CN107418557B - 一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用 - Google Patents

一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用，所述七甲川吲哚菁类有机染料的结构式如下：

Description

一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用
技术领域
本发明涉及一种七甲川吲哚菁类有机染料在线粒体荧光成像中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
线粒体是细胞内非常重要的细胞器之一。它是真核生物进行氧化代谢的部位，是产生和释放能量的主要场所。此外，线粒体也负责调控包括细胞凋亡、钙离子平衡、自由基产生、细胞生长和分化在内的诸多生物学行为。近年来，大量研究表明线粒体功能异常与人类多种疾病的产生息息相关，而这种病理改变在细胞层面上通常表现为线粒体大小、数量和形态的变化。例如，阿兹海默症患者的细胞中线粒体数量会有所减少。因此，对线粒体进行成像观察在细胞生物学、病理学以及临床医学等领域都具有重要的意义。荧光成像技术由于其操作简便、成本低廉以及可多重标记等优势已经被广泛应用于细胞内线粒体成像。目前，商品化的线粒体荧光成像试剂包括MitoTracker系列、JC-1、Rhodanmine 123、Rhodanmine 6G、Tetramethylrosamine、CellLight线粒体荧光蛋白和DiOC6(3)等。但是，这些染料大多是绿色荧光探针，在实际染色过程中可能会存在信噪比较低和细胞自发荧光较强等问题，而红色荧光探针则能够有效克服这些缺点。此外，一些荧光探针在浓度较高的时候可能会将细胞的内质网等结构也染上色，从而会影响对线粒体的观察。因此，非常有必要开发出一种高信噪比且线粒体靶向效果稳定的红色荧光探针。
七甲川吲哚菁衍生物是一类新兴的近红外荧光分子，近年来被广泛应用于生物检测、荧光成像和癌症治疗等领域。另外，很多七甲川吲哚菁类分子本身就具有显著的线粒体靶向能力，能够长时间特异性地富集在细胞的线粒体中。目前已有报道将七甲川吲哚菁染料作为一类新型的线粒体探针。然而，这类染料所发出的荧光通常在近红外波段且荧光量子产率较低，而市面上大多数荧光显微镜都不具备观察近红外荧光的能力，同时近红外光也不利于人眼直接观察。因此，本领域迫切需要开发出一种具有红色荧光且荧光量子产率较高的七甲川吲哚菁染料来满足上述线粒体荧光成像的要求。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种免清洗的线粒体红色荧光探针。该染料具有良好的线粒体靶向效果，能够稳定地富集在线粒体中；同时，该染料具有较高的荧光量子产率，线粒体成像效果优异。
技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用，所述七甲川吲哚菁类有机染料的结构式如下：
所述七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针，能够实现线粒体的免清洗红色荧光成像。该染料具有极性依赖的荧光响应，即在水溶液中几乎不发出荧光，但在线粒体内的弱极性环境中能够发出强烈的红色荧光。
所述红色荧光的波段在580-660纳米。
所述七甲川吲哚菁类有机染料的合成方法如下所示：
具体制备方法如下：
步骤1：以甲苯作为溶剂，2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与溴化苄在氮气保护下避光反应，回流12小时；其中2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与溴化苄的摩尔比为1:1,所得反应产物经异丙醇重结晶得到化合物1；
步骤2：二氯甲烷作为溶剂，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应试剂和溶剂，环己酮与POCl3发生Vilsmeimer-Haack甲酰化反应，反应4小时；其中环己酮:POCl3:DMF的摩尔比为1:2.3:5.4；所得产物经乙酸乙酯重结晶得到化合物2；
步骤3：所得上述两种产物1和2与无水醋酸钠共溶于乙酸酐中，在70℃下氮气保护反应30分钟，冷却至室温后向溶液中加入二氯甲烷，并用饱和碳酸钠溶液进行洗脱；所得产物经硅胶柱层析分离得到目标分子3。
本发明所述的荧光探针具有极性依赖的荧光发射：在水溶液中，该分子的分散性较差，极易发生自聚集并导致荧光被淬灭；但在弱极性环境中，该分子的分散性得到改善，发出较强的红色荧光(量子产率大于43％)。该荧光探针与细胞孵育后能够靶向到线粒体，由于线粒体膜内部极性较低，因此该探针能够响应性地发出红色荧光，从而实现免清洗的线粒体红色荧光成像。此外，该荧光探针具有良好的稳定性，即使在较高浓度和较长孵育时间内也能够对线粒体进行特异性成像。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)免清洗成像：在对细胞染色后无需清洗即可直接进行观察，简化了染色步骤；
(2)红色荧光成像：相比于大多数市售的线粒体绿色荧光探针，红色荧光探针能够有效提高成像的信噪比，提高成像质量；同时较近红外荧光探针相比，红色荧光属于可见光波段，方便操作者直接进行观察；
(3)线粒体靶向效果优异：该染料属于七甲川吲哚菁衍生物，相比于其他多数线粒体荧光探针，该染料对线粒体具有更高的特异性，即使在浓度较高或长时间染色过程中依然稳定富集在线粒体中；
(4)荧光量子产率高：该染料在弱极性环境中的荧光量子产率大于43％，有效提高了线粒体成像效果；
(5)良好的安全性：该染料对细胞的毒性较低，在染色过程中不会影响细胞的活性。
附图说明
图1是本发明试剂在水和乙醇中的荧光光谱图。
图2是本发明试剂在不同浓度的脂质体溶液中的荧光光谱图。
图3是本发明试剂对人宫颈癌细胞的线粒体染色效果图。
图4是本发明试剂对其他细胞(人肺癌细胞、人正常肺细胞、人肝癌细胞和人正常肝细胞)的线粒体染色效果图。
图5是本发明试剂对人宫颈癌细胞的毒性评价结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
所述的线粒体荧光探针(以下称为IR825-Cl)合成过程如下：
步骤1：以甲苯作为溶剂，2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与溴化苄在氮气保护下避光反应，回流12小时；其中2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与溴化苄的摩尔比为1:1,所得反应产物经异丙醇重结晶得到化合物1；
步骤2：二氯甲烷作为溶剂，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应试剂和溶剂，环己酮与POCl3发生Vilsmeimer-Haack甲酰化反应，反应4小时；其中环己酮:POCl3:DMF的摩尔比为1:2.3:5.4；所得产物经乙酸乙酯重结晶得到化合物2；
步骤3：所得上述两种产物1和2与无水醋酸钠共溶于乙酸酐中，在70℃下氮气保护反应30分钟，冷却至室温后向溶液中加入二氯甲烷，并用饱和碳酸钠溶液进行洗脱；所得产物经硅胶柱层析分离得到目标分子IR825-Cl。
实施例2
测量实施例1所制得的IR825-Cl在水中和乙醇中的荧光光谱，其方法如下：
将IR825-Cl先溶于二甲亚砜，配制成50mg/mL的储存液，再将该储存液分别用水和乙醇稀释为10μg/mL的工作液。用荧光光谱仪对这两种溶液的荧光性质进行表征。结果见图1。
如图所示，实施例1所制得的IR825-Cl在水中几乎没有荧光，但在乙醇中时在610nm左右发出强烈的红色荧光。
实施例3
测量实施例1所制得的IR825-Cl在不同浓度的脂质体溶液中的荧光光谱，其方法如下：
将IR825-Cl先溶于二甲亚砜，配制成50mg/mL的储存液，再将该储存液用磷酸缓冲液(PBS)稀释为20μg/mL的工作液。称取棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)4mg，加入1mL PBS进行水化，随后利用超声的方法制备成POPC的脂质体溶液。将该脂质体溶液用PBS分别稀释成浓度为20,100和400μg/mL的溶液后，与上述IR825-Cl工作液等体积混合，配成最终样品。用荧光光谱仪对这三种样品的荧光性质进行表征。结果见图2。
如图所示，随着脂质体溶液的浓度增加，实施例1所制得的IR825-Cl的红色荧光也相应增强。
实施例4
观察实施例1所制得的IR825-Cl对人宫颈癌细胞的线粒体的染色情况，其方法如下：
将人宫颈癌细胞于8孔板中培养，24小时后，将IR825-Cl按浓度5μg/mL分散于DMEM完全培养基后加入8孔板(200μL/孔)，于37℃、5％CO2环境中孵育30分钟。随后用PBS清洗两次，加入商品化线粒体染色试剂罗丹明123继续孵育30分钟，再用PBS清洗两次，加入DMEM完全培养基。
共聚焦荧光显微镜成像观测：罗丹明123染色试剂在488nm的激发光下发出绿色荧光，IR825-Cl在552nm的激发光下发出红色荧光。结果见图3(a-d)。由图可见，IR825-Cl与罗丹明123的荧光几乎完全共定位，证明实施例1所制备的探针具有良好的线粒体成像效果。
实施例5
观察实施例1所制得的IR825-Cl对人肺癌细胞(A549)、人正常肺细胞(AT II)、人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞(L02)的线粒体的染色情况，其方法如下：
将上述4种细胞分别在8孔板中培养，24小时后，将IR825-Cl按浓度5μg/mL分散于DMEM完全培养基后加入8孔板(200μL/孔)，于37℃、5％CO2环境中孵育30分钟。随后用PBS清洗两次，加入商品化线粒体染色试剂罗丹明123继续孵育30分钟，再用PBS清洗两次，加入DMEM完全培养基。
共聚焦荧光显微镜成像观测：罗丹明123染色试剂在488nm的激发光下发出绿色荧光，IR825-Cl在552nm的激发光下发出红色荧光。结果见图4(a-l)。由图可见，IR825-Cl在上述4种细胞中的荧光与罗丹明123的荧光几乎完全共定位，证明实施例1所制备的探针对正常细胞和癌细胞都具有优异的线粒体成像能力，即该荧光探针具有良好的普适性。
实施例6
评价实施例1所制得的IR825-Cl的细胞暗毒性，步骤如下：将人宫颈癌细胞按5×104个/mL的密度接种于96孔板中，培养24小时后，再与不同浓度的IR825-Cl避光孵育24小时，最后利用MTT检测法评价光疗纳米制剂对人宫颈癌细胞的毒性，结果见图5。实验结果表明，该线粒体荧光探针在较高的浓度下也几乎没有细胞毒性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (2)

1.一种七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用，其特征在于，所述七甲川吲哚菁类有机染料的结构式如下：
所述七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针，能够实现线粒体的免清洗红色荧光成像，所述红色荧光的波段在580-660纳米。
2.根据权利要求1所述的七甲川吲哚菁类有机染料作为线粒体荧光探针的应用，其特征在于，所述七甲川吲哚菁类有机染料的合成方法如下所示：
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