CN1732387A

CN1732387A - 一种分析蛋白质与底物肽之间相互作用的蛋白质芯片

Info

Publication number: CN1732387A
Application number: CNA200380108047XA
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 李锡宰
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 2003-01-04
Filing date: 2003-10-18
Publication date: 2006-02-08
Anticipated expiration: 2023-10-18
Also published as: KR20040063058A; CN1333255C; US20060105407A1; WO2004061453A1; KR100523212B1; AU2003271225A1; JP2006512581A

Abstract

本发明涉及一种S－L－SP型的蛋白质芯片，其中底物肽(SP)通过连接蛋白(L)的介导被固定到固体基底(S)上，还涉及一种使用该蛋白质芯片来分析反应蛋白和底物肽相互作用的方法。使用本发明的蛋白质芯片来分析反应蛋白与底物肽之间相互作用的方法包括下述步骤：在蛋白质芯片上加入反应蛋白，反应蛋白对固定在蛋白芯片上的底物肽具有特异性相互作用；检测反应蛋白与底物肽之间的相互作用。本发明能在蛋白质芯片上提高低分子量肽与高分子量酶之间的反应性，并且提高肽与反应性抗体之间的反应性，从而能快速大量地分析肽与蛋白质之间的相互作用。

Description

一种分析蛋白质与底物肽之间相互作用的蛋白质芯片

技术领域

本发明涉及一种分析蛋白质与底物肽之间相互作用的蛋白质芯片。尤其是，本发明涉及一种S-L-SP型的蛋白质芯片，其中底物肽(SP)通过连接蛋白(L)的介导而被固定到固体基底上，本发明还涉及采用该蛋白质芯片来分析蛋白质与底物肽之间相互作用的方法。

背景技术

在发现能与特定蛋白质具有特异性相互作用的生物分子的功能，以及开发治疗和预防疾病的方法的研究中，蛋白质芯片是一项关键技术。采用基于蛋白质分析和网络分析得到的数据的传统方法是不能实现这些研究的。

发展至今的蛋白质芯片技术大概能分成下述4类。

(1)采用DNA微阵列技术在芯片上分析DNA和蛋白质之间相互作用的技术。在芯片上，单链寡核苷酸转化成双链寡核苷酸，然后，与DNA序列特异性的限制性酶相作用。依据是否发生了DNA消化来检查DNA-蛋白质的相互作用。因此，该技术能用在发现和表征一种新的DNA结合蛋白(Bulyk，M.L.等，Nat.Biotechnol.，17：573-7，1999)。

(2)在蛋白质芯片上分析抗原-抗体相互作用以及包括限制性酶、过氧化物酶、磷酸酶、蛋白激酶等各种酶的反应的技术(US2002/0055186A1；WO01/83827A1；Braunwalder，A.等，Anal.Biochem.，234：23-6，1996；Houseman，B.等.，Nat.Biotechnol.，20：270-4，2002；以及Ruud，M.等，Nat.Biotechnol.，18：989-94，2000)。尤其是，该技术能通过蛋白-蛋白相互作用、激酶-底物肽相互作用和蛋白配体结合反应用于大规模筛选、生化分析、新的候选药物的分析、疾病的诊断等方面。但是，在固定激酶或蛋白特异性的低分子量底物肽的情况下，存在的缺陷是，固定的物质会被包埋在用于抑制非特异性固定的封闭液BSA中。此外，据报道，当不同种类的抗体固定到芯片上并与荧光标记的抗原混合物反应时，仅有60％的抗体表现出定量结果，仅有23％的抗体表现出定性的结果(MacBeath，G.等，Science，289：1760-3，2000；以及Haab，B.等，Genome Biol.，2：research 0004，2001)。

(3)在芯片上从cDNA文库表达大量的蛋白质并进行分析的技术(WO01/83827；WO 02/50260)。该技术能对蛋白质的生化活性进行大规模研究。

(4)通过在芯片表面形成均匀稳定的单层生物分子，并用亲合标记在分子水平保持生物分子方向来分析样品的技术(US2002/0055125A1；US 6,406，921；Paul，J.等，JACS，122：7849-50，2000；RaVi，A.等，Anal.Chez.，73：471-80，2001；以及Benjamin，T.等，TrendsBiotechnol.，20：279-81，2002)。例如，蛋白质以His-标记融合蛋白的方式表达，然后与Ni-NTA结合芯片反应而固定到芯片上，从而保持了生物分子的活性。另外，蛋白质以内蛋白子(intein)融合蛋白的方式表达，从而能很容易地被纯化。而且，也可以在特定位点将蛋白质生物素化，并在抗生物素蛋白处理的芯片上以给定的方向固定，这样能使蛋白质保持在一个更加稳定和更具活性的状态(Zhu等，Science，293：2101-5，2001；Marie-Laure，L等，JACS，124：8768-9，2002)。此外，与支持物特异性结合的蛋白质(如钙调蛋白)以与标记物(例如，聚半胱氨酸，赖氨酸，组氨酸等)融合的方式表达，然后固定至支持物上，所得到的结构能用于蛋白纯化、表面等离子体共振(SPR)分析和荧光激活的细胞筛选(FACS)分析(Hentz等，Anal.Chem.，68：3939-44，1996；Hodneland等，PANS，99：5048-52，2002；Kukar等，Anal Biochem.，306：50-4，2002；US 6,117,976)。

尽管已发展出了上述各种蛋白芯片技术，但是目前的蛋白质芯片技术使用的低分子量肽一般由小于50个的氨基酸组成，由于大分子反应蛋白(酶和抗体)与肽发生相互作用的空间和结构问题，使得现有的蛋白质芯片很难诱导固定的肽与反应蛋白之间的相互作用。并且，由于使用荧光标记的抗体检测相互作用时存在许多缺陷，使得该技术很难得到实际应用。此外，该技术需要肽能以高浓度固定至芯片上，因而目前的经济效益低。

因此，长期以来都迫切需要开发出一种能在芯片上有效分析低分子量的底物肽与高分子量的反应蛋白之间的相互作用的方法。

因此，本发明的发明人进行了深入的研究，开发出了一种能有效分析反应蛋白和底物肽相互作用的方法，从而发现当低分子量的底物肽通过连接蛋白的介导被固定至固体基底上，并用反应蛋白处理，然后用抗体检测反应蛋白与肽之间的相互作用时，底物肽与反应蛋白之间的特定相互作用能被轻易和有效得检测出来。基于上述几点完成了本发明。

发明内容

相应地，本发明的主要目的在于提供一种S-L-SP型蛋白质芯片，其中底物肽(SP)通过接合蛋白(L)的介导被固定到固体基底(S)上。

本发明的另一个目的在于提供一种使用上述生物芯片来分析反应蛋白与底物肽之间的相互作用的方法。

实现上述发明目的的蛋白质芯片的制备方法是：通过连接蛋白与底物肽融合，然后在连接蛋白的介导下将底物肽固定到固体基底上。底物肽与连接蛋白的融合方式优选采用肽单体、单体-脯氨酸-单体的二聚体、或单体之间通过脯氨酸连接的多聚体。

底物肽与连接蛋白的融合可以通过下述方法实现：用含有编码底物-连接蛋白的DNA的重组载体转化微生物，从培养的微生物中分离底物-连接蛋白，纯化分离的底物-连接蛋白；或者在实验室条件下用化学方法结合底物肽与连接蛋白。但是，考虑到提高经济效益和制备的简便，优选采用微生物表达体系来制备。

本发明所用的底物肽是一种能与反应蛋白进行特异性反应的底物，并能根据反应蛋白的种类进行选择。本发明所用的连接蛋白并不局限于但优选使用下列蛋白：如瘦素或苹果酸酶，它们能很容易地在微生物中表达且易于纯化。本发明所用的固体基底也不局限于但是优选使用蛋白质芯片中常用的表面带有醛类物质的载玻片。

此外，使用本发明的蛋白质芯片来分析反应蛋白与底物肽之间相互作用的方法包括下述步骤：在蛋白质芯片上加入反应蛋白，反应蛋白对固定在蛋白芯片上的底物肽具有特异性相互作用；以及检测反应蛋白与底物肽之间的相互作用。在该方法中，根据分析目的可从包括酶和抗体的多种蛋白中选择出反应蛋白，并且也可依据与底物肽的选择相互关联的方式来选择相应的反应蛋白。例如，使用蛋白激酶A作为反应蛋白，肯普肽(kemptide)(SEQ ID NO：1)作为底物肽。或者，采用Ab1激酶作为反应蛋白，Ab1(SEQ ID NO：8)作为底物肽。

Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly(SEQ ID NO：1)

Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Pro Phe Ala Lys Lys(SEQ ID NO：8)

检测底物肽与反应蛋白之间相互作用的步骤优选采用荧光标记抗体，但是根据反应蛋白的特性可使用各种抗体用于检测。例如，当使用蛋白激酶A或Ab1激酶作为反应蛋白时，底物肽在这些激酶作用下的磷酸化优选使用Cy3-标记的抗磷酸化丝氨酸抗体或Cy5-标记的抗磷酸化酪氨酸抗体进行检测。

以下，将详细说明本发明。

当与酶如激酶反应的底物肽被固定在芯片上，并使用抗体来检测底物肽和酶之间的相互作用时，抗体和底物间的相互作用存在空间和结构上的限制，并且由于低分子量而使得底物肽存在不够稳定的缺陷。

为了解决这些问题，在本发明中，底物肽以与连接蛋白融合的方式在E.coli中表达，并且是以不溶性的聚集物形式或6个组氨酸残基与N末端区域相连的水溶形式过度表达。然后将融合蛋白固定到固体基底上，从而制得蛋白质芯片。将来源于人瘦素的中止密码子以及苹果酸酶的中止密码子去除，其中苹果酸酶的6个组氨酸残基与N末端区域相连。然后，用于融合的底物肽的氨基酸序列与中止密码子连接，从而使它能以单体形式表达。或者，两个底物肽通过脯氨酸来相互连接而以二聚体形式表达，因此采用抗体检测相互作用以更高效和简便的方式进行。

图1是本发明制备的瘦素-肯普肽，苹果酸酶-肯普肽和瘦素-Ab1肽的示意图。在图1中，作为底物肽的肯普肽和Ab1肽与作为连接蛋白的瘦素和苹果酸酶以单体和二聚体形式融合，其中单体之间通过脯氨酸相互连接。

具体来说，本发明中E.coli经能够表达图1蛋白的重组质粒转化，然后培养，从而得到不溶性聚合体或水溶性形式的三种蛋白：瘦素-肯普肽、苹果酸酶-肯普肽和瘦素-Ab1肽。将收集的蛋白质纯化，并固定到带有醛类物质的载玻片上，制得蛋白质芯片。使用这种蛋白质芯片，分析这些蛋白质与荧光标记的抗体间的相互作用。结果，当仅仅是底物肽如低分子量的肯普肽固定到蛋白质芯片上时，它不与抗体产生相互作用，但是当肽以与连接蛋白如瘦素和苹果酸酶融合的方式固定至芯片上时，则与抗体产生了特异性的相互作用。并且，还发现二聚体形式比单体形式表现出更高的反应性。

附图说明

图1是瘦素-肯普肽，苹果酸酶-肯普肽和瘦素-Ab1肽的示意图；

图2是重组质粒pLKM和pLKD的示意图；

图3是重组质粒pTLMK3的示意图；

图4是重组质粒pLAM和pLAD的示意图；

图5是在蛋白质芯片上瘦素-肯普肽蛋白和蛋白激酶A相互作用的荧光计分析照片；

图6是在蛋白质芯片上苹果酸酶-肯普肽蛋白和蛋白激酶A相互作用的荧光计分析照片。

图7是在蛋白质芯片上瘦素-Ab1肽和Ab1激酶相互作用的荧光计分析照片。

发明详述

下文中本发明将以实施例的方式详细介绍。显然，对于本领域的普通技术人员来说这些实施例只是用于说明的目的，本发明的保护范围并不受这些

实施例的限制。

实施例1：重组质粒的构建

(1)重组质粒pLKM和pLKD的构建

构建表达特异性针对蛋白激酶A的瘦素-肯普肽蛋白(图1)的重组质粒pLKM和pLKD。为了将特异性针对蛋白激酶A的底物肽，即肯普肽(SEQ IDNO：1)与人瘦素以单体形式融合，进行PCR扩增，所用的模板DNA为包含414bp瘦素基因的重组质粒pEDOb5(Jeong等，Appl.Environ.Microbiol.，65(7)：3027-32，1999)，所用的引物1包含限制性酶NdeI和BamHI的消化位点，所用的引物2包含肯普肽基因序列。

引物1(SEQ ID NO：2)：5′-CGGAATTCATATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCA-3′

引物2(SEQ ID NO：3)：5′-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCACGACGCAGGCACCCAGGGCTGAGG-3′

此外，以二聚体形式融合时，采用上述的模板DNA和引物1以及下列的引物3进行PCR扩增，从而得到缺失了BamHI消化位点和中止密码子的模板DNA。

引物3(SEQ ID NO：4)：5′-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCGCGGCGCAGGGGGCCCAGGCTCGCACGACG-3′

然后，使用下述引物4进行PCR，得到一个包含编码蛋白形式的基因的DNA，该蛋白形式中包含限制性酶BamHI的消化位点和中止密码子的肯普肽以二聚体形式与C末端融合。

引物4(SEQ ID NO：5)：5′-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCGCGGCGCAGGGGGCCCAGGCTCGCACGACG-3′

采用下述条件进行PCR：94℃下第一次变性5分钟；30个循环包含94℃下第二次变性1分钟；56℃下退火50秒钟，72℃下延伸90秒；最后在72℃下延伸5分钟。PCR扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后分离出约435bp和459bp的DNA。用NdeI和BamHI消化分离得到的DNA，得到DNA片段。

然后，用限制性酶NdeI和BamHI消化包含T7启动子的质粒pET-3a(Novagen，USA)，混合DNA片段，并用T4DNA连接酶连接，从而构建了重组质粒pLKM和pLKD(见图2)。图2是质粒pLKM和pLKD的示意图。重组质粒pLKM和pLKD包含编码人瘦素的cDNA，编码蛋白激酶A特异性的肯普肽的寡核苷酸，以及卡钠霉素抗性基因，并能分别表达瘦素-单体肯普肽形式的蛋白和瘦素-二聚体肯普肽形式的蛋白质。

用热休克方法，将重组质粒pLKM和pLKD导入到E.coli BL21(DE3)[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm fDE3)，具有T7RNA聚合酶基因的前噬菌体](Novagen，USA)，在含有卡钠霉素(50μg/mL)的LB培养基中培养，然后筛选转化的E.coli。分离出重组质粒pLKM和pLKD，并用限制性酶NdeI和BamHI消化，从而获得439bp和459bp大小的DNA片段。这些DNA片段是编码作为底物肽的肯普肽与人瘦素相融合的蛋白形式的基因。

(2)构建重组质粒pTLMK3

构建表达特异性针对蛋白激酶A的苹果酸酶-肯普肽蛋白(图1)的重组质粒pTLMK3。在与实施例1-(1)的相同条件下进行PCR扩增，得到其中6个组氨酸残基与N末端相连的苹果酸酶，使用的模板为来源于E.coli K-12的E.coli W3110(λ-，F-，原养型)的染色体DNA，使用的下述引物5(在N末端包含编码6个组氨酸残基的序列)包含限制性酶Ncol和XbaI的消化位点；以及所用的下述引物6在C末端包含肯普肽基因序列(Hong等，Biotechnol.Bioeng.，20，74(2)：89-95，2001)。

引物5(SEQ ID NO：6)：5′-CATGCCATGGGCATCACCATCATCACCATGATATTCAAAAAAGAGTG-3′

引物6(SEQ ID NO：7)：5′-GCTCTAGATTAGCCCAGGCTCGCACGACGCAGGATGGAGGTACGGCGGTA-3′

PCR扩增得到的DNA经琼脂糖凝胶电泳分离出1782bp大小的DNA。用限制性酶NcoI和Xbal消化分离得到的DNA，然后插入到用相同限制性酶消化过的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech Co.，Sweden)中，从而构建了重组质粒pTLMK3(FIG.3)。图3是重组质粒pTLMK3的示意图。重组质粒pTLMK3包含编码来源于E.coli的苹果酸酶的cDNA、编码肯普肽的寡核苷酸、以及氨苄青霉素抗性基因，该质粒能表达苹果酸酶-单体肯普肽蛋白，其中的6个组氨酸残基与N末端相连。

E.coli L1-Blue(Stratagene，La Jolla，USA)经重组质粒pTLMK3转化后，在包含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中培养。筛选转化的E.coli，从E.coli中分离出重组质粒pTLMK3。

(3)构建重组质粒pLAM和pLAD

构建表达特异性针对Ab1激酶的瘦素-Ab1肽(图1)的重组质粒pLAM和pLAD。用限制性酶NdeI和BamHI消化编码Ab1(SEQ ID NO：8)的DNA序列，得到约477bp和516bp大小的DNA片段。同时，用相同的限制性酶NdeI和BamHI来消化包含T7启动子的质粒pET-30a(Novagen，USA)。

为了得到被选用作为连接蛋白的438bp人瘦素基因，PCR扩增采用重组质粒pEDOb5(Jeong etal.，Appl.Environ.Microbiol.，65：3027-32，1999)作为模板，使用包含限制性酶NdeI和BamHI消化位点的下述引物7和8。

引物7(SEQ ID NO：9)：5′-CGGAATTCATATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCA-3′

引物8(SEQ ID NO：10)：5′-CGGGATCCTCATTATTTTTTTTTCGCA

AACGGCGCCGCATAGATCGCTTCGCACCCAGGGCTGAGGT-3′

此外，为了进行二聚体形式的融合，使用上述的相同模板DNA、引物1和下述引物9进行PCR，从而得到缺失了BamHI消化位点和中止密码子的模板DNA。

引物9(SEQ ID NO：11)：5′-CGGGATCCTTTTTTTTTCGCAAACGGCGCCGCATAGATCGCTTCGCACCCAGGGCTGAGGT-3

使用合成的引物7和9进行PCR来扩增模板，构建包含BamHI消化位点的下述引物10以得到二聚体PCR产物。

引物10(SEQ ID NO：12)：5′-CGGGATCCTCATTATTTTTTTTTCGCAAACGGCGCCGCATAGATCGCGGGTTTTTTTTTCGCAAACGGCGC-3′

PCR扩增的DNA经琼脂糖凝胶电泳分离出约477bp和516bp大小的DNA片段。分离出的DNA经限制性酶NdeI和BamHI消化后，插入到用同样限制性酶消化过的质粒pET-30a中，从而构建了重组质粒pLAM和pLAD(图4)。图4是重组质粒pLAM和pLAD的示意图。质粒pLAM和pLAD包含编码人瘦素的cDNA，编码Ab1的寡核苷酸，以及卡钠霉素抗性基因，该质粒能分别表达瘦素-单体Ab1形式的蛋白和瘦素二聚体-Ab1形式的蛋白。

E.coli BL21(DE3)经重组质粒pLAM和pLAD转化后，在包含卡钠霉素(50μg/mL)的LB培养基中培养。筛选转化的E.coli，从转化的E.coli中分离出重组质粒pLAM和pLAD。

实施例2：在固定了瘦素-肯普肽蛋白的蛋白质芯片上分析瘦素-肯普肽蛋白和蛋白激酶A之间的相互作用

(1)制备其上固定了瘦素-肯普肽蛋白的蛋白质芯片

经重组质粒pLKM和pLKD转化的重组E.coli被接种到200ml LB培养基中，在37℃下培养，其中重组质粒pLKM和pLKD包含编码瘦素-肯普肽蛋白的基因。当600nm波长下的光密度达到0.7时，加入1mM的IPTG诱导瘦素-肯普肽蛋白的表达。4小时以后，培养肉汤在4℃、6000rpm下离心5分钟，所得的沉淀用100ml TE缓冲液(Tris-HCl 10mM；EDTA 1mM，pH 8.0)冲洗。冲洗后的物质在4℃、6000rpm下离心5分钟，然后悬浮于100ml的TE缓冲液中。用超声器(Branson Ultrasonics Co.，USA)破碎所得的细胞。

破碎液在4℃、6000rpm下离心30分钟，将所得的颗粒悬浮在10ml的变性液中(8M脲，10mM Tris，pH 8.0)。悬浮液在室温下振荡4小时，并溶解，然后将振荡液在4℃、6000rpm下离心30分钟。收集上清并用0.2μm过滤器过滤。用Bradford蛋白检测法(Bradford，M.M.，Anal.Biochem.，72：248-54，1976)定量滤液中包含的蛋白质，然后用固定液(40％甘油，PBS，pH 7.4)稀释至浓度为1mg/mL。

使用微阵列器，以间隔300-500μm(500/cm²)将稀释液在含醛类物质的载玻片上点样(Yoon，S.H.等，J.，Microbiol.Biotechnol.，10：21-6，2000)，并在30℃下潮湿的反应室中固定1小时。然后在室温下与封闭液(1％ BSA，PBS，pH 7.4)反应1小时，从而制得蛋白质芯片。用相同固定液稀释的1mg/mL肯普肽，1mg/mL BSA，1mg/mL瘦素和磷酸缓冲液用作对照。

(2)分析瘦素-肯普肽蛋白和蛋白激酶A之间的相互作用

实施例2-(1)制得的蛋白芯片用洗涤液(20mM Tris，150mM NaCl，10mMEDTA，1mM EGTA，0.1％ Triton-X100，pH 7.5)洗涤3次共5分钟，然后用激酶溶液(50mM Tris，10mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤。然后将200μl激酶溶液(包含100μM ATP)散布在芯片上，用覆盖孔覆盖，然后与瘦素-肯普肽蛋白相互作用1小时。

相互作用后，用激酶溶液充分洗涤蛋白质芯片，将200μl激酶反应液(包含100μM ATP和10单位的cAMP-依赖型蛋白激酶)散布于芯片上，用覆盖孔覆盖，然后与瘦素-肯普肽蛋白相互作用1小时。相互作用后，用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)充分洗涤蛋白质芯片，然后芯片上的瘦素-肯普肽蛋白与Cy3标记的抗磷酸化丝氨酸抗体反应。然后，所得的溶液经充分洗涤后，200g下离心1分钟，完全除去过量的溶液。接着，用ScanArray 5000(Axon Instrument，Forster，USA)激光扫描仪分析反应(图5)。

图5是瘦素-肯普肽蛋白和蛋白激酶A之间相互作用的荧光分析照片。在图5中，1代表1mg/mL的瘦素-二聚体肯普肽，2代表10倍稀释的瘦素二聚体，3代表1mg/mL的瘦素-单体肯普肽，4代表10倍稀释的瘦素单体，P代表PBS，K代表肯普肽(1mg/mL)。

如图5所示，蛋白激酶A显示出与融合了瘦素的肯普肽间的特异性相互作用，但是与肯普肽的单独形式没有产生相互作用。在2和4所示的稀释状态，二聚体表现出比单体更高的反应性。因而，正如所预料的，发现低分子量的肽与酶蛋白反应性很低，而与连接蛋白如瘦素融合的肽具有高反应性，其中，与连接蛋白以二聚体蛋白方式融合的肽形式比单体形式融合的肽形式表现出更高的反应性。

实施例3：使用固定了苹果酸酶-肯普肽蛋白的蛋白质芯片来分析苹果酸酶-肯普肽与蛋白激酶A之间的相互作用

(1)制备其上固定了苹果酸酶-肯普肽蛋白的蛋白质芯片

经重组质粒pTLMK3转化的重组E.coli在和实施例2-(1)相同的条件下培养，其中重组质粒pTLMK3包含编码苹果酸酶-肯普肽蛋白的基因，然后培养的细胞用超声器破碎。破碎液在4℃、6000rpm下离心30分钟，收集上清，用平衡溶液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)透析，接着用镍螯合的树脂纯化(Quiagen，USA)，再用PBS透析，然后经0.2μm的过滤器过滤。采用实施例2-(1)中相同的方法定量滤出液中包含的蛋白质，然后点样在含醛类物质的载玻片上，从而制得蛋白质芯片。

(2)分析苹果酸酶-肯普肽蛋白与蛋白激酶A之间的相互作用

使用实施例3-(1)制得的蛋白芯片，以实施例2-(2)中相同的方法来分析苹果酸酶-肯普肽蛋白与蛋白激酶A之间的相互作用(见图6)。图6是苹果酸酶-肯普肽蛋白与蛋白激酶A之间的相互作用的荧光分析图。在图6中，1代表阳性对照(Cy3标记的抗磷酸化丝氨酸抗体)，2-1代表瘦素-单体肯普肽，2-2代表瘦素-二聚体肯普肽，3代表肯普肽，4代表PBS，5代表苹果酸酶-单体肯普肽。

如图6所示，蛋白激酶A显示出与融合了瘦素或苹果酸酶的肯普肽之间的特异性相互作用，但是与肯普肽的单独形式没有产生相互作用或很弱的相互作用。因此，如图5中所示的结果，蛋白质芯片上的低分子量肽与酶蛋白反应性很低，但是与连接蛋白如苹果酸酶或瘦素融合的肽具有和酶蛋白的高反应性。

实施例4：使用固定了瘦素-Ab1肽的蛋白质芯片来分析瘦素-Ab1肽与Ab1激酶之间的相互作用

(1)制备其上固定了瘦素-Ab1肽的蛋白质芯片

经重组质粒pLAM和pLAD转化的重组E.coli在和实施例2-(1)相同的条件下培养，其中重组质粒pLAM和pLAD包含编码瘦素-Ab1肽的基因。从培养的E.coli中分离瘦素-Ab1肽，在含醛类物质的载玻片上点样，从而制得蛋白质芯片。

(2)分析瘦素-Ab1肽与Ab1激酶之间的相互作用

实施例4-(1)制得的蛋白芯片用洗涤液(PBS，pH 7.5)洗涤3次共5分钟，然后用激酶溶液(50mM Tris，10mM MgCl₂，1mM EGTA，2mM二硫苏糖醇，0.01％ Brij 36，pH 7.5)洗涤。然后将包含100μM ATP的200μl激酶溶液散布在芯片上，用覆盖孔覆盖，然后与瘦素-Ab1肽相互作用1小时。相互作用后，用激酶溶液充分洗涤蛋白质芯片，将200μl激酶溶液(包含100uM ATP和100单位的Ab1激酶)散布于芯片上，用覆盖孔覆盖，然后与瘦素-Ab1肽相互作用1小时。

相互作用后，用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)充分洗涤蛋白质芯片，然后芯片上溶液与Cy5标记的抗磷酸化丝氨酸抗体反应，经充分洗涤后，200g下离心1分钟，完全除去过量的溶液。接着，对相互作用的结果进行分析(图7)。

图7是瘦素-Ab1肽和Ab1激酶之间相互作用的荧光分析照片。在图7中，1代表瘦素-二聚体Ab1，2代表瘦素-单体Ab1，P代表PBS。如图7所示，Ab1激酶表现出与融合了瘦素的Ab1单体和二聚体间的特异性相互作用。

结合附图对本发明进行了详细的描述，但是本领域的普通技术人员能很容易理解说明书中的实施例仅仅是优选的实施方式，它们不是用来限制本发明的。因而，本发明的实际范围将由后附的权利要求及其等同体限定。

工业应用性

如上所述，使用本发明的S-L-SP型蛋白质芯片能在蛋白质芯片上提高低分子量肽与高分子量酶之间的反应性，并且提高肽与反应性抗体之间的反应性，从而能快速有效地分析肽与蛋白质之间的相互作用。因而，本发明的蛋白质芯片能有效和经济地用于研究和应用，包括大规模搜索、生化分析、分析新的候选化合物，疾病的诊断等。

序列表

<110>韩国科学技术院

<120>一种分析蛋白质与底物肽之间相互作用的蛋白质芯片

<130>PCF051165C

<140>PCT/KR2003/002183

<141>2003-10-18

<150>KR10-2003-0000464

<151>2003-01-04

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>肯普肽

<400>1

Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly

1 5

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物1

<400>2

cggaattcat atggtgccca tccaaaaagt cca 33

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物2

<400>3

gcggatcctt agcccaggct cgcacgacgc aggcacccag ggctgagg 48

<210>4

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物3

<400>4

gcggatcctt agcccaggct cgcgcggcgc agggggccca ggctcgcacg acg 53

<210>5

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物4

<400>5

gcggatcctt agcccaggct cgcgcggcgc agggggccca ggctcgcacg acg 53

<210>6

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物5

<400>6

catgccatgg gcatcaccat catcaccatg atattcaaaa aagagtg 47

<210>7

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物6

<400>7

gctctagatt agcccaggct cgcacgacgc aggatggagg tacggcggta 50

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>Ab1

<400>8

Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Pro Phe Ala Lys Lys

1 5 10

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物7

<400>9

cggaattcat atggtgccca tccaaaaagt cca 33

<210>10

<211>67

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物8

<400>10

cgggatcctc attatttttt tttcgcaaac ggcgccgcat agatcgcttc gcacccaggg 60

ctgaggt 67

<210>11

<211>61

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物9

<400>11

cgggatcctt tttttttcgc aaacggcgcc gcatagatcg cttcgcaccc agggctgagg 60

t 61

<210>12

<211>71

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物10

<400>12

cgggatcctc attatttttt tttcgcaaac ggcgccgcat agatcgcggg tttttttttc 60

gcaaacggcg c 71

Claims

1.一种S-L-SP型蛋白质芯片，其中，底物肽(SP)通过连接蛋白(L)的介导被固定到固体基底(S)上。

2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其中，所述连接蛋白是瘦素或苹果酸酶。

3.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其中，所述底物肽与所述连接蛋白融合的方式采用肽单体形式、单体-脯氨酸-单体的二聚体形式、或单体之间通过脯氨酸连接的多聚体形式。

4.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其中，所述肽单体是肯普肽(SEQID NO：1)或Ab1(SEQ ID NO：8)。

5.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其中，所述固体基底是带有暴露的醛类物质的载玻片。

6.一种使用权利要求1所述的蛋白质芯片来分析反应蛋白与底物肽之间相互作用的方法，包括下述步骤：

(a)在蛋白质芯片上加入反应蛋白，所述反应蛋白对固定在蛋白芯片上的底物肽具有特异性相互作用；

(b)检测所述反应蛋白与所述底物肽之间的相互作用。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反应蛋白是酶或抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述酶是蛋白激酶A或Ab1激酶。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述检测底物肽与反应蛋白相互作用的步骤是采用荧光标记抗体进行的。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，用激酶检测底物肽的磷酸化的步骤是采用Cy3标记的抗磷酸化丝氨酸抗体或Cy5标记的抗磷酸化酪氨酸抗体进行的。