JP4318180B2

JP4318180B2 - タンパク質の飽和標識用の試薬及び方法

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Publication number: JP4318180B2
Application number: JP2004518895A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムズ，カレン; ストーン，ティモシー; シモンズ，エイドリアン・クリストファー; スウィート，アリソン・クレアー; フォウラー，スーザン・ジャネット
Original assignee: ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2002-07-08
Publication date: 2009-08-19
Anticipated expiration: 2022-07-08
Also published as: ES2341946T3; DE60235652D1; EP1520176B1; US20050233462A1; WO2004005933A1; CA2491692C; AU2002317958B2; ATE460670T1; JP2005532543A; CN1650168A; US7511155B2; CN1307263C; AU2002317958A1; CA2491692A1; EP1520176A1

Description

本発明は、蛍光染料並びにディファレンシャルタンパク質分析が可能となる複合タンパク質試料の標識方法に関する。

二次元ディファレンスゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）では、二次元（２Ｄ）電気泳動分離の前に、タンパク質試料を標識するためスペクトル分割された整合蛍光染料が用いられる（Ｍｉｎｄｅｎ，Ｊ．ｅｔａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，（１９９７），１８，２０７１）。この蛍光多重化法は、従来の二次元電気泳動の多くの問題を解決する。タンパク質試料の蛍光プレラベリングによって、複数の試料を同一ゲルで流すことができ、蛍光イメージをオーバーレイすることによって試料間の量的な差を容易に同定することができる。蛍光多重化するには、複数のタンパク質試料を染料で同等に標識しなければならず、量的な差が検出できるように標識タンパク質のゲル中での移動が位置的に整合していなければならない。

国際公開第９６／３３４０６号（Ｍｉｎｄｅｎ．Ｊ．ｅｔａｌ）には、二次元電気泳動の前に、スペクトル分割された整合蛍光染料を試料中のタンパク質の標識に用いて、異なる細胞試料間の差を検出する方法が開示されている。記載された染料は、移動度が同じになるように分子量及び電荷の整合した染料群である。この方法では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル反応性基を有するシアニン染料を用いてアミン類を標識する。ＮＨＳエステル基は、タンパク質中のリジン残基のε−アミノを標的とし、共有結合による標識がなされる。３種類の異なる染料（Ｃｙ２（商標）、Ｃｙ３及びＣｙ５）を誘導体化して多重化を可能とする。これらの染料分子は約５００ダルトンの分子量を有しており、標識タンパク質移動度が同じになるように質量が整合している。染料のリジンへの染料の結合によるリジンの正電荷の喪失を補うため、染料はシアニン蛍光団に固有の電荷に依拠する。国際公開第９６／３３４０６号には、結合可能な部位の１〜２％を標識するという最小標識法で染料を使用することが記載されている。移動度を揃えるため、シアニンのインドール環同士の間のリンカー長の差を、インドール窒素に結合した脂肪族鎖の鎖長を２炭素単位ずつ調整して補うことによって、染料ペアの質量を整合せしめている。こうした基準を満足する２種以上のスペクトル分割染料が、最小標識用の整合染料セットとなる。プロピルＣｙ３及びメチルＣｙ５を用いてタンパク質を標識し、次いで二次元分離してイメージをオーバーレイすると２つの標識試料の位置が整合することから、リジンの最小標識用整合染料セットの移動度が等しいことが実証されている。

リジン残基はタンパク質に極めて豊富に存在しており、この標識法で複合試料中に存在するすべてのタンパク質が標識される。しかし、タンパク質の典型的なリジン含有量は７％であり、タンパク質中のすべてのリジンが標識されると、染料による多大な質量シフトを生じるはずである。そのため、採用された方針は、５つのタンパク質分子のうちほぼ１分子だけが標識され、もって各標識分子当たりの結合染料が１つだけとなる統計的確率が得られるように、タンパク質を「最小」標識するというものである。これによって、銀染色イメージと酷似した二次元スポットパターンが得られるが、感度とダイナミックレンジが高く、多重化が可能となる。
国際公開第９６／３３４０６号パンフレットＭｉｎｄｅｎ，Ｊ．ｅｔａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，（１９９７），１８，２０７１

典型的な二次元ゲル分析では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる同定のためゲルから所定のタンパク質スポットを「採取」する。最小標識法では、タンパク質当たり２通りのスポット（つまり、標識スポットと非標識スポット）が生じ、タンパク質の大部分は非標識スポットにある。非標識スポットは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでの同定が可能となる十分なタンパク質が回収できる位置になければならない。これには、スポットの採取前に、追加の染色工程が必要とされる。蛍光ゲルからタンパク質スポットを直接採取できるようにするため、１種類のタンパク質につき単一のスポットを与える標識法が必要とされる。

本用いる標識法は、できるだけ多くの標的残基を標識するためタンパク質を染料で飽和させること、及びタンパク質イソフォーム当たり単一の標識スポットを得ることを目的とする。したがって、シアニン染料分子はタンパク質の利用可能な標的アミノ酸残基すべてと結合し、結合染料分子の数がほぼ同じ標識タンパク質分子の単一集団が得られる。本発明では、チオール基を含むシステイン残基を標的とした染料セットを用して、飽和標識を成し遂げる。システイン残基は９５％のタンパク質に存在しているが、各タンパク質中のシステイン残基の数はリジンよりも少ない。このことは、すべてのタンパク質分子を標識できるが、各タンパク質分子は、リジン残基を飽和標識したときよりも標識残基の数が少ないことを意味する。そのため、標識タンパク質の割合が最小標識法よりも高いので検出感度は増大するが、タンパク質は可溶性のままとなる。

システイン残基の飽和標識法での染料の付加による質量の増大（質量シフト）は、リジン残基の最小標識法を採用した場合よりも大きくなる。ただし、質量の増大はリジン残基に飽和標識法を用いた場合よりは少ない。染料の付加による質量シフトの程度は、個々のタンパク質システイン含有量（典型的には約２％）及び標識反応条件下での染料に対するシステイン残基の利用可能性に応じてタンパク質毎に異なるはずである。そのため、得られる二次元スポットパターンは、公表された銀染色二次元タンパク質マップとは非常に異なるものとなる。

そこで、本発明は、システイン含有タンパク質の混合物中で接近可能な、利用可能なシステインすべてを再現性よく標識するための蛍光試薬及び方法を提供する。本発明のシアニン染料誘導体は、有用な蛍光標識のセットを提供するが、各々は共通のコア構造を有していて多重化分析に特に有用である。

したがって、第一の態様では、本発明は、式（Ｉ）及びそれらの塩の２種以上の異なる蛍光染料を含んでなる蛍光染料の整合セットを提供する。

式中、ｎは１、２又は３であって上記染料の各々で異なり、
Ｚ^１及びＺ^２は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
Ｒ^１及びＲ^２基の一方は次式の基であり

（式中、Ｙは標的結合基である。）、
残りのＲ^１又はＲ^２基は、−（ＣＨ_２）_４−Ｗ又は−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｈから選択され、
Ｒ^３基は、Ｒ_１又はＲ_２のいずれかが−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｈである場合（この場合Ｒ^３はＷである。）を除いて、水素であり、
Ｗはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
ｐは３〜６の整数であり、
ｑは２又は３となるように選択され、
ｒは１〜５の整数であり、
上記染料の２種類のｎが＋１だけ異なる場合にはその２種類の染料のｐ、ｑ及びｒの１つは−１だけ異なることを特徴とする。

本発明では、蛍光染料の整合セットであって、セットの各染料がタンパク質に共有結合することができ、セットの染料の１つで標識したタンパク質の電気泳動での相対的移動度が、同一セットの異なる染料で標識した同一タンパク質の電気泳動での移動度と同一又は実質的に同一になるように互いに整合した分子構造及び電荷を染料の各々が有するものが提供される。第１の態様の一実施形態では、染料の整合セットは２種以上の異なる蛍光染料を含み、当該セット中の各染料は、式（Ｉ）の化合物であって、式中、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｙ、Ｗ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上述の定義の通りである。好適には、蛍光染料の整合セット中の異なる染料はスペクトルが分かれており、かかる染料で標識された異なる試料を互いに識別することができる。好適には、染料の整合セットの２種以上の染料は、式（Ｉ）の構造を有しており、トリメチンシアニン染料クラス（ｎ＝１）、ペンタメチンシアニン染料クラス（ｎ＝２）及びヘプタメチンシアニン染料類（ｎ＝３）から選択し得る。

好適には、本発明の蛍光染料の整合セットは、式（ＩＩ）及びそれらの塩の２種以上の異なる蛍光染料を含む。

式中、ｎは１、２又は３であって上記染料の各々で異なり、
Ｒ^１及びＲ^２基の一方は次式の基であり

好ましくは、蛍光染料の整合セットは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の２種以上の異なる染料であって、式中、
ｎは１又は２となるように選択され、
ｐは４又は５となるように選択され、
ｑは２又は３となるように選択され、
ｒは１、２又は３となるように選択されるものを含む。

好ましくは、蛍光染料の整合セットの各染料中の標的結合基Ｙは同一であり、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。各染料について特に好ましい標的結合基はマレイミド基である。

特に好ましいのは、トリメチンシアニン系の染料及びペンタメチンシアニン系の染料から選択される式（Ｉ）又は（ＩＩ）の染料セットである。かかる染料は、Ｃｙ３（商標）及びＣｙ５染料と呼ばれる。シアニン染料に対する吸収及び発光データを、以下の表１に示す。

好適には、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の蛍光染料の塩は、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｒ_３ＮＨ^＋及びＲ_４Ｎ^＋（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである。）から選択し得る．
代替的な実施形態では、染料の整合セットは１以上の追加の染料を適宜含んでいてもよいが、かかる追加の染料の各々が、当該染料で標識したタンパク質の電気泳動での移動度が、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の染料で標識したタンパク質の電気泳動での移動度と同一又は実質的に同一になる電荷及び質量特性を有していることを条件とする。かかる追加の染料としては、ベンゾオキサゾール含有染料が挙げられる。追加の染料の例はＣｙ２である。

タンパク質と結合したときの電気泳動での移動度が整合した式（Ｉ）又は（ＩＩ）の蛍光染料のペアを含む代表的なセットは以下の通りである。

セット１
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｉ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１，３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩ）。

セット２
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−プロピル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩＩ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＶ）。

セット３
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｉ）と、
１−（５−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｖ）。

セット４
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩ）と、
１−（５−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩＩ）。

セット５
１−（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩＩＩ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＶ）。

セット６
１−（６−｛［３−（２−５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＸ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｘ）。

したがって本発明は、使用した条件下、システイン含有タンパク質の混合物中で接近可能なシステイン残基のすべてを再現性よく標識するための試薬の整合セットを提供する。染料が結合するチオール基の中性電荷と釣り合わせるために、全体として中性電荷を備えた染料セットを使用して、ｐＩ次元での同等の移動度を得る。中性シアニン染料は、染料構造に共有結合したスルホン酸又はスルホネート基の置換基によって得ることができる。さらには、同等の質量移動は単に染料セットの分子量の適合化によって成し遂げらるものではなく、かかる染料で標識したタンパク質の位置的整合を成し遂げるために染料の全体としてのサイズ及び質量の注意深い操作を必要とすることが判明した。システイン飽和標識法を用いて移動度を同等にするには、式（Ｉ）の整合染料の各々の質量が１炭素単位だけ異なる染料セットが必要とされる。染料セットは、染料発色団に結合した各種置換基を変えることによって得ることができる。これらの基準を満足する２以上のスペクトル分割染料が、整合飽和染料セットを表す。

本発明はまた、タンパク質中の利用可能な標的アミノ酸残基すべてを標識し、それによって、標識タンパク質分子の単一集団が本質的に得られるように、蛍光染料でタンパク質を飽和標識する方法も提供するものである。好適には、標的アミノ酸はシステイン残基である。「利用可能」という用語は、アミノ酸残基が反応のために蛍光染料に接近可能であることをいう。利用可能なシステイン残基は接近可能で還元（すなわち、遊離チオール）型でなければならない。

したがって、第二の態様では、試料中のタンパク質の混合物を標識する方法であって、タンパク質の各々が１以上のシステイン残基を含んでおり、当該方法が、
ｉ）試料を含む水性液体に、タンパク質と共有結合で反応し得る標的結合基を有する蛍光染料を添加し、
ii）染料をタンパク質と反応させてタンパク質を染料で標識する
ことを含み、タンパク質中の利用可能なシステイン残基すべてを染料で標識することを特徴とする方法が提供される。

好ましくは、第二の態様の方法にかかる蛍光染料はシアニン染料である。本方法で使用されるのに特に好ましいシアニン染料は、スルホン酸又はスルホネート基を含むもの、例えば、式（Ｉ）の染料である。

好ましくは、標的結合基はマレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。

第二の態様に係る好ましい実施形態では、この方法はさらに、工程ｉ）の前に、タンパク質を還元剤で処理する工程を含む。

好ましくは、シアニン染料はタンパク質５０μｇ当たり染料の５〜２００ｎｍｏｌの範囲で使用される。

好ましくは、第二の態様に係る試料中のタンパク質の混合物を標識する方法は、ｐＨ６．０〜９．０で実施される。

本発明はまた、式（Ｉ）の染料を使用して、試料（好適にはタンパク質試料）を標識し、蛍光特性を付与する方法も提供する。したがって、第三の態様では、試料中の１種以上のタンパク質を標識する方法であって、当該方法が、
ｉ）該１種以上のタンパク質を含む液体試料に、次の式（Ｉ）：

（式中、ｎは１、２又は３であって上記染料の各々で異なり、
Ｚ^１及びＺ^２は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
Ｒ^１及びＲ^２基の一方は次式の基であり

（式中、Ｙは標的結合基である。）、
残りのＲ^１又はＲ^２基は、−（ＣＨ_２）_４−Ｗ又は−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｈから選択され、
Ｒ^３基は、Ｒ_１又はＲ_２のいずれかが−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｈである場合（この場合Ｒ^３はＷである。）を除いて、水素であり、
Ｗはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
ｐは３〜６の整数であり、
ｑは２又は３となるように選択され、
ｒは１〜５の整数である。）及びそれらの塩の蛍光染料であって、染料の２種類のｎが＋１だけ異なる場合にはその２種類の染料のｐ、ｑ及びｒの１つは−１だけ異なることを特徴とするものを添加し、
ii）１種以上のタンパク質の標識化に適した条件下で、染料を試料と共にインキュベートすることを含む方法が提供される。

好ましくは、Ｚ^１及びＺ^２の各々は、フェニル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表す。

好ましくは、第三の態様に係る方法は、式（Ｉ）の蛍光染料であって、式中、
ｎは１又は２となるように選択され、
ｐは４又は５となるように選択され、
ｑは２又は３となるように選択され、
ｒは１、２又は３となるように選択されるものを用いる。

好ましくは、標的結合基Ｙは、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。

タンパク質中のシステイン残基の飽和標識法を実施するには、以下に挙げる数多くの反応パラメータを考慮しなければならない。

ｉ）タンパク質チオール基の接近可能性
未変性の折りたたまれたタンパク質では、多くのシステイン残基がジスルフィド結合形成によってタンパク質の二次構造の中に包含されており、分子の核内に埋め込まれていることもある。これらの残基を標識するためには、染料が接近可能となるようにすべく、尿素などのタンパク質変性剤を使用してタンパク質がほどかれねばならず、それらは遊離チオールを作り出すように還元されていなければならない。タンパク質の効率的な還元を可能とするには、還元剤の選択が重要である。一般に使用されれるチオール含有タンパク質還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びβ−メルカプトエタノールである。好適なホスフィン還元剤としては、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。水素化ホウ素ナトリウムを使用してもよい。ＴＣＥＰは効率的な還元をもたらす好ましい還元剤であるものの、染料との反応を低く抑えてしまう。

還元の効率は、還元剤の濃度（タンパク質試料のシステイン含有量に比例）、反応の温度（タンパク質変性に影響を及ぼす）及び反応の所要時間による影響を受ける。還元剤がビーズ上に固定化されると、効率に影響し得る。特定の試料のタイプに対する至適な還元剤濃度は、使用した還元剤と試料のシステイン含有量によって変化するであろう。しかし、（平均システイン含有量を２％と仮定すると）５０μｇのタンパク質は還元のために概して１０ｎｍｏｌのＴＣＥＰを必要とする。システイン含有量がより高い哺乳動物由来の試料の場合であれば、概して２０ｎｍｏｌのＴＣＥＰが使用される。至適な標識をもたらすには、１ｎｍｏｌのＴＣＥＰに対して２ｎｍｏｌの染料の比率を保つことも重要である。

これらの因子の至適な組合せは、個々のタンパク質構造及びシステイン含有量によって変化する。還元温度が高いと、タンパク質の変性が増大する結果標識が高められることとなり、したがってシステインの接近可能性が高められる。しかし、高温はタンパク質に悪影響を及ぼしかねない。尿素はカルバミレートとの平衡状態をもって存在しているが、高温（一般的に＞４０℃）では、かかる平衡状態はカルバミレートの方に偏ったものになる。カルバミレートは尿素よりも化学的に反応性の高い種であり、一級アミン（例えば、リジンのＮ−末端アミノ基及びε−アミノ基）を攻撃して、人工的な電荷の不均一性及び二次元ゲル上での電荷列の発生をもたらすことができる。尿素の存在下、３７℃でのシステイン残基の飽和標識では、カルバミル化効果を呈しない。

ii）染料濃度
シアニン染料の疎水的な性質には、溶解性を助けるために有機溶媒（例えば、１０％ＤＭＦ）の使用が必要である。標識が完遂するように利用可能な標的残基の飽和を成し遂げるには、染料の溶解性を維持しながら、標識のために高濃度の染料を使用することが必要である。シアニン染料に対してスルホネート基を使用することが、高い染料濃度で溶解性を維持するのに役立つ。特定の試料タイプに対する標識反応における至適な染料濃度は、試料のシステイン含有量、及び試料中に標識を妨害するかもしれないその他の成分が何かあるかどうかによって変化するであろう。しかし、飽和標識を成し遂げるのに、染料は常に少なくともチオール含有量を越えて存在するべきであり、至適な飽和標識を生じさせるのに１ｎｍｏｌ対ＴＣＥＰと２ｎｍｏｌの染料の比率を維持することも重要である。染料を過剰に使用することは、概して、５０μｇのタンパク質試料当たり５〜２００ｎｍｏｌの範囲の染料を必要とするはずである。しかし、５０μｇのタンパク質は、標識反応のために概して（平均システイン含有量を２％と仮定すると）２０ｎｍｏｌの染料を必要とする。より高いシステイン含有量を有する哺乳動物試料に対しては、概して４０ｎｍｏｌの染料が使用される。しかし、試料中の他の成分も染料と反応し得る。例えば、肝臓試料はストレス／毒性物質に呼応して上昇したレベルのトリペプチドグルタチオンを含んでいるかもしれない。その結果、標識効率を維持するため、染料濃度を高めることが必要となることもある。高められたレベルのアルブミンを含有する血清試料で、システイン含有量の高いタンパク質の非常に富んだものでもやはり、染料濃度を増大させる必要があるかもしれない。

iii）標識反応のｐＨ
システイン残基は強力な求核試薬であり、ヨードアセトアミド及びマレイミド反応性基を有する試薬を用いて、タンパク質中で標識できる。特に好ましい反応性基は、マレイミド基である。チオール基のｐＫａは、その反応性を決定するのに重要なものである。対応するｐＨを越えると、チオレート（Ｓ⁻）型がプロトン化ＳＨ種に置き換わるにつれてその求核性は著しく増大する。単離システイン分子において、チオール基は約８．６のｐＫａを有しているがタンパク質内のチオールの微小環境もｐＫａに影響し得る。チオール基のマレイミドとの反応の速度は、チオレートアニオンの濃度の増加に起因してアルカリ性ｐＨで増大する。アルカリ性条件下では、マレイミドからマレインアミド酸への加水分解は顕著な副反応となり、リジン及びヒスチジンなどのその他の官能基との反応の競合がさらに顕著になる。

リジンのε−アミノ基は、タンパク質中で９．０〜９．５のｐＫａを持つ典型的なアミンとしてふるまう。さらに低いｐＨ、例えば、ｐＨ６．５では、アミン基の大部分が主として、プロトン化された非反応性のＮＨ_３ ^＋型になっており、マレイミド基との反応はチオールとの反応より約１０００倍遅くなる。末端アミン基は、関係するアミノ酸によって７．５〜８のｐＫａ値を有する。末端アミンは、リジンの場合よりも低いｐＨで、プロトン化されていない（反応性の）型で存在するはずである。したがって、アミンとのマレイミド基の反応は、チオール基との反応よりも高いｐＨを必要とするのである。その結果、マレイミドでのチオール基の標識は低ｐＨでより選択的になると共に、リジン残基を標識する潜在性はより低くなる。したがって、反応のｐＨもまた、飽和標識を成し遂げる上で、及びチオール基の特異的標識のために重要な因子である。好ましくは、例えば式（Ｉ）の蛍光染料を用いた飽和標識は、ｐＨ６．０〜９．０、最も好ましくは８．０のｐＨで実施されるが、これは反応性チオレートの存在と反応性アミンの存在との間の妥協点なのである。

比較のためのタンパク質試料は、種（例えば、ヒト、齧歯類、サル）について認識されるあらゆる供給源、組織供給源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）及び細胞タイプ（例えば、上皮性、内皮性）に由来するすべての正常及び形質転換細胞を含めた、様々な細胞供給源から由来するものであってよい。多様な細胞タイプの培養のために利用可能な、確立されたプロトコルがある。（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＡｌａｎＲ．ＬｉｓｓＩｎｃ．１９８７参照。）。本発明は、無傷の植物又は培養植物細胞を使用して植物からの試料を比較するのにも使用できる。さらに、本発明の方法において使用する試料は、組換え遺伝子でトランスフェクトした培養細胞、外部刺激（熱ショック又は薬物処理など）を受けた細胞又は他の生物学的流体（脳脊髄液又は血清）から由来するものであってもよい。本発明はまた、例えば低分子量タンパク質又はｐＩ範囲などの特定の画分、核タンパク質などの細胞下区画を単離することにより、標識の前に、細胞中に存在するタンパク質のサブセットを標的にするのに使用できる。

当業者であれば、タンパク質試料は様々な方法及び抽出試薬を使用してかかる試料から抽出できることを認識するであろう。組織／培養物からの細胞は一般的に、例えばホモジナイズ、超音波処理、細胞溶解によって破壊され、尿素、チオ尿素などの変性試薬、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０などの界面活性剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノールなどの還元剤、及びＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝液を含めた試薬の存在下にタンパク質が抽出及び可溶化されている。内在性プロテアーゼによる分解を最小限に抑えるため、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アプロチニンなどのプロテアーゼインヒビターを添加してもよい。

蛍光染料の整合セット及び標識方法は、例えばＭｉｎｄｅｎ，Ｊ．ｅｔａｌ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，（１９９７），１８，２０７１）に記載の方法にしたがって、２種以上の異なるタンパク質試料のタンパク質含有量の差を検出するために使用できる。その方法の代表的な例において、タンパク質は上述の通り公知の方法によって２つの異なる試料の各々から抽出され、タンパク質濃度が測定される。各タンパク質抽出物の５０μｇのアリコートに１０ｎｍｏｌのＴＣＥＰ（トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し、これを３７℃で１時間インキュベートする。これらの還元タンパク質試料の各々に２０ｎｍｏｌの染料を添加して、３７℃で３０分間インキュベートする。第１のタンパク質試料は、染料の整合セットの第一染料（例えば、Ｃｙ３）で標識され、第二のタンパク質試料はその染料の整合セットの第二の染料（例えば、Ｃｙ５）で標識される。反応は、ＤＴＴを含有する試料緩衝液の添加によって停止される。標識タンパク質試料を混ぜ合わせて、分離用の単一試料を得る。この試料を電気泳動で、好ましくは二次元ＰＡＧＥによって分離する。電気泳動による分離の手順は、当業者にはよく知られているものである。

本発明の第四の態様では、式（Ｉ）及びそれらの塩の２種以上の異なる蛍光染料を含む蛍光染料の整合セットを含んでなるキットが提供される。

式中、ｎは下記染料の各々について異なっており、１、２又は３であり、
Ｚ^１及びＺ^２は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
Ｒ^１及びＲ^２基の一方は次式の基であり

本発明はさらに、以下の実施例及び図面を参照することによって例証される。

図１は、二次元電気泳動でシステイン反応性染料を使用したタンパク質試料のディファレンシャル分析のための典型的なワークフローである。２つの異なるタンパク質試料が細胞、組織又は他の生物学的流体から調製される。第一及び第二のタンパク質試料は、タンパク質含有量を比較することが望まれる、例えば正常と疾患組織由来又は対照に対して薬物処置／刺激を施した細胞など、どのような２つの試料であってもよい。方法は、一元分離システムに適用されても構わない。

図２は、染料セット１、１２及び９で標識され、二次元電気泳動によって分離したタンパク質のオーバーレイイメージを示すもので、標識タンパク質スポットの輪郭が、位置的整合を立証している。

実施例１
染料の合成
ｉ）一般的な実験手順
１ＨＮＭＲ（δ_Ｈ）スペクトルは、ＪｅｏｌＪＮＭ−ＬＡ３００ＦＴＮＭＲ分光器にて記録した。化学的シフトが、δ（ｐｐｍ）で報告される。試料は、ｄ_４−メタノールなどの好適な重水素化溶媒中での溶液として調製した。ＵＶ／ＶＩＳ分光法は、ＵｎｉｃａｍＵＶ３ＵＶ／ＶＩＳ分光器を使用して行った。トリメトキシプロペンは、ＫａｒｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社（米国オハイオ州）から購入した。その他の化学薬品はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（英国ドーセット）から購入した。

Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチルマレイミド及びＮ−ＢＯＣ−アミノプロピルマレイミドは、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），６０，５３５２−５３５５に記載の通り調製した。

ii）カリウム２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホン酸
ヒドラジノベンゼンスルホン酸（２０．０ｇ）を酢酸（６０ｍｌ）に溶解して、３−メチル−２−ブタノン（２６．０ｇ）を添加し、次いで環流下に３時間加熱した。引っかきながら冷蔵庫で冷却することによって所望の化合物を沈殿させ、オフホワイト色のスラリーをプロパン−２−オールで希釈して濾過した（７１％）。

２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドレニン（１６．４５ｇ）をメタノール（１６０ｍｌ）に加熱溶解して、ＫＯＨのプロパン−２−オール飽和溶液（１００ｍｌ）を添加した。溶液は黄色に変化し、固体が生じた。この溶液を冷却して固体を濾過し、オフホワイト色の固体を得た（１５．９ｇ、９８％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．８４（ｍ，２Ｈ）、７．４６（ｄ，１Ｈ）、３．３０（ｓ，３Ｈ）及び１．３５（ｓ，６Ｈ）。

iii）ヨウ化１，２，３，３−テトラメチル−５−スルホニル−インドリウム
カリウム２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホン酸（１．０ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）及びヨードメタン（０．２５ｍｌ、３．９７ｍｍｏｌ）を、ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）と窒素雰囲気下に混合した。溶液は砂浴を使用して１００℃で４時間加熱した。固体が形成され始めていたが、薄層クロマトグラフィーによる分析（３０％メタノール／７０％ＤＣＭ）で生成物の形成が完了していないことが判明したので、さらに等量のヨードメタンを添加し、反応混合物をさらに２時間加熱して、その後室温にまで冷却した。固体を濾過によって収集して、ジクロロベンゼン、ジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空中で乾燥して紫色固体を得た（０．８９ｇ、９８％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．０６（ｍ，１Ｈ）、７．９４（ｄｄ，１Ｈ）、７．８４（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｓ，３Ｈ）及び１．６１（ｓ，６Ｈ）。

iv）ヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム
カリウム２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホン酸（１０．０ｇ、４１．９７ｍｍｏｌ）及びヨードエタン（４．０ｍｌ、５０．３５ｍｍｏｌ）を、ジクロロベンゼン（４０ｍｌ）と窒素雰囲気下に混合した。溶液を、砂浴を使用して１２０℃で１６時間加熱して紫色固体を得た。固体を濾過によって収集し、その後ジクロロベンゼン、クロロホルム及びエーテルで洗浄して淡いピンク色の固体を得た（１０．２ｇ、９１％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．９８（ｍ，３Ｈ）、４．５５（ｑ，２Ｈ）、１．５６（ｓ，６Ｈ）及び１．４８（ｔ，３Ｈ）。

ｖ）ヨウ化１−プロピル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム
カリウム２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホン酸（１．０ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）及びヨードプロパン（０．４ｍｌ、３．９７ｍｍｏｌ）を、ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）と窒素雰囲気下に混合した。溶液を、砂浴を使用して１００℃で２０時間加熱して赤褐色のゼラチン状の固体を得た。固体を濾過によって収集し、その後ジクロロベンゼン、クロロホルム及びジエチルエーテルで洗浄してピンク色の固体を得た（４７２ｍｇ、４７％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．９１（ｍ，３Ｈ）、４．５０（ｔ，２Ｈ）、２．０１（ｄｔ，２Ｈ）、１．５６（ｓ，６Ｈ）及び１．１３（ｔ，３Ｈ）。

vi）ヨウ化１−スルホブチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム
２，３，３−トリメチルインドレニン（２．０ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（１．７ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を混合して、１００℃にて６時間加熱した。溶液は徐々に赤色に変化し、６時間後に反応混合物を室温まで冷却した。固体をジエチルエーテル中に分散させて濾過した。固体を収集して乾燥した。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．９１（ｍ，１Ｈ）、７．７５（ｍ，１Ｈ）、７．４２（ｍ，２Ｈ）、４．５８（ｍ，２Ｈ）、２．９３（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）、１．９４（ｍ，２Ｈ）及び１．６１（ｓ，６Ｈ）。

vii）ヨウ化１−（５−カルボキシペンチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム
２，３，３−トリメチルインドレニン（６．４ｇ、４０ｍｍｏｌ）をジクロロベンゼン（２５ｍｌ）に溶解して、溶液が均一になるまで撹拌した。これに６−ブロモヘキサン酸（１５．６ｇ、８０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を砂浴中で１１０℃に６．５時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却して、フラスコの側面を引っかき、次いでフラスコを冷蔵庫の中に１時間置いた。この後、ベージュ色の固体が紫色の溶液中に形成されていたので、その固体を濾過によって収集し、次いでジクロロベンゼン及びエーテルで洗浄してベージュ色の固体を得た（７．４２ｇ、５２％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．９１（ｍ，１Ｈ）、７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，２Ｈ）、４．５２（ｔ，２Ｈ）、２．３８（ｔ，２Ｈ）、２．０４（ｐ，２Ｈ）、１．８８−２．４５（ｍ，４Ｈ）及び１．６１（ｓ，６Ｈ）。

viii）ヨウ化１−（４−カルボキシブチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム
２，３，３−トリメチルインドレニン（１１．３ｇ、４０ｍｍｏｌ）をジクロロベンゼン（３０ｍｌ）に溶解して、溶液が均一になるまで撹拌した。これに５−ブロモブタン酸（１９．３ｇ、１０６．６ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を砂浴中で１１０℃に６．５時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却して、フラスコの側面を引っかき、次いでフラスコを冷蔵庫の中に１時間置いた。この後、ベージュ色の固体が紫色の溶液中に形成されていたので、その固体を濾過によって収集し、次いでジクロロベンゼン及びエーテルで洗浄してベージュ色の固体を得た（１８．０ｇ、７５％）。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）７．９０（ｍ，１Ｈ）、７．７８（ｍ，１Ｈ）、７，６２（ｍ，２Ｈ）、４．５９（ｔ，２Ｈ）、２．４１（ｔ，２Ｈ）、２．０４（ｍ，２Ｈ）、１．７６（ｍ，２Ｈ）及び１．６１（ｓ，６Ｈ）。

ix）アミノエチルマレイミド及びアミノプロピルマレイミド
４Ｍ塩酸のジオキサン溶液に適量のＢＯＣ−アミノアルキルマレイミドを添加して、反応混合物を室温にて３０分間攪拌した。この後、反応混合物は固体を析出しており、溶媒を真空中で除去すると白色の綿毛状固体が表れた。化合物は、以下の工程において加工しないままで使用した。

ｘ）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｉ）
ヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（２．０ｇ、７．４８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（１．５ｇ、７．４８ｍｍｏｌ）及びオルトギ酸トリエチル（１．１ｇ、７．４８ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍｌ）中に溶解し、その後還流下（１００℃）に３時間加熱した。反応フラスコの側面に固体が形成され、ＵＶ／ＶＩＳは４０８ｎｍに新しいピークを示した。ジエチルエーテルを添加して、沈殿物及び固体を濾過によって収集し、エーテルで洗浄して真空中で乾燥して、黄色／橙色の固体を得た（１．８３ｇ、６６％）。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝４０８ｎｍ。

Ｃｙ３半染料（１．８３ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１０ｍｌ）溶液に、無水酢酸（１．０ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。この後、臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（２．２ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってモニターした。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（逆相シリカ：水−５０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、２９９ｍｇの所望のＣｙ３酸生成物（９％）を得た。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。

Ｃｙ３酸（２００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（８０μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（１２０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（８０μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）で処理し、アミノエチルマレイミド（８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（Ｔｌｃ）で新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（９８ｍｇ、３４％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．５６（ｔ，１Ｈ）、７．９２（ｍ，２Ｈ）、７．６２−７．３８（ｍ，５Ｈ）、６．７２（ｓ，２Ｈ）、６．５０（ｄｄ，２Ｈ）、４．１９（ｍ，４Ｈ）、３．５２（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、１．９４−１．５６（ｍ，６Ｈ）、１．７５（ｓ，１２Ｈ）及び１．４４（ｔ，３Ｈ）。

xi）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１，３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩ）
ヨウ化１，２，３，３−テトラメチル−５−スルホニル−インドリウム（５．００ｇ、１１．９０ｍｍｏｌ）を、酢酸（４０ｍｌ）及びＴＦＡ（２ｍｌ、１８．０ｍｍｏｌ）の混合液中にすべての固体が溶解するまで懸濁した。１，３，３−トリメトキシプロペン（１２．５ｍｌ、９５．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加して、室温にて５時間攪拌した。溶液を５００ｍｌのジエチルエーテルにピペットで入れて、沈殿物を濾過によって収集した（４．８０ｇ、塩を含有）。

Ｃｙ５半染料（４．８０ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍｌ）溶液に酢酸カリウム（３．００ｇ、３４．２ｍｍｏｌ）及び臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（３．００ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を添加した。終夜攪拌した後、溶液をジエチルエーテル（５００ｍｌ）中にピペットで入れて、青色の固体を濾過によって収集し、真空中で乾燥した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（逆相シリカ：水−５０％メタノール濃度勾配）によって精製を行ない、２．３０ｇの所望の生成物（２８％）を得た。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４２ｎｍ。

Ｃｙ５酸（２００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（８０μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（１２０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を、薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（８０μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）で処理し、アミノエチルマレイミド（８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を２時間攪拌した。Ｔｌｃで新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントすると青色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（１０５ｍｇ、４３％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．１８（ｄｔ，２Ｈ）、７．８２（ｍ，２Ｈ）、７．５６−７．２４（ｍ，５Ｈ）、６．８０（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｔ，１Ｈ）、６．４５（ｄ，１Ｈ）、６．２４（ｄ，１Ｈ）、４．１７（ｔ，２Ｈ）、３．６０（ｓ，３Ｈ）、３，４０（ｔ，２Ｈ）、２．０９（ｔ，２Ｈ）、１．８９−１．４８（ｍ，６Ｈ）及び１．７９（ｓ，１２Ｈ）。

xii）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−プロピル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩＩ）
１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（６．０ｇ、１６．９４ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（６．６３ｇ、３３．８７ｍｍｏｌを酢酸（２０ｍｌ）に溶解し、次いで還流下（１２０℃）に４時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却して、その後溶媒を真空中で除去した。橙色のオイルをクロロホルム中に溶解して水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、Ｃｙ３半染料の橙色オイルになるまで濃縮した。このオイルは、さらに精製することなく使用した。

Ｃｙ３半染料（１．００ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１０ｍｌ）溶液に、無水酢酸（１．０ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。この後、ヨウ化１−プロピル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（０．９２ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってモニターした。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、２４１ｍｇの所望のＣｙ３酸生成物（２１％）を得た。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。

Ｃｙ３酸（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（３０μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（５４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（３０μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）で処理してアミノエチルマレイミド（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加し、２時間攪拌して反応させた。Ｔｌｃで新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（４１ｍｇ、３４％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．５２（ｔ，１Ｈ）、７．９０（ｍ，２Ｈ）、７．６０−７．３９（ｍ，５Ｈ）、６．７８（ｓ，２Ｈ）、６．５２（ｄｄ，２Ｈ）、４．２２（ｍ，４Ｈ）、３．５６（ｍ，２Ｈ）、２．１３（ｔ，２Ｈ）、１．９７−１．５６（ｍ，８Ｈ）、１．７５（ｓ，１２Ｈ）及び１．０９（ｔ，３Ｈ）。

xiii）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＶ）
１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（４．０ｇ、１４．５９ｍｍｏｌ）及びマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）塩酸塩（７．５５ｇ、２９．１８ｍｍｏｌ）を酢酸（２０ｍｌ）に溶解し、次いで還流下（１２０℃）に４時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却して、その後溶媒を真空中で除去した。赤色のオイルをクロロホルム中に溶解して水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、Ｃｙ５半染料の赤色オイルになるまで濃縮した。このオイルは、さらに精製することなく使用した。

Ｃｙ５半染料（１．００ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１０ｍｌ）溶液に、無水酢酸（１．０ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。これにヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（０．５９ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってモニターした。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、３６５ｍｇの所望のＣｙ５酸生成物（３１％）を得た。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。

Ｃｙ５酸（５２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（１０μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（２８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（１０μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）で処理してアミノエチルマレイミド（１８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加し、２時間攪拌して反応させた。Ｔｌｃで新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（３０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントすると青色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（２９ｍｇ、４７％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．３８（ｍ，２Ｈ）、７．８８（ｍ，２Ｈ）、７．５５−７．２４（ｍ，５Ｈ）、６．８０（ｓ，２Ｈ）、６．７１（ｔ，１Ｈ）、６，４２（ｄ，１Ｈ）、６．２４（ｄ，１Ｈ）、４．１１（ｍ，４Ｈ）、３．５４（ｔ，２Ｈ）、２．１２（ｔ，２Ｈ）、１．９２−１．３６（ｍ，９Ｈ）及び１．８１（ｓ，１２Ｈ）。

xiv）１−（５−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｖ）
臭化１−（４−カルボキシブチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（２．００ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）及びマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）塩酸塩（２．２８ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）を酢酸（３０ｍｌ）に溶解し、次いで１２０℃で６時間加熱した。反応混合物を冷却して、その後真空中で酢酸を除去し、流動性のあるオイルを得た。これをクロロホルム中に溶解して水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して真空中にて濃縮してより粘稠なオイルを得た。未反応のマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）のほとんどは、クロロホルム／水の界面に残っていた。化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−３０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、赤色固体を得た（１２０ｍｇ、５％）。

Ｃｙ５半染料（１２０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（３ｍｌ）溶液に、無水酢酸（０．５ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。この後、ヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（８３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて終夜攪拌した。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ジクロロメタン−４０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、８４ｍｇの所望の生成物（４８％）を得た。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。

Ｃｙ５（８４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（ＤＩＰＥＡ２６μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（４５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（２６μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）で処理して、その後アミノエチルマレイミド（５２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間攪拌して反応させた。Ｔｌｃで新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（３０ｍｇ、３０％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．１５（ｑ，２Ｈ）、７．８０（ｍ，２Ｈ）、７．５２−７．３１（ｍ，５Ｈ）、６．７５（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｔ，１Ｈ）、６．４６（ｄ，１Ｈ）、６．３２（ｄ，１Ｈ）、４．２７（ｍ，４Ｈ）、４．１５（ｔ，２Ｈ）、２．０９（ｔ，２Ｈ）、１．７９（ｓ，６Ｈ）、１．６５（ｓ，６Ｈ）２．５６−２．４４（ｍ，４Ｈ）及び１．１２（ｔ，３Ｈ）。

xv）１−（６｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩ）
臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（５００ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（２７８ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）及びヨウ化１−スルホブチル−２，３，３−トリメチルインドリウム（４１８ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍｌ）に溶解して、室温で撹拌した。次いで無水酢酸（０．４ｍｌ）を添加して、反応混合物を外界温度にて終夜撹拌した。ピリジンを真空中で除去して、マゼンタ色のオイルをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−１０％メタノール濃度勾配）によって精製し、ピンク色の固体を得た（６７ｍｇ、８％）。

Ｃｙ３酸（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（２０μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（５９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（２０μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）で処理して、その後アミノエチルマレイミド（３２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間攪拌して反応させた。反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（２４ｍｇ、４３％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．４９（ｔ，１Ｈ）、７．５２−７．３５（ｍ，８Ｈ）、６．７２（ｓ，２Ｈ）、６．４６（ｄｄ，２Ｈ）、４．０９（ｍ，４Ｈ）、３．５７（ｍ，２Ｈ）、２．８５（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、１．９４−１．４３（ｍ，１０Ｈ）及び１．８５（ｓ，１２Ｈ）。

xvi）１−（５−｛［２（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩＩ）
臭化１−（４−カルボキシブチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（１．０ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）及びマロンアルデヒドビスフェニルイミン塩酸塩（７６０ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍｌ）に溶解し、次いで１２０℃で１８時間加熱した。反応混合物を冷却して、その後真空中で酢酸を除去し、流動性のある赤色オイルを得た。これをクロロホルム中に溶解して水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して真空中にて濃縮してより粘稠な赤褐色オイルを得た。化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−２０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、橙色固体を得た（１．４３ｇ、５５％）。

Ｃｙ５半染料（１２０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（５ｍｌ）溶液に、無水酢酸（０．５ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。この後、ヨウ化１−スルホブチル−２，３，３−トリメチルインドリウム（８３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて２時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ジクロロメタン−２０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、７８ｍｇの所望の生成物（５１％）を得た。

Ｃｙ５酸（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（１５μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（２８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（１５μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）で処理して、その後アミノエチルマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間攪拌して反応させた。Ｔｌｃ分析で新たな生成物への変換が認められた。反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントすると青色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（３０ｍｇ、３０％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．１９（ｔ，２Ｈ）、７．５２−７．４２（ｍ，８Ｈ）、６．７１（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｔ，１Ｈ）、６．３６（ｄｔ，２Ｈ）、４．１８（ｍ，４Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、２．８９（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、１．７９（ｓ，１２Ｈ）及び２．０１−１．３６（ｔ，８Ｈ）。

xvii）１−（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｖｌｌｌ）
臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（３５４ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（１９６ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチル−５−スルホニル−インドリウム（２６７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１５ｍｌ）に溶解して、室温で撹拌した。次いで無水酢酸（０．５ｍｌ）を添加して、反応混合物を外界温度にて終夜撹拌した。ピリジンを真空中で除去して、マゼンタ色のオイルをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−４０％メタノール濃度勾配）によって精製し、ピンク色の固体を得た（３０ｍｇ、６％）。

Ｃｙ３酸（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（１０μｌ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（１０μｌ、０．０５ｍｍｏｌ）で処理して、その後アミノエチルマレイミド（９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間攪拌して反応させた。反応混合物をジエチルエーテル（２０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（１５ｍｇ、４４％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝５５０ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．５３（ｔ，１Ｈ）、７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．５９−７．４１（ｍ，５Ｈ）、６．７８（ｓ，２Ｈ）、６．５０（ｔ，２Ｈ）、４．１７（ｍ，４Ｈ）、３．５０（ｍ，２Ｈ）、３．１４（ｔ，２Ｈ）、２．１４（ｔ，２Ｈ）１，９８−１．２８（ｍ，１１Ｈ）及び１．７９（ｓ，１２Ｈ）。

xviii）１−（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＸ）
臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（６．０ｇ、１６．９５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（６．６３ｇ、３３．８７ｍｍｏｌ）を酢酸（２０ｍｌ）に溶解し、次いで１２０℃で５時間加熱した。真空中で酢酸を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ：ジクロロメタン−２０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、黄色／橙色固体を得た（１．３４ｇ、２１％）。

Ｃｙ３半染料（２５０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（５ｍｌ）溶液に、無水酢酸（０．５ｍｌ）を添加して、反応混合物を窒素雰囲気下に１０分間攪拌した。この後、ヨウ化１−スルホブチル−２，３，３−トリメチルインドリウム（１６１ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温にて２２時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去してフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ジクロロメタン−２０％メタノール濃度勾配）を使用して精製し、１４２ｍｇの所望のＣｙ３酸生成物（４５％）を得た。

Ｃｙ３酸（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（１５μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（２８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（１５μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）で処理して、アミノプロピルマレイミド（１８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加し、２時間攪拌して反応させた。反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（１５ｍｇ、２４％）が得られた。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．４９（ｔ，１Ｈ）、７．７８−７．２２（ｍ，８Ｈ）、６．７２（ｓ，２Ｈ）、６．５０（ｔ，２Ｈ）、４．１２（ｍ，４Ｈ）、３．４７（ｍ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，２Ｈ）、２．８５（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、２．０１−１．２４（ｍ，１２Ｈ）及び１．８５（ｓ，１２Ｈ）。

xix）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｘ）
臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウム（３５３ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、マロンアルデヒドビスフェニルイミン塩酸塩（２５９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びヨウ化１−スルホブチル−２，３，３−トリメチルインドリウム（２９５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍｌ）中に溶解して、室温で撹拌した。次いで無水酢酸（０．４ｍｌ）を添加して、反応混合物を外界温度にて終夜撹拌した。ピリジンを真空中で除去して、青色のオイルをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−１０％メタノール濃度勾配）によって精製し、青色の固体（５４ｍｇ、８％）を得た。

Ｃｙ５酸（４９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に無水ＤＭＦに溶解し、次いで室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（１２μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（２７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／８０％ＤＣＭ）によってＮＨＳエステルへの変換が完了したと判断されるまで２時間攪拌した。ＮＨＳエステルは第二の等量のＤＩＰＥＡ（１２μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）で処理して、その後アミノエチルマレイミド（２８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２時間攪拌して反応させた。Ｔｌｃで新たな生成物への変換が認められたので、反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、溶媒をデカントするとピンク色の残渣が残った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ＤＣＭ−４０％メタノール濃度勾配）で、所望のマレイミド生成物（２４ｍｇ、４５％）が得られた。ＵＶ／ＶＩＳ（メタノール）；吸収λ_ｍａｘ＝６４４ｎｍ。δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）８．２１（ｔ，２Ｈ）、７．５４−７．２６（ｍ，８Ｈ）、６．８０（ｓ，２Ｈ）、６．６４（ｔ，１Ｈ）、６．３８（ｄｄ，２Ｈ）、４．１８（ｍ，４Ｈ）、３．５８（ｍ，２Ｈ）、２，８９（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、１．７６（ｓ，１２Ｈ）及び２．０６−１．３９（ｍ，１０Ｈ）。

xx）１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１，３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＸＩ）
同様の方法によって、ヨウ化１，２，３，３−テトラメチル−５−スルホニル−インドリウム及び臭化１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドリウムをＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンと一緒に反応させてＣｙ３酸を形成し、これをＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに活性化してアミノエチルマレイミドで処理すると、１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１，３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムに変換した。

実施例２
２．１タンパク質の単離及び標識
最初の実験は、大腸菌試料について実施した。大腸菌ＥＲ１６４７株（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー）を、グルコース富有ＭＯＰＳ培地中で３７℃にて終夜培養し、その後４℃にて１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって収集した。細胞ペレットを洗浄緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム）で二回洗浄した。次いで細胞を溶解緩衝液（８Ｍ尿素、４％質量／容積ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中に再度懸濁して、超音波処理（氷上で３ｘ１０秒のパルス）によって溶解させた。大腸菌溶解物のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−ＲａｄＤｃＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙを使用して、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、英国ハートフォードシャー）による記載の通りに定量した。

使用前に、シアニン染料を無水ＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログコード番号２２，７０５−６）中で再構成して、１０ｍＭ（１０ｎｍｏｌ／μｌ）の最終濃度とした。染料をＤＭＦの添加後に軽く渦流混合して、染料が完全に溶解されるようにした。再構成した染料は−２０℃で保存し、２週間以内に使用した。

溶解緩衝液中の５０μｇタンパク質におけるジスルフィド結合を、１０ｎｍｏｌのＴＣＥＰ［トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン］の添加によって還元し、その後３７℃で１時間インキュベートした。還元の後に、２０ｎｍｏｌの再構成染料を添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。等体積の２ｘ試料緩衝液（溶解緩衝液プラス２０ｍｇ／ｍｌＤＴＴ及び４％（体積／体積）Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ３−１０）で反応を停止した。試料は一次元分離の前に氷上で短時間保存するか又はより長期間保存するために光から保護して冷凍した。

２．２分離用のタンパク質試料の調製
Ｃｙ３及びＣｙ５化合物Ｉ〜ＸＩで標識したタンパク質試料の等量を混合して、表２に示す染料ペアセットを得た。

２．３二次元電気泳動によるタンパク質の分離
標準的なＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製二次元ＰＡＧＥ装置及びＰｌｕｓＯｎｅ（商標）試薬（英国バッキンガムシャー）を使用して、二次元電気泳動を実施した。ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（ｐＨ３−１０ＮＬ又はｐＨ４−７ＮＬ、２４ｃｍ）を４５０μｌの再水和緩衝液（８Ｍ尿素、４％質量／体積ＣＨＡＰＳ、１％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（ｐＨ３−１０）、２ｍｇ／ｍｌＤＴＴ）中で終夜再水和し、ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＤｒｙＳｔｒｉｐＲｅｓｗｅｌｌｉｎｇＴｒａｙの中で２．５ｍｌのＤｒｙＳｔｒｉｐＣｏｖｅｒＦｌｕｉｄでオーバーレイした。Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ等電点電気泳動システムを使用して、ストリップを泳動分離に付した。第二次元ＰＡＧＥの前に、、各々のストリップを振盪台の上で１０ｍｌの平衡化緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３０％体積／体積グリセロール、１％質量／体積ＳＤＳ、５ｍｇ／ｍｌＤＴＴ）で１０分間、その後１０ｍｌの平衡化緩衝液Ｂ（８Ｍ尿素、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３０％体積／体積グリセロール、１％質量／体積ＳＤＳ、４５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミド）でさらに１０分間平衡化した。ストリップは次いで、１２％のイソクラティックＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付して流した。

２．４蛍光ゲルイメージング
標識タンパク質を、２９２０Ｍａｓｔｅｒｌｍａｇｅｒ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー）を使用して以下の設定にて可視化した。

露光時間は、個々の実験に対して至適化して５０，０００のイメージに対して最高のピクセル値を得るようにし、シグナルの飽和を回避した。二次元マスターからのデータを、ＰａｉｎｔｓｈｏｐＰｒｏ（商標）にＴＩＦファイルとしてエクスポートして、目視検査用のカラーオーバーレイを作製した。染料整合化の詳細な定量的分析のため、ゲルイメージを二次元イメージマスターソフトウェアプログラムにエクスポートした。

２．５イメージ分析
本研究におけるゲル分析は、二次元イメージマスター（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー）、二次元分析ソフトウェアプラットフォームを使用して実施した。スポットの検出に続き、各スポットの中心を使用して、Ｃｙ３及びＣｙ５イメージの各々に対するピクセルの座標を作製した。移動度の整合度は、Ｃｙ３及びＣｙ５スポットの中心の座標を比較することによって決定した。これを使用して、ｘ（ｐＩ）及びｙ（質量）座標の双方において互いに±２ピクセル以内の整合スポットの数で位置的整合を表すことができる。

同一試料を標識するのに双方の染料が使用されているので、標識した各試料中に同じタンパク質が存在しており、したがって同等の移動に対して染料が整合していれば、すべてのスポットは、２つのイメージ間で正確にオーバーレイされるはずである。全体としての整合性を調べるために、＋／−２ピクセル内のスポットの％を測定した。

実施例３
アルキル鎖長（ｒ）の変動による、システイン残基での飽和標識に対して整合染料のディファレンシャルゲル電気泳動
同じ複合タンパク質試料（大腸菌溶解物）を各染料で標識し、Ｃｙ３及びＣｙ５標識試料を混合し、二次元電気泳動により分離することによって、染料構造効果を試験した。蛍光スキャニングの後、イメージをオーバーレイして前記の実施例に記載の通りに分析した。

大腸菌溶解物を、上述の通りＣｙ３化合物及びＣｙ５化合物で標識した。ＣＨ_２単位の付加によるアルキル鎖長の変化の効果を示すために、標識試料を分離前に混合して染料セット１、２、９、１１及び１２を得た。表３に、染料セット１、２、９、１１及び１２で標識したタンパク質のオーバーレイイメージの分析後の、定量的な位置のデータを示す。

このように、Ｃｙ３とＣｙ５が同じアルキル鎖を有する場合（例えば、染料セット１１及び１２）、Ｃｙ３の全体としての質量はＣｙ５に比例して減少する。この結果、質量の大きさにおいて位置的整合に劣ることになる。アルキル鎖長に２炭素単位の差がある場合（例えば、染料セット９）、質量の整合性が向上する。質量及びｐＩの双方に対する至適整合性は、染料間に単一の炭素原子の差がある場合に得られる（例えば、染料セット１及び２）。好ましい染料セットは染料セット１である。これは、リンカーｒにおける単一の炭素単位の差を使用した移動度の整合が、二次元電気泳動上で示差的に標識されるタンパク質の良好な位置的整合をもたらすことを示す。

図２は、染料セット１、１２及び９で標識され、二次元電気泳動によって分離したタンパク質のオーバーレイイメージを示すもので、標識タンパク質スポットの輪郭が、位置的整合を立証している。オーバーレイは、約２０〜３０ｋＤａの質量範囲及び約５．５〜６．０のｐＩ範囲を示す、Ｃｙ３又はＣｙ５で標識した大腸菌溶解物の二次元電気泳動ゲルの一部から取られている。Ｃｙ３及びＣｙ５で標識したタンパク質の双方に対するタンパク質スポットの概観の位置を表している円（矢印付記）は、二次元イメージマスターソフトウェアを使用して決定した。染料セット１２は、Ｃｙ５で標識したタンパク質がＣｙ３で標識したタンパク質よりも下に流れるので（例に矢印付記）、質量の整合性に劣っている。染料セット９もまた、質量の整合性に劣っることが示されており、この例ではＣｙ５で標識したタンパク質がＣｙ３で標識したタンパク質よりも上に流れている（例に矢印付記）。好ましい染料セット１は、至適な位置的整合をもたらすものである。

実施例４
インドール核に対するリンカー長（ｐ）の変動による、システイン残基での飽和標識に対して整合染料のディファレンシャルゲル電気泳動
大腸菌溶解物をＣｙ３及びＣｙ５化合物で標識し、試料を混合して上述の染料セット１及び３を得た。表４に、これらの染料セットで標識したタンパク質のオーバーレイイメージの分析後の、定量的な位置のデータを示す。

これにより、リンカーｐにおける単一の炭素単位の差を使用した移動度の整合が、二次元電気泳動上で示差的に標識されるタンパク質の良好な位置的整合をもたらすことが示される。

実施例５
マレイミド基に対するリンカー長（ｑ）の変動による、システイン残基での飽和標識に対して整合染料のディファレンシャルゲル電気泳動
アミノエチルからアミノプロピルマレイミドに、単一のＣＨ_２単位によってリンカー長を増大させることにより、リンカーｑを変動させた。大腸菌溶解物をＣｙ３及びＣｙ５化合物で標識し、試料を混合して上述の染料セット１、５及び７を得た。表５に、これらの染料セットで標識したタンパク質のオーバーレイイメージの分析後の、定量的な位置のデータを示す。

このように、おそらくはβ−効果のために、アミノエチルリンカー（染料セット１）では、アミノプロピルリンカー（染料セット５及び７）に比較してｐＩの整合性が改善されている。染料間に２つの炭素単位の差がある場合、質量の整合性も低下する（染料セット７）。単一の炭素単位の差がある場合、質量の整合性が改善されている。したがって、アミノエチルマレイミドリンカー（ｑ＝２）が、ｐＩの整合性については好ましい。

実施例６
スルホネート基の位置の変動による、システイン残基での飽和標識に対して整合染料のディファレンシャルゲル電気泳動
スルホン化シアニン染料は一般的に、染料セット１におけるようにインドール環に直接結合したスルホネート基を有する。スルホネートの位置の変更は、ブチル鎖リンカーを介して環にスルホネートを結合させることによって成し遂げた。大腸菌溶解物をＣｙ３及びＣｙ５化合物で標識し、試料を混合して上述の染料セット１、４、６、８及び１０を得た。表６に、これらの染料セットで標識したタンパク質のオーバーレイイメージの分析後の、定量的な位置のデータを示す。

前のデータとの比較より、環系からスルホネートを除去してペンダントブチル鎖にするとｐＩ整合性が変化するらしいことが示される。質量の大きさにおける整合性は、染料セット１で成し遂げられたものと変わりない。染料間の差ｎを補うものがない場合、移動度の整合性は低下する（染料セット１０）。２つの炭素単位の差がある場合（染料セット８）、質量の整合性は染料セット１に比較して低下する。単一の炭素単位の差がある場合（染料セット４及び６）、整合性は改善される。ペンダントブチルスルホネートとの最良の組合せは、リンカーｑをマレイミドに修飾することである（染料セット６）。

二次元電気泳動でシステイン反応性染料を使用したタンパク質試料のディファレンシャル分析のための典型的なワークフローの概略図である。染料セット１、１２及び９で標識され、二次元電気泳動によって分離したタンパク質のオーバーレイイメージを示す図である。

Claims

式（ＩＩ）及びそれらの塩の２種以上の異なる蛍光染料を含んでなる蛍光染料の整合セット。

式中、ｎは１、２又は３であって上記染料の各々で異なり、
Ｒ¹及びＲ²基の一方は次式の基であり

（式中、Ｙは、システイン残基と共有結合で結合し得る標的結合基である。）、
残りのＲ¹又はＲ²基は−（ＣＨ₂）₄−Ｗ又は−（ＣＨ₂）_r−Ｈから選択され、
Ｒ³基は、Ｒ₁又はＲ₂のいずれかが−（ＣＨ₂）_r−Ｈである場合（この場合Ｒ³はＷである。）を除いて、水素であり、
Ｗはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
ｐは３〜６の整数であり、
ｑは２又は３となるように選択され、
ｒは１〜５の整数であり、
上記染料の２種類のｎが＋１だけ異なる場合にはその２種類の染料のｐ、ｑ及びｒの１つは−１だけ異なるとともに当該蛍光染料の整合セットの各染料におけるＹ及びＷが同一であることを特徴とする。
式（ＩＩ）の２種以上の異なる蛍光染料を含み、
ｎが１又は２となるように選択され、
ｐが４又は５となるように選択され、
ｑが２又は３となるように選択され、
ｒが１、２、３又は４となるように選択される、請求項１記載の整合セット。
染料セットの各染料における標的結合基Ｙがマレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される、請求項１又は請求項２記載の整合セット。
各染料のＹがマレイミド基である、請求項３記載の整合セット。
前記塩がＫ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺、Ｒ₃ＮＨ⁺及びＲ₄Ｎ⁺（式中、ＲはＣ₁〜Ｃ₄アルキルである。）から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の整合セット。
以下のセットから選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の染料の整合セット。
セット１
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｉ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１，３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩ）、
セット２
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−プロピル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＩＩ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＶ）、
セット３
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｉ）と、
１−（５−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｖ）、
セット４
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩ）と、
１−（５−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソペンチル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩＩ）、
セット５
１−（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＶＩＩＩ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−トリメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＶ）、及び
セット６
１−（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（３，３−ジメチル（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロプ−１−エニル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（化合物ＩＸ）と、
１−（６−｛［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−（１−スルホ−ブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３Ｈ−インドリウム（化合物Ｘ）。
試料中のタンパク質の混合物を標識する方法であって、タンパク質の各々が１以上のシステイン残基を含んでおり、当該方法が、
ｉ）試料を含む水性液体に、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の蛍光染料の整合セットから選択される蛍光染料の各々を添加し、
ii）染料をタンパク質と反応させてタンパク質を染料で標識する
ことを含み、もってタンパク質中の利用可能なシステイン残基すべてを染料で標識する、方法。
工程ｉ）の前に、タンパク質を還元剤で処理する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
前記染料がタンパク質５０μｇ当たり染料５〜２００ｎｍｏｌで使用される、請求項７又は請求項８記載の方法。
前記標識がｐＨ６．０〜９．０で実施される、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
試料中の１種以上のタンパク質を標識する方法であって、当該方法が、
ｉ）該１種以上のタンパク質を含む液体試料に、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の蛍光染料の整合セットから選択される蛍光染料の各々を添加し、
ii）１種以上のタンパク質の標識化に適した条件下で、染料を試料と共にインキュベートすることを含む方法。
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の蛍光染料の整合セットを含んでなるキット。