38-3.52(m，16H，O-C₂H₄-O-C₂H₄-O)，3.20(s，6H，O-CH₃)，1.74(d，-CH₃)。m/z：1061.3[M^-]。

3.2荧光发射光谱分析

将制得的Cy5-671配置成1.16×10^-7mol/L的水溶液，做荧光发射光谱，结果如图3所示。从图3可以看出，其最大发射波长为671nm，最大荧光发射强度为358330，荧光量子产率为0.20。

3.3产品Cy5-671的活化

向50mL三颈瓶中依次加入30.0mg（0.026mmol）Cy5-671、12.0mg（0.039mmol）2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（TSTU），13.0μL三乙胺和3.0mL DMF，用锡纸包裹三颈瓶，氩气保护下室温反应2.0h，反应结束后，将反应液加入到100mL乙酸乙酯中，析出蓝色沉淀，抽滤，真空干燥，得到活化过的Cy5-671。

3.4标示牛血清白蛋白

在25mL三颈瓶中，加入1.0mL硼酸盐缓冲溶液（ph=9.18）及56.2mg（0.00085mmol）牛血清白蛋白(BSA)；将2.1mg（0.0017mmol）活化过的Cy5-671溶于136μL无水无氨的DMF中（浓度接近25nmol/μL），并将此溶液加入三颈瓶中，氩气保护下室温反应3.0h，反应结束后，反应液通过G25葡聚糖凝胶柱分离，除去未标示的活化Cy5-671，接收第一段蓝色溶液，测定280nm、670nm下的吸光度，按公式计算D/P值为：1.57。

D/P值按下式计算：

\frac{D}{P} = \frac{A_{dye} E_{prot}}{(A_{280} - X A_{dye}) E_{dye}}

D-荧光标示物的摩尔数；

P-牛血清蛋白的摩尔数；

A_dye-荧光标示物在最大吸收波长处的吸光度；

A_prot-牛血清蛋白在280nm处的吸光度；

E_dye-荧光标示物的摩尔吸光系数；

E_prot-牛血清蛋白的摩尔吸光系数；

X-纠正因子：荧光标示物在280nm的吸光度和荧光标示物最大吸收波长处的吸光度之比。

实施例2

水溶性不对称吲哚菁荧光染料（Cy3-567），其结构为：

制备方法为：

（1）N-(3，5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚的合成

向50mL三颈瓶中依次加入30mL乙醇、0.0042mol2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、0.0126mol乙酸钾及0.0126mol3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴，氩气保护下回流反应20h，反应结束后，旋蒸出乙醇，以体积比为1﹕2的甲醇/二氯甲烷混合溶剂为洗脱剂，用硅胶填料分离柱对粗产品进行分离，得红色固体产品，收率61％。

（2）合成目标产物

在50mL三颈瓶中依次加入6.0mL乙酸、6.0mL乙酸酐、0.0015mol N-对羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、0.0015mol N,N′-二苯基二甲脒、0.0015mol N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚，加入3mL吡啶，氩气保护下于60℃反应6h。反应结束后冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯析出固体，抽滤，用C18反相硅胶填料分离柱分离（甲醇﹕乙腈=1﹕5），分出三个色带，接收第二个色带，得到红棕色固体Cy3-567，收率：54％。

对所得产品进行质谱分析和核磁共振分析，图4是该化合物的质谱图，图5是其HNMR谱图，相应的HNMR和质谱数据如下：

¹HNMR(400MHZ,D-DMSO)：δ：9.9(d，1H，βprotonofthe bridge)，7.95(m，4H，6,6′-H,-OOC-Ar-H)，7.50(d，1H，4-H)，7.24(m，4H，7，7′-H，-OOC-Ar-H)，7.01(d，1H，4′-H)，6.40(m，3H，Ar-H)，6.35(d，2H，αproton ofthe bridge)，5.49(s，2H，CH₂-Ar-COOH)，5.09(s，2H，CH₂-Ar-O)，4.02(t，4H，Ar-O-CH₂)，3.67(t，4H，Ar-O-CH₂CH₂)，3.38-3.52(m，16H，O-C₂H₄-O-C₂H₄-O)，3.20(s，6H，O-CH₃)，1.65(d，12H，-CH₃)。m/z：1037.7[M+H]，1059.7[M+Na]。

将所得产品Cy3-567配成1.16×10^-7mol/L的水溶液，进行荧光发射光谱分析，结果见图6，可知其最大发射波长为552nm，最大荧光发射强度为415230。

参照实施例1的方法对产品Cy3-567进行活化和标示牛血清白蛋白，D/P值值为：1.47。

实施例3

水溶性不对称吲哚菁荧光染料Cy7，结构为：

其制备方法如下：

向50mL三颈瓶中依次加入30mL甲醇、0.0042mol2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、0.0042mol乙酸钾及0.0042mol3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴，氩气保护下回流反应40h，反应结束后，旋蒸出甲醇，以体积比为1﹕2的甲醇/二氯甲烷混合溶剂为洗脱剂，用硅胶填料分离柱对粗产品进行分离，得红色固体产品，收率61％。

（2）合成目标产物

在50mL三颈瓶中依次加入6.0mL乙酸、6.0mL乙酸酐、0.0015mol N-对羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、0.0015mol戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐、0.0015mol N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚，加入3mL吡啶，氩气保护下于100℃反应1h。反应结束后冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯析出固体，抽滤，用C18反相硅胶填料分离柱分离（甲醇﹕乙腈=1﹕4），分出三个色带，接收第二个色带，得到鲜亮紫色固体Cy7。

Claims

1.水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，其特征在于，所述水溶性不对称吲哚菁荧光染料具有如下通式：

，其中n=1，2，3；制备方法包括以下步骤：

（1）合成N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚：将2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有机钾盐、3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴依次加入醇溶剂中，在惰性气体保护下回流反应20-40 h，反应结束后蒸出溶剂，以甲醇/二氯甲烷混合溶剂为洗脱剂、用硅胶分离柱分离产物，得红色固体；其中，所述醇溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；所用有机钾盐为乙酸钾；

（2）合成目标产物：将N-羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚以及缩合剂溶于乙酸/乙酸酐混合溶剂中，加入吡啶或嘧啶，惰性气体保护下反应1-6 h，反应温度控制在60-100℃，反应结束后冷却，加入乙酸乙酯析出沉淀，抽滤，以甲醇/乙腈混合溶剂为洗脱剂、用反相硅胶填料分离柱分离产物，分出三个色带，接收第二个色带，即得目标产物；所述缩合剂为N,N′-二苯基二甲脒、β-苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸盐或戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐。

2.如权利要求1所述的水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有机钾盐以及3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基苄溴的摩尔比为1:1-3:1-3。

3.如权利要求1所述水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中N-羧苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚及缩合剂的摩尔比为1:1:1。

4.如权利要求1或2或3所述的水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所用洗脱剂为体积比1﹕2的甲醇/二氯甲烷混合溶剂。

5.如权利要求4所述的水溶性不对称吲哚菁荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所用洗脱剂为体积比1﹕4-5的甲醇/乙腈混合溶剂。