CN105566207B - 一种基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针，该探针化学名称为N,N‑二((4‑(2’‑(4”‑十二烷基)吡啶‑4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺，其化学结构通式如式(I)所示。本发明还公开了所述荧光探针在标记或显示组织中的细胞膜形态和活细胞中的应用。实验证实，本发明的探针能够均匀连续地染色细胞膜，而且由于其是转子型分子，绑定到高粘度的细胞膜后能够发出明亮的双光子深红光，预示其作为细胞膜荧光探针具有很好的前景，有望填补细胞膜探针在组织成像方面的空缺。同时本发明的探针具有适用范围广，光稳定性好，细胞毒性低，以及能在活性细胞中专一成像细胞膜的特点。

Description

一种基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发 射的荧光探针
技术领域
本发明涉及一种基于分子转子的高信噪比细胞膜探针及其应用，尤其涉及一种适用于双光子显微镜近红外激发光源深红发射的细胞膜荧光探针及其在标记或显示组织中的细胞膜形态和活细胞中的应用。
背景技术
细胞膜作为真核细胞的第一屏障，通过选择性地调节某些物质的进出，保证了细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序进行。同时，细胞膜与信号传导，细胞分化，细胞融合，细胞识别等细胞活动息息相关。据我们所知，相比人工体外培养的细胞，许多细胞的状态及基本功能在组织中能更好地反应其真实自然的情况。比如在体外培养的细胞的细胞膜形态与其在真实组织中的形态存在着很大的不同。因此原位实时地可视化细胞膜对于我们理解其相关的生理过程及形态是非常必要的。目前，荧光探针由于非侵入性、原位实时快速检测的特点已成为一种非常有利的生物成像工具。因此，开发一种能够在细胞中特别是组织中准确勾勒细胞边缘的细胞膜荧光探针是十分必要的。
大量的研究已经表明双光子显微镜(TPM)比单光子显微镜在生物成像方面特别是厚的或高散射的组织样品的成像更具有优势。因为使用长波长的近红外光作为激发源和更小的激发面积，TPM大大减小了对样品光漂白作用。同时长波长的激发源也有效地避开了细胞的自吸收和光散射，从而增大了样品的穿透深度。因此，一些用于TPM的细胞膜探针已经被成功开发。Laurdan是早期开发的可用于成像细胞膜的双光子探针，但是对细胞膜磷脂较弱的亲和力导致它们内在化极其严重(Y.X.Zeng.et al.,2014.Proc.of SPIE Vol.9230)。近期，Chi-Kin Koo et al.等人报道了一个大双光子吸收截面的细胞膜探针，然而细胞图片的保真度较低(Chi-Kin,K.et al.,2009,Inorg.Chem.,48,7501)。相比普通的双光子细胞膜探针，基于转子型的双光子细胞膜探针有利于增强信噪比，提高照片质量。分子转子的荧光强度强烈地依赖于环境的粘度，在高粘度环境下，其自由旋转受阻，辐射跃迁增强，导致荧光增强。分子转子的这一性质正好可以应用到具有高粘度的细胞膜，从而使探针一旦靶向到细胞膜后荧光显著增强，实现荧光的turn-on效果，提高照片的信噪比。
在生物成像中，红光或深红光发射也是十分有利于厚组织样品内信号的检测。首先，长波长的红光或深红光比短波长的蓝绿光穿透力更强，能够提高对生物样品的探测深度。其次，红光或深红光的波长处于生物光学窗口，光毒性低，大大降低了对样品的光损伤。而且，长波长的红光或深红光发射有效地避开了细胞的自吸收和自发荧光，有利于提高信噪比。因此，开发双光子红光或深红光发射的膜探针对于成像组织中的细胞膜探针十分有利。然而，双光子红光或深红光的细胞膜探针却鲜有报道。据我们所知，只有两个基于纳米粒子的红发射的双光子细胞膜探针被Liu et al.所报道(P.Liu,et al.,2015,Appl.Mater.Interfaces,7,6754)。这两个探针都是通过荧光能量共振转移将一个绿色的荧光团共轭地连接到一个红色的荧光团，进而实现了长波长的红光发射。无疑，这样一方面增大了合成的难度，另一方面这样大的分子结构限制了其在组织样品中的应用。基于此，研究和开发新型的能够清晰可视化细胞内特别是组织中的细胞膜的荧光探针具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针。
本发明所述基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针为转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针，为三苯胺衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学名称为：N,N-二((4-(2’-(4”-十二烷基)吡啶-4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺，其化学结构通式如式(I)所示：
上述转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针的制备方案概述如下：
以红发射的苯乙烯吡啶盐分子进行改造。为了使该分子有大的双光子吸收截面，将两个这样的结构通过三苯胺连接起来，这样可在两个方向实现光场极化，大大增强了分子的双光子吸收截面。本发明经大量的试验筛选将连接体确定为三苯胺，是由于三苯胺本身具有转子的性质，这一特性正好可以应用于具有高粘度的细胞膜，实现荧光的turn-on效果，提高信噪比。在两个吡啶盐处各接十二个碳原子的亲脂性的长烷基链能够保证很好地绑定到磷脂双分子层中，减小内在化。基于以上方案和反复试验，深红发射的双光子的三苯胺衍生物T1(N,N-二((4-(2’-(4”-十二烷基)吡啶-4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺)最终形成。
具体的，上述深红发射的双光子的三苯胺衍生物T1的制备反应式如下：
本发明所述转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针在标记或显示组织中的细胞膜形态和活细胞中的应用。
其中，所述组织为小鼠肌肉组织和肝脏组织；所述活细胞为永生化细胞和正常细胞。所述永生化细胞是HeLa细胞和SiHa细胞，所述正常细胞是HUVEC细胞。
实验结果证实，本发明所述的转子型的双光子深红发射的细胞膜荧光探针(T1)在高粘度环境(甘油)中的荧光强度明显高于普通的有机溶剂。高的信噪比使它能够清晰地染色永生化细胞(HeLa细胞和SiHa细胞)和正常细胞(HUEVC细胞)的细胞膜，并且发出明亮的深红色荧光。将本发明公开的荧光探针T1与鉴别凋亡或死细胞的商业化染料SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)进行共染实验的结果表明T1能够染色活细胞。在TPM下，T1也能够均匀连续地染色组织(小鼠肌肉组织或肝脏组织)中的细胞膜。同时细胞实验也证实了该探针具有低的毒性、优秀的光稳定性以及和其他探针很好的兼容性，提示该探针有望为研究与细胞膜相关的生理和病理活动提供直观的和有利的影像证据。
本发明提供的基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针是首次报道的可成像组织中细胞膜的双光子深红发射的探针分子。与功能相近的其他细胞膜荧光探针相比，本发明所述探针具有分子结构小、光稳定性强、兼容性好、斯托克斯位移大、激发能量低、双光子吸收截面大的特点。本发明的荧光探针T1是一个转子型的探针分子，能够在高粘度的细胞膜上实现荧光turn-on效果，预示其作为细胞膜荧光探针具有很好的前景，有望填补细胞膜探针在组织成像方面的空缺。
附图说明
图1：染色HeLa细胞的照片。
(I)用T1染色后在800nm激光辐照下得到的双光子照片。其中a图为双光子荧光照片；b图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图。
(II)分别用T1和S-11348染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中d图为用T1染色后在488nm激光辐照下得到的照片；e图为用S-11348染色后的在405nm激光辐照下得到的照片；f图为d、e的叠加图。
(III)分别用T1和Hoechst 33342染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中g图为用T1染色后在488nm激光辐照下得到的照片；h图为用Hoechst 33342染色后的在405nm激光辐照下得到的照片；i图为g、h的叠加图。
图2：T1分别染色SiHa细胞(I)和HUVEC细胞(II)的共聚焦荧光照片。
其中a、d为488nm激光辐照下得到的照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。
图3：T1染色HeLa细胞的共聚焦(I)和双光子(II)荧光照片。
其中Ia图为488nm激光辐照下得到的照片，IId图为800nm激光辐照下得到的双光子照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。T1染色HeLa细胞后在488nm和800nm激光连续辐照下获得的一系列不同时间的共聚焦(III图)和双光子(IV图)荧光照片。
图4：用T1染色小鼠肌肉组织(I图)和肝脏组织(II图)后在800nm激光辐照下得到的双光子荧光照片。
其中a、d图为双光子荧光照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。
具体实施方式
实施例1：
N,N-二甲酰基苯胺的合成
将干燥的DMF(3.7mL)和三氯氧磷(3.7mL,40.7mmol)混合加入三口烧瓶，在0℃下搅拌。30min后，将溶于氯仿中的三苯胺(1.0g,4.0mmol)逐滴加入上述混合物中，加热搅拌24h。反应结束后冷却至室温，加入适量的氢氧化钠和水，然后用二氯甲烷萃取，水洗。用无水硫酸钠进行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物进行柱层分析获得最终产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.88(s,2H),7.85(d,J＝8.64Hz,4H),7.49(t,J＝7.84Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.17(d,J＝8.56Hz,4H).
1-十二烷基-4-甲基吡啶-1碘化物的合成
将4-甲基吡啶(2mL,20mmol)和1-碘十二烷混合，以乙醇为溶剂，加热回流。24小时后反应结束，真空蒸馏除去乙醇，得到粗产品。然后用乙醇冲洗3遍，石油醚冲洗三遍，得到最终产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.93(d,J＝6.4Hz,2H),7.99(d,J＝6.4Hz,2H),4.52(t,J＝7.4Hz,2H),2.61(s,3H),1.89(q,J＝7.2Hz,2H),1.23(s,18H),0.85(t,J＝6.8Hz,3H).
N,N-二((4-(2’-(4”-十二烷基)吡啶-4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺的合成
将N,N-二甲酰基苯胺和1-十二烷基-4-甲基吡啶-1碘化物混合，以乙醇为溶剂，哌啶作为催化剂，回流反应24小时后，固体析出，直接过滤得到粗产品。然后用乙醇冲洗3遍，石油醚冲洗三遍，得到最终产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.91(d,J＝6.8Hz,4H),8.20(d,J＝6.8Hz,4H),8.01(d,J＝16Hz,2H),4.47(t,J＝7.2Hz,4H),1.91(d,J＝6.4Hz,4H),1.27(d,J＝5.2Hz,8H),1.24(s,28H),0.85(t,J＝6.8Hz,6H).
实施例2：永生化的癌细胞(HeLa和SiHa)和正常细胞(HUVEC)培养
HeLa、SiHa、HUVEC细胞株均是在37℃，5％CO2的CO2培养箱中进行培养。HeLa和SiHa细胞株在内含10％胎牛血清和1％双抗的H-DMEM培养液中贴壁培养。HUVEC细胞株于内含10％胎牛血清和2ng/mL FGF-2M199培养液中贴壁培养。等细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100mL细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1mL 0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1×105)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。
实施例3：T1染色HeLa细胞的双光子荧光显微实验
将接好的细胞爬片用2μM T1染色，在CO2培养箱中孵育20min。吸出培养液后用PBS洗三遍，将细胞爬片取出，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在双光子荧光显微镜下进行观察，发现，细胞膜被T1均匀连续地着色。因此，本发明所述探针T1是一个双光子的细胞膜探针。
结果见图1(I)。用T1染色后在800nm激光辐照下得到的双光子照片。其中a图为双光子荧光照片；b图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图。
实施例4：T1染色活细胞的证明实验及T1可与其他探针兼容性的实验
S-11348为一种商业化的只染凋亡细胞或死细胞的核酸的荧光染料。将接种好的细胞爬片用2μM T1进行染色，在CO2培养箱中培养20min。吸出培养液后，然后再用5μM的S-11348染色细胞，在CO2培养箱中培养5min。然后用PBS洗三遍，将细胞爬片取出，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在共聚焦显微镜(激发波长：488nm)分两个通道分别收集T1和S-11348的信号。结果发现，能够被T1均匀连续染色细胞膜的细胞均没有来自S-11348的荧光，因此可证明T1能够染色活细胞。
结果如图1(II)。分别用T1和S-11348染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中d图为用T1染色后在488nm激光辐照下得到的照片；e图为用S-11348染色后的在405nm激光辐照下得到的照片；f图为d、e的叠加图。
Hoechst 33342是一种商业化的可染色DNA的细胞核染料。将接种好的细胞爬片用2μM T1进行染色，在CO2培养箱中培养20min。吸出培养液后，然后再用5μM的Hoechst 33342染色细胞，在CO2培养箱中培养30min。然后用PBS洗三遍，将细胞爬片取出，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在共聚焦显微镜在激发波长分别为488nm和405nm下分两个通道分别收集T1和Hoechst 33342的信号。结果发现，凡是细胞膜被T1着色的细胞同时其细胞核也被Hoechst 33342着色，可见T1能够和Hoechst相兼容。
结果见图1(III)。分别用T1和Hoechst 33342染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中g图为用T1染色后在488nm激光辐照下得到的照片；h图为用Hoechst 33342染色后的在405nm激光辐照下得到的照片；i图为g、h的叠加图。
实施例5：T1染色SiHa、HUVEC细胞
将接好的细胞爬片用2μM T1染色，在CO2培养箱中孵育20min。吸出培养液后用PBS洗三遍，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在共聚焦荧光显微镜进行观察，发现，细胞膜被T1均匀连续地着色。因此，本发明所述探针T1也能专一性地成像SiHa、HUVEC细胞的细胞膜。
结果见图2。T1分别染色SiHa细胞(I图)和HUVEC细胞(II图)的共聚焦荧光照片。其中a、d为488nm激光辐照下得到的照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。
实施例6：T1染色HeLa细胞的共聚焦、双光子照片及连续激光辐照下光稳定性实验
将接种好的细胞爬片用2μM T1进行染色，在CO2培养箱中培养20min。吸出培养液后用PBS洗三遍，将细胞爬片取出，细胞生长面朝下盖在载玻片上，分别在共聚焦显微镜(激发波长：488nm)和TPM(激发波长：800nm，平均飞秒脉冲功率为3mW)下进行连续辐照一系列时间观察细胞。
结果见图3。T1染色HeLa细胞的共聚焦(I图)和双光子(II图)荧光照片。其中Ia图为488nm激光辐照下得到的照片，IId图为800nm激光辐照下得到的双光子照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。T1染色HeLa细胞后在488nm和800nm激光连续辐照下获得的一系列不同时间的共聚焦(III图)和双光子(IV图)荧光照片。
实施例7：T1染色小鼠肌肉组织和肝脏组织的双光子显微实验
将从小鼠体内取出的肌肉组织和肝脏组织分别培养在装有细胞培养液的培养小皿中，然后用10μM的T1染色，在CO2培养箱中培养40min。吸出培养液后用PBS洗三遍。然后在TPM(激发波长：800nm)下进行观察。
结果见图4。用T1染色小鼠肌肉组织(I图)和肝脏组织(II图)后在800nm激光辐照下得到的双光子荧光照片。其中a、d图为双光子荧光照片；b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b的叠加图,f图为d、e的叠加图。

Claims (4)

1.一种转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针，为三苯胺衍生物，其特征在于：所述探针化学名称为N,N-二((4-(2’-(4”-十二烷基)吡啶-4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺，其化学结构通式如式(I)所示：
2.权利要求1所述转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针在标记或显示组织中的细胞膜形态和活细胞中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述组织为小鼠肌肉组织和肝脏组织；所述活细胞为永生化细胞和正常细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述永生化细胞是HeLa细胞和SiHa细胞，所述正常细胞是HUVEC细胞。
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