CN108603169A - 来自成体干细胞的诱导型起搏细胞和浦肯野细胞 - Google Patents

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Abstract

通过SHOX2>TBX5>HCN2的顺序激活，将成体干细胞重新编程以形成起搏细胞和浦肯野细胞。这些浦肯野细胞自发地围绕更大的起搏细胞并与这些起搏细胞连接，从而形成诱导型窦房体，所述诱导型窦房体产生趣味电流并且可以以类似于自然窦房结的方式使心血管组织搏动。

Description

来自成体干细胞的诱导型起搏细胞和浦肯野细胞
先前相关申请
本申请涉及于2015年12月28日提交的U.S.14/980,274“Induced Pacemaker andPurkinje Cells from Adult Stem Cells”，其全部内容出于所有目的并入本文。
公开领域
本发明涉及用于产生用于治疗心律失常的非收缩的、电活性的诱导心肌细胞的方法，以及用于增强心脏电活动的细胞的诱导产生和形成，例如由此产生并用于此目的的心脏的窦或窦房结细胞和浦肯野细胞。
背景技术
心脏(图1A)是将血液泵送通过循环系统的血管的肌肉器官。在由右心房和左心房以及右心室和左心室组成的健康的哺乳动物心脏中，因为心脏瓣膜防止回流，所以血液仅一个方向流经心脏。心脏被包围在保护囊，心包中，其也包含少量液体。心脏壁由三层组成：心外膜、心肌和心内膜。
窦房结(sinoatrial node)(通常缩写为SA结或SAN；通常也称为窦房结(sinusnode)，不太常见的是窦房结(sinuatrial node))是心脏的起搏点，并负责心跳的起始。它位于上腔静脉和心房的交界处，尺寸约为5毫米×2厘米。它自发地产生一个电脉冲，在整个心脏传导之后，导致心脏收缩。虽然电脉冲是自发产生的，但脉冲的速率(以及因此的心率)由支配位于心脏的右心房(上腔室)中的窦房结的神经来修改。
房室(AV)结是协调心腔收缩的心脏电传导系统的一部分。它将心房和心室电性连接(图1B)。AV结是心房和心室之间的专门组织区域，特别是在冠状窦开口附近的房间隔的后下部区域，其将正常电脉冲从心房传导到心室。AV结相当紧凑(约1x 3x 5毫米)。它位于科赫三角形的中心-由三尖瓣隔膜瓣、冠状窦和房间隔的膜部分包围的三角形。
AV结的远端部分被称为希氏束。希氏束在室间隔中分裂成两个分支，左束支和右束支。左束支激活左心室，右束支激活右心室。两个束状分支逐渐缩小以产生许多浦肯野纤维，这些纤维刺激个别心肌细胞群收缩。
趣味电流(或趣味通道，或If或IKf，或起搏电流)是指心脏中的特定电流。在20世纪70年代后期首次在浦肯野纤维和窦房结肌细胞中描述，心脏起搏“趣味”电流已被广泛表征，并且其在心脏起搏中的作用已被研究。
趣味电流在自发活动的心脏区域高度表达，如窦房结、房室结和传导组织的浦肯野纤维。趣味电流是一种混合钠-钾电流，其在舒张压范围(通常从-60/-70mV到-40mV)的电压下超极化时激活。当在窦房结动作电位结束时，膜在低于If阈值(大约-40/-50mV)时复极化，趣味电流被激活并且提供向内电流，其负责开始舒张性除极相(DD)。通过这种机制，趣味电流控制窦房肌细胞的自发活动率，从而控制心率。
起搏电流的分子决定因素属于超极化激活的环核苷酸门控通道家族(HCN)，其中4种亚型(HCN1-4)迄今已知。基于它们的序列，HCN通道被分类为电压门控K+(Kv)和环核苷酸门控(CNG)离子通道超家族的成员。
简而言之，控制心跳的电信号可以描述如下。电脉冲开始于SA结。电活动通过心房的壁传播并导致它们收缩。这迫使血液进入心室。AV结的功能就像是一个能够在电信号进入心室之前减缓电信号的门。这种延迟使心房有时间在心室之前收缩。经过这段延迟时间后，刺激发散，并通过左右希氏束传导至心脏各侧的相应浦肯野纤维，以及心脏心尖处的心内膜，最后传导至心室外膜。希氏-浦肯野纤维网络将脉冲发送到心室的肌肉壁并使其收缩。这迫使血液从心脏流向肺部和身体。SA结触发另一个脉冲，循环再次开始。
心脏会出现许多问题而导致不规律的跳动。病窦综合征-也称为窦房结疾病或窦房结功能障碍-是一组心脏节律问题(心律失常)的名称，其中窦房结-心脏的自然起搏点-无法正常工作。
人造心脏起搏器是一种医疗设备，它使用由使心脏肌肉去极化的电极来传递的电脉冲来调节心脏的跳动。人造心脏起搏器的主要目的是保持充足的心率，或者是因为心脏的自然起搏点不够快，或者是因为心脏的电传导系统存在阻塞。现代起搏器可以在外部进行编程，并允许心脏病专家为个别患者选择最佳起搏模式。有些将起搏器和除颤器结合在一个植入式设备中。其他具有刺激心脏内不同位置的多个电极以改善心脏的较高(心房)和较低心腔(心室)的同步。
虽然人造起搏器挽救了许多生命，但它们并不是完美的解决方案。特别是，它们不具有激素响应性，会受到机械和/或电气故障，需要更换，电池并且可能在强磁场或治疗性辐射环境中被破坏。此外，感染始终是危险因素，心脏起搏器介导的心动过速、次优房室(AV)同步以及其他几种类型的起搏器诱发的心律失常也是危险因素。因此，目前正在努力开发更自然的起搏器。
生物起搏器通常用作能够在静默组织中诱导自发活动的细胞底物，这是一种克服电子起搏器限制的潜在工具。开发自然起搏器以代替人造心脏起搏器的努力通常采取两种方法之一。
一种方法是通过遗传操作(即直接重编程)将搏动心肌转换成起搏细胞。在这方面，早期关键转录因子TBX3提供了有希望的结果，但是产生具有不完整起搏特征的细胞。
另一种方法是使用已编程形成起搏细胞的胚胎或诱导多能干细胞(所谓的IPS细胞)，然后用这些新编程的AV样细胞替换或补充AV细胞。
在一项研究中，Jung等人试图通过诱导多能干细胞(iPSC)中的TBX3的上调来产生起搏细胞。Hashem等人(2013)指出SHOX2调节拟胚体中的起搏点基因程序。Bakker等人(2012)试图通过上调TBX3将终末分化的心肌细胞重编程为起搏细胞。在另一项研究中，Kapoor等人(2013)试图通过在成人心肌细胞中过表达TBX18来产生起搏细胞。Hu等人(2014)试图通过上调Tbx18将心肌细胞转化为起搏细胞。
尽管过去曾多次试图产生心脏起搏细胞，但迄今为止还没有来自未分化的成体自体干细胞的正确的功能性生物起搏细胞可用于临床应用。以前只证明胚胎细胞或IPS细胞等细胞可以通过操纵某些基因来诱导以获得一些特征，这些特征存在于起搏点或心脏传导系统的其他细胞中。单独一个转录因子的表达不能开启转换为起搏或浦肯野细胞的完整的相应调控分化途径。过去产生起搏细胞的尝试未能模拟自然心脏起搏细胞的适当生理功能和形态特性。
本文所述的工作使该研究进入新的和更高的状态：诱导来自患者自身组织的成人未修饰的新鲜未培养细胞(本文也称再生细胞)分化成具有自然起搏和浦肯野细胞的形态和功能结构和特征的非收缩性心肌细胞，这一成果以前尚未实现。
发明概述
本文描述了诱导起搏细胞、浦肯野细胞和由其缔合产生的窦房体，以及制造和使用它们的方法。
使用基于慢病毒和基于mRNA的转染方法，脂肪来源干细胞(ADSC)已经通过各自连续应用包括SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的转录因子的组合而重新编程为心脏起搏细胞。
SHOX2是SA结中的NKX 2.5的负性调节因子，其抑制收缩性心肌细胞分化途径，但是通过上调起搏点分化途径来特异性地将原始的相应祖细胞朝向非收缩性心肌细胞起搏细胞谱系引导。TBX3、TBX5和TBX18是调节原始中胚层来源的干细胞向起搏细胞谱系分化和SAN形成的主要转录因子。
在组织发育晚期阶段，成熟起搏细胞不同于常见心肌细胞，因为存在自发性去极化过程，这是由不稳定的第4阶段电位引起的，其在心动周期的舒张阶段期间逐渐降低膜电位。当降低达到临界阈值时，钠通道打开并引起动作电位。起搏细胞的自发舒张性去极化归因于超极化激活的环核苷酸门控(HCN)通道基因，其编码特定蛋白质，提供被称为If或趣味电流的内向电流的存在。据信HCN2的表达对于起搏细胞的适当生理功能是重要的，但有可能其他HCN基因可以替代或补充HCN2。
下面更详细地描述本发明。
起搏点重编程基因
SHOX2(UniProt O60902)，又名矮小同源框2或SHOT，被确定为与人类矮小同源框基因(SHOX；312865)和小鼠og12基因相关的基因。最初的发现者表明，SHOX2与SHOX相比，与og12具有更高的同源性。分离出两种不同的亚型，分别称为SHOTa和SHOTb，它们具有相同的同源结构域，并共享颅面表达同源域蛋白质的C端14个氨基酸残基基元特征。SHOTa和SHOTb之间的区别在N末端和C末端的可变剪接外显子。在阶段性小鼠胚胎的切片上og12的原位杂交在发育性静脉窦(主动脉)，女性生殖器，间脑、中脑和髓脑，鼻囊，腭，眼睑和四肢中检测到高度限制性转录物。亚型1是330个氨基酸并含有同源框DNA结合结构域。
TBX5(UniProt Q99593)，又名T-BOX-5，跨越9个外显子和超过47kb，并且该蛋白质的突变导致Holt-Oram综合征，这是一种影响心脏和四肢的发育障碍。研究人员发现，过表达野生型TBX5的P19CL6细胞系开始较早地搏动并且比亲本P19CL6细胞更多地表达心脏特异性基因，而表达G80R突变(601620.0004)的细胞系没有分化成搏动的心肌细胞，该G80R突变导致严重的心脏缺陷和HOS中的轻微骨骼异常。相反，导致上肢畸形而不导致心脏异常的R237Q突变(601620.0003)在与野生型TBX5相似的程度上激活Nppa启动子。亚型1是558个氨基酸。
代替TBX5或除TBX5之外，TBX3(UniProt O15119)可用于本文所述的方法中。TBX3，又名T-BOX-3，与TBX5一起在研究与Holt-Oram综合征的联系时被发现。存在替代转录的TBX3转录物，其中包括1种中断T-box的转录物。TBX3基因的完整开放阅读框编码预测的723个氨基酸的蛋白质。其他T-box基因与TBX3的比较表明在DNA结合结构域外具有基本同源性的区域。
除了参与肢体模式形成之外，TBX3还参与起搏点发育。使用遗传谱系分析、敲除研究和外植体测定，发现需要TBX18(OMIM 604613)来从间充质前体建立小鼠窦房结的大头结构。随后，TBX3诱导起搏功能的起搏基因表达。它也被用于提高诱导多能干(iPS)细胞的质量。
TBX18(UniProt O95935)也可用于本文所述的方法中。TBX18或T-BOX-18作为参与多种组织和器官发育过程的转录抑制因子，包括心脏和冠状血管、输尿管和脊柱。这对于窦房结(SAN)头部区域的胚胎发育是必需的。作为这个家族的典型代表，有几个外显子(8)，至少4个转录物，全长蛋白质是607个氨基酸。
HCN2(UniProt Q9UL51)，又称超极化激活的环核苷酸门控钾通道2和脑环核苷酸门控2；BCNG2被认为是起搏点离子通道之一。HCN2基因含有跨越约27kb的8个外显子，并且像所有通道一样，它以889个氨基酸是相当大的，具有至少6个跨膜结构域。这种超极化激活的离子通道表现出较弱的超过钠离子的针对钾的选择性，并且促成心脏中的原生(趣味)起搏电流(If)。
方法概述
一般来说，我们使用成人未培养和最初未修饰的脂肪组织来源的再生细胞，其包括非常早期的多能干细胞和祖细胞。使用来自同一患者的自体细胞是优选的，其需要修复其心脏的心律失常(心动过缓或心动过速)。
用编码SHOX2、TBX5和HCN2，或SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的顺序表达载体转染这些细胞，使得每个基因以顺序和有组织的方式转录，导致产生功能性蛋白质。
脂肪组织来源的干细胞的使用仅是示例性的，并且可以使用任何合适的再生细胞制剂。再生细胞制剂例如包括来自骨髓、脐带组织、脐带血、胎盘、血液或身体的任何其他组织的细胞，所述其他组织例如毛根或网膜脂肪，其含有血管，并因此含有能够用本申请中描述的方法诱导产生起搏细胞的早期干细胞。这个可能的细胞列表仅仅是示例性的而不是详尽的。
根据我们的经验，蛋白质应该按照特定的顺序和数量顺序引入细胞(图2)。试图一次转染所有基因杀死大部分细胞。但是，通过更好的引入系统，细胞可能不会受冲击并可能存活。然而，激活顺序预计仍然很重要，表达的水平也是如此。
这里使用的载体是慢病毒载体，然而，这仅仅是示例性的，并且可以使用任何表达载体。或者，可以使用RNA或者甚至完整的功能性蛋白质。
DNA、RNA和蛋白质可以各种方式引入细胞，包括例如显微注射、电穿孔和脂质介导的转染。也可使用例如HIV-1-tat蛋白的tat融合物将RNA递送至细胞。Tat已成功用于蛋白质递送。例如，细胞穿透肽TAT的四甲基罗丹明标记二聚体dfTAT通过高效地从内体逃逸而穿透活细胞。其他细胞穿透肽(CPP)是已知的，事实上完整的蛋白质可以使用CPP作为融合蛋白以及通过非共价CPP/蛋白质复合物来递送。
目前，逆转录病毒是基因疗法(逆转录病毒和慢病毒)的首选，目前已用于超过350种基因治疗研究。逆转录病毒载体由于转移的转基因的长期和稳定表达而特别适合于细胞的基因校正，并且也因为它们的克隆和生产所需的努力很少。然而，预计下一代载体将继续被开发，其可以同样用于诱导起搏细胞的目的。
此外，随着基因组工程技术(如CRISP/CAS等)的出现，未来还可能通过基因组工程选择性地激活所需的蛋白质，而不是通过细胞传递DNA、RNA或蛋白。选择性表观遗传学改变(例如，改变甲基化模式)在将来也可能是可能的，但目前是不切实际的。
尽管本文可以使用许多不同的成体多能干细胞来源，但本发明的一个重要方面在于产生用于治疗人类窦病综合征和其他心律失常的细胞。干细胞的优选来源是自体细胞，例如来自需要修复心律失常的相同患者的脂肪组织来源的再生细胞。优选脂肪组织，其含有大量这些早期多能细胞，这些细胞能够经历适当的顺序诱导以形成非收缩的但电特异的细胞，例如起搏细胞和浦肯野细胞，其联合形成窦房体。脂肪组织很容易从患者身上获得，而不会产生与汲取骨髓源相关的不适或使用同种异体细胞，从而排除任何排斥问题。未来，当越来越多的患者存储例如脐带血和/或脐带或胎盘来源的干细胞等时，在匹配的同种异体移植过程中可能优选其他类型的干细胞，但是当前，目前为数不多的患者可获得这些资源。
到目前为止没有人能够使用未培养或培养的成体(即非胚胎和非iPS)干细胞来产生诱导窦房结细胞，这些细胞在形态学水平和功能水平上均显示起搏细胞的特征。这些细胞的使用代表了超过胚胎干细胞的巨大优势，因为它们可以是自体的，消除排斥问题，并且容易获得，这与胚胎干细胞不同。此外，诱导多能干(iPS)细胞可能并不安全-最近的一些报道表明这些细胞接近癌细胞。
同种异体细胞也可能是合适的，尽管如果HLA模式不匹配通常需要免疫调节药物。然而，目前这些细胞已被使用，随着越来越多的库收集和储存脐带血、脐带组织干细胞等以及由此产生的干细胞，将来可能更适合于使用，特别是在数百个和数千个不同的HLA模式可以被收集并进行冷冻保存，以便匹配同种异体移植的可能性增加时更是如此。或者，可以预先产生诱导起搏细胞/浦肯野细胞文库，因此在需要时，这些细胞可以容易地用于移植。
此外，我们已经使用人类野生型基因描述了本发明，但是可以使用适合于物种的其他来源。密码子优化也可以被执行以优化表达。
本发明包括以下一个或多个实施例，这些实施例呈其任何组合形式：
如本文所用，“诱导型窦房体”由重编程干细胞组成，所述重编程干细胞已被诱导形成起搏和浦肯野细胞，所述起搏和浦肯野细胞然后缔合以形成功能互连并产生诱导型窦房体，其产生趣味电流并可诱发心脏跳动。起搏和浦肯野细胞的功能互连和电生理学特性与特定细胞膜连接和离子通道的表达有关；特别是在心脏传导细胞方面，包括CX30.2和HCN4(图10、11)。
如本文所使用的，起搏细胞是具有几个蜘蛛状突起的较大的主要圆形(>50μm)细胞，其具有自发去极化的能力(图7、8)。
如本文所用，“浦肯野细胞”是小的(在主细胞体的直径上<20μm)细胞，其彼此形成特定链并自发地将其自身定位在链和通道中，将围绕起搏细胞并与起搏细胞形成互连(图7、8、9)。
如本文所用，“诱导”干细胞中某些基因的表达并不意味着任何特定的方法学，并且不限于使用诱导型启动子。相反，可以使用开启基因表达的任何手段，包括使用表达载体，裸DNA或RNA或蛋白质，诱导的表观遗传变化等。它不包括那些已经证明了所述基因/蛋白质表达的自然细胞，但是仅仅是已经被人类重新编程来实现这一结果的干细胞。
如本文所用，“干细胞”或“再生细胞”包括多潜能干细胞和多能干细胞，以及可成功重编程以便分化成本文所述细胞类型的其他类型的细胞。这些细胞尚未分化，或已被去分化，因此有可能形成所有细胞类型或多种细胞类型。
“成体干细胞”通常是来自非婴儿的多能干细胞，并不意味着供体的任何特定年龄。也被称为体干细胞，它们可以在儿童以及成人身上找到。
如本文所用，“自体”是指来源于患者或遗传上相同的患者的细胞。“同种异体”是指来源于同一物种但具有不同基因型的细胞。
除非上下文另外指出，否则在权利要求书或说明书中的单词“一个/种(a/an)”当结合术语“包含”使用时意指一个或多于一个。
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本文使用以下缩略语：
缩写 术语
αMEM 具有Earles平衡盐的MEM
ADST 脂肪来源的干细胞
cDNA 复制DNA
DNA 脱氧核糖核酸
EKG 心电图，也称为ECG
FBS 胎牛血清
MEM 极限必需培养基
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PCR 聚合酶链反应
qPCR 定量PCR
RNA 核糖核酸
SAN 窦房结
附图说明
图1A.心脏解剖：横截面心脏解剖图，具有EKG迹线(右上)。
图1B.心脏的电生理学：心脏的电系统和EKG迹线的详细信息。
图2.基因激活序列：代表涉及心脏起搏细胞谱系发育的不同阶段的关键基因的示意性算法。
图3.实验概述：示意图，代表用于产生心脏起搏细胞的实验程序的序列。
图4.载体图：用作TBX3、TBX5、TBX18、HCN2、SHOX2构建体的表达载体的PNL-TREPiTT-EGFP deltaU3-IRES2-EGFP质粒。
图5.转染前后的ADSC：在多西环素依赖性转换开始后7天，用心脏起搏点诱导因子SHOX2、TBX5和HCN2转染后ADSC的形态从ADSC的典型成纤维细胞样形态(A)改变成小网状形成细胞的集落(B)，参见箭头。
图6.改变形态学：在开始多西环素开关控制诱导后1周内，在用起搏点诱导因子SHOX2、TBX5和HCN2转染后，ADSC形态从ADSC的典型成纤维细胞样形态改变成小和大网状形成细胞的集落。
图7.细胞类型和排列：在用SHOX2、TBX5和HCN2转染的ADSC的培养板中观察到2种不同的细胞类型。右箭头-具有穗状突起的小细胞群体。小细胞开始形成特殊的对齐生长模式并形成通道状结构。左箭头-具有特殊蜘蛛形状形态的较大细胞。
图8.大细胞的特写：在多西环素控制的SHOX2、TBX5和HCN2诱导后14天内出现大细胞(>50μm)的典型蜘蛛状形态。
图9.网络：在诱导SHOX2、TBX5和HCN2后3周内，大蜘蛛形细胞开始彼此并与小细胞形成网络。
图10.在小细胞中的DAPI和CX30.2。CX30.2(起搏细胞谱系的特异性标志物)在小网状形成细胞中的表达。蓝色的DAPI染色剂点亮DNA，表明细胞核。
图11.在大细胞中的DAPI和CX30.2。CX30.2在小型和大型蜘蛛形细胞中的表达。
图12.DAPI和HCN4(起搏细胞谱系的特异性标志物)在小细胞和大细胞中的表达。
图13.RNA表达水平。在开始诱导2周后用不同起搏点诱导因子组合转染的ADSC中心脏浦肯野细胞的特异性标志物基因的mRNA表达水平。
图14.RNA表达水平续在开始SHOX2、TBX5和HCN2诱导后2周，用起搏点诱导因子的不同组合转染的ADSC中的心脏起搏细胞的特异性标志物基因的mRNA表达水平。
图15.单细胞电压钳实验，趣味电流对照细胞：从ADSC(对照2)细胞记录的代表趣味电流(If)。以从-100mV到-40mV的电压阶跃，使用从-40mV的保持电位的10mV增量，引发If电流历时500mS。
图16.小细胞中的趣味电流：用SHOX2、TBX5和HCN2转染的小尺寸部分(<20μm细胞大小)的ADSC记录的代表性的趣味电流(If)。以从-100mV到-40mV的电压阶跃，使用从-40mV的保持电位的10mV增量，引发If电流历时500mS。
图17.在大细胞中的趣味电流。从大尺寸部分(>50μm细胞大小)的SHOX2、TBX5、HCN2转染的ADSC记录的代表性趣味电流(If)。以从-100mV到-40mV的电压阶跃，使用从-40mV的保持电位的10mV增量，引发If电流历时500mS。
具体实施方式
本发明提供了制造起搏细胞和浦肯野细胞或窦房结(SAN)的新方法；由此制成的起搏细胞、浦肯野细胞和SAN；以及使用它们来例如替换或补充患者(例如人类患者)心脏中的受损起搏和浦肯野纤维的方法。细胞可以直接手术或通过导管注射来递送到需要它们的位置。例如，对于窦房结的修复，基于导管将几千个细胞注入受损和功能减退的窦房结足以实现修复。
为了修复心动过速性心律失常，将浦肯野细胞注入慢速传导区(例如梗塞的边界区)，以加速该致心律失常基质中的传导速度，并且通过以使循环脉冲遇到不起反应的心肌并且将再进入加以中断的方式来加速循环脉冲，从而封闭再进入途径。
优选地，细胞由自体细胞制成，使用来自患者的任何可用的干细胞来源，例如骨髓来源的干细胞或脂肪来源的或血液、皮肤和脐带组织来源的干细胞。
基于慢病毒的重新编程
为了诱导ADSC分化成心脏起搏细胞，通过应用慢病毒载体系统，使用包括SHOX2、TBX5、TBX3、TBX18和HCN2的心脏起搏点诱导因子的不同组合来顺序转染它们。慢病毒载体处于开关的控制下，例如多西环素开关。
心脏起搏点诱导因子的表达通过慢病毒载体实现，所述慢病毒载体以24小时间隔以连续方式应用于细胞(图3)。细胞在用5％马血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸替代的α-MEM中培养。每天用400ng/ml多西环素处理培养物3天，然后在具有上述补充物的α-MEM中维持2周。进行细胞的每日显微镜观察以研究转染后细胞的形态学变化。在多西环素诱导开始后第14天从不同实验组收集RNA样品。
人源ADSC(hADSC)获自(Houston，TX)。根据机构审查委员会批准的组织获取方案，在知情同意的情况下获得30-40岁供体的脂肪组织。ADSC由从进行选择性脂肪整形的供体获得的脂肪抽吸物制备。如前所述分离hASDC。
简而言之，将脂肪组织切碎并在Transpose RTTM处理单元中，在39℃下在Ringer溶液中与浓度为每克脂肪组织1单位的Matrase一起孵育30分钟。随后将经处理的组织通过100μm过滤器过滤并在450g下离心10分钟。丢弃含有脂肪细胞和碎片的上清液，用Hanks平衡盐溶液(CELLGRO TM)洗涤沉淀的细胞两次，最后悬浮在生长培养基中。按照InGeneron Transpose RTTM系统的使用说明来详细描述了该过程。生长培养基含有α改性伊格尔培养基(CELLGRO TM)，20％FBS(ATLANTABIOLOGICALS TM)，2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(CELLGRO TM)。
将贴壁细胞称为hADSC，并在含有5％CO2的潮湿气氛中37℃培养瓶中生长，然后每日洗涤以除去红细胞和未附着的细胞。在达到80％汇合时，应用0.25％胰蛋白酶溶液将细胞分离，并以3000个细胞/cm2的密度在新鲜细胞培养瓶中接种。
为了将ADSC分化为心脏起搏细胞，使用慢病毒载体系统(表1)，将ADSC用心脏起搏点诱导因子(包括SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2)转染。本文使用的慢病毒载体包括包装载体psPAX2和包膜载体pMDS2.G(ADDGENE TM)(Islas，2012)。另外，多西环素控制的反式激活因子(rtTA2)被用作该系统的转录诱导型开关。使用质粒PNL-TREPiTT-EGFPδU3-IRES2-EGFP(图4)作为每个单一基因的骨架载体。商业细胞系-293FT-用于病毒包装。293FT细胞系是由SV40大T抗原转化的人胚肾细胞衍生的快速生长、高度转染的克隆分离株，可从THERMOFISCHER 获得。
简而言之，在293个T细胞中产生病毒颗粒，所述T细胞用psPAX2、pMDs2.G载体和含有每种单个目标基因(包括SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18、HCN2)的质粒转染。根据预定义的实验组(参见表1)，通过用包含SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18、HCN2载体的病毒颗粒的不同组合感染来完成将约80％汇合的ADSC重编程为增殖状态。4和5基因组合也呈现出良好的初步结果。
转染的细胞在大组织培养板中通过补充有5％(体积/体积)马血清、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸的α-MEM来培养。
使用PCR在转染后72小时证实每种基因构建体的稳定整合和mRNA表达。
为了研究转染后细胞中发生的任何变化，每天进行细胞的细致显微镜观察。本文显示代表性数据，其属于SHOX2>TBX5>HCN2的连续转染的三重组合。
从多西环素触发治疗后的第2周开始，来自不同实验组的遗传编程起搏细胞开始转化它们的成纤维细胞样形态，并形成含有特定网状形成细胞类型的新集落，所述细胞类型具有几个大的穗状突起。图5、6显示了SHOX2>TBX5>HCN2的连续转染。
在各个实验组的分化期间，逐渐出现两种不同类型的细胞，包括特定的大型蜘蛛形细胞类型和具有长穗样突起的小纺锤形细胞。图7、8显示了在SHOX2>TBX5>HCN2的三重连续转染中两种细胞类型的出现。随后，两个纺锤体和蜘蛛形细胞群开始彼此形成高度互连的网络(图9)。此外，小穗形细胞开始形成特定的，高度对齐的生长模式(参见图7中的直线沟槽形成，其可能对应于心脏的自然传导系统中的浦肯野细胞网络。
根据之前关于从胎儿SAN中分离起搏细胞的研究结果，蜘蛛形状形态已被定义为起搏细胞的典型形态。因此，我们的有序转染实验显示，SHOX2>TBX5>HCN2的三重连续转染使得细胞的形态非常像自然起搏细胞那样。
虽然本文未显示，但在用起搏点诱导因子的各种组合进行转染的不同组的ADSC中进行了相似的观察。然而，在用TBX转录因子(特别是TBX5)转染的ADSC组中，与用SHOX2和HCN2的单独或双重组合转染的组相比，观察到了更强烈的转变成心脏传导细胞典型形态的形态学变化。在用SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合转染的ADSC组中观察到最强烈的形态学变化，因此这些结果在本文中部分显示。通过qPCR测定在心脏传导系统的分子标志物的表达中也观察到类似的结果(图13、14)。
确定心脏传导系统发育的主要分子调节物的早期体内研究的结果鉴定了T-box蛋白作为心脏传导系统形态发生的重要因素以及编码促成心脏传导细胞的电生理功能的离子通道蛋白的基因的上调。
Hoogaars等人，2007指出，TBX3控制窦房结基因程序，并在心房施加起搏功能。其他研究的结果指示TBX5是调节心脏传导细胞成熟和功能所需的发育网络的关键转录因子。
全基因组关联研究(GWAS)的结果已经鉴定了许多与人类心脏传导系统(包括TBX5和离子通道)的发育过程相关的基因座。离子通道的表达对系统的电生理功能至关重要。Arnold等人，2012发现TBX5缺失会导致心脏传导系统严重功能障碍，包括快速传导的丧失、心律失常和猝死。
此外，基于全基因组关联研究(GWAS)的结果，确定了TBX5和SCN5A(UNIPROTQ14524)，又名NAV1.5(一种快速传导系统的关键介质)之间的分子连接。这项研究的结果确定了SCN5A下游的TBX5响应增强子，这对于心室传导系统的谱系规范是足够的(Arnolds，2012)。
较小的细胞对应于浦肯野细胞，如通过纺锤体样形态学和长细胞突起所确定的：转染后两周，这些小纺锤体样细胞特别说明高度排列的生长模式，包括通过单个细胞的彼此紧密连接形成多细胞链和网络。这些细胞在单细胞膜片钳分析中显示了中等程度的趣味电流。根据之前关于各种心脏细胞类型的分离和表征的体内研究的结果，这种特定的链和网状形成生长模式已被定义为浦肯野细胞的典型特征。在之前通过在ESC中过表达TBX3来体外产生心脏结细胞的尝试中报道了类似的形态特征。此外，与我们的研究结果相一致，先前关于不同类型心脏传导细胞表征研究的结果也揭示了与心脏起搏细胞相比，心脏浦肯野细胞中的电生理活性较低。
两种细胞类型相关联以形成互连网络，其中一个起搏细胞被包围并连接到若干浦肯野细胞以形成网络。浦肯野细胞的目的是充当由起搏细胞诱导的初始自发去极化的放大器和导体。这些相互关联的网络的形成与心脏传导细胞(包括CX30.2和HCN4)的特定膜连接和离子通道的表达密切相关，这些膜连接和离子通道是细胞电生理功能所必需的。HCN4是超极化激活的环核苷酸门控钠通道的成员，对于特定的起搏电流If来说是必需的。CX30.2负责细胞间连接和自发性去极化心肌细胞之间的网络形成。
基于RNA的重编程
诱导程控起搏点非收缩性心肌细胞的另一种成功方法是使用基于mRNA的转染方法。这种方法尚未完全针对所有不同的诱导因素完成，但我们目前的结果表明该方法同样可行和有效。
简而言之，使用特异性引物通过PCR扩增编码DNA序列。然后纯化PCR产物并测定产生的DNA的质量。使用体外转录(IVT)过程，从DNA产物产生mRNA。随后，将产物纯化并用磷酸酶处理以除去5'-三磷酸酯。对生成的mRNA进行额外的纯化和质量控制后，将进行转染实验。
为了获得IVT的DNA模板，使用PCR扩增所有TBX18、TBX3和HCN2质粒。因此，通过使用具有T120延伸的反向引物将120个胸腺嘧啶(T)的聚T尾添加至插入物。因此，在IVT后，所产生的mRNA获得具有限定长度的聚A尾。使用例如HOTSTAR TM HIFIDELITY POLYMERASE KIT(Germany)进行100μl的PCR反应，并且含有0.7μM的每种正向和反向引物，1×Q-溶液，1×HOTSTAR TM HIFIDELITY PCR缓冲剂，50ng质粒DNA，2.5U HOTSTAR TMHIFIDELITY DNA聚合酶。
使用例如以下循环方案进行扩增：在95℃下5分钟的初始活化步骤，接着25个循环的95℃变性45秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后在72℃延伸10分钟。根据制造商的说明书使用QIAQUICKTM PCR PURIFICATION KIT(Germany)纯化PCR产物，使用20μl无核酸酶的水洗脱DNA。DNA的质量和纯度可以通过1％琼脂糖凝胶电泳进行评估。
在PCR之后，使用例如 T7试剂盒(LIFEGermany)，在体外将遗传信息从DNA转录成mRNA。mRNA转录物然后将用于诱导细胞中的蛋白质表达。首先，制备含有7.5mM ATP，1.875mM GTP(都来自 T7试剂盒)，7.5mM Me-CTP，7.5mM假UTP(均来自TRILINKBIOTECHNOLOGIES TM，CA)和2.5mM 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA帽结构类似物(NEWENGLAND Germany)的23μl NTP/帽类似物混合物并充分混合。
然后通过加入40U RIBOLOCK TM RNA酶抑制剂(THERMO FISHER SCIENTIFIC)，1μgPCR产物，1×反应缓冲剂和1×T7RNA聚合酶混合物来组装40μl的IVT反应混合物。将IVT反应混合物在37℃下在热混合器中孵育3小时。为了除去模板DNA，将1μl TURBO TM DNA酶(来自 T7试剂盒)加入到IVT反应混合物中并在37℃孵育15分钟。然后，根据制造商的说明使用RNEASY TM Mini Kit(QIAGEN)纯化反应混合物。用40μl无核酸酶的水将修饰的mRNA从离心柱膜洗脱两次。
产生的mRNA将用南极磷酸酶(NEW ENGLAND )处理以除去可被RIG-1识别并导致免疫激活的5'三磷酸酯。此外，磷酸酶处理阻止了自我连接反应中的重新环化。为此，将9μl 10×南极磷酸酶反应缓冲剂加入到79μl纯化的mRNA溶液中。随后，将2μl的南极磷酸酶(5U/μl)加入到反应混合物中并在37℃孵育30分钟。
可以使用例如RNeasy Mini Kit(QIAGEN)根据制造商的说明书来纯化处理的mRNA。用50μl无核酸酶的水将修饰的mRNA从离心柱膜洗脱两次。浓度将使用SCANDROP分光光度计(ANALYTIC JENA,Germany)测量。通过加入无核酸酶的水将mRNA的浓度调节至100ng/μl。合成的修饰mRNA的质量和纯度将通过1％琼脂糖凝胶电泳确定。修饰后的mRNA将被等分并储存在-80℃并用于转染。
ADSC将在补充有10％FBS(LIFE TECH.)，2mM L-谷氨酰胺(PAA LABORATORIES,Austria)和1％青霉素/链霉素(PAA LAB.)的α-MEM培养基中培养。细胞将保持在37℃和5％CO2下，培养基每3天更换一次。细胞将使用胰蛋白酶/EDTA(0.04％/0.03％，PROMOCELL TM，Germany)进行传代。为了进行转染实验，将24孔板的每孔上铺1.5×105个细胞。将细胞在37℃下在细胞培养箱中孵育过夜。第二天，可以进行转染实验。
用2000(LIFE )进行用本发明的不同mRNA转染ADSC。为了确定用于形成脂质复合物的所需量的2000，使用不同量的1、2、4、6μl的2000转染细胞。为了转染24孔板的一个孔，根据制造商的说明制备250μl Opti-MEM I低血清培养基，其含有2.5μg各目标mRNA和相应量的2000。
通过移液来轻轻混合组分。然后将转染混合物在室温下孵育20分钟以产生用于转染的脂质体复合物。将细胞用250μl DPBS/孔洗涤，将转染混合物移液至孔中。在37℃和5％CO2下孵育4小时后，用1ml完全细胞培养基代替转染混合物。细胞将在细胞培养箱中培养24小时并使用流式细胞术进行分析。
为了确定诱导蛋白质表达所需的mRNA量，首先使用不同量的每种eGFP-mRNA(0、0.5、1、1.5、2、2.5μg)进行细胞转染。为了转染24孔板的一个孔，制备250μl Opti-MEM I低血清培养基，其具有相应量的mRNA和1μl 2000。
轻轻混合各组分并在室温下孵育20分钟。将细胞用500μl DPBS/孔洗涤并加入转染混合物。细胞将在37℃和5％CO2下孵育4小时。之后，将转染混合物吸出并将1ml完全细胞培养基添加到细胞中。细胞将在培养箱中孵育24小时。
使用流式细胞术，验证细胞中的eGFP表达。在通过eGFP来确定用于诱导蛋白质表达的所需量的mRNA之后，根据本发明对相应的mRNA应用相同的浓度。
免疫组织化学
为了进一步表征诱导起搏细胞，在多西环素触发诱导后2周进行包括CX30.2和HCN4在内的心脏起搏细胞谱系的主要生成基因的免疫组织化学(IHC)染色。
对于包括CX30.2和HCN4的非收缩性心肌细胞的两种主要标志物基因进行IHC染色。在用SHOX2>TBX5>HCN2三联体连续转化的细胞中IHC染色的结果揭示了纺锤体和蜘蛛细胞群体中CX30.2和HCN4的表达(图10、11、12)。HCN4是特定起搏电流If所需的超极化激活的环核苷酸门控钠通道的成员。CX30.2负责各个非收缩性心肌细胞之间的细胞-细胞连接和网络的形成。
在用起搏点诱导因子的其他组合转染的不同组的ADSC中也观察到类似的免疫表型。然而，与用SHOX2和HCN2的单独或双重组合转染的组相比，在用TBX转录因子(特别是TBX5)转染的ADSC组中观察到转染的ADSC的形态学特性和免疫表型朝向自发去极化的非收缩心肌细胞的更强烈的变化。通过SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合观察到转染的ADSC的形态学特性和免疫表型朝向窦房结细胞的最强烈的变化。TBX3和TBX18也可以用作TBX5的补充或替代品，也可以使用HCN4补充或替代HCN2。
关键基因的表达水平
为了评价心脏起搏点诱导因子的各种组合对ADSC向不同类型的心脏传导细胞谱系(包括起搏和浦肯野细胞)分化的影响，分析了两种细胞谱系的特定标志物基因的mRNA表达水平。
为此，包括HCN1、HCN3、HCN4、SCN3B(UniProt Q9NY72)、CX30.2(适当地称为GJC3、UniProt Q8NFK1)的心脏起搏细胞的一组下游晚期阶段标志物以及包括IRX3(UniProtP78415)、IRX5(UniProt P78411)、SEMA3B(UniProt Q6PI51)、SCN10A(UniProt Q9Y5Y9)、SHH(UniProt Q15465)的浦肯野细胞的特异性标志物基因的mRNA表达对混合细胞类型群体应用qPCR分析来确定(例如细胞不是首先分离成起搏和浦肯野细胞，虽然本实验是经过计划的)。
简而言之，使用的RNEASY TM试剂盒来分离总RNA，并使用SuperscriptIII将其逆转录成cDNA。使用SYBR Green(APPLIED )作为检测器，用ABI Prism 7000系统检测序列(SDS)和软件(APPLIED )进行定量PCR。
由此分析心脏起搏点标志物(表3和图12)和浦肯野细胞(表2和图13)的一组特定标志物基因的mRNA表达水平。基于qPCR分析的结果，在用不同的起搏点诱导因子组合转染的所有不同实验组中，可以观察到心脏浦肯野细胞的标志物基因的表达。然而，不同的心脏诱导因子组合在上调下游心脏起搏点标志物基因包括HCN1、HCN3、HCN4、SCN3B(UniProtQ9NY72)、CX30.2(GJC3、UniProt Q8NFK1)中起着不同的作用。
例如，在用SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合转染的ADSC中观察到HCN3B、HCN3和CX30.2的最高mRNA表达水平，而HCN1的mRNA表达与TBX18的上调更相关。根据这项研究的结果，HCN4的mRNA表达与SHOX2的上调高度相关。此外，在用SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合转染的ADSC中观察到中等表达水平的HCN4。总之，基于qPCR的结果，用SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合转染ADSC导致心脏传导细胞的不同标志物基因的最一致的上调。可以得出结论，与用SHOX2和HCN2的单独或双重组合转染的组相比，转染的ADSC的基因表达模式朝向自发去极化的非收缩性心肌细胞的最强烈变化在用TBX转录因子(特别是TBX5)转染的ADSC组中观察到。通过SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合观察到转染的ADSC的基因表达模式朝向自发去极化的非收缩心肌细胞的最稳健和一致的变化。
通常可以得出结论，SHOX2、TBX5和HCN2的三重组合可以有效地用于产生包括浦肯野和起搏细胞的两种心脏传导系统的细胞类型。
膜片钳测试
为了进一步验证遗传编程起搏细胞的功能、其电生理性质，我们进行了单细胞膜片钳实验以测量细胞产生的电流(White，2005)。
全细胞电压钳实验使用标准膜片钳方法进行。记录电极使用Flaming-Brown微电极拉制器(P-97，SUTTER INSTRUMENTS TM，CA)由1.5mm薄壁硼硅酸盐玻璃(No.7052，GARNERGLASS TM，CA)制成并在使用前加热抛光。填充内部溶液时，每个移液器的吸头电阻为2-5MΩ。使用Axoclamp 2B膜片钳放大器(AXON INSTRUMENTS TM；CA)进行记录。以2kHz过滤数据，并使用Clampex 8软件(AXON INSTRUMENTS TM)获取数据。
膜片移液器从硼硅酸盐玻璃中拉出并加热抛光。当填充细胞间溶液时，它们具有2-5MΩ的电阻。
对于电流钳记录，细胞间溶液含有10mM NaCl，130mM天冬氨酸钾，0.04mM CaCl2。3mM Mg-ATP，10mM HEPES。用KOH将pH调节至7.2。细胞外(浴)溶液含有pH 7.4的140mMNaCl，5.4mM KCl，1.8mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM葡萄糖和5mM HEPES。
以从-100mV到-40mV的电压阶跃，使用从40mV的保持电位的10mV增量，测量趣味电流(If)密度历时500mS。因为心脏起搏细胞的一个重要特征是表达向内趣味电流(If)。根据这项研究的结果，小纺锤形细胞以及大蜘蛛形细胞的两个群体表现出强大的If电流，HCN通道亚型的典型电流(图15、16、17)。
关于慢病毒载体举例说明了本发明。然而，这仅仅是示例性的，并且本发明可以广泛地应用于包括用于激活干细胞如ADSC中必需基因的任何手段。以下实施例意图仅仅是说明性的，并且不会不当地限制所附权利要求书的范围。
以下参考文献都出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
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出于所有目的，本文中的所有UniProt引用在此通过引用并入，包括与其有关的序列。

Claims (34)

1.一种诱导成体再生细胞分化为诱导型非收缩性心肌细胞的方法，所述方法包括使成体再生细胞群体经历SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达以诱导所述细胞的特异性分化，并且培养所述细胞直至心脏起搏细胞和浦肯野细胞形成。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述再生细胞包含成体干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述再生细胞包含自体脂肪组织来源的干细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其包括诱导将编码SHOX2>TBX5>HCN2的DNA或mRNA顺序转染到所述细胞中。
5.如权利要求1所述的方法，其包括诱导SHOX2>TBX5>TBX3>TBX18>HCN2的顺序表达。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述非收缩性心肌细胞由自体脂肪组织来源的再生细胞产生。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的一种或多种表达载体。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的一种或多种表达载体。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的一种或多种慢病毒载体。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的一种或多种慢病毒表达载体。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的mRNA。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的mRNA。
13.如权利要求1所述的方法，还包括使所述起搏细胞和所述浦肯野细胞生长直至形成诱导型窦房体。
14.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求13所述的方法来制备的诱导型窦房体。
15.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求1所述的方法来制备的诱导型起搏细胞。
16.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求1所述的方法来制备的诱导型浦肯野细胞。
17.一种组合物，其包含由成体再生细胞形成的重编程细胞群体，所述成体再生细胞用表达构建体来转化，所述表达构建体允许SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达，从而形成所述重编程细胞，所述重编程细胞群体在药学上可接受的液体赋形剂和/或细胞支持培养基中。
18.如权利要求17所述的组合物，所述重编程细胞群体通过SHOX2>(TBX3和TBX5和TBX18)>HCN的顺序表达来形成。
19.如权利要求16所述的组合物，所述重编程细胞群体通过SHOX2>TBX3>TBX5>TBX18>HCN的顺序表达来形成。
20.一种方法，其包括获得成体干细胞，在所述成体干细胞中诱导SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达以形成重编程细胞，并培养所述重编程细胞直至形成心脏起搏细胞和浦肯野细胞。
21.如权利要求20所述的方法，还包括使所述心脏起搏细胞和浦肯野细胞生长直到它们缔合并形成诱导型窦房体。
22.如权利要求21所述的方法，还包括将所述诱导型窦房体引入到患者的心脏中。
23.如权利要求22所述的方法，所述成体干细胞是自体脂肪组织来源的成体干细胞。
24.如权利要求20所述的方法，其包括诱导SHOX2>(TBX3>TBX5>TBX18)>HCN2的顺序表达。
25.如权利要求20所述的方法，其包括诱导SHOX2>TBX3>TBX5>TBX18>HCN2的顺序表达。
26.如权利要求20所述的方法，还包括通过大小分选来分离所述起搏细胞和浦肯野细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中<20μm的细胞被分类为浦肯野细胞并且>50μM的细胞被分类为起搏细胞。
28.如权利要求27所述的方法，还包括将所述分离的浦肯野细胞施用于患者以治疗心动过速性心律失常。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述成体干细胞从患有心动过速性心律失常的患者获得，并且其中所述分离的浦肯野细胞以足以治疗所述心动过速性心律失常的量向所述患者施用。
30.如权利要求26所述的方法，还包括将所述分离的起搏细胞施用于患者以治疗病态窦房结综合征。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述成体干细胞从患有病态窦房结综合征的患者获得，并且其中所述分离的起搏细胞以足以治疗所述病态窦房结综合征的量向所述患者施用。
32.一种治疗心律失常的方法，其包括从患有心律失常心脏的患者获得成体干细胞，通过顺序表观遗传重新编程来诱导所述成体干细胞转化成浦肯野和起搏心肌细胞的谱系定向，并将所述浦肯野细胞或所述起搏细胞或两者引入到所述心律失常心脏中。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述起搏细胞和浦肯野细胞基于它们的大小来彼此分开。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述起搏细胞和所述浦肯野细胞一起用于重建所述患者的受损窦房结。
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