KR102664046B1 - 식물공장 시스템을 이용한 인삼 및 인삼 클론 대량생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼 클론 묘의 생산 방법 및 수경재배 방식에 대한 것이다.
Description
본 발명은 수경재배 시스템을 이용한 수경재배 인삼 및 인삼 클론 묘의 대량 생산 방법에 대한 것이다.
우리나라에서 한해 생산되는 인삼 종자량은 약 200 톤으로 추정되고 있으며, 이는 기존의 방식으로 토양에 인삼을 재배하는 경우 충분한 양으로 생각되며, 일부 저장된 종자도 상당량에 이르는 것으로 알려져 있다. 최근 농촌진흥청에서 개발하여 농가에 보급한 “수경재배에 의한 새싹삼” 재배 기술에 의해 생산된 인삼은 뿌리 뿐 만 아니라 잎, 줄기도 식용이 가능함과 동시에 무농약 인삼 이라는 점에서 호평을 받고 있으며, 수경재배의 농가가 급격히 증가하고 있는 상황이다.
인삼은 파종 혹은 묘삼의 식재에서 종자 수확까지 약 3년 이상의 시간을 요하며, 인삼 개체 당 생산되는 종자량도 약 20개 내외 일 뿐 만 아니라 무엇보다 종자를 결실할 경우 인삼 뿌리의 생육이 저하되는 단점이 있어 4년생에서 6년 생 인삼을 생산하는 농가에서 인삼 종자의 수확은 대체로 한번 혹은 드물게 두 번으로 한정하기 때문에 인삼 종자를 단시일 내 수십 배, 혹은 수백 배 생산하는 것은 불가능 한 것으로 여겨지고 있다.
전통적인 인삼재배의 경우 종자에서 묘삼을 생산하는데 약 2년의 시간이 소요되며, 본포에 옮긴 이후 약 4년에서 5년 후 (묘삼 사용 시) 수확을 하는 반면, 수경재배에 의한 새싹삼 생산의 경우 대체로 묘삼 (즉, 종묘)을 수경재배하여 30일 만에 수확함으로써, 수경재배 농가가 늘어남에 따라 필요한 인삼 종자 혹은 묘삼의 수는 기하급수적으로 늘어날 것으로 판단되며, 모든 농가가 수경재배를 할 경우 이론적으로 약 8,000 톤의 종자가 필요함으로 현재의 종자 생산 방법으로 자체적으로 필요한 인삼 종자 혹은 종묘를 공급한다는 것은 극히 어려울 것으로 생각된다.
이러한 관점에서 인삼의 세포 및 조직 배양 기술을 통하여 산업적인 규모로 체세포 배 유래의 클론 종묘를 생산할 경우, 향후 수경재배 농가에 안정적인 종묘 공급이 가능할 것으로 판단하고 있다. 지금까지 무수히 많은 연구 논문이나 특허 등에서 인삼을 기내배양 (in vitro culture) 하여 종묘로 사용할 수 있는 식물체를 얻을 수 있다는 보고와 특히, 체세포 배 유도를 할 경우 산업적인 규모의 종묘 공급이 이론적으로 가능하다는 논문이나 특허가 나와 있음에도 불구하고, 아직까지 농가에 실질적으로 보급을 한 경우는 우리나라뿐 만 아니라 전 세계적으로도 보도된 바가 없다. 그 이유로는 지금까지 개발된 기술에 의해 인삼의 세포나 조직 배양 기술에 의해 일정 시간 내 얻을 수 있는 소 식물체의 수가 제한적이고 정상적인 발육을 하는 개체의 빈도도 낮을 뿐 아니라 무엇보다도 토양에 이식하는 과정에서 급격히 변한 환경 조건에 의해 생존율이 크게 떨어지는 점을 들 수 있다.
인삼 류에 있어서 세포 및 조직배양기술을 이용하여 클론 묘를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 찾아내기 위하여 우리나라뿐 만 아니라 전세계적으로도 많은 연구가 진행되어 왔으며, 그 결과가 논문이나 특허를 통해 보고 된 바 있다. 특히, 인삼 클론 묘를 대량으로 생산하기 위해 가장 적합한 방법으로써 체세포 배를 통한 연구가 현재에도 집중적으로 이루어 지고 있으며, 성숙한 인삼의 조직이나 절편 (Nhut DT et al., 2012; Shou-Jing et al., 2012)에서부터 미성숙 종자 혹은 성숙 종자의 배 (Yong Eui Choi et al., 1996; Yong Eui Choi et al., 1998), 성숙 종자의 자엽 (Tang W et al., 2000; Sijun Zhou et al., 2006; Yong Eui Choi et al., 1997), 꽃눈 (Kishira H et al., 1992), 현탁배양 세포 (Marta M et al., 2002) 등 다양한 공시 재료로부터 체세포 배 유도에 성공한 연구결과가 무수히 발표된 바 있다.
사용된 시료로부터 체세포 배를 유도 (induction)하는데 영향을 미치는 요인으로써 배양 배지 조성과 식물 생장 조절물질 (Punja ZK et al., 2004; Kim Ok Tae et al., 2006; 양덕춘 등 1999; Wang X et al., 1999) 및 배지 내의 삼투 농도 (Isao Asaka et al., 1993) 등 관련 분야에 많은 연구 결과가 보고 된 바 있다 (Tirajoh A etal., 1998 ; Claire K et a., 2000).
그럼에도 불구하고 현재까지 인삼 클론 묘를 생산하여 이를 사업화가 가능한 수준으로 적용한 예가 거의 없으며, 기내에서 배양된 인삼 소식물체를 토양에 이식할 경우 생존율이 극히 낮아 인삼의 클론 묘를 농가에서 재배한 경우가 없는 것으로 파악된다.
본 발명자들은 인삼 클론 묘의 기내 대량생산에 관한 새로운 기술을 개발 하였으며, 또한 클론 묘를 순화시킨 후 생장시키는 과정에서 클론 묘 유래의 인삼 소식물체를 토양에 이식하여 재배하는 것 보다 수경재배를 이용하는 것이 산업적인 규모의 생산 및/또는 수확에 더 적합하다는 것을 알고 이에대한 방법을 개발하고 확인하였다.
[문헌 1] Nhut DT et al., African Journal of Biotechnology 11(5):1084-1091, 2012
[문헌 2] Shou-Jing et al., International Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences 97-99, 2012
[문헌 3] Yong Eui Choi et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 45:137-143, 1996
[문헌 4] Yong Eui Choi et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 52:177-181, 1998
[문헌 5] Tang W, Plant Cell Reports 19:727-737, 2000;
[문헌 6] Yong Eui Choi et al., Plant Cell Reports 16:841-846, 1997
[문헌 7] Kishira H et al., Acta Horticulturae 319:197-202, 1992
[문헌 8] Marta M et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 68:225-232, 2002
[문헌 9] Punja ZK et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 40:329-338, 2004
[문헌10] Kim Ok Tae et al., Journal of Plant Biology 49(5): 348-352, 2006
[문헌11] 양덕춘 등 J. Ginseng Res. 23(4):199-204, 1999
[문헌12] Wang X et al., J. Ginseng Res. 23(4):148-163, 1999
본 발명의 목적은 수경재배 시스템을 이용한 인삼 및 인삼 클론 묘의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼 클론 묘의 생산 방법과 수경재배 기술을 이용하여 클론 묘의 순화 및 생장 효율을 높이는 기술을 제공한다.
본 발명에서 IEDC 및 PEDC 기술을 이용하여 인삼 클론 묘의 효율적인 대량 생산이 가능하다. 뿐 만 아니라 클론 묘 유래의 소식물체를 수경재배하여 생존율과 생장율을 크게 높임으로써 인삼 클론 종묘를 전통적인 인삼 재배 농가뿐 아니라 인삼을 수경재배 하고자 하는 농가에도 안정되게 공급할 수 있다.
도 1은 접합 배로부터 유도된 캘러스의 사진이다.
도 2는 선발된 캘러스 조직으로부터 체세포 배를 형성한 사진이다.
도 3은 체세포 배 및 체세포 배성 세포의 사진이다.
도 4는 체세포 배성 세포가 증식된 사진이다.
도 5는 체세포 배로부터 소식물체가 분화한 사진이다.
도 6은 소식물체를 배양하는 전경이다.
도 7은 순화 1 단계 담액식 수경재배이다.
도 8은 순화 2 단계 박막식 수경재배이다.
도 9는 순화 3 단계 분무식 수경재배이다.
도 2는 선발된 캘러스 조직으로부터 체세포 배를 형성한 사진이다.
도 3은 체세포 배 및 체세포 배성 세포의 사진이다.
도 4는 체세포 배성 세포가 증식된 사진이다.
도 5는 체세포 배로부터 소식물체가 분화한 사진이다.
도 6은 소식물체를 배양하는 전경이다.
도 7은 순화 1 단계 담액식 수경재배이다.
도 8은 순화 2 단계 박막식 수경재배이다.
도 9는 순화 3 단계 분무식 수경재배이다.
본 발명은,
IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼의 생산 방법에 대한 것이다.
본 발명은,
IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼 클론 묘의 생산 방법 및 클론 묘 유래의 소식물체를 수경재배하여 대량 생산하는 기술에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계
본 발명의 인삼의 생산 방법은 IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함한다.
IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배는 조직으로부터 캘러스를 유도한 후 캘러스로부터 직접 체세포 배가 만들어지는 방식으로 만들어진 체세포 배이다. PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배는 조직에서 분리된 하나의 세포로부터 직접 체세포 배를 유도하는 방식으로 만들어진 체세포 배이다.
접합 배로부터 IEDC 형 체세포 배를 유도하여 사용할 수 있으며, IEDC 형 체세포 배를 지속적으로 얻기 위하여 계대배양을 하는 과정에서 부정형의 캘러스와 갈색을 띄는 캘러스 (생장 속도가 느리고 체세포 배로 분화하지 않으며 세포 분열 만 하는 세포의 덩어리)는 제거하고 전형적인 체세포 배를 형성하는 능력이 뛰어난 옅은 노랑색의 캘러스 조직만 분리 배양할 수 있다.
IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계는 IEDC 형 체세포 배 유래의 옅은 노랑색 캘러스 조직을 분리한 후 물리적인 힘을 가하여 단세포나 다세포로 조제하고, 이를 계대배양하는 단계를 포함할 수 있다.
IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계에서 IEDC 형 체세포 배를 지속적으로 계대배양하는 과정에서 캘러스 조직의 일부를 적출하여 물리적 힘을 가한 다음 단세포나 다세포를 조제하고, 이를 액체 배양 배지에 계대배양하며, 배양 과정에 진탕배양기 (shaker)에서 흔들어 줌으로써 단세포와 다세포 배양체를 얻어 이를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, IEDC 형 체세포 배 유래의 캘러스 조직을 1차적으로 유리봉으로 물리적인 힘을 가하고, 2차적으로 거즈와 250 mm 메쉬 (mesh)를 이용하여 1 mm 이상의 세포덩어리를 제거 후 연속적인 150 rpm의 진탕배양기에 배양함으로써 다량의 단세포와 다세포를 얻을 수 있다. 또한 액체 진탕배양기에서 현탁배양된 세포를 반고체 배지에 배양하여 단일 콜로니로부터 유도된 PEDC 형의 체세포 배 만 선발할 수 있다.
PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계
본 발명의 인삼의 생산 방법은 PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 소식물체란, 기내 배양된 식물체 중 길이가 5 cm 미만인 식물체를 의미한다. 이때 PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻은 후 정상 개체를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때 정상 개체는 정상적인 형태의 자엽과 정상적인 형태의 뿌리가 동시에 형성된 개체이다. 이때 PEDC 형 체세포 배 중에서 자엽과 뿌리가 형성된 정상적인 개체 만 선발하여 순화함으로써 생존율을 높일 수 있으며, 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 97% 의 생존율을 얻을 수 있다.
한 예에서, 기내 배양에 있어서 접합 배로부터 인삼 소식물체 (클론 묘)를 대량으로 얻기 위하여 단계 별로 서로 다른 배양 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 접합 배 배양으로 체세포 배성 캘러스 및 체세포 배성 세포를 유도하기 위해서는 MS 배지에 2,4-D 0.5 내지 1.0 ppm을 넣어 주고, 체세포 배의 증식에는 MS 배지에 2,4-D 1.0 ppm 과 NAA 0.6 내지 1.6 ppm 및 kinetin 0.2 ppm을 넣어주고, 체세포 배로부터 완전한 소식물체 분화를 위해서는 MS 기본배지에 GA3 를 5 내지 15 ppm 농도로 넣어줄 수 있다.
소식물체를 순화시키는 단계
본 발명의 인삼의 생산 방법은 소식물체를 순화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 인삼 클론 묘의 생산 방법은 IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계; PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계; 및 소식물체를 순화시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 인삼 클론 묘의 생산 방법은 IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계; PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계; 상기 소식물체로부터 정상 개체를 선발하는 단계; 및 상기 정상 개체로 선발된 소식물체를 순화시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 순화는 담액식 수경 재배, 박막식 수경 재배 및 분무식 수경 재배로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 순화는 담액식 수경 재배, 박막식 수경 재배 및 분무식 수경 재배를 순차적으로 이용하여 3개 이상의 단계로 수행될 수 있다. 이때 각각의 단계는 10일 내지 45일의 기간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 15일 내지 40일의 기간 동안 수행될 수 있다.
담액식 수경 재배(DWC : Deep Water Culture) 는 양분과 산소가 충분한 용액, 즉 양액(배양액)에 뿌리를 담가 재배하는 방식을 가리킨다. 박막식 수경 재배(NFT : Nutrient Film Technology)는 양액을 뿌리가 위치한 곳으로 계속해서 공급하여 재배하는 방식을 가리킨다. 분무식 수경 재배(Aeroponics)는 고압 펌프 등을 이용하여 양액을 매우 작은 입자 형태로 뿌리에 살포하여 재배하는 방식을 가리킨다.
이때, 담액식 수경 재배 및 박막식 수경 재배는 2000 lux 이상 4000 lux 이하의 광도 조건 하 수행하고 분무식 수경 재배는 4000 lux 초과 6000 lux 이하의 광도 조건 하 수행하는 것이 바람직하다. 이때 배양액의 산도는 pH 5 이상 7 미만, 바람직하게는 5.3 이상 6.6 이하인 것이 바람직하며, 온도는 주간에 24 ℃ 초과 28 ℃ 이하, 야간에 20 ℃ 이상 24 ℃ 이하인 것이 바람직하다.
분무식 수경 재배는 부피 기준으로, MS 배지를 1/128 이상 1/16 미만 포함하는 배지에서 수행할 수 있으며, 1/64 이상 1/16 미만 포함하는 배지에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
기내 배양에서 유도된 체세포 배 유래의 인삼 소식물체를 수경재배하는 한 예에서, 1 단계에서는 담액식 수경재배 방법을 적용하여 1달 간 재배하고, 2 단계에서는 박막식 수경재배 방식으로 1달을 재배 한 후, 3 단계에서 분무식 수경재배 방식이나 박막식 수경재배 방식으로 1달 간 재배하여 순화된 인삼 클론 묘를 대량 생산할 수 있다.
한 구현예에서, 순화를 위한 수경재배 양액의 산도는 pH 6으로 조절하고, 1 단계 및 2 단계에서는 10 내지 36 시간, 예컨대 24 시간 저장된 수돗물만 사용하며, 3 단계에서는 MS배지를 1/32 로 희석한 배양액을 사용할 수 있다. 또한 1 단계와 2 단계에서는 광도를 3,000 lux 미만으로 하고 3 단계에서는 광도를 5,000 lux 정도로 배양하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 인삼의 생산 방법
본 발명은 IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼의 생산 방법을 제공하며, 이때 상기 인삼은 인삼 클론 묘일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 방법은 IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계; 및 PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계; 소식물체를 순화시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 식물 공장 시스템으로 수행할 수 있으며, 이때 식물 공장 시스템이란 빛, 공기, 온도 등과 같은 식물의 재배 환경을 인공적으로 조정하여 계획적으로 식물을 생산하는 시스템을 말한다.
지금까지 인삼 종묘 생산과 관련된 기내배양 연구가 실용화되지 못한 근본적인 원인으로는 (1) 대부분의 체세포 배 유도는 조직이나 캘러스로부터 직접 체세포 배가 만들어지는 IEDC (Induced Embryogenic Determined Cell) 형태로써, 생산성이 떨어지고 노동집약적이라는 점, (2) 유도된 체세포 배 유래의 소식물체가 대부분 비정상적인 형태를 지니고 있어서 기내에서 생육하는 과정에 고사하는 비율이 높다는 점, (3) 순화 시 정상적으로 생장을 하는 클론 묘의 수가 5 %에도 미치지 못하는 점 등을 들 수 있다.
본 발명의 생산 방법은 기내에서 최대한 많은 수의 체세포 배를 얻기 위한 방법으로 하나의 세포에서 하나의 체세포 배가 만들어지는 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형태의 기술을 개발함과 동시에 정상적인 체세포 배와 비정상적인 체세포 배를 조기에 선발 함으로써 기내 배양된 인삼 소식물체를 대량 생산 할 수 있는 기술 개발과 더불어 기내 (무균상태)에서 기외 (토양)로 순화하는 과정에서 생존율을 높이기 위해 생장 단계별로 최적의 수경재배 기술을 적용한 것이다.
본 발명의 방법에 의하여 생산된 인삼 클론 종묘는 수경재배를 하는 농가에 직접 공급함으로써 묘삼을 대체할 수 있을 뿐 만 아니라, 향후 수경재배 농가가 급속히 늘어날 경우에도 충분한 양의 인삼 종묘를 공급할 수 있을 것으로 판단되며, 최종 단계인 분무식 수경재배기술의 경우 기내배양 된 체세포 배 유래의 식물체를 약 1년 가까이 수경재배 함으로써 전통적인 재배 시 생산되는 3년 근 정도 크기의 인삼 수확이 가능함에 따라 그 자체로 건강 식품, 화장품 및 의약품 소재로 활용 할 수 있을 것으로 생각되며, 인삼 종자 산업법에 의해 국내에서 생산된 인삼 종자나 묘삼의 국외 수출은 불가하지만 본 발명에 의해 생산된 체세포배 유래의 인삼 클론 종묘 혹은 그 종묘를 수경재배하여 얻어진 인삼 뿐 아니라 기술 자체를 수출 할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 인삼 클론 묘의 생산 방법의 한 구현예는 하기의 4 단계를 포함할 수 있다:
1. 인삼 종자 내 접합 배 (zygotic embryo) 를 배양하여 캘러스를 유도한 다음, 유도된 캘러스로부터 IEDC 형태의 체세포 배를 생산하는 단계. 이때 하기 (a) 내지 (c)의 단계를 포함할 수 있다.
(a) 인삼 종자의 표면 소독
(b) 인삼 종자로부터 접합 배 적출 및 배양
(c) 다량의 IEDC 형태의 체세포 배 유도
2. IEDC 형 체세포 배로부터 액체 현탁배양 (Liquid suspension culture)이 가능한 체세포 배성 캘러스를 유도 후, 세포 배양에 의한 PEDC 형태의 체세포 배를 유도하는 단계. 이때 하기 (a) 내지 (c)의 단계를 포함할 수 있다.
(a) IEDC 형의 체세포 배로부터 깨어지기 쉬운 형태의 체세포 배성 캘러스 유도
(b) 단세포 및 다세포의 분리 및 배양
(c) PEDC 유래의 체세포 배를 유도
3. 유도된 체세포 배 배양 과정에서 정상적인 체세포 배를 조기에 선발 하는 단계로 기내 배양된 인삼 소식물체 중 정상적인 잎과 줄기를 가진 개체 만 선발하는 단계.
4. 소식물체 생존율를 극대화 할 수 있는 기술 개발 단계로 순화 중간 과정 중 단계별 최적 방법 또는 기술 적용 단계. 이때 하기 (a) 내지 (c)의 단계를 포함할 수 있다.
(a) 담액식 수경재배 (DWC : Deep Water Culture)
(b) 분무식 수경재배 (Aeroponics)
(c) 박막식 수경 재배 (NFT : Nutrient Film Technology)
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
인삼 종자는 저온 처리 후 개갑된 종자를 시중에서 구입하여 사용하였다.
기내 배양 시 단계별 배양배지는 하기와 같이 사용하였다:
(1) 실시예 <1-1> 내지 <1-3>의 접합 배로부터 캘러스 및 체세포 배성 세포 유도는 MS 기본 배지 + 2,4-D (2,4-dichlirophenoxyacetic acid) 0.5 내지 1.0 ppm
(2) 실시예 <1-4>의 체세포 배의 증식은 MS 기본 배지 + 2,4-D 1.0 + NAA (α-naphthaleneacetic acid) 0.6 내지 1.6 ppm + kinetin 0.2 ppm
(3) 실시예 2의 체세포 배로부터 완전한 소식물체 분화는 MS 기본배지 + GA3 5 내지 15 ppm
<실시예 1>
<1-1> 인삼 종자의 표면 소독
시중에서 구입한 인삼 종자를 배양 재료로 사용하기 위하여 세척 및 멸균하였다. 구체적으로는 개갑된 종자를 주방세제와 수돗물로 깨끗이 씻은 다음 물기를 제거하고 소독된 용기에 넣은 후 70% (v/v) 주정에 1분 간 침지 시킨 후, 주정을 제거하고 멸균수로 한번 헹구어 준 다음 4% (v/v) 차아염소산 용액에 10 분 간 침지하였다. 그 후, 차아염소산 용액을 제거한 후, 멸균수로 3회 씻어 무균 상태의 종자를 만들어 공시재료로 사용하였다.
<1-2> 접합 배 적출 및 배양
무균 상태인 종자로부터 접합 배를 적출하여 식물생장조절물질 (plant growth regulator) 이 함유된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 기본 배지에 접합 배를 치상하여 60일 간 배양하였다. 이때 광도는 1,000 lux 이하로 조절하였으며, 배양 온도는 26 ℃로 고정하였다.
<1-3> IEDC 형 체세포 배의 유도
접합 배 (zygotic embryo) 배양 60일 후 부정형의 캘러스와 갈색을 띠는 캘러스를 제거하고, 옅은 노랑색을 띄며, 체세포 배의 전형적인 모습을 보이는 캘러스 조직만 따로 분리하여(도 1) 계대배양(subculture)을 하였으며, 계대배양의 주기는 생장속도에 따라 30일 또는 60일 간격으로 실시하였다. 계대배양 시 체세포 배에서 부정형의 세포나 갈색의 세포 덩어리를 제거하고 다량의 체세포 배를 생산하는 체세포 배 조직만 선발하여 지속적인 계대배양을 실시하였다. 이 과정에서 다수의 IEDC 형 체세포 배를 얻을 수 있었다(도 2).
<1-4> IEDC 형 체세포 배로부터 깨지기 쉬운 형태의 체세포 배성 캘러스의 유도
IEDC 형 체세포 배의 경우 조직이 치밀하여 자체적으로는 소식물체로 분화 (regeneration)가 가능하지만, 물리적인 힘을 주어 단세포나 다세포로 분리하기 힘들다. 그러므로 단세포나 다세포로 분리하기 힘든 체세포를 제거하거나, 잘 부서지는(friable) 세포로 이루어진 체세포 배가 만들어질 때까지 IEDC 형 체세포 배를 계대배양을 하였다 (도 3). 부서지기 쉬운 형태의 체세포 배를 무균상 (clean bench) 내에서 소독된 용기에 액체 MS 배지와 함께 넣은 후 유리봉으로 물리적인 힘을 가해 부수어 단세포나 다세포를 조제하였으며, 거즈를 이용하여 직경 0.1mm 이상의 세포 덩어리는 제거하고, 이후 특수하게 고안된 250 mm 메쉬 (mesh)를 이용하여 액체 배양에 적합한 세포를 분리하여 지속적으로 계대배양을 수행함으로써 체세포 배성 (embryogenic) 세포의 증식을 도모하여 체세포 배성 캘러스를 유도하였다(도 4). 이때 배양은 로타리 방식의 진탕배양기를 사용하였으며, 이때 진탕배양기의 회전 속도는 150 rpm을 유지시켰다.
<1-5> 단세포 및 다세포 배양체의 분리 및 배양, 그리고 PEDC 형 체세포 배의 유도
액체 현탁배양(즉, 진탕배양)으로부터 얻은 단세포 혹은 일부 다세포 배양체를 반고체 MS 배지에서 배양하였다. 그리고 하나의 체세포로 분리되어 자라는 것만 PEDC 형 체세포 배로 인정하고 나머지는 제거하거나, 계대배양 재료로 사용하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 얻은 PEDC 형 체세포 배를 기내에서 재분화하여 소식물체를 얻었다(도 5 및 도 6). 이때 PEDC 형 체세포 배로부터 얻은 소식물체 중 한 개의 자엽과 뿌리를 가진 개체만 정상적인 개체로 규정하고 이를 선발하여 순화 실험에 사용하였다. 비정상적인 형태의 잎을 가진 개체, 비정상적인 뿌리를 가진 개체 등은 비정상 개체로 규정하였다. 도 6은 소식물체를 배양하는 전경이다.
정상 개체와 비정상 개체의 순화를 위해서 기내 배양된 소식물체를 담액식 수경 재배로 7일 간 실시하였으며, 이때 비닐을 덮어주어 재배상 내부의 상태습도가 95% 이상 유지되도록 하였으며, 이후 비닐을 벗겨내고 정상적인 소 식물체로 발육한 개체의 수를 측정하여 하기 식 1과 같이 생존율을 평가하였다.
<식 1>
생존율(%) = (정상적인 소식물체로 발육한 개체의 수/순화에 사용한 개체 수) X 100
그 결과, 정상적인 개체로 선발하여 순화에 사용한 경우 개체의 생존율은 95% 이상인 반면 비정상 개체는 순화 시 5% 내외의 생존율을 보였다. 구체적으로, 개체의 형태에 따라 PEDC 형 체세포 배의 형태가 정상적인 소식물체로 발육하는 비율은 하기 표 1과 같다.
| 종류 | 개체별 형태적인 특징 | 생존율(%) |
| 정상 개체 | 자엽과 뿌리 형성 | 97 |
| 비정상 개체 | 자엽과 비정상적인 뿌리 형성 | 3 |
| 부정형의 자엽과 뿌리 형성 | 0 | |
| 유리질화 된 자엽과 뿌리 형성 | 0 | |
| 여러개의 자엽과 뿌리 미형성 | 5 |
<실시예 3>
실시예 1에서 얻은 PEDC 형 체세포 배를 기내에서 재분화하여 소식물체를 얻었다. 이때 PEDC 형 체세포 배로부터 얻은 소식물체 중 한 개의 자엽과 뿌리를 가진 개체만 정상적인 개체로 규정하고 이를 선발하여 실시예 3의 순화 실험에 사용하였다.
기내 소식물체를 기외에서 순화를 시키기 위해서 총 3달이 소요되었다. 이때 순화 과정은 1 달 간격으로 1 단계, 2 단계, 3 단계로 나누었으며, 각 단계별로 서로 다른 수경재배 시스템을 적용하여, 단계 별로 하기 식 2와 같이 생존율 및 생장 상태를 평가하였다. 생장 상태는 순화에 사용된 개체 수에 대해 잎사귀가 100% 전개되며 짙은 녹색을 띄고 잔뿌리가 10 개 이상 유도된 경우 극히 양호, 잎사귀가 90% 이상 100% 미만 전개되며 짙은 녹색을 띄며 잔뿌리가 7개 이상 유도된 경우 양호, 잎사귀가 85% 이상 90% 미만 전개되며 녹색을 띄고 잔뿌리가 5개 이상 유도된 경우 보통, 잎사귀가 50% 이상 85% 미만 전개되며 옅은 녹색을 띄며 잔뿌리가 5개 미만 유도된 경우 불량, 잎사귀가 50% 미만 전개되며 짙은 노랑색을 띄고 잔뿌리가 유도되지 않는 개체를 극히 불량으로 나누었다.
<식 2>
순화 단계에 따른 생존율(%) = (정상적인 소 식물체로 발육한 개체의 수/순화에 사용한 개체 수) X 100
<3-1> 순화 1 단계 시험
1 단계에서는 기내 배양된 3 내지 5cm 크기의 소식물체를 기외에서 순화하기 위해 3 가지의 수경재배 기술을 적용 한 결과 담액식 수경재배가 가장 양호한 생장 상태와 높은 생존율을 보인 반면 분무식 수경재배는 보통의 생장 상태와 약 50%의 생존율을 보였으며, 박막식 수경재배의 경우 대부분이 불량한 생장 특성과 70% 정도가 고사하였다(표 2).
따라서 1 단계에서는 담액식 수경재배 시스템을 사용하는 것이 클론 묘의 생장 및 생존에 탁월한 것으로 나타났다(도 7).
<3-2> 순화 2 단계 시험
상기 1 단계에서 담액식 수경재배 시스템을 사용하는 것이 클론 묘의 생장 및 생존에 탁월한 것으로 나타났다. 그러므로 담액식 수경 재배를 통해 1 단계 순화를 실시한 후 여기에서 1 개월 정도 자란 클론 묘를 공시재료로 사용하여 순화 2 단계 시험을 실시하였다.
그 결과, 2 단계에서 담액식 수경재배를 계속 할 경우 1 단계보다는 생장이 둔화될 뿐 만 아니라, 무엇보다도 뿌리 무름병과 뿌리 썩음병이 빈번히 발생함으로 최종적인 생존율이 50% 정도로 나타났다. 반면 2 단계에서 분무식 수경재배 방식을 적용할 경우 뿌리무름병이나 뿌리 썩음 병의 발생이 줄어드는 반면 뿌리의 비대가 잘 되지 않으며 줄기의 경우도 보통의 생장 특성과 70% 수준의 생존율을 보였다. 2 단계에서 박막식 수경 재배 방식을 채택 한 경우 생장 생장 상태가 양호 하였을 뿐 아니라 생존율도 80%에 비교군 가운데 가장 높았다(표 2).
그러므로 1 단계에서 담액식 수경재배 시스템을 사용한 후, 2 단계에서 박막식 수경재배 방식을 사용하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다(도 8).
<3-3> 순화 3 단계 시험
클론 묘를 1 단계인 담액식 수경재배 방식으로 1달 키운 후, 이를 2단계에서는 박막식 수경재배 방식으로 키운 후 3 단계를 위한 공시 재료로 사용하였다.
3 단계에서 역시 담액식 수경재배 시스템보다는 박막식 수경재배 시스템이 조금 더 나은 생장 상태와 생존율을 보였으나, 분무식 수경재배 시스템의 경우 뿌리의 비대나 줄기의 생장에 있어서 극히 양호한 생장 상태 뿐 만 아니라 100% 의 생존율을 보였다(표 2)(도 9).
| 단계 | 적용된 기술 | 생장 상태 | 생존율(%) |
| 1 단계 | 담액식 수경 재배 (DWC) | 극히 양호 | 90 |
| 분무식 수경 재배 (Aeroponics) | 보통 | 50 | |
| 박막식 수경 재배 (NFT) | 극히 불량 | 30 | |
| 2 단계 | 담액식 수경 재배 (DWC) | 보통 | 50 |
| 분무식 수경 재배 (Aeroponics) | 보통 | 70 | |
| 박막식 수경 재배 (NFT) | 양호 | 80 | |
| 3 단계 | 담액식 수경 재배 (DWC) | 보통 | 60 |
| 분무식 수경 재배 (Aeroponics) | 극히 양호 | 100 | |
| 박막식 수경 재배 (NFT) | 양호 | 90 |
<실시예 4>
<4-1>
최적의 산도 (pH) 조건을 구명하기 위하여, 24 시간 방치한 수돗물에 산도를 4.0 에서 8.0 까지 0.2 간격으로 조절한 다음 실험을 실시하였다. 산도가 4.6 이하와 7.0 이상의 처리구에서는 생장을 멈춘 반면 4.6 에서 6.0 까지는 산도가 증가함에 생장 속도가 빨라지는 경향을 나타낸 반면, 6.0 에서 7.0 사이에서는 점차적으로 생장이 떨어지는 것을 알 수 있었다. 최적의 산도는 5.8 에서 6.0 으로 나타났다.
또한 최적의 광도 (lux)를 구명하기 위하여, 24 시간 방치한 수돗물에 광도는 1,000 lux 에서 10,000 lux 까지 1,000 lux 간격으로 처리하였다. 그 결과 초기 생장 (1 단계) 은 생장은 1,000 lux 에서 7,000 lux 까지 좋은 반응을 보였으나 3,000 lux 이상에서는 급속히 노화되면서 잎의 빛깔이 노란색에서 옅은 녹색으로 바뀌며 1달 후 부터는 생장 속도가 느려지는 것을 알 수 알 수 있었다. 반면 3,000 lux 이하에서는 줄기가 웃자라는 현상이 있어났다. 3 단계에서는 3,000 lux 보다 5,000 lux 에서 생장과 생존율이 모두 높게 나타났으며, 5,000 lux 이상에서는 초기 생장에서처럼 잎의 노화 현상이 나타났다.
또한 근권 온도의 조건을 구명하기 위해 모든 처리구에서 주간에는 16 시간 동안 26 ℃로 유지하였으며, 야간에는 18 ℃에서 26 ℃까지 2 ℃ 간격으로 처리구를 달리하여 실험하였다. 그 결과 22 ℃에서 생장과 생존율 모두에서 18 ℃, 20 ℃, 24 ℃ 및 26 ℃에서 재배한 실험군군에 비해 가장 좋았다.
결론적으로, 1 단계 및 2 단계의 수경재배에 사용된 배양액은 기본적으로 수돗물을 24시간 양액 저장고에 저장한 후 사용 하였는데, 수돗물을 바로 사용하는 것 보다 초기 생육상태가 다소 좋은 것으로 관찰되었으며, 이는 수돗물 속에 포함된 염소가 24 시간 저장 시 사라지는 것으로 생각되었다. 산도 (pH)는 5.8~6.0 의 처리구가 가장 좋았으며, 4.5 이하이거나 7.0 이상에서는 생육이 크게 저하되었다. 광도는 3,000 lux, 근권 온도는 주간에 26 ℃, 야간에는 22 ℃로 유지하는 것이 가장 좋았으며, 3 단계에서는 다른 조건은 동일하나 광도를 5,000 lux 로 높여주는 것이 생장과 생존율 모두에서 비교군에 비해 가장 좋았다.
<4-2>
클론 묘를 1 단계인 담액식 수경재배 방식으로 1달 키운 후, 이를 2단계에서는 박막식 수경재배 방식으로 키웠다. 이때 1 단계 및 2 단계의 수경재배에 사용된 배양액은 기본적으로 수돗물을 24시간 양액 저장고에 저장한 후 산도 (pH)를 6으로 조절하여 사용하였으며, 광도는 3,000 lux, 근권 온도는 주간에 26 ℃, 야간에는 22 ℃로 유지하였다. 그리고 이를 순화 3 단계에서 배지 종류 시험의 공시 재료로 사용하였다.
순화 3 단계에서 수경재배 클론 묘의 생장을 극대화하기 위하여 MS 배지를 다양한 농도로 만들어 생장 상태 및 생존율을 평가하였다. 이때 생존율은 상기 식 2와 동일하게 계산하였으며, MS 배지 외 다른 성분으로는 증류수를 사용하였다. 예컨대 1/4 MS 배지 조성의 경우, 부피 기준으로 1/4는 MS 배지이고 3/4는 증류수이다.
그 결과, 1/32 MS 배지를 사용한 경우 생존율이 100%로 매우 양호하였다(표 3).
| 배지 조성 | 생장 상태 | 생존율 (%) |
| MS (full strength) | 극히 불량 | 1 |
| 1/2 MS | 극히 불량 | 5 |
| 1/4 MS | 불량 | 10 |
| 1/8 MS | 불량 | 30 |
| 1/16 MS | 보통 | 50 |
| 1/32 MS | 극히 양호 | 100 |
| 1/64 MS | 양호 | 70 |
Claims (11)
- IEDC(Induced Embryogenic Determined Cell) 형 체세포 배로부터 PEDC (Pre Embryonic Determined Cell) 형 체세포 배를 유도하는 단계를 포함하는 인삼의 생산 방법.
- 제 1항에 있어서,
PEDC 형 체세포 배를 재분화하여 소식물체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 2항에 있어서,
소식물체를 순화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 1항에 있어서,
IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계는 IEDC 형 체세포 배를 계대배양한 후 물리적 힘을 가하여 단세포나 다세포를 조제하고, 이를 계대배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 1항에 있어서,
IEDC 형 체세포 배로부터 PEDC 형 체세포 배를 유도하는 단계는 IEDC 형 체세포 배를 계대배양한 후 물리적 힘을 가하여 단세포나 다세포를 조제하고, 이를 계대배양하여 체세포 배성 캘러스를 유도하고, 상기 체세포 배성 캘러스로부터 단세포 또는 다세포 배양체를 얻어 이를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 3항에 있어서,
상기 순화는 담액식 수경 재배, 박막식 수경 재배 및 분무식 수경 재배로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 3항에 있어서,
상기 순화는 담액식 수경 재배, 박막식 수경 재배 및 분무식 수경 재배를 순차적으로 이용하여 3개 이상의 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 7항에 있어서,
각각의 단계는 10일 내지 45일의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 7항에 있어서,
담액식 수경 재배 및 박막식 수경 재배는 2000 lux 이상 4000 lux 이하의 광도 조건 하 수행하고 분무식 수경 재배는 4000 lux 초과 6000 lux 이하의 광도 조건 하 수행하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 7항에 있어서,
분무식 수경 재배는 MS 배지를 1/128 이상 1/16 미만 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 인삼은 인삼 클론 묘인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020210164794A KR102664046B1 (ko) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | 식물공장 시스템을 이용한 인삼 및 인삼 클론 대량생산 방법 |
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