CN106511337A - 一类七甲川吲哚花菁染料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种一类七甲川吲哚花菁染料的应用，所述一类七甲川吲哚花菁染料是以靶向蓄积于细胞线粒体内，实现细胞保护，增强机体组织修复再生功能的有机小分子。采用本发明所述的一类七甲川吲哚花菁染料对移植的干细胞进行预处理，或是直接用于机体创伤修复治疗，减轻炎症损伤。

Description

一类七甲川吲哚花菁染料的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一类线粒体靶向的七甲川吲哚花菁染料的应用。

背景技术

近年来，干细胞由于其自我更新和多向分化的潜能在再生医学中受到了越来越多的关注。尽管有许多成功的案例报道，但是对于移植细胞在治疗中所发挥的具体作用尚不完全清楚，所以目前对于干细胞移植治疗的临床应用仍然存在着很多的争议。由于移植后只有很少量的细胞能够在组织内定植存活，严重影响了细胞移植的治疗效果，因而当前干细胞移植治疗亟需解决的首要问题就是促进移植细胞在机体组织，尤其是受损组织中的定植和存活，从而改善和提高干细胞移植的临床治疗潜力。

在过去的几十年中，很多研究都在试图通过不同的技术或材料来预处理干细胞，从而改善和提升细胞移植治疗效果；此外，机体遭受创伤后，增强机体自身组织和细胞的自我修复，减轻创伤引起的机体生理功能减退也是当前创伤修复研究的重点。但是到目前为止，在某些创伤类型比如急性心肌梗死等，尚缺乏有效的治疗药物。

以往的研究已经证明，缺血-再灌注损伤、缺氧或炎症都会在病变组织处形成局部急性氧化应激微环境。此外，炎症反应与很多疾病的发生发展有着密切的关系，适度的炎症反应对机体是有利的，它可以清除异物、老化细胞等，但是过度的炎症反应则会造成机体不同程度的损伤。巨噬细胞是炎症反应中的关键细胞，它的不同表型在炎症反应的各个阶段有较大差异，这些差异使得巨噬细胞在抵抗病原微生物感染、肿瘤及免疫调节中发挥不同的功能。因此，在一定的信号刺激条件下，巨噬细胞的功能表型就会发生转变以适合当前的病理或生理需要。

综上所述，开发一种能够调控细胞线粒体功能，促进细胞在生物体内存活，增强损伤细胞和组织自我修复，减轻机体炎症损伤，恢复正常生理功能的小分子化合物具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一类七甲川吲哚花菁染料的应用。所述一类七甲川吲哚花菁染料是以靶向蓄积于细胞线粒体内，实现细胞保护，增强机体组织修复再生功能的有机小分子。采用本发明所述的一类七甲川吲哚花菁染料对移植的干细胞进行预处理，或是直接用于机体创伤修复治疗，减轻炎症损伤，与目前其它处理方法相比，更具有转化和应用前景。本发明所述一类七甲川吲哚花菁染料，为更好地研究、改善干细胞移植治疗效果和增强机体修复再生功能提供可行性。

实现本发明的技术方案是：

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗组织器官缺血缺氧性损害药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗炎症损伤的药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备细胞移植/治疗中增强细胞保护和抗损伤能力的预处理药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗炎症损伤的药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗脓毒症药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗促进创面愈合，减轻瘢痕形成的药物中的应用。

上述应用是通过调节细胞内抗氧化应激信号通路，提高细胞在病损部位有害微环境中的存活率，增强损伤细胞和组织自我修复，减轻机体炎症损伤来实现。

所述一类七甲川吲哚花菁染料具有以下结构通式：

其中，R₁为N-烷基侧链，包括对甲酸苄基、羟乙基、己酸基中的任意一种；X^－为溴离子、碘离子、氯离子、烷基磺酸根、四氟硼酸根、高氯酸根中任意的一种。

当N-烷基侧链R₁为对甲酸苄基,X为溴离子时，命名为化合物1；

当N-烷基侧链R₁为羟乙基,X为溴离子时，命名为化合物2；

当N-烷基侧链R₁为己酸基,X为溴离子时，命名为化合物3；

本发明所述一类七甲川吲哚花菁染料，通过对线粒体靶向的近红外七甲川吲哚花菁染料烷基侧链进行修饰，合成上述3种能够促进细胞抗氧化应激损伤，减轻炎症损伤，促进组织再生修复的小分子荧光化合物。作为一类靶向线粒体的小分子化合物，这类小分子化合物能够调控线粒体生理功能，减轻急性氧化应激对细胞造成的损害。这种保护作用是通过调节细胞内Nrf2和PI3K/Akt信号通路，增强细胞抗氧化应激损伤能力，从而提高细胞在病损部位有害微环境中的存活率，改善治疗效果。同时，此类小分子荧光化合物可以蓄积于机体内不同细胞，调控细胞功能，发挥减轻炎症损伤，促进组织修复与再生的功能。

本发明所述为一类七甲川吲哚花菁染料在体内外对细胞具有保护作用，同时增强机体组织修复再生的小分子荧光化合物在促进细胞抵抗病损微环境氧化应激损伤，增加细胞定植存活，改善细胞治疗效果以及在增强组织和细胞修复，减轻炎症损伤，维持机体生理功能中的应用。

本发明所述一类七甲川吲哚花菁染料，具有细胞线粒体靶向蓄积、调控线粒体功能促进细胞抗氧化应激损伤、调控巨噬细胞减轻炎症损伤、促进机体组织修复与再生等多功能活性。申请人的实验结果表明，所制备的小分子荧光化合物，可实现干细胞移植治疗的细胞保护，减轻炎症损伤，增强病损部位组织细胞修复再生能力的作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的实质性内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1为本发明实施例2的化合物1-3对人脐带间充质干细胞的促增殖作用；

图2为本发明实施例3的化合物1蓄积于人脐带间充质干细胞的线粒体；

图3为本发明实施例4的化合物1对人脐带间充质干细胞的毒性作用；

图4为本发明实施例6的化合物1对过氧化氢损伤细胞活力的保护情况；

图5为本发明实施例7的化合物1对γ射线减弱细胞成集落能力的保护情况；

图6为本发明实施例9的化合物1对复合伤动物模型促进创面愈合，减轻瘢痕形成情况；

图7为本发明实施例10的化合物1对急性心肌梗死动物模型改善心脏功能，减小心梗面积情况。

图8为本发明实施例11的化合物1减轻LPS刺激巨噬细胞产生炎症因子的情况。

图9为本发明实施例12的化合物1对提高脓毒症小鼠生存率的情况。

具体实施例

实施例中所采用的试剂与仪器：

除了试剂二氯甲烷、甲醇、DMF、POCl₃、三乙胺需经过蒸馏纯化与干燥处理以外，其他所涉及的化学试剂和溶剂购买于s igma-aldrich或阿拉丁等试剂公司并直接使用；

所有反应均处于氩气及避光保护条件下进行，且硅胶薄层层析监测至反应结束。

硅胶薄层层析使用烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂所生产的高效薄层层析硅胶板(型号CF-254)，采用254nm荧光下直接检测或采用磷钼酸、茚三酮、溴甲酚绿、碘显色等官能团显色剂进行检测。

柱层析用于染料分子的最终纯化，采用烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂生产的层析硅胶(10－40μ)。层析用有机溶剂均为分析纯，且经过重蒸干燥处理。

所有化合物¹H NMR和¹³C NMR由美国Varian公司生产的Mercury Plus-400核磁共振谱仪测定，TMS作内标，未经特殊说明，均用CDCl₃作溶剂，δ值单位为ppm。

质谱由HP5989A型质谱仪测定，IR由Testscan Schimadzu FTIR 8000 series测定。

细胞培养使用美国Thermo Fisher公司CO₂细胞培养箱(型号HERAcell 150i)。

细胞活力使用日本Dojindo公司CCK-8试剂，并用美国Thermo Fisher公司全波长酶标仪(Multiskan GO，型号1510)在450nm波长处检测。

小分子细胞线粒体定位使用德国Leica公司激光共聚焦显微镜(型号TCSSP5)检测，检测条件为激发光633nm，发射光7 80nm。

免疫组化实验使用日本Olympus公司荧光显微镜(型号BX51)观察实验结果。

大鼠心脏功能使用加拿大VisualSonics公司超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统(型号2100)测定。

实施例1化合物1-3的合成

制备步骤如下：

2-氯-3-羟甲烯-1-甲酰基环己烯的制备

在冰浴下将35mL干燥二氯甲烷和37mL三氯氧磷的溶液滴入80mL干燥二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰(1:1，v/v)的混合液中。维持0℃下，10g(0.10mol)环己酮逐滴加入至反应液，然后缓慢升温至回流反应3h。停止反应，冰水浴冷却，将反应液分批倒入200g碎冰中。大量红色固体析出。减压过滤，固体以冰冻的丙酮分批少量洗涤至黄色，真空抽干得粗品，用丙酮重结晶得黄色固体12.86g，收率：73％，熔点：130-132℃。¹H NMR：¹H NMR(400MHz,DMSO-d):1.573(m,2H,5-CH2),2.351(t,4H,4,6-CH2),3.347(s,2H,3-CH2OH),10.851(s,1H,1-CHO).

含不同氮烷基侧链的吲哚季铵溴盐的制备

反应器中加入2,2,3-三甲基-3H吲哚,1,2-邻二氯苯和不同含溴烷基或芳香基，于110℃下反应12h。停止反应，冷至室温，静置10小时。体系析出大量黄棕色固体，抽滤，用丙酮反复洗涤滤饼至灰白色固体。粗品不需继续纯化，可以直接进行下步反应。

含不同氮烷基侧链的化合物1-3制备

取7.75×10^-3mol不同季铵盐加入100ml单口圆底瓶中，加入0.67g(3.87×10^{- 3}mol)2-氯-3-羟甲烯-1-甲酰基环己烯,加入0.66g(7.75×10^-3mol)醋酸钠，加入40m l乙醇，搅拌，回流反应1h,取样TLC监控反应(二氯甲烷：甲醇＝15:1)，显示原料反应完全，将反应液转移至分液漏斗中，用饱和NaCl溶液洗涤，无水NaSO₄干燥，过滤，减压浓缩得红棕色液体，用二氯甲烷-乙醚粗略重结晶得红棕色固体，柱层析得绿色固体化合物1-3:

化合物1：¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ：8.26(d，J＝14.4Hz，2H)，7.94(d，J＝8.0Hz，4H)，7.69(d，J＝7.6Hz，2H)，7.40(t，J＝7.2Hz，8H)，7.33-7.28(m，2H)，6.38(d，J＝14.0Hz，2H)，5.63(s，4H)，2.53-2.50(m，4H)，1.73(s，14H)；HRMS[M-Br]⁺：calc.723.2984，measured723.2882。

化合物2：¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ：8.24(d，J＝14.0Hz，2H)，7.62(d，J＝7.6Hz，2H)，7.45-7.39(m，4H)，7.29-7.25(m，2H)，6.42(d，J＝14.0Hz，2H)，5.10(s，2H)，4.29(s，4H)，3.80(d，J＝4.4Hz，4H)，2.68(d，J＝5.6Hz，4H)，1.84(s，2H)，1.68(s，12H)；HRMS[M-Br]⁺：calc.543.2773，measured543.2763。

化合物3：¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：d 1.557(m，4H)，1.706(s，12H)，1.766(m，4H)，1.856(m，4H)，2.008(s，2H)，2.484(s，4H)，2.738(s，4H)，4.120(t，4H)，6.216(d，2H)，7169-7.413(m，8H，Ar-H)，8.325(d，2H)。¹³CNMR(400MHz，DMSO-d6)：d 174.223，172.180，171.925，147.948，147.930，142.004，141.021，128.598，126.156，125.134，122.478，111.489，101.573，48.945，43.629，33.402，27.434，26.680，25.788，25.597，24.123，20.971，20.339。HRMS[M-Br]⁺：calc.683.3616，measured 683.3610。

实施例2细胞增殖实验：

细胞株选用原代分离培养的人脐带来源的间充质干细胞(hUCMSCs)，以含细胞生长因子的人脐带间充质干细胞培养基(瑞士Lonza公司)于37℃，5％CO₂条件下培养，2天更换一次培养液。取生长良好，达70-80％融合的细胞，消化接种于96孔板(1×10⁴/孔)中培养过夜。然后向细胞中分别加入10μM小分子化合物1-3于37℃，5％CO₂条件下孵育30分钟。弃去染液，用PBS洗三次后，用100μL的新鲜培养基培养72h。采用CCK-8试验检测细胞相对活力。结果显示，与正常细胞相比，上述三种小分子化合物均对细胞有明显的促增殖作用(图1)。

实施例3细胞线粒体定位：

细胞株选用原代分离培养的人脐带来源的间充质干细胞(hUCMSCs)，以含细胞生长因子的人脐带间充质干细胞培养基(瑞士Lonza公司)于37℃，5％CO₂条件下培养，2天更换一次培养液。取生长良好，达70-80％融合的细胞，消化离心后接种于激光共聚焦小皿中，培养过夜。次日弃去培养基，于培养皿中分别加入浓度为10μM、体积为1mL的化合物1，于37℃，5％CO₂条件下孵育20分钟。弃去染液，以PBS缓冲液漂洗三次，以浓度为100nM的线粒体探针Mito-Tracker Green或10μM的rhodamine 123孵育细胞，作用15分钟。弃去染液，以PBS缓冲液漂洗三次，以浓度为5μg/ml的Hoechst 33342复染细胞核10分钟。弃去染液，以PBS缓冲液漂洗三次后于Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜下观察NIRCP-61的荧光信号与Mito-Tracker Green或rhodamine 123的荧光信号的重叠情况。结果表明，NIRCP-61在体外培养条件下可被间充质细胞高效摄取，显示出很强的红色荧光信号；红色荧光信号可与来自线粒体的绿色荧光信号完全重合，证实化合物进入细胞后，主要分布于细胞线粒体内(图2)。

实施例4细胞毒性实验

将hUCMSCs接种于96孔板(1×10⁴/孔)中培养过夜。然后向细胞中分别加入2.5、5、10、20、40、80、160μM小分子化合物1于37℃，5％CO₂条件下孵育30分钟。弃去染液，用PBS洗三次后，用100μL的新鲜培养基培养72h。采用CCK-8试验检测细胞相对活力。结果显示，与正常细胞相比，80μM以下浓度小分子化合物1不会对细胞产生明显的毒性作用，且在10μM、20μM浓度时对细胞有明显的促增殖作用(图3)。

实施例5细胞分化实验

将hUCMSCs接种于12孔板(1×10⁵/孔)中培养过夜。然后向细胞中分别加入20μM小分子化合物1于37℃，5％CO₂条件下孵育30分钟。弃去染液，用PBS洗三次后，用新鲜培养基培养至细胞长满培养板底部80％。弃去原培养基，分别使用人脐带间充质干细胞成骨诱导培养基和人脐带间充质干细胞成骨诱导培养基进行诱导分化培养4周。分别使用茜素红和油红O对形成的骨结节和脂肪滴进行染色观察。结果显示，与正常细胞相比，20μM小分子化合物1处理细胞不会改变细胞正常的分化能力。

实施例6细胞活力试验

将hUCMSCs接种于96孔板(1×10⁴/孔)中培养过夜。然后向细胞中分别加入0、10、20μM浓度的化合物1于37℃，5％CO₂条件下孵育30分钟。弃去染液，用PBS洗三次后，用100μL的新鲜培养基培养48h。用400μM H₂O₂处理12小时后，采用CCK-8试验检测细胞相对活力。结果显示，与对照组细胞相比，小分子化合物1处理过的细胞能够明显减少H₂O₂处理引起的细胞活力降低(图4)。

实施例7集落形成试验

将化合物1处理后的hUCMSCs接受不同照射剂量γ射线照射，照射后，细胞重新接种于6孔培养板(1×10³/孔)培养14天，直到集落清晰可见。4％多聚甲醛固定后使用0.5％结晶紫染色，计数超过50个细胞的单个集落数，计算生存率。结果显示，使用小分子化合物1预处理过的细胞在受辐照后的集落形成能力明显强于对照组细胞(图5)。

实施例8γ-H2AX形成试验

小分子化合物1处理后的hUCMSCs接种于盖玻片上，培养2天后进行γ射线照射(5Gy)。分别于照射后不同时间点用4％多聚甲醛固定细胞，1％triton溶液处理后山羊血清封闭30分钟，γ-H2AX抗体4℃孵育过夜，山羊抗鼠荧光二抗37℃避光孵育2小时，DAPI复染细胞核后用荧光显微镜采集图像观察γ-H2AX形成情况。结果显示，与对照组细胞相比，小分子化合物1处理能够明显减少辐照引起的细胞核内γ-H2AX的形成。

实施例9复合伤动物试验

将eGFP⁺hUCMSCs和经小分子化合物1处理过的eGFP⁺hUCMSCs分别用PBS重悬，制备成细胞悬液待用(浓度为1×10⁷/mL)。对3周龄SD大鼠进行γ射线照射(5Gy)，照射后在大鼠背部造1cm²大小创面，形成照射复合伤动物模型。动物造模后经尾静脉分别给动物注入200μL PBS或200μL细胞悬液，观察不同治疗组动物创面愈合情况。结果显示，与对照组和未经小分子化合物1处理的细胞相比，小分子化合物1预处理的细胞移植后在大鼠创面处定植存活的更多，创面愈合速度(a)更快，愈合后形成的瘢痕(b)也更薄(图6)，表明小分子化合物1预处理能够改善细胞移植治疗的效果，提高创伤愈合的速度和质量。。

实施例10心肌梗死动物试验

对8周龄雄性SD大鼠施行冠状动脉左前降支结扎术，形成急性心肌梗死动物模型。动物造模1小时后分别于经尾静脉注射100μL PBS或100μL小分子化合物1溶液(浓度为0.2mM)，4周后观察不同治疗组动物心梗治疗情况。结果显示，与正常大鼠相比，施行冠状动脉左前降支结扎术造成急性心肌梗死的大鼠心功能较差，有明显梗死区域产生，左心室扩大。但是与注射PBS的对照组相比，小分子化合物1处理组动物心脏左心室射血分数(a)明显改善，心肌梗死面积(b)明显较小，且左心室内径(c)扩大程度也明显减小(图7)。

实施例11巨噬细胞炎症因子释放实验

细胞株选用巨噬细胞Raw264.7，使用DMEM高糖培养基于37℃，5％CO₂条件下培养。待细胞达50％融合时，弃去原培养基，用10μM的小分子化合物1处理细胞30min，PBS洗三次后换新鲜DMEM高糖培养基继续培养48h。换用含LPS(1μg/ml)的DMEM高糖培养基刺激细胞24h，提取巨噬细胞总RNA进行Real-Time PCR检测炎症相关因子IL-6和TNF-α的表达量。以正常培养的巨噬细胞为正常组，单独使用含LPS培养基刺激后的巨噬细胞为对照组。实验结果显示，LPS刺激使得巨噬细胞大量表达炎症相关因子IL-6和TNF-α，而预先使用小分子化合物1处理过的巨噬细胞经LPS刺激后IL-6(a)和TNF-α(b)的表达量显著低于对照组，表明小分子化合物1处理可以减少巨噬细胞释放炎症因子，从而减轻炎症反应(图8)。

实施例12脓毒症小鼠生存实验

将20只C57BL小鼠称重，采用随机分组的方法随机分为对照组和小分子化合物1处理组，每组10只。将小分子化合物1用PBS调节浓度为10μM，对小分子化合物1处理组小鼠腹腔注射化合物1溶液(100μL/只/日)进行预防。三天后，将两组小鼠采用盲肠结扎穿孔脓毒症模型制作方法建立脓毒症模型。小鼠术后，每日观察小鼠的各项生命体征，记录各组小鼠死亡情况，建立生存曲线。实验结果显示，对照组小鼠在术后第3～5天迅速死亡，到第5天全部死亡，小分子化合物1处理组小鼠在建模后死亡数量较少，7天生存率为33.3％，证明小分子化合物1腹腔注射能够有效减轻脓毒症小鼠的炎症反应，提高小鼠生存率(图9)。

Claims (8)

1.一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗组织器官缺血缺氧性损害药物中的应用。

2.一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗炎症损伤的药物中的应用。

3.一类七甲川吲哚花菁染料在制备细胞移植/治疗中增强细胞保护和抗损伤能力的预处理药物中的应用。

4.一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗脓毒症药物中的应用。

5.一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

6.一类七甲川吲哚花菁染料在制备治疗促进创面愈合，减轻瘢痕形成的药物中的应用。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述应用是通过调节细胞内抗氧化应激信号通路，提高细胞在病损部位有害微环境中的存活率，增强损伤细胞和组织自我修复，减轻机体炎症损伤实现的。

8.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述一类七甲川吲哚花菁染料具有以下结构通式：

其中，R₁为N-烷基侧链，包括对甲酸苄基、羟乙基、己酸基中的任意一种；X^－为溴离子、碘离子、氯离子、烷基磺酸根、四氟硼酸根、高氯酸根中任意的一种，

1)当N-烷基侧链R₁为对甲酸苄基,X为溴离子时，其结构式为化合物1；

2)当N-烷基侧链R₁为羟乙基,X为溴离子时，其结构式为化合物2；

3)当N-烷基侧链R₁为己酸基,X为溴离子时，其结构式为化合物3。