CN102516793A - 一类双苄基五甲川菁荧光染料、其制备方法及应用 - Google Patents
一类双苄基五甲川菁荧光染料、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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技术领域
本发明涉及一类双苄基五甲川菁荧光染料,其制备方法以及作为特异性荧光探针在活细胞和固定细胞标记中的应用。
背景技术
线粒体是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器,各种生命活动所需的能量大部分都是靠线粒体中合成的ATP提供的,因此有细胞的“动力工厂”之称。目前商品化的线粒体荧光探针主要有:JC-1、Rhodamine 123及系列探针。其中,JC-1应用最为广泛。它在浓度或线粒体膜电位低时,以单体存在,激发波长为490nm,发射波长为527nm,呈绿色荧光。当浓度升高或线粒体膜电位升高时,JC-1形成J-聚体,呈橙色荧光,此时激发波长为490nm,发射波长为590nm。JC-1最重要的应用是检测活细胞内线粒体的膜电位,以及追踪凋亡细胞中的线粒体变化。Rhodamine 123是一种能渗透入细胞,带阳离子的荧光探针。它的激发波长为505nm,发射波长为534nm。活细胞摄取Rhodamine 123达到平衡的速度较快,只需5分钟,通过激光扫描共聚焦显微镜观察,即可见到线粒体被Rhodamine 123染成绿色。当细胞被反复冲洗时,Rhodamine 123通常不被细胞保留,但许多癌细胞可较长时间保留这种染料,因此,它有助于某些癌症的诊断。但是,一旦线粒体的膜电位损失,它们就很容易被洗掉。这就限制了某些应用。系列探针则是Invitrogen专为线粒体而设计,具有细胞通透性,能被动渗透质膜,在有活性的线粒体中积累。尽管有些MitoTracker探针能实现固定细胞中的线粒体标记,但在很短的时间内就会匀染整个细胞,所以这些染料还是只推荐给活细胞。
因此,目前的线粒体荧光探针都存在着不同的缺点,如受线粒体膜电位控制、不能标记固定细胞中的线粒体等。更为重要的是,这些探针的吸收和发射波长均在可见光区(490-530nm),而生物样品在这个区域有很强的吸收和荧光发射,这会造成荧光检测效率大大降低。
随着生物技术和荧光标示技术的飞速发展,由于菁染料具有摩尔消光系数大,吸收和发射波长随着染料共轭链的长度可调,与生物分子结合后荧光较强,细胞毒性小等特点,已成为在DNA、蛋白质及核酸等分析检测中使用的主要荧光探针。五甲川菁染料Cy5的吸收、发射波长在600nm以上,接近近红外区域,是波长最短的近红外菁染料,作为新一代的商品化荧光标示剂,在蛋白标记、DNA测序、离子中性小分子识别、细胞以及活体组织成像方面得到了很广泛的应用。但到目前为止,还没有文献报道五甲川菁染料用于荧光特异性标记细胞内线粒体。
发明内容
本发明的目的在于提供光谱范围在近红外光区、能够在活细胞和固定细胞中对线粒体进行荧光标记的、结构简单性能优良的基于五甲川菁染料的探针分子,
本发明的目的之一在于提供一类双苄基五甲川菁荧光染料,具有如下结构通式I:
通式I中,X-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CF3 -、BF4 -、R1CO2 -、R2SO3 -或OTs-,
其中R1和R2各自独立地选自C1-12的烷基或芳基。
优选的技术方案中,所述的R1和R2各自独立地选自C1-6的烷基。
更进一步优选,通式I中,X-选自卤素负离子,最优选Cl-、Br-、I-。
本发明另一方面的目的在于提供上述本发明的双苄基五甲川菁荧光染料的制备方法,是使用通式化合物II与化合物III(缩合剂丙二醛缩苯胺盐)在碱存在条件下反应所得,反应溶剂是酸酐,反应温度20~150℃,反应时间10~100分钟。其中优选的反应时间是30~50min。
其中,X-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CF3 -、BF4 -、R1CO2 -、R2SO3 -或OTs-。优选卤素负离子,最优选Cl-、Br-、I-。
其中R1和R2各自独立地选自C1-12的烷基或芳基,优选C1-6的烷基。
化合物II与化合物III的投料摩尔比为1∶0.1~1;
化合物II与碱的投料摩尔比为1∶0.5~2。
上述本发明的制备方法中,所述的所述的化合物II与化合物III的投料摩尔比优选1∶0.4~0.6。
上述本发明的双苄基五甲川菁荧光染料的制备方法中,化合物II和化合物III的缩合反应在碱存在条件下进行。同样类型的反应在现有技术中已有记载,因此,本领域的技术人员通常可以确定反应中所使用的碱及其用量。本发明的优选技术方案中,选择使用醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、甲酸钠、丙酸钠、丙酸钾、草酸钠或草酸钾为碱。最优选醋酸钠。碱的用量是化合物II投料摩尔量的0.9~1.1倍。
上述本发明的双苄基五甲川菁荧光染料的制备方法中,化合物II和化合物III的缩合反应在酸酐为溶剂的反应体系中进行,优选的作为溶剂的酸酐包括乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐和戊二酸酐。最优选乙酸酐。
通过上述制备方法制得的荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收,以达到需要的纯度。例如反应结束后冷却,倒入NaCl的饱和水溶液中,搅拌后析出蓝色颗粒。过滤,用乙醚洗涤,干燥后蓝色固体。产物的纯化可采用正相硅胶柱色谱(如石油醚∶乙酸乙酯=1∶10)进行分离。
上述本发明所提供的结构通式I的双苄基五甲川菁染料在DMSO中的最在吸收在654/662nm,最大发射光谱在672nm;在水中的最大吸收和最大发射光谱分别在647nm和662nm;在固定细胞中特异性荧光标记线粒体,并不依赖于线粒体膜电位,因此对致病细胞格外有用;用10nM浓度的I在室温孵化24小时后细胞存活率IC50可达到60%。I与Mitotracker GreenTM在活细胞内线粒体的荧光染色位置完全相同,对活细胞内线粒体的特异性荧光标记。
因此,本发明再一方面的目的还在于提供上述双苄基五甲川菁荧光染料在线粒体荧光特异性标记中的应用。其中所述的线粒体包括活细胞线粒体和固定细胞线粒体。与本领域的现有技术相似,以本发明所述的双苄基五甲川菁荧光染料进行荧光标记,必然包括将本发明的上述染料之一的化合物、其缀合物、或含有上述染料之一的组合物以有效浓度的剂量与待标记的细胞在适宜的条件下充分接触的过程。更具体的条件,本领域的技术人员可以根据现有技术,针对具体的待染色样品选用合适的方案。
附图说明
本发明附图7幅,
图1(a)是染料I-1分别在DMSO和水中的吸收光谱。横坐标为波长,纵坐标为吸收强度;图1(b)是染料I-1分别在DMSO和水中的荧光发射光谱。横坐标为波长(nm),纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计,型号:Hp8453;荧光分光光度计,型号:FP-6500。染料I-1的浓度为5μM。
图2是不同浓度的染料I-1在MCF-7中的活细胞染色的荧光染色图片:
染料I-1在培养基中的终浓度分别为a)10nM;b)100nM;c)500nM和d)1μM;染料与MCF-7活细胞在37℃,5%CO2条件下孵育30分钟后,使用荧光倒置显微镜(Olympus IX81)观察拍照,Cy5滤光器(激发波长:628/40nm),放大20倍。
图3(a)是Mito-Tracker GreenTM在MCF-7中的活细胞染色图片;
图3(b)是染料I-1在MCF-7中的活细胞染色照片;
图3(c)是a和b的叠加照片;
图3(d)是图c中的方框部分荧光染色区域放大图;
图4是用Slidebook(Olympus)软件分析实施例5的结果,即图3d中两种染料对活细胞的染色。黄线表示软件选取的细胞分析范围。横坐标为微米,左侧纵坐标为染料I-1的相对荧光强度,右侧纵坐标为染料Mito-Tracker GreenTM的相对荧光强度。所用仪器:荧光倒置显微镜(Olympus IX81),分别选用Cy5滤光器(激发波长:628/40nm)激发探针染料I-1,GFP滤光器(激发波长:472/30nm)激发Mitotracker GreenTM,调整相应的曝光时间(500毫秒-1000毫秒)用油镜(60×)观察。
图5是实施例6中染料I-1与DAPI在MCF-7固定细胞中的复染图片;
图6是实施例6中,随机选择某个细胞,用Slidebook(Olympus)软件分析DAPI和染料I-1在固定细胞的染色区域。灰色线代表DAPI,黑色线代表染料I-1。所用仪器:荧光倒置显微镜(Olympus IX81),分别选用Cy5滤光器(激发波长:628/40nm)激发探针染料I-1,DAPI滤光器(激发波长:377/50nm),调整相应的曝光时间(500毫秒-1000毫秒)用油镜(60×)观察。
图7是染料I-1在MCF-7细胞中存在时的细胞存活率。染料在培养基中的终浓度为0μM(TCP)、0.01μM、0.1μM、1μM和10μM,在37℃的5%的CO2细胞培养箱中孵育24小时后,加入CellTiter-BlueTM,用荧光计数仪(FL600,Bio-Tek)对有荧光的细胞进行计数,560EM/590EX记录荧光。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1.染料I-1的合成:
精确称量524mg(2mmol)中间体II-1,258mg(1mmol)缩合剂丙二醛缩苯胺盐酸盐(III-1)混合倒入10ml的单口烧瓶中。加入醋酸钠164mg(2mmol),溶于5ml醋酐中,加热搅拌,回流40min后停止加热。冷却后,倒入NaCl的饱和水溶液中,搅拌后析出蓝色颗粒。过滤,用乙醚洗涤,干燥后称量得到520mg蓝色固体,反应粗收率为74%。产物的纯化采用正相硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯=1∶10)分离。
精确称量524mg(2mmol)中间体II-2,258mg(1mmol)缩合剂丙二醛缩苯胺氢溴酸酸盐(III-2)混合倒入10ml的单口烧瓶中。加入醋酸钠164mg(2mmol),溶于5ml醋酐中,加热搅拌,回流40min后停止加热。冷却后,倒入NaCl的饱和水溶液中,搅拌后析出蓝色颗粒。过滤,用乙醚洗涤,干燥后称量得到430mg蓝色固体,反应粗收率为70%。产物的纯化采用正相硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯=1∶10)分离。染料I-1的核磁及高分辨质谱数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.35(t,2H,CH=CH),7.66(d,J=7.4Hz,2H,Ar-H),7.56(d,J=7.9Hz,2H,Ar-H),7.42-7.20(m,12H,Ar-H),7.01(t,J=7.4Hz,2H,Ar-H),6.38(d,J=13.6Hz,3H,CH=CH),5.39(s,4H,N-CH2),1.73(s,12H,C(CH3)2).13C NMR(100MHz,DMSO)δ173.85,168.71,142.68,141.49,139.79,135.55,129.44,129.10,128.97,128.25,127.01,125.40,123.41,123.03,119.44,111.77,104.36,49.52,27.70,24.45.HRMS-ESI:m/z,calc.535.3108 for C39H39N2 +;found 535.3109.
实施例3.染料I-1在DMSO和水中的吸收和发射光谱
分别将染料I-1溶解在DMSO和水中,配制终浓度为5μM的溶液。
检测结果如附图1所示,染料I-1在DMSO中的最大吸收在654/662nm,最大发射光谱在672nm;在水中的最大吸收和最大发射光谱分别在647nm和662nm。可见染料I-1的最大吸收和发射光谱均在近红外光区。从图1中也可见,该探针在疏水环境中的吸收和发射强度均大于在水环境中,所以当探针与线粒体脂质作用时,会表现出较强的荧光。
所用仪器为紫外可见分光光度计,型号:Hp8453;荧光分光光度计,型号:FP-6500。
实施例4.荧光显微镜下观察染料I-1在不同浓度时对MCF-7活细胞染色
将可传代的MCF-7细胞接种于12孔板中,37℃,5%CO2条件下在细胞培养箱中培养24小时,加入染料I-1溶液(溶解在DMSO中),终浓度分别为10nM、100nM、500nM和1μM,37℃孵育30分钟,吸掉培养基,PBS冲洗2遍,并加入不含酚红的新鲜培养基,在荧光倒置显微镜(Olympus IX81)下观察细胞形态。
在相同曝光时间下,选用Cy5滤光器(激发波长:628/40nm)结构式1染料,放大(20×)观察,重复三次。
从图2中a、b、c和d四张图片可以看出,不同浓度的染料I-1均可对MCF-7活细胞荧光染色,并随着染料浓度的增大,荧光增强,染色区域限于细胞质。
实施例5荧光显微镜下观察染料I-1与Mitrotracker GreenTM对MCF-7活细胞内染色
Mitotracker GreenTM是一种商品化线粒体绿色荧光探针,可以用于活细胞内线粒体特异性荧光染色。将结构式I-1染料与Mitotracker GreenTM分别对MCF-7活细胞染色,比较它们对活细胞的染色效果,能够进一步确定DBCy5对线粒体的特异性荧光标记。
将可传代的MCF-7细胞接种于12孔玻璃孔板中(孔板厚度约为0.13-0.17毫米),37℃,5%CO2条件下在细胞培养箱中培养24小时,分别加入结构式I-1染料和MitotrackerGreenTM,终浓度为500nM,37℃孵育30分钟,吸掉培养基,PBS冲洗2遍,并加入不含酚红的新鲜培养基,在倒置显微镜(Olympus IX81)下观察细胞形态。分别选用Cy5滤光器(激发波长:628/40nm)激发I-1染料,GFP滤光器(激发波长:472/30nm)激发Mitotracker GreenTM,调整相应的曝光时间(500毫秒-1000毫秒)用油镜(60×)观察,重复三次。
图3a是Mito-Tracker GreenTM的活细胞染色照片(绿色),图3b是染料I-1的活细胞染色照片(红色),图3c是图3a和图3b的叠加照片。从这三张图片可以看出,Mito-TrackerGreenTM和染料I-1对活细胞的染色位置完全重叠。图3d是图3c中的部分荧光染色区域放大图(白色方框内),用Slidebook(Olympus)软件分析图3d中两种染料对活细胞的染色位置。结果如图4,可见:两种染料对活细胞内线粒体的荧光染色完全相同,更可以定量地证明染料I-1对活细胞内线粒体的特异性荧光标记。
实施例6.荧光显微镜下观察染料I-1与DAPI对MCF-7固定细胞的复染
DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,因此常直接用于固定细胞或组织的细胞核染色。将DAPI染料与染料I-1对固定细胞进行复染,可用来观察染料I-1在细胞中的染色区域。
将可传代的MCF-7细胞接种于盖玻片上,37℃,5%CO2条件下在细胞培养箱中培养24小时。同时加入染料I-1和DAPI,终浓度为500nM,37℃孵育30min,吸掉培养基,PBS冲洗2遍,用10%的甲醛溶液固定细胞2min,吸掉甲醛溶液,PBS冲洗3遍。并立即展开,密封,在倒置显微镜(Olympus IX81)下观察细胞形态。分别选用Cy5滤光器(激发波长:628/40nm)激发探针染料I-1,DAPI滤光器(激发波长:377/50nm)激发DAPI染料。用油镜(60×)观察,重复三次。从图5中可以看出,灰色(蓝色)荧光区域表示DAPI染MCF-7细胞核,白色(红色)荧光区域是染料I-1特异性荧光标记线粒体。如图6,随机选择某个细胞,用Slidebook(Olympus)软件分析DAPI和染料I-1对固定细胞的染色情况,发现两种染料对细胞染色基本无交叉区域,这说明I-1染料能够在固定细胞中特异性荧光标记线粒体,并不依赖于线粒体膜电位,因此对致病细胞格外有用。
实施例7染料I-1在MCF-7细胞中的细胞活性实验
CellTiter-BlueTM细胞活性检测用均质、荧光的方法,估计一个细胞群体中活性细胞的数目。这一系统包括CellTiter-BlueTM试剂,即溶解于缓冲溶液中的高纯度的刃天青。刃天青是一种可直接加入细胞培养物中的氧化还原指示剂。细胞可将深蓝色的氧化型染料(刃天青)转化为红色的还原型染料(试卤灵)。因为无活性的细胞很快丧失了代谢能力而不能还原刃天青,也就不能产生荧光信号,所以,该系统特异性检测活性细胞。实验结果可用荧光计或分光光度计记录。
将相同数目的细胞接种到96孔板,每孔终体积为100μL,每组染料浓度接种3个孔,细胞密度为7×103cells/well,37℃,5%CO2条件下在细胞培养箱中培养24h。分别加入I-1染料的DMSO母液,使每组的染料终浓度为0μM(TCP)、0.01μM、0.1μM、1μM和10μM,室温下摇晃10s,在37℃的5%的CO2细胞培养箱中孵育24h后,将细胞从细胞培养箱中取出,分别向每个孔加入20μL的CellTiter-BlueTM,室温下摇晃10s后,在37℃的5%CO2细胞培养箱中孵育2h;用荧光计数仪(FL600,Bio-Tek)对有荧光的细胞进行计数,560EM/590EX记录荧光。此试验重复四次,进行统计学分析。从图7可以看出,结构式1染料浓度在10nM、24小时后细胞存活率IC50达到60%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途,不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料,对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下,还可以做出若干简单推理,得出本发明的化合物的其他应用用途,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
2.权利要求1所述的双苄基五甲川菁荧光染料,其特征在于,所述的R1和R2各自独立地选自C1-6的烷基。
3.权利要求2所述的荧光染料,其特征在于所述的X-优选卤素负离子。
5.权利要求4所述的方法,其特征在于所述的化合物II与化合物III的投料摩尔比是1∶0.4~0.6。
6.权利要求4所述的方法,其特征在于所述的碱选自醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、甲酸钠、丙酸钠、丙酸钾、草酸钠和草酸钾。
7.权利要求6所述的方法,其特征在于所述的化合物II与碱的投料摩尔比为1∶0.9~1.1。
8.权利要求4所述的方法,其特征在于所述的酸酐选自乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐和戊二酸酐。
9.权利要求1所述的双苄基五甲川菁荧光染料在线粒体荧光特异性标记中的应用。
10.权利要求9所述的应用,其特征在于所述的线粒体包括活细胞线粒体和固定细胞线粒体。
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