CN1650168A - 用于饱和标记蛋白质的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一组匹配的荧光染料，其中该组中的每一种染料能够共价连接于蛋白质上，并且其中每一种染料具有彼此互相匹配的分子结构和电荷，这使得利用该组中的一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度与用该组中另一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度相同。该匹配的组含有至少两种不同的通式的荧光染料：其中n是1、2或3；Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；基团R1和R2中的一个是目标连接基团；其余的基团R1或R2选自－(CH2)4－W或－(CH2)r－H；基团R3是氢，除了当R1或R2是－(CH2)r－H时，R3是W的情形之外；W选自磺酸和磺酸酯。本发明还提供了一种使用荧光染料饱和标记蛋白质的方法，它使得可以对所有可得到利用的目标氨基酸、适宜的半胱氨酸、蛋白质中的残基进行标记，从而得到被标记蛋白质分子的单一种群。

Description

用于饱和标记蛋白质的试剂和方法
本发明涉及荧光染料，以及用于对复合蛋白质样品进行标记的方法，以实现差异蛋白分析。
双向差异凝胶电泳(DIGE)在双向(2D)电泳分离之前使用匹配的、可光谱分辨的荧光染料来标记蛋白质样品(Minden，J.等人，Electrophoresis，(1997)，18，2071)。这种荧光多路复用技术克服了传统的双向电泳的很多缺点。对蛋白质样品进行荧光预标记可以允许多个样品在同一凝胶上操作，从而保证通过重叠荧光图象可以方便地识别出这些样品之间的定量差异。为了允许荧光多元化，必须用染料对蛋白质样品进行相同的标记，并且被标记的蛋白质在凝胶中的迁移必须在位置上相匹配，以保证定量差异被检测到。
WO 96/33406(Minden，J.等人)公开了一种检测不同的细胞样品之间的差别的方法，它在双向电泳之前使用匹配的、可光谱分辨的染料来标记样品中的蛋白质。为了保证等同的迁移，所述染料在分子量和电荷上是匹配的。该方法使用了具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯反应性基团的花青染料来标记胺类。该NHS酯基靶向蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基，从而导致共价标记。将三种不同的染料(Cy2TM、Cy3和Cy5)衍生来实现多路传输。这些染料分子具有大约500道尔顿的分子量，并且为了保证被标记的蛋白质等同迁移，它们在质量上是匹配的。这类染料利用花青氟的本征电荷来弥补染料与赖氨酸轭合时赖氨酸的正电荷损失。WO 96/33406描述了这些染料在最小化标记策略中的应用，以便在1-2％的可附着位点之间进行标记。为了实现等同迁移，通过调节通过两个碳单元与吲哚氮相连的脂肪链的大小，来弥补花青吲哚环之间的连接链长度上的差别，使这些染料对在质量上匹配。满足这些标准的两种或多种可光谱分辨的染料代表了匹配的最小化标记染料组。使用丙基Cy3和甲基Cy5标记蛋白质，然后双向分离并将所得到的图象重叠，表明这两种被标记样品在位置上是匹配的，从而证实了该匹配赖氨酸最小化标记染料组是等同迁移的。
赖氨酸残基在蛋白质中是非常丰富的，这确保了这种标记策略代表在复合样品中存在的所有蛋白质。然而，蛋白质中通常的赖氨酸含量为7％，并且如果蛋白质中的所有赖氨酸均被标记的话，可能引起因染料导致的大的质量变化。因此，所使用的策略对蛋白质进行“最小化”标记以确保5个蛋白质分子中仅有～1个被标记，从而保证所得到的统计概率为每个被标记的分子仅连接了一种染料。这样得到十分类似于银染图象(silver stained image)的双向斑点图案，但是其赋予了更大的多路复用的灵敏度和动力学范围以及能力。
典型的双向凝胶分析包括从凝胶上“采集”感兴趣的蛋白质斑点以通过MALDI-MS进行识别。最小化标记方法中每个蛋白质得到2个斑点(即被标记的和未被标记的)，其中大多数蛋白质是未被标记的斑点。未被标记的斑点必须被定位以回收足够多的蛋白质从而确保证通过MALDI-MS进行鉴定。这要求在斑点采集之前进行附加的着色步骤。为了加快直接从荧光凝胶上采集蛋白质斑点，需要一种能使每种蛋白质得到单一斑点的标记策略。
为了标记尽可能多的目标残基以及为了使每种蛋白质异形体得到单一被标记的斑点，本发明所使用的标记策略目的是将该蛋白质用染料饱和。因此，将花青染料分子偶合至蛋白质的所有可能利用的目标氨基酸残基上，从而得到被标记蛋白质分子的单一种群，它们连接有数量相当的染料分子。根据本发明，使用定向于含有巯基的半胱氨酸残基的颜料组来实现饱和标记。半胱氨酸残基存在于95％的蛋白质中，但是在每种蛋白质中半胱氨酸比赖氨酸少。这意味着所有的蛋白质分子都可以被标记，但是如果将赖氨酸残基标记至饱和，那么每种蛋白质分子将具有更少的被标记残基。这使得检测的灵敏度得到提高，这是因为被标记蛋白质的比例高于使用最小化标记的比例，但是确保了这些蛋白保持可溶性。
与使用赖氨酸残基的最小化标记策略相比，使用半胱氨酸残基的饱和标记，由于加入了染料，质量增加更大(质量位移)。然而，如果对赖氨酸残基使用饱和标记手段，那么观察到的质量增加要小。因加入颜料而引起的质量位移的程度视各种蛋白质不同而不同，这取决于单个的蛋白质半胱氨酸的含量(通常是～2％)以及在标记条件下半胱氨酸残基对染料的利用度。这导致双向斑点图案远远不同于先前已经公开的银染双向蛋白质图象。
因此，本发明提供了一类荧光试剂以及对存在于含半胱氨酸的蛋白质混合物中可接近的所有可能的半胱氨酸残基进行重复标记的方法。根据本发明的花青染料衍生物提供了有用的荧光标记组，它们具有共同的核心结构并且尤其可用于多路复用分析。
因此，本发明第一方面提供了荧光染料的匹配组，它含有至少两种式(I)结构的不同荧光染料：
其中对于每一种所述染料，n不同，并且为1、2或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A0282949800112
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料是的两种的n相差+1时，则所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
本发明提供了一种荧光染料的匹配组，其中该组中的每一种染料能够共价连接于蛋白质上，并且其中每一种染料具有彼此互相匹配的分子结构和电荷，这样使得使用该组中的一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度与用该组中另一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度相同或者基本上相同。在根据本发明第一方面的一个实施方案中，该染料匹配组含有至少两种不同的荧光染料，其中所述组中的每一种染料为具有式(I)的化合物，其中Z1、Z2、R1、R2、R3、Y、W、n、p、q以及r如上文定义。适宜地，该荧光染料匹配组中的不同染料是光谱可分辨的以保证用这类染料标记的不同样品彼此能够互相区别开来。适宜地，该染料匹配组中的至少两种染料具有根据式(I)的结构，它们可以选自三次甲基花青染料类(其中n＝1)、五次甲基花青染料类(其中n＝2)以及七次甲基花青染料(其中n＝3)。
适宜地，根据本发明的荧光染料匹配组含有至少两种式(II)的不同荧光染料：
其中对于每一种所述的染料，n不同，并且为1、2、或3；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A0282949800122
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述的两种染料的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
优选地，该荧光染料匹配组含有至少两种根据式(I)或(II)的不同染料，其中：n选自1或2；p选自4或5；q选自2或3；以及r选自1、2或3。
优选地，该荧光染料匹配组中的每一种染料的目标连接基团Y是相同的，并且选自马来酰亚胺基(maleimido)和碘代乙酰胺基(iodoacetamido)。每种染料中特别优选的目标连接基团是马来酰亚胺基。
特别优选的是选自三次甲基花青类染料和五次甲基花青类染料的式(I)或(II)的染料组。将这类染料描述为Cy3TM和Cy5染料。该花青染料的吸收和发射数据如下表1所示。
                     表1
    染料     荧光颜色     吸收(nm)     发射(nm)
    Cy3     橙色     550     570
    Cy5     远红     649     670
    Cy7     近IR     747     774
适宜地，根据式(I)或(II)的荧光染料的盐类选自K+、Na+、NH4 +、R3NH+和R4N+，其中R是C1-C4烷基。
在一替代的实施方案中，该荧光染料匹配组可以任选地含有一种或多种附加的染料，条件是每一种所述的附加染料所具有的电荷和质量特性可以保证使用该染料标记的蛋白质的电泳淌度与使用根据式(I)或(II)的染料标记的蛋白质的电泳淌度相同或者基本上相同。其它的这类附加染料可以包括含有苯并噁唑的染料。附加染料的实例有Cy2。
含有成对的根据式(I)或(II)的、当其与蛋白质偶合时可获得匹配的电泳淌度的荧光染料的示例性染料组合如下所述：
组1
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物II)；
组2
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物III)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；
组3
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物V)；
组4
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VI)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[1(E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物VII)。
组合5
1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VIII)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；以及
组合6
1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物IX)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-1(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物X)。
因此，本发明提供一种试剂匹配组，其在含半胱氨酸的蛋白质混合物中，在所使用的条件下，用于对所有可及半胱氨酸残基进行重现性标记。为了使与染料连接的巯基上的中性电荷相匹配，利用整体上具有中性电荷的染料组可以在pl方向上获得等同迁移。中性花青染料可以通过使磺酸或磺酸酯基取代基共价连接于染料结构上的方式获得。此外已经发现，等同的质量迁移并不是简单地通过使染料组的分子量相匹配而获得的，除此以外，为了使利用这类染料标记的蛋白质获得位置上的匹配，还要求对染料的整体尺寸和质量进行细致的调节。为了利用半胱氨酸饱和标记方法获得等同的迁移，要求染料组中的每一种根据式(I)的匹配染料在质量上相差一个碳单元。染料组可以通过改变连接于染料发色团上的不同取代基而得到。满足上述要求的两种或多种可光谱分辨的染料代表了匹配的饱和染料组。
本发明还提供了一种使用荧光染料饱和标记蛋白质的方法，它使得可以对蛋白质中所有可及的目标氨基酸残基进行标记，从而得到被标记蛋白质分子的单一种群(single population)。适宜地，该目标氨基酸是半胱氨酸残基。术语“可及的”是指可被荧光染料接近到以发生反应的氨基酸残基。可及的半胱氨酸残基必须是可接近到的，并且必须是还原(即游离巯基)形式。
因此在第二个方面，本发明提供了一种用于对样品中的蛋白质混合物进行标记的方法，其中每一种所述的蛋白质含有一种或多种半胱氨酸残基，所述方法包括：
i)向含有所述样品的含水液体中加入荧光染料，其中所述的染料含有与所述蛋白质共价反应的目标连接基团；然后
ii)使所述染料与所述蛋白质发生反应以使所述染料对所述蛋白质进行标记；
其特征在于，所述蛋白质中所有可能利用的半胱氨酸残基被所述的染料标记。
优选地，根据第二方面所述方法的荧光染料是花青染料。用于该方法中的特别优选的花青染料是含有磺酸或磺酸酯基团的花青染料，例如根据式(I)的染料。
优选地，该目标连接基团选自马来酰亚胺基和碘代乙酰胺基。
在根据第二方面所述的优选实施方案中，该方法在步骤i)之前还包括将所述蛋白质用还原剂处理。
优选地，所述的花青染料在5-200nmol染料/50μg蛋白质的范围内使用。
优选地，根据第二个方面所述的用于对样品中的蛋白质混合物进行标记的方法是在pH为6.0-9.0的范围内进行的。
本发明还提供了一种使用根据式(I)的染料进行标记从而赋予样品(适宜的是蛋白质样品)荧光特性的方法。因此在第三个方面，本发明提供了一种对样品中的一种或多种蛋白质进行标记的方法，该方法包括：
i)向含有所述一种或多种蛋白质的液体样品中加入式(I)的荧光染料：
Figure A0282949800171
其中对于每一种所述染料，n不同，并且为1、2、或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A0282949800172
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，则所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1；然后
在适合于对所述的一种或多种蛋白质进行标记的条件下，将所述的染料与所述的样品一起孵育。
优选地，Z1和Z2中的每一个表示闭合苯基环系所必需的碳原子。
优选地，根据第三方面所述的方法使用式(I)的荧光染料，其中：
n选自1或2；
p选自4或5；
q选自2或3；以及
r选自1、2或3。
优选地，该目标连接基团Y选自马来酰亚胺基和碘代乙酰胺基。
为了实现对蛋白质中半胱氨酸残基进行饱和标记的方法，必须考虑诸多反应参数，包括：
i) 蛋白质巯基的可接近性
在天然折叠的蛋白质中，很多半胱氨酸残基通过二硫键形成而与蛋白质的二级结构相关，并且它们还可能包埋在分子中心。为了标记这些残基，必须使用蛋白质变性剂例如脲将蛋白质展开以保证能够接近到所述染料，同时将其还原产生游离的巯基。还原剂的选择对于实现蛋白质的有效还原是重要的。常用的含巯基蛋白质还原剂是二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇。适宜的膦还原剂包括三丁基膦(TBP)和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。还可以使用硼氢化钠。为了保证有效还原同时尽量最小化与染料的反应，TCEP是优选的还原剂。
还原效率受还原剂的浓度(相对于蛋白质样品中的半胱氨酸含量而言)、反应温度(其对蛋白质变性产生影响)以及反应持续时间的影响。如果还原剂固定在珠上的话，这也可能会对效率产生影响。对于特定样品类型而言，最佳的还原剂浓度将因所使用的还原剂和样品中半胱氨酸含量的改变而改变。然而，还原50μg蛋白质通常需要10nmolTCEP(假设平均半胱氨酸含量为2％)。对于具有更高半胱氨酸含量的哺乳动物样品而言，那么通常使用20nmol TCEP。另外为了获得最佳标记，维持1nmol TCEP比2nmol染料的比例也是重要的。
对这些因素的最优化组合因特定的蛋白质结构和半胱氨酸含量而变化。更高的还原温度可以提高标记程度，这是因为提高了蛋白质变性程度从而使半胱氨酸的可接近性增加。然而，高温对于蛋白质也具有负面作用。脲和氨基甲酸酯之间存在一个平衡，但是在高温(通常是＞40℃)时这个平衡倾向于偏向氨基甲酸酯。氨基甲酸酯是比脲更具化学反应活性的物质，它可以攻击伯胺(例如N-末端氨基和赖氨酸的ε-氨基)，导致人为的电荷异质以及在2D凝胶上产生电荷串。在37℃下、在脲存在下对半胱氨酸残基进行饱和标记不会表现出氨基甲酰化效果。
ii)染料浓度
花青染料的疏水性，因而需要使用有机溶剂(例如10％的DMF)以帮助溶解。为了实现将所有可及的目标残基饱和以完成标记，需要使用高浓度的染料进行标记，而同时仍然保持染料的溶解性。在花青染料上利用磺酸酯基团有助于保持高染料浓度下的溶解性。对于特定的样品类型而言，标记反应中的最佳染料浓度取决于样品中的半胱氨酸含量以及样品中是否还存在可能对标记产生干扰的其它成分。然而，所述染料始终应该至少存在过量的巯基含量以实现饱和标记，同样，为了实现最佳标记，保持1nmol TCEP比2nmol染料的比例也是很重要的。使用过量的染料通常是要求每50g蛋白质样品中染料为5-200nmol。然而，为了完成标记反应通常是50μg蛋白质需要20nmol染料(假设平均半胱氨酸含量为2％)。对于具有更高半胱氨酸含量的哺乳动物样品而言，通常是使用40nmol染料。当然，样品中的其它成分也可能与染料反应。例如，肝样品可能含有更高含量的三肽谷胱甘肽以对应激/毒性物质产生响应。因此，为了维持标记的有效性，可能需要提高染料的浓度。含有高水平白蛋白的血清样品是一种具有高半胱氨酸含量的含量丰富的蛋白质，也可能需要较高的染料浓度。
iii)标记反应的pH
半胱氨酸残基是强的亲核试剂，因而可以使用具有碘代乙酰胺和马来酰亚胺反应活性基团的试剂将其标记在蛋白质中。特别优选的反应活性基团是马来酰亚胺基。在巯基反应活性的判断中，其pKa显得很重要。如果高于相应的pH，由于硫醇盐(S-)形式取代了质子化的SH形式，从而导致其亲和性显著提高。在分离的半胱氨酸分子中，巯基的pKa大约为8.6；然而巯基在蛋白质中所处的微环境也可能影响其pKa。巯基与马来酰亚胺的反应速度在碱性pH时有所增加，这是因为硫醇盐阴离子的浓度增加了。在碱性条件下，马来酰亚胺水解得到马来酰胺酸成为重要的副反应，并且与其它功能基团例如赖氨酸和组氨酸的竞争反应变得更加明显。
赖氨酸的ε-氨基相对于pKa为9.0-9.5的蛋白质中的典型胺。在较低的pH下例如pH6.5下，绝大多数胺基是以质子化了的、未反应的NH3 +形式存在，与马来酰亚胺基团的反应比与巯基的慢～1000倍。末端胺基具有7.5-8的pKa值为，取决于所对应的氨基酸。末端胺基在比赖氨酸更低的pH下可以以未质子化的(反应活性)形式存在。因此，马来酰亚胺基团与胺的反应要求比与巯基反应更高的pH。这样一来，使用马来酰亚胺标记巯基在较低的pH下显得更具特异性，它同时更不容易标记到赖氨酸残基。因此，在实现饱和标记方面以及为了特异性的标记巯基，反应的pH也是一个重要因素。优选使用例如根据式(I)的荧光染料的饱和标记是在pH为6.0-9.0的范围内完成的，最优选pH为8.0，这是存在反应活性硫醇盐和存在反应活性胺之间的一个折衷。
用于比较的蛋白质样品可来自于各种细胞源，包括由任意一种就物种(例如人类、啮齿动物、猿)来说已知的细胞源、组织源(例如脑、肝、肺、心脏、肾、皮肤、肌肉)以及细胞类型(例如上皮细胞、内皮细胞)得到的所有正常和变异细胞。有各种已制定的协议可用于培养各种细胞类型(参见例如Freshney，R.I.，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第二版，Alan R. Liss Inc. 1987)。本发明也可用于利用完整的植物或培养的植物细胞来比较植物样品。此外，用于本发明方法中的样品可以来自用重组基因转染并培养过的细胞、经受外界刺激(例如热休克和药物治疗)或其它生物学流体(例如脑脊髓液或血清)处理过的细胞。本发明还可用于在标记之前定位存在于细胞中的蛋白质亚组；例如通过分离出特定部分例如低分子量蛋白质或pl范围；亚细胞部分例如核内蛋白。
本领域技术人员应该理解，蛋白质样品可以使用各种不同的方法和萃取试剂萃取由这类样品得到。典型地，例如通过均化作用、超声波降解、细胞裂解将来自组织/培养基的细胞分解，然后对所述的蛋白质在各种试剂存在下进行萃取或溶解，这些试剂包括变性试剂例如脲、硫脲，去污剂例如SDS、CHAPS、TritonX-100、NP-40，还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇以及缓冲剂例如Tris、Hepes。为了尽量减少被内生蛋白酶降解，还可以加入蛋白酶抑制剂例如苯甲磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽。
例如根据Minden，J.等人描述的方法(Electrophoresis，(1997)，18，2071)，本发明所述荧光染料组以及所述标记方法可用于检测至少两种不同的蛋白质样品中蛋白质含量之间的差别。在该方法的典型实例中，将蛋白质从两种不同样品中按照上述已知方法萃取出来，然后测定蛋白质浓度。向每种蛋白质萃取液50μg等分液中加入10nmolTCEP(三-(2-羧基乙基)膦)，然后将其在37℃下孵育1小时。向每份所述还原后的蛋白质样品中加入20nmol染料，然后在37℃下孵育30分钟。将第一蛋白质样品用染料匹配组中的第一染料(例如Cy3)标记，第二蛋白质样品用染料匹配组中的第二染料(例如Cy5)标记。通过加入含有DTT的样品缓冲液停止反应。混合这些被标记的蛋白质样品，得到用于分离的单一样品。该样品可以通过电泳分离，优选通过2D-PAGE分离。用于电泳分离的步骤是本领域技术人员众所周知的。
在本发明的第四个方面，提供了一种试剂盒(kit)，所述的试剂盒包括含有至少两种具有式(I)结构的不同荧光染料的荧光染料的匹配组：
其中对于每一种所述的染料，n不同，并且为1、2、或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A0282949800221
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，则所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
通过参照下面的实施例和附图对本发明进行进一步描述，其中：
图1描述了使用半胱氨酸活性染料与2D电泳对蛋白质样品进行差异分析的典型流程。两种不同的蛋白质样品是由细胞、组织或其它生物学流体制备得到的。第一和第二蛋白质样品可以是任意的两种样品，其中理想的是将例如来自正常和患病组织、或者来自对照与药物处理/刺激的细胞中的蛋白质的含量进行对比。该方法还可应用于单向分离系统。
图2示出了使用染料组1、12和9进行标记、然后通过2D电泳分离的蛋白质的重叠图象，标记的蛋白质斑点的轮廓用于证明位置匹配性。
实施例
实施例1. 染料的合成
i) 一般实验步骤
1H NMR(δH)光谱是在Jeol JNM-LA300 FT NMR分光光度计上记录的。化学位移以δ(ppm)为单位进行记录。在适宜的氘化溶剂例如d4-甲醇中制备得到样品溶液。UV/VIS光谱是使用Unicam UV3 UV/VIS光谱仪进行操作的。三甲氧基丙烯购自Karl Industries Inc.，Ohio，USA。其它所有的化学品购自Sigma-Aldrich Company Limited，Dorset，England。
N-BOC-氨基乙基马来酰亚胺和N-BOC-氨基丙基马来酰亚胺根据描述在J.Org.Chem.，(1995)， 60，5352-5355中的文献描述制备得到。
ii) 2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾
将肼苯磺酸(20.0g)溶解于乙酸(60ml)中，加入3-甲基-2-丁酮(26.0g)，然后加热回流3小时。所得到的化合物通过在冰箱中刮涂冷却而沉淀析出，所得到的白色浆状物用丙-2-醇洗涤并过滤(71％)。
将2，3，3-三甲基-5-磺酰基-假吲哚(16.45g)加热溶解于甲醇(160ml)中，加入KOH在丙-2-醇(100ml)中的饱和溶液。溶液变成黄色，并形成固体。将溶液冷却，过滤固体形成一灰白色固体(15.9g，98％)。δH(300MHz，CD3OD)7.84(m，2H)，7.46(d，1H)，3.30(s，3H)和1.35(s，6H)。
iii) 1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾(1.0g，3.61mmol)和碘代甲烷(0.25ml，3.97mmol)与二氯苯(10ml)在氮气气氛下混合。溶液在100℃下使用沙浴加热4小时。开始形成固体，但是薄层色谱(30％MeOH/70％DCM)分析显示产物并未完全形成，因此再加入等量的碘代甲烷，继续加热反应2小时，然后冷却至室温。通过过滤收集固体，用二氯苯、二乙基醚洗涤，然后真空干燥得到紫色固体(0.89g，98％)。δH(300MHz，CD3OD)8.06(m，1H)，7.94(dd，1H)，7.84(m，1H)，4.02(s，3H)和1.61(s，6H)。
iv) 1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾(10.0g，41.97mmol)和碘代乙烷(4.0ml，50.35mmol)与二氯苯(40ml)在氮气气氛下混合。在120℃下使用沙浴加热溶液16小时，得到紫色固体。通过过滤收集固体，然后用二氯苯、氯仿和乙醚洗涤得到浅粉红色固体(10.2g，91％)。δH(300MHz，CD3OD)7.98(m，3H)，4.55(q，2H)，1.56(s，6H)和1.48(t，3H)。
v) 1-丙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾(1.0g，3.61mmol)和碘代丙烷(0.4ml，3.97mmol)与二氯苯(10ml)在氮气气氛下混合。将溶液在100℃下使用沙浴加热20小时，得到红棕色凝胶状固体。通过过滤收集固体，用二氯苯、氯仿和二乙醚洗涤得到粉红色固体(472mg，47％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，3H)，4.50(t，2H)，2.01(dt，2H)，1.56(s，6H)和1.13(t，3H)。
vi) 1-磺丁基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚(2.0g，12.6mmol)和1，4-丁烷磺内酯(butanesultone)(1.7g，12.6mmol)混合在一起并在100℃加热6小时。溶液逐渐转红，6小时后反应冷却至室温。将固体分散于二乙基醚中，过滤。收集固体并干燥。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.75(m，1H)，7.42(m，2H)，4.58(m，2H)，2.93(m，2H)，2.18(m，2H)，1.94(m，2H)和1.61(s，6H)。
vii) 1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚(6.4g，40mmol)溶解于二氯苯(25ml)中搅拌直到溶液均匀。向其中加入6-溴己酸(15.6g，80mmol)，反应在沙浴中加热至110℃，持续6.5小时。将反应冷却至室温，刮涂烧瓶侧壁，然后将其置于冰箱中1小时。此后，在紫色溶液中形成浅褐色固体，通过过滤收集固体，然后用二氯苯和乙醚洗涤，得到浅褐色固体(7.42g，52％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62(m，2H)，4.52(t，2H)，2.38(t，2H)，2.04(p，2H)，1.88-2.45(m，4H)和1.61(s，6H)。
viii) 1-(4-羧基丁基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物
将2，3，3-三甲基假吲哚(11.3g，40mmol)溶解于二氯苯(30ml)中搅拌直到溶液均匀。向其中加入5-溴丁酸(19.3g，106.6mmol)，反应在沙浴中加热至110℃，持续6.5小时。将反应冷却至室温，刮涂烧瓶侧壁，然后将其置于冰箱中1小时。此后，在紫色溶液中形成浅褐色固体，通过过滤收集固体，然后用二氯苯和乙醚洗涤，得到浅褐色固体(7.42g，52％)。δH(300MHz，CD3OD)7.90(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62(m，2H)，4.59(t，2H)，2.41(t，2H)，2.04(m，2H)，1.76(m，2H)和1.61(s，6H)。
ix) 氨基乙基马来酰亚胺和氨基丙基马来酰亚胺
向4M盐酸的二  烷溶液中加入适宜的BOC-氨基烷基马来酰亚胺，反应在室温下搅拌30分钟。此时反应已经沉淀析出固体，真空除去溶剂，得到白色絮状固体。在下面的步骤中使用该化合物的粗产品。
x) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-2-[3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢 -2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)
将1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(2.0g，7.48mmol)、N，N′-二苯基甲脒(1.5g，7.48mmol)和原甲酸三乙酯(1.1g，7.48mmol)溶解于乙醇(10ml)中，然后回流(100℃)加热3小时。在反应烧瓶侧壁形成固体，UV/VIS示出408nm处有一新峰。加入二乙基醚，通过过滤收集沉淀和固体，用乙醚洗涤并真空干燥，得到黄色/橙色固体(1.83g，66％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝408nm。
向该Cy3半染料(1.83g，6.22mmol)的无水吡啶(10ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。然后加入1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(2.2g，6.22mmol)，反应在室温下搅拌16小时。反应过程通过tlc检测(20％ MeOH/80％DCM)。在减压下除去溶剂，然后使用快速柱色谱法纯化(反相二氧化硅∶水-50％甲醇梯度)得到299mg所需的Cy3酸产物(9％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
在氮气气氛下，将Cy3酸(200mg，0.36mmol)溶解于无水DMF中，然后在室温下搅拌。加入DIPEA(80μl，0.40mmol)和TSTU(120mg，0.40mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将该NHS酯用第二份等量的DIPEA(80μl，0.40mmol)处理，然后加入氨基乙基马来酰亚胺(80mg，0.40mmol)，反应搅拌2小时。薄层层析法(Tlc)显示已经转化为新产物，因此将反应用二乙基醚(50ml)稀释，滗析溶剂，留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(98mg，34％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550mn。δH(300MHz，CD3OD)8.56(t，1H)，7.92(m，2H)，7.62-7.38(m，5H)，6.72(s，2H)，6.50(dd，2H)，4.19(m，4H)，3.52(m，2H)，2.15(t，2H)，1.94-1.56(m，6H)，1.75(s，12H)和1.44(t，3H)。
xi) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E-5-(1，3，3-三甲基-5- 磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合 物II)
将1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(5.00g，11.90mmol)悬浮于乙酸(40ml)和TFA(2ml，18.0mmol)的混合物中直到所有的固体全部溶解。向反应物中加入1，3，3-三甲氧基丙烯(12.5ml，95.0mmol)，然后在室温下搅拌5小时。将溶液吸入500ml二乙基醚中，通过过滤收集所得到的沉淀(4.80g，含盐)。
向该Cy5半染料(4.80g，14.9mmol)的甲醇(40ml)溶液中加入醋酸钾(3.00g，34.2mmol)和1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(3.00g，16.4mmol)。搅拌过夜之后，将溶液吸入二乙基醚(500ml)中，通过过滤收集所得到的蓝色固体并真空干燥。通过快速柱色谱法(反相二氧化硅∶水-50％甲醇梯度)纯化，得到2.30g所需产物(28％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝642nm。
在氮气气氛下，将Cy5酸(200mg，0.36mmol)溶解于无水DMF中，然后在室温下搅拌。加入DIPEA(80μl，0.40mmol)和TSTU(120mg，0.40mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将该NHS酯用第二份等量的DIPEA(80μl，0.40mmol)处理，然后加入氨乙基马来酰亚胺(80mg，0.40mmol)，反应搅拌2小时。Tlc显示已经转化为新产物，因此将反应用物二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下蓝色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(105mg，43％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.18(dt，2H)，7.82(m，2H)，7.56-7.24(m，5H)，6.80(s，2H)，6.64(t，1H)，6.45(d，1H)，6.24(d，1H)，4.17(t，2H)，3.60(s，3H)，3.40(t，2H)，2.09(t，2H)，1.89-1.48(m，6H)和1.79(s，12H)。
xii) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3- 二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物 III)
将1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓(6.0g，16.94mmol)和N，N′-二苯基甲脒(6.63g，33.87mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后回流(120℃)加热4小时。使反应冷却至室温，真空除去溶剂。将所得到橙色油状物溶解于氯仿中，用水洗涤，硫酸镁干燥并浓缩为橙色油状物的Cy3半染料。该油状物直接使用不再纯化。
向该Cy3半染料(1.00g，2.18mmol)的无水吡啶(1.0ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。然后加入1-丙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(0.92g，3.28mmol)，反应在室温下搅拌16小时。通过tlc(20％MeOH/80％DCM)监视反应进程。减压下除去溶剂，利用快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)纯化得到241mg所需Cy3酸产物(21％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
在氮气气氛下，将Cy3酸(100mg，0.18mmol)溶解于无水DMF中。加入DIPEA(30μl，0.20mmol)和TSTU(54mg，0.20mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(30μl，0.20mmol)处理，然后加入氨乙基马来酰亚胺(40mg，0.20mmol)，反应搅拌2小时。Tlc显示已经转化为新产物，因此将反应用二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(41mg，34％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.52(t，1H)，7.90(m，2H)，7.60-7.39(m，5H)，6.78(s，2H)，6.52(dd，2H)，4.22(m，4H)，3.56(m，2H)，2.13(t，2H)，1.97-1.56(m，8H)，1.75(s，12H)和1.09(t，3H)。
xiii) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基] 氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三 甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚 鎓(化合物IV)
将1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓(4.0g，14.59mmol)和丙二醛双(苯基亚胺)盐酸盐(7.55g，29.18mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后回流(120℃)加热4小时。反应冷却至室温，真空除去溶剂。将所得到的红色油状物溶解于氯仿中，用水洗涤，硫酸镁干燥并浓缩为红色油状物的Cy5半染料。该油状物直接使用不再纯化。
向该Cy5半染料(1.00g，2.07mmol)的无水吡啶(10ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。向其中加入1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(0.59g，2.28mmol)，反应在室温下搅拌16小时。通过tlc(20％MeOH/80％DCM)监视反应进程。减压下除去溶剂，然后使用快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)纯化得到365mg所需的Cy5酸产物(31％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。
在氮气气氛下，将Cy5酸(52mg，0.09mmol)溶解于无水DMF中，并在室温下搅拌。加入DIPEA(10μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(10μl，0.10mmol)处理并加入氨乙基马来酰亚胺(18mg，0.10mmol)，反应搅拌2小时。Tlc显示已经转化为新产物，因此将反应用二乙基醚(30ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下蓝色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(29mg，47％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.38(m，2H)，7.88(m，2H)，7.55-7.24(m，5H)，6.80(s，2H)，6.71(t，1H)，6.42(d，1H)，6.24(d，1H)，4.11(m，4H)，3.54(t，2H)，2.12(t，2H)，1.92-1.36(m，9H)和1.81(s，12H)。
xiv) 1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基- 5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3-H-吲哚鎓(化 合物V)
将1-(4-羧丁基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(2.00g，5.88mmol)和丙二醛双(苯基亚胺)盐酸盐(2.28g，8.82mmol)溶解于乙酸(30ml)中，然后在120℃下加热6小时。在真空除去乙酸之前使反应冷却至室温，得到粘性油状物。将其溶解于氯仿中并用水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩得到更具粘性的油状物。大部分未反应的丙二醛双(苯基亚胺)残余在氯仿/水的分界面上。所得到化合物使用快速柱色谱法(二氯甲烷-30％甲醇梯度)处理得到红色固体(120mg，5％)。
向该Cy5半染料(120mg，0.31mmol)的无水吡啶(3ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。然后，加入1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(83mg，0.31mmol)，反应在室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂，使用快速柱色谱法(二氧化硅∶二氯甲烷-40％甲醇梯度)纯化得到84mg所需产物(48％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。
在氮气气氛下，将Cy5(84mg，0.15mmol)溶解于无水DMF溶液中，然后在室温下搅拌。加入DIPEA(26μl，0.15mmol)和TSTU(45mg，0.15mmol)，搅拌反应2小时直到tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(DIPEA(26μl，0.15mmol))处理并加入氨乙基马来酰亚胺(52mg，0.30mmol)，将反应再搅拌2小时。Tlc显示已经转化为新产物，因此将反应用二乙基醚(50ml)稀释，滗析溶剂，留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(30mg，30％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.15(q，2H)，7.80(m，2H)，7.52-7.31(m，5H)，6.75(s，2H)，6.64(t，1H)，6.46(d，1H)，6.32(d，1H)，4.27(m，4H)，4.15(t，2H)，2.09(t，2H)，1.79(s，6H)，1.65(s，6H)2.56-2.44(m，4H)和1.12(t，3H)。
xv) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3- 二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物 VI)
将1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(500mg，1.41mmol)、N，N′-二苯基甲脒(278mg，1.41mmol)以及1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(418mg，1.41mmol)溶解于无水吡啶(5ml)中，并在室温下搅拌。然后加入乙酸酐(0.4ml)，反应在环境温度下搅拌过夜。真空除去吡啶，所得到的红紫色油状物通过快速柱色谱法(二氯甲烷-10％甲醇梯度)纯化得到粉红色固体(67mg，8％)。
在氮气气氛下，将该Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解于无水DMF中，然后室温搅拌。加入DIPEA(20μl，0.09mmol)和TSTU(59mg，0.18mmol)，反应搅拌2小时直到tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将该NHS酯用第二份等量的DIPEA(20μl，0.09mmol)处理，然后加入氨基乙基马来酰亚胺(32mg，0.18mmol)，反应继续搅拌2小时。反应用二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(24mg，43％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.49(t，1H)，7.52-7.35(m，8H)，6.72(s，2H)，6.46(dd，2H)，4.09(m，4H)，3.57(m，2H)，2.85(m，2H)，2.15(t，2H)，1.94-1.43(m，10H)和1.85(s，12H)。
xvi) 1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1- 磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚 鎓(化合物VII)
将1-(4-羧丁基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(1.0g，2.94mmol)和丙二醛双苯基亚胺盐酸盐(760mg，2.94mmol)溶解于乙酸(10ml)中，然后在120℃下加热18小时。在真空除去乙酸之前反应置冷，得到粘性红色油状物。将其溶解于氯仿中用水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩得到更具粘性的红色/棕色油状物。该化合物使用快速柱色谱法(二氯甲烷-20％甲醇梯度)纯化得到橙色固体(1.43g，55％)。
向该Cy5半染料(120mg，0.26mmol)的无水吡啶(5ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。然后加入1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(83mg，0.28mmol)，反应在室温下搅拌2小时。件压下除去溶剂，使用快速柱色谱法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)纯化得到78mg所需产物(51％)。
在氮气气氛下，将该Cy5酸(50mg，0.09mmol)溶解于无水DMF中，室温搅拌。加入DIPEA(15μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反应搅拌2小时直到tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(15μl，0.10mmol)处理并加入氨基乙基马来酰亚胺(30mg，0.17mmol)，反应继续搅拌2小时。Tlc分析显示已经转化为新产物。反应用二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下蓝色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(30mg，30％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.19(t，2H)，7.52-7.42(m，8H)，6.71(s，2H)，6.64(t，1H)，6.36(dt，2H)，4.18(m，4H)，3.55(m，2H)，2.89(m，2H)，2.15(t，2H)，1.79(s，12H)和2.01-1.36(t，8H)。
xvii) 1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基] 氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基- 1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化 合物VIII)
将1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(354mg，1.00mmol)、N，N′-二苯基甲脒(196mg，1.00mmol)以及1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(267mg，1.00mol)溶解于无水吡啶(15ml)中，室温搅拌。然后加入乙酸酐(0.5ml)，反应在环境温度下搅拌过夜。真空除去吡啶，所得到的红紫色油状物通过快速柱色谱法(二氯甲烷-40％甲醇梯度)纯化得到粉红色固体(30mg，6％)。
在氮气气氛下，将该Cy3酸(30mg，0.05mmol)溶解于无水DMF中，然后室温搅拌。加入DIPEA(10μl，0.05mmol)和TSTU(2mg，0.05mmol)，反应搅拌2小时直到tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(10μl，0.05mmol)处理，然后加入氨乙基马来酰亚胺(9mg，0.05mmol)，反应继续搅拌2小时。反应用二乙基醚(20ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(15mg，44％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.53(t，1H)，7.95(m，2H)，7.59-7.41(m，5H)，6.78(s，2H)，6.50(t，2H)，4.17(m，4H)，3.50(m，2H)，3.14(t，2H)，2.14(t，2H)，1.98-1.28(m，11H)和1.79(s，12H)。
xviii) 1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基] 氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)- 1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化 合物IX)
将1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(6.0g，16.95mmol)和N，N′-二苯基甲脒(6.63g，33.87mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后在120℃下加热5小时。真空除去乙酸，残余物使用柱色谱法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)纯化得到黄色/橙色固体(1.34g，21％)。
向该Cy3半染料(250mg，0.55mmol)的无水吡啶(5ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反应在氮气气氛下搅拌10分钟。然后加入1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(161mg，0.55mmol)，反应在室温下搅拌22小时。减压下除去溶剂，快速柱色谱法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)纯化得到142mg所需的Cy3酸产物(45％)。
在氮气气氛下，将Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解于无水DMF中，然后在室温下搅拌。加入DIPEA(15μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(15μl，0.10mmol)处理，同时加入氨丙基马来酰亚胺(18mg，0.10mol)，反应搅拌2小时。反应用二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(15mg，24％)。δH(300MHz，CD3OD)8.49(t，1H)，7.78-7.22(m，8H)，6.72(s，2H)，6.50(t，2H)，4.12(m，4H)，3.47(m，2H)，3.10(m，2H)，2.85(m，2H)，2.15(t，2H)，2.01-1.24(m，12H)和1.85(s，12H)。
xix) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1- 磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚 鎓(化合物X)
将1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(353mg，1.00mmol)、丙二醛双苯基亚胺盐酸盐(259mg，1.00mmol)和1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(295mg，1.00mmol)溶解于无水吡啶(5ml)中，室温搅拌。然后加入乙酸酐(0.4ml)，反应在环境温度下搅拌。真空除去吡啶，所得到蓝色油状物，通过快速柱色谱法(二氯甲烷-10％甲醇梯度)纯化得到蓝色固体(54mg，8％)。
在氮气气氛下，将该Cy5酸(49mg，0.08mmol)溶解于无水DMF中，然后在室温下搅拌。加入DIPEA(12μl，0.09mmol)和TSTU(27mg，0.09mmol)，反应搅拌2小时直到通过tlc(20％MeOH/80％DCM)显示NHS酯已经完全形成。将所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(12μl，0.09mmol)处理，然后加入氨基乙基马来酰亚胺(28mg，0.16mmol)，反应继续搅拌2小时。Tlc显示已经转化为新产物，因此将反应物用二乙基醚(50ml)稀释，轻轻倾出溶剂留下粉红色残余物。快速柱色谱法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)处理得到所需的马来酰亚胺产物(24mg，45％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.21(t，2H)，7.54-7.26(m，8H)，6.80(s，2H)，6.64(t，1H)，6.38(dd，2H)，4.18(m，4H)，3.58(m，2H)，2.89(m，2H)，2.15(t，2H)，1.76(s，12H)和2.06-1.39(m，10H)。
xx) 1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨 基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢- 2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物XI)
按照类似的方法，将1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物和1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物与N，N′-二苯基甲脒一起反应形成Cy3酸，将其活化成N-羟基琥珀酰亚胺，再用氨乙基马来酰亚胺处理，转化为1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓。
实施例2
2.1 蛋白质的分离和标记
在E.coli样品上进行初始试验。将E.coli菌株ER 1647(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)在富含葡萄糖的MOPS介质中于37℃下培养过夜，然后在4℃、12,000×g下离心采集。将细胞丸颗用洗涤缓冲液(10mM Tris pH8.0，0.5mM醋酸镁)洗涤。然后将细胞再次悬浮于溶菌缓冲液(8M脲，4％w/v CHAPS，40mM TrispH8.0)中，通过超声波降解法(3×10秒脉冲，冰上)溶菌。E.coli溶菌液的蛋白质浓度使用Bio-Rad Dc蛋白质测定法按照制造商(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)所描述的方法进行测定。
在使用之前，将花青染料重构于无水DMF(Aldrich目录编码22，705-6)中使得最终浓度为10mM(10nmol/μl)。在加入DMF后将染料简单进行涡旋以保证染料完全溶解。将该重构的染料储存于-20℃下，在2周内使用。
通过加入10nmol TCEP[三-(2-羧基乙基)膦]，接着在37℃下孵育1小时，将50μg蛋白质的溶菌缓冲溶液中的二硫键还原。还原之后，加入20nmol重构的染料，在37℃下孵育30分钟。使用等体积的2x样品缓冲液(溶菌缓冲液和20mg/ml DTT以及4％(v/v)Pharmalytes 3-10)停止反应。在单向分离或避光长期冷冻保藏之前，将样品简单储存在冰块中。
2.2 供分离的蛋白质样品的制备
用Cy3和Cy5标记等量的蛋白质样品，化合物I-XI进行混合，得到如表2所示的染料配对组。
                         表2
染料配对组     化合物   染料配对组     化合物
    1     III     7     VIIII
    2     IIIIV     8     IXVII
    3     IV     9     IIIII
    4     VIVII     10     VIX
    5     VIIIIV     11     IIV
    6     IXX     12     XIII
2.3通过2D电泳分离蛋白质
使用标准的Amersham Biosciences 2D PAGE装置和PlusOneTM试剂(Buckinghamshire，UK)完成2-D电泳。将Immobiline DryStrips(pH3-10 NL或pH4-7 NL，24cm)在用2.5ml DryStrip涂液重叠的450μl复水缓冲液(8M脲，4％w/v CHAPS，1％Pharmalytes(pH3-10)，2mg/ml DTT)中、于Immobiline DryStrip Reselling Tray中再水化过夜。各试片(strip)使用多光子等电子聚集系统聚集。在双向PAGE之前，各试片在镀银振动台上用10ml平衡缓冲液A(8M脲，100mM Tris-HCl pH6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，5mg/ml DTT)平衡10分钟，接着再用10ml平衡缓冲液B(8M脲，100mM Tris-HClpH6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，45mg/ml碘代乙酰胺)平衡10分钟。装入试片，在12％等度洗脱(isochratic)Laemmli SDS-PAGE凝胶上进行操作。
2.4荧光凝胶成像
使用如下设置的2920 Masterlmager(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)观察被标记的蛋白质：
     激发      发射
Cy3     540nm(25nmBP)     590nm(35nmBP)
Cy5     620nm(30nmBP)     680nm(30nmBP)
根据不同的试验优化曝光时间以在50,000图象上得到最大的象素值从而避免信号饱和。将来自2D-Master的数据以TIF文件的形式输入至Paintshop ProTM以生成彩色重叠图象，供肉眼观察。为了具体地定量分析染料的配对，将凝胶图象输入2D Image Master软件程序中。
2.5 图象分析
本研究中的凝胶分析是利用2D Image Master(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)——一种2-D分析软件平台完成的。在检测到斑点之后，每个斑点的中心用于生成每个Cy3和Cy5图象的象素坐标。通过对比这些Cy3和Cy5斑点中心的座标位置确定迁移匹配性的程度。它可以用于描述在x(pl)和y(质量)坐标上彼此相差±2象素的匹配斑点数目方面的位置配对。
由于两种染料都被用来标记同样的样品，而在每种被标记样品中存在相同的蛋白质，因此如果染料在等同迁移方面是匹配的，那么所有的斑点在两张图象之间就应该是精确重叠的。测量落入+/-2象素的斑点百分数以确定整体匹配性。
实施例3 对于通过改变烷基链长度(r)在半胱氨酸残基上进行的 饱和标记来说匹配的染料的差异凝胶电泳
通过使用每种染料对相同的复合蛋白质样品(E.coli溶菌液)进行标记、混合这些Cy3和Cy5标记样品，然后通过2D电泳分离，测试染料结构的作用。在荧光扫描之后，将图象按照上面实施例所述的方法进行重叠和分析。
如上所述，将E.coli溶菌液用Cy3化合物和Cy5化合物标记。在分离之前，混合这些被标记样品得到染料组合1、2、9、11和12，观察通过增加CH2单元而改变烷基链长度所带来的影响。表3示出了在对用染料组1、2、9、11和12标记的蛋白质重叠图象进行分析之后得到的定量位置数据。
表3： 改变烷基链长度(r)对位置配对的影响
  染料组合   n值     p     q     r   2象素内的匹配斑点(％)
    X(pl)     Y(质量)
  1   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     21     82.7     88.8
  2   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     32     79.7     77.7
  9   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     31     76     76.3
  11   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     22     86.1     44.3
  12   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     11     59.7     58.9
因此，当Cy3和Cy5具有相同的烷基链时(例如染料组11和12)，Cy3的总质量相对于Cy5而言有所降低。这导致质量方向上的位置配对较差。当烷基链长度存在两个碳单元的差距时(例如染料组合9)，其质量配对有所改善。当各种染料之间存在单个碳原子的差距时(例如染料组1和2)，此时对于质量和pl而言获得最佳的配对。优选的染料组是染料组1。这表明，使用接头r之间相差单个碳单元的迁移配对可以使被不同标记的蛋白质在2D电泳上获得良好的位置配对。
图2示出了使用染料组1、12和9进行标记、然后通过2D电泳分离的蛋白质的重叠图象，标记蛋白质斑点的轮廓用于反映位置配对。该重叠图象是由使用Cy3或Cy5标记的E.coli溶菌液的部分2D电泳凝胶得到的，它示出了～20-30kDa质量范围和～5.5-6.0pl范围。代表被Cy3和Cy5标记的蛋白质的蛋白斑点轮廓位置的圆圈(箭头所指)是使用2D ImageMaster软件测得的。染料组12得到较差的质量配对，这是因为被Cy5标记的蛋白质出现在被Cy3标记的蛋白质下方(实施例中箭头所指)。染料组9也显示出较差的质量配对，在该情形中被Cy5标记的蛋白质出现在被Cy3标记的蛋白质上方(实施例中箭头所指)。优选的染料组1得到最佳的位置配对。
实施例4对于 通过改变吲哚核心之间的接头长度(p)在半胱氨酸 残基上进行饱和标记而言匹配的染料的差异凝胶电泳
如上所述，将E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物标记，混合样品得到染料组1和3。表4示出了在对使用这些染料组合标记的蛋白质重叠图象进行分析之后得到的定量位置数据。
表4： 改变接头长度(p)对位置配对的影响
  染料组   n的值     p     q     r         在2个象素内的匹配斑点(％)
    X(pl)     Y(质量)
  1   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     21     87.3     86.4
  3   1(Cy3)2(Cy5)     54     22     22     88.1     85.2
这表明，使用接头p之间相差单个碳单元的迁移匹配可以使被不同标记的蛋白质在2D电泳上获得良好的位置配对。
实施例5对于 通过改变马来酰亚胺基团之间的接头长度(q)在半 胱氨酸残基上进行饱和标记而言匹配的染料的差异凝胶电泳
通过由氨基乙基到氨基丙基马来酰亚胺使接头长度增加单个的CH2单元，从而改变接头q。如上所述，将E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物标记，混合样品得到染料组1、5和7。表5示出了在对使用这些染料组标记的蛋白质重叠图象进行分析之后得到的定量的位置数据。
表5：改变马来酰亚胺接头长度(q)对位置配对的影响
  染料组   n值     p     q     r       在2个象素内的匹配斑点(％)
    X(pl)     Y(质量)
  1   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     21     85.7     88.0
  5   1(Cy3)2(Cy5)     55     32     22     64.2     80.7
  7   1(Cy3)2(Cy5)     55     32     21     67.6     71.8
因此，可能是由于β-效应的原因，氨基乙基接头(染料组合1)相对于氨基丙基接头(染料组合5和7)而言具有更好的pl配对。当各种染料之间相差两个碳单元时，质量配对也降低(染料组7)。当相差单个碳单元时，位置配对得到改善。因此，氨基乙基马来酰亚胺接头(q＝2)对于pl配对而言是优选的。
实施例6对于 通过改变磺酸酯基团的位置在半胱氨酸残基上进行 饱和标记而言匹配的染料的差异凝胶电泳
磺酸酯化的花青染料通常具有直接连接于染料组1中的吲哚环的磺酸酯基团。通过将磺酸酯连接于通过丁基链接头连接的环上，从而改变磺酸酯的位置。如上所述，将E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物标记，混合样品得到染料组1、4、6、8和10。表6示出了在对使用这些染料组标记的蛋白质重叠图象进行分析之后得到的定量的位置数据。
表6：改变磺酸酯位置对配对的影响
  染料组   磺酸酯的位置   n值     p     q     r        在2个象素内的匹配斑点(％)
    X(pl)     Y(质量)
  6   侧链侧链   1(Cy3)2(Cy5)     55     32     44     86.3     82.6
  4   侧链侧链   1(Cy3)2(Cy5)     54     22     44     78.3     79.7
  8   侧链侧链   1(Cy3)2(Cy5)     54     32     44     73.3     63.7
  10   侧链侧链   1(Cy3)2(Cy5)     55     22     44     82.4     49.8
与前面的数据进行对比表明，将磺酸酯从环系上移到侧链丁基链上似乎确实改变了pl匹配性。在质量方向上的配对并不比使用染料组1所获得的配对好。在没有对各种染料之间的n差异进行补偿的情形下，迁移匹配对有所降低(染料组10)。如果存在两个碳单元的差别(染料组8)，相对于染料组1而言其质量配对降低了。如果存在单个碳单元的差别(染料组4和6)，配对得到改善。最好的与侧链丁基磺酸酯的组合将接头9修饰成马来酰亚胺(染料组6)。

Claims (19)

1.一种荧光染料的匹配组，它含有至少两种式(I)结构的不同荧光染料：
其中对于每一种所述的染料，n不同，并且为1、2、或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A028294980002C2
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
2.一种荧光染料的匹配组，它含有至少两种式(II)的不同荧光染料：
其中对于每一种所述的染料，n不同，并且为1、2、或3；
基团R1和R2中的一个下列是基团：
Figure A028294980003C2
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
3.根据权利要求1或权利要求2的匹配组，它含有至少两种不同的根据式(I)或(II)的荧光染料，其中：
n选自1或2；
p选自4或5；
q选自2或3；以及
r选自1、2或3。
4.根据权利要求1-3中任意一项的匹配组，其中该染料组中的每一种染料的目标连接基团Y是相同的，并且选自马来酰亚胺基和碘代乙酰胺基。
5.根据权利要求4的匹配组，其中每一种染料中的Y是马来酰亚胺基。
6.根据权利要求1-5中任意一项的匹配组，其中所述盐类选自K+、Na+、NH4 +、R3NH+和R4N+，其中R是C1-C4烷基。
7.根据权利要求1-6中任意一项的匹配组，它选自：
组1
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5 E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物II)；
组2
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物III)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；
组3
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物V)；
组4
1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VI)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[1(E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物VII)。
组5
1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VIII)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；以及
组6
1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物IX)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-1(1-磺基-丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物X)。
8.一种用于对样品中的蛋白质混合物进行标记的方法，其中每一种所述的蛋白质含有一种或多种半胱氨酸残基，所述的方法包括：
i)向含有所述样品的含水液体中加入荧光染料，其中所述的染料含有与所述的蛋白质共价反应的目标连接基团；然后
ii)使所述的染料与所述的蛋白质发生反应以使所述的染料对所述的蛋白质进行标记；
其特征在于，所述蛋白质中所有可利用的半胱氨酸残基是用所述的染料进行标记的。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的荧光染料是花青染料。
10.根据权利要求9的方法，其中所述的花青染料含有磺酸或磺酸酯基团。
11.根据权利要求8-10中任意一项的方法，其中所述的目标连接基团选自马来酰亚胺基和碘代乙酰胺基。
12.根据权利要求8的方法，还包括在步骤i)之前将所述蛋白质用还原剂处理的步骤。
13.根据权利要求8的方法，其中所述的染料在5-200nmol染料/50μg蛋白质的范围内使用。
14.根据权利要求8的方法，其中所述标记是在pH为6.0-9.0的范围内进行的。
15.一种用于对样品中的一种或多种蛋白质进行标记的方法，该方法包括：
i)向含有所述一种或多种蛋白质的液体样品中加入式(I)的荧光染料：
其中对于每一种所述染料，n不同，并且为1、2、或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
Figure A028294980007C1
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1；然后
ii)在适用于对所述的一种或多种蛋白质进行标记的条件下，将所述的染料与所述的样品一起孵育。
16.根据权利要求15的方法，其中Z1和Z2中的每一个表示闭合苯基环系所必需的碳原子。
17.根据权利要求15的方法，其中：
n选自1或2；
p选自4或5；
q选自2或3；以及
r选自1、2或3。
18.根据权利要求15-17中任意一项的方法，其中所述的目标连接基团Y选自马来酰亚胺基和碘代乙酰胺基。
19.一种试剂盒，它包括含有至少两种具有式(I)结构的不同荧光染料的荧光染料匹配组：
Figure A028294980008C1
其中对于每一种所述染料，n不同，并且为1、2、或3；
Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；
基团R1和R2中的一个是下列基团：
其中Y是目标连接基团；
另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；
基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；
W选自磺酸和磺酸酯；
p是3-6的整数；
q选自2或3；以及
r是1-5的整数；
以及它们的盐类；
其特征在于，当所述染料中的两种的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。
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