CN1411555A - 通过切割和质谱确定多肽特征 - Google Patents

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Abstract

提供了一种确定一种多肽或一群多肽的特征的方法，该方法包括：(a)使含有一种或多种多肽的样品和第一切割剂接触，产生多肽片段；(b)分离一种或多种多肽片段，各片段含有片段化产生它的多肽的N－末端或C－末端；(c)用质谱鉴定分离的片段；(d)用切割位点和第一种切割剂不同的第二种切割剂对样品重复步骤(a)－(c)；和(e)从步骤(c)和(d)鉴定的片段，确定样品中一种或多种多肽的特征。

Description

通过切割和质谱确定多肽特征
本发明涉及一种使用质谱鉴定多肽的末端片段，从而确定多肽特征的方法。该方法涉及切割多肽，并分离群体中来自各蛋白质的单个末端肽。本发明还涉及在测定组织、细胞类型或亚细胞区室中蛋白质表达或分析大蛋白质复合物的方法中使用上述方法。
描述蛋白质全貌的技术，即对组织中蛋白质的身份和数量按目录分类的技术，在自动化或高产率方面还发展的不完善。描述一蛋白质群体全貌的经典方法是采用双向电泳法(R.A.Wan Bogelen.，E.R.Olson，“双向蛋白质凝胶在生物技术中的应用”，生物技术年度综述，1：69-103，1995)。在该方法中，将生物样品中抽提出的蛋白质样品在窄凝胶条上分离。这种第一次分离常利用蛋白质的等电点来分离蛋白质。然后将整个凝胶条靠在矩形凝胶的一条边上。将条中已分开的蛋白质根据其大小电泳分离到第二条凝胶中。该技术缓慢，而且难于自动化。在其最简单的具体实践中，它还是相对不够灵敏的。
已做了许多改进，来提高2-D凝胶电泳的蛋白质分辨率，并改进该系统的灵敏度。一种改进2-D凝胶电泳灵敏度及其分辨率的方法是用质谱分析凝胶上特定斑点中的蛋白质(Jungblut P，Thiede B.“用MALDI质谱从2-DE凝胶鉴定蛋白质”，Mass Spectrom.Rev.16：145-162，1997)。该方法之一是在胶内用胰蛋白酶消化，然后用质谱分析胰蛋白酶消化片段，来产生肽质谱指纹。如果需要序列信息，可进行串联质谱分析。
最近还尝试了用质谱来分析已经过液相层析或毛细管电泳组分的全体蛋白质(Dolnik V.“蛋白质的毛细管区带电泳”，电泳18，pp2353-2361，1997)。已测试了使用毛细管电泳质谱的联机系统。然而，用质谱分析全体蛋白质遇到了许多困难。第一个是对各蛋白质可达到的多种电离状态所产生的复杂质谱的分析有困难。第二个主要缺点是质谱仪目前对于高分子量物质，即对质谱中大于4千道尔顿的离子的质谱分辨率太低。因此，在质谱中分辨质量接近的蛋白质有困难。第三个缺点是用串联质谱进一步分析全体蛋白质很困难，因为全体蛋白质的分级图式极端复杂并难于解释。
WO 98/32876公开了描述蛋白质群体全貌的方法，该方法通过从该群体中各蛋白质分离一条肽来描述。该申请中公开的方法包括以下步骤：
1.通过群体中各蛋白质的一个末端将该群体蛋白质捕获在一固相载体上。
2.用序列特异性切割剂切割捕获的蛋白质。
3.洗去切割剂产生的不保留在固相载体上的肽。
4.释放保留在固相载体上的末端肽。
5.分析释放的末端肽，优选鉴定并定量测定混合物中的每种肽。分析优选用质谱进行。
在该申请中，指出C-末端是更优选的用来捕获蛋白质群体的末端，因为N-末端常常是封闭的。为了用C-末端捕获蛋白质群体，必须将C-末端羧基与蛋白质上的其它反应基团区分开来，而且C-末端羧基必须与导致固定化的试剂特异性反应。在许多C-末端测序化学反应中，需活化C-末端羧基，以促进在C-末端形成噁唑酮基。在C-末端羧基的活化过程中，侧链羧基也被活化，但它们不能形成噁唑酮基。已报道C-末端噁唑酮基在碱性条件下比活化的侧链羧基对亲核试剂的反应性较差，从而提出了选择性封闭侧链羧基的方法(V.L.Boyd等，蛋白质结构分析方法：109-118，Plenum Press，M.Z.Atassi和E.Appella编，1995)。其它更具反应性的侧链可在活化羧基前使用各种常规试剂封闭。用该方法可封闭所有的反应性侧链，并可专一性标记C-末端。
EP-A-0 594 164描述了从蛋白质中分离C-末端肽的方法，采用N-末端测序试剂对C-末端肽进行测序。在该方法中，采用能切割赖氨酸残基C-末端的内切蛋白酶消化感兴趣的蛋白质。使得到的肽和能与所有游离氨基反应的DITC聚苯乙烯反应。可用三氟乙酸(TFA)切下已和DITC聚苯乙烯反应的N-末端氨基，从而释放出所有肽的N-末端。然而赖氨酸的ε氨基不能被切下，因此所有非末端肽保留在载体上，仅释放C-末端肽。根据该专利，回收C-末端肽用于微测序。
然而，上述方法都不能轻易鉴定群体中存在的所有蛋白质，而且事实上这些方法中许多完全不能唯一的鉴定所有存在的蛋白质。
因此，本发明的一个目的是克服现有技术有关的问题，并提供一种用于确定多肽特征的方法，该方法能唯一的鉴定样品中存在的，比用现有技术方法可能鉴定出更大比例的蛋白质。因此本发明的一个目的是提供从混合物、复合物或群体(用任意的形式制备的)分离单个末端肽的改进方法。本发明的另一个目的是提供适合自动化的方法。本发明的还有一个目的是提供改进质谱分析本发明方法产生的末端肽的灵敏度的方法。
因此，本发明提供了一种确定一种多肽或一群多肽的特征的方法，该方法包括：
(a)使含有一种或多种多肽的样品和第一切割剂接触，产生多肽片段；
(b)分离一种或多种多肽片段，各片段含有片段化产生它的多肽的N-末端或C-末端；
(c)用质谱鉴定分离的片段；
(d)用切割位点和第一种切割剂不同的第二种切割剂对样品重复步骤(a)-(c)；和
(e)确定步骤(c)和(d)鉴定的片段样品中一种或多种多肽的特征。
在本发明内容中，多肽包括任何含有两个或多个氨基酸的肽，并包括任何蛋白质。在本文中，在重复步骤(d)中使用的样品与步骤(a)中使用的相同。“相同样品”可指(例如)从一种起源样品分离出的多个部分之一，这一部分用于步骤(a)-(c)的每一次重复。
可重复步骤(a)-(c)任意次数，例如一次、两次或更多次。每次重复使用的切割剂切割位点与前一次使用的切割剂不同。因此每次重复都产生了一组不同的末端片段，即使处理的是相同样品。如果通过在某特定位点切割产生的末端片段不能区分两种或多种蛋白质(例如，如果两种或多种蛋白质产生的末端片段具有相同的或不可区别的质量)，那么可在不同位点切断而产生不同质量的末端片段。因此，用多种不同切割剂重复进行可提高该方法的分辨率。
本发明中使用的切割剂无特别限定。优选的切割剂包括内切肽酶或化学切割剂。更优选的，使用的切割剂含有Lys-C内切肽酶，一种硫氰酸酯化合物、溴化氰、BNPS-粪臭素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或凝血酶。
本发明还提供了确定一种多肽或一群多肽的特征的方法，该方法包括：
(f)使含有一种或多种多肽的样品与第一封闭剂在第一封闭步骤中接触，以在该多肽的一条或多条反应性侧链上引入封闭基团；
(g)使该样品和切割剂接触，产生多肽片段；
(h)分离一种或多种多肽片段，每条片段含有片段化产生它的多肽的N-末端或C-末端；
(j)用质谱鉴定分离的片段；
(k)在样品上用第二封闭剂重复步骤(f)-(j)，该封闭剂在第一封闭步骤的同一侧链上引入封闭基团，但所用的基团和第一封闭步骤使用的基团质量不同；和
(l)确定步骤(j)和(k)鉴定的片段样品中一种或多种多肽的特征。
每次重复该方法可使用相同的切割剂或不同切割剂，只要每次重复使用的封闭基团具有不同质量。可重复步骤(f)-(j)任意次数，如一次、两次或多次。每次重复使用的封闭基团和前一次使用的相应封闭基团具有不同的质量。因此每次重复都产生了一群不同的末端片段，即使用相同的切割剂处理相同的样品。如果两种或多种蛋白质不能根据它们被特定封闭基团封闭的末端片段区分开来(即如果两种或多种蛋白质的末端片段具有相同或不可区别的质量)，那么使用一种或多种与前一次封闭步骤中(对于同样的两种或多种蛋白质)使用的相应基团质量不同的封闭基团，可产生不同质量的末端片段。因此通过使用多种封闭基团(每种具有不同质量)重复进行，可提高该方法的分辨率。
在上述方法中，当群体中蛋白质的侧链要封闭时，待封闭的侧链可含有下列一个或多个：
精氨酸的NH2侧链；
天冬酰胺的NH2侧链；
谷氨酰胺的NH2侧链；
赖氨酸的NH2侧链；
天冬氨酸的COOH侧链；
谷氨酸的COOH侧链；
丝氨酸的OH侧链；
苏氨酸的OH侧链；
甲状腺氨酸的OH侧链；
酪氨酸的OH侧链；和
半胱氨酸的SH侧链。
本发明所用的封闭剂无特别限制。优选封闭剂包括碘乙酸酯化合物，异氰酸酯化合物(如异氰酸苯酯)，甲硅烷基化合物(如三甲基氯甲硅烷)，酸酐化合物(如乙酸酐和甲基乙烯砜)和乙烯基吡啶衍生物(如4-乙烯基吡啶)。可通过取代改变封闭基团的质量。这些取代无特别限制，只要封闭反应仍能进行。用氚或碘等卤素取代是优选的。
因此在一个优选方面，本发明提供了一种产生蛋白质表达全貌的方法，该方法通过将同一蛋白质混合物产生的，但经过两种或多种序列特异性不同的切割剂处理的两种或多种蛋白质表达全貌组合起来，从而提高了分辨率。在产生每种蛋白质表达全貌中使用了不同的序列特异性切割剂。在该内容中，分辨率指一蛋白质群体中根据末端肽的质量可从一数据库唯一的鉴定出来的蛋白质比率。
在另一个优选方面，本发明提供了一种产生蛋白质表达全貌的方法，该方法通过将从同一蛋白质混合物产生，并用序列特异性相同的切割，但其特异性侧链(如氨基酸侧链)已用质量不同的两种或多种封闭试剂封闭的两种或多种蛋白质表达全貌组合起来，从而提高了分辨率。在产生每种蛋白质表达全貌中，使用了不同组的封闭剂。
现在将详细讨论本发明的更优选方面。在第一个优选方面，本发明提供了一种产生一群末端肽的方法，包括步骤如下：
1.将一群蛋白质固定在固相载体上。
2.使该固定的蛋白质群体和与蛋白质N-末端α-氨基和赖氨酸ε氨基反应的反应剂接触。该试剂还可任选的和丝氨酸和苏氨酸侧链反应，以将其封闭。关于这点，封闭指，使侧链与一试剂反应，该试剂使该侧链不与该方法后随步骤中使用的任何试剂反应。如果该试剂不封闭氨基以外的侧链，可应用其它封闭剂，来封闭其它反应性侧链，从而可依次封闭所有的反应性侧链。
3.使该蛋白质群体和一试剂接触，该试剂将会活化蛋白质的游离羧基。该活化剂优选促进在该群体蛋白质的C-末端活化的羧基处形成噁唑酮基团。
4.使产生的衍生蛋白质和亲核试剂在碱性条件下接触，来封闭侧链羧基活化的衍生物。C-末端噁唑酮比活化的侧链羧基对亲核试剂的反应性弱。用这种方法可封闭所有反应性侧链官能基团。加入的亲核试剂优选硫氰酸盐。
5.使反应混合物和合适的酸，优选TFA接触，其促进C-末端噁唑酮基团和硫氰酸反应，产生C-末端乙内酰硫脲衍生物。
6.使这些蛋白质和一切割剂接触，从衍生的蛋白质上切下C-末端乙内酰硫脲，从而暴露每个蛋白质中次末端氨基酸的羧基。
7.使暴露的次末端羧基和合适试剂接触，通过C-末端固相捕获蛋白质。
8.使C-末端修饰的蛋白质和序列特异性切割剂接触。
9.在固相载体上捕获C-末端肽，并洗去非末端肽。
10.任选使捕获的肽的末端氨基和质谱敏化试剂反应。
11.从固相载体上释放捕获的C-末端肽。
12.回收释放的肽。
13.用质谱分析C-末端肽。
可如上述在本发明的一般方法中使用上述优选步骤的任一步骤、或上述优选步骤的组合。
在第二个优选方面，本发明提供了一种产生一群末端肽的方法，包括步骤如下：
1.将一群蛋白质固定在固相载体上。
2.使该固定的蛋白质群和能与蛋白质N-末端的α-氨基和赖氨酸ε-氨基反应的试剂接触，该试剂还可任选的和丝氨酸和苏氨酸侧链反应，以将其封闭。关于这点，封闭指，使侧链与一试剂反应，该试剂使该侧链不和该方法后随步骤中使用的任何试剂反应。如果该试剂不封闭氨基以外的侧链，可应用其它封闭剂，来封闭其它反应性侧链，从而可依次封闭所有的反应性侧链。
3.使该蛋白质群体和试剂接触，该试剂将会活化蛋白质的游离羧基。该活化剂应优先促进在该群体蛋白质的C-末端活化的羧基处形成噁唑酮基团。
4.使产生的衍生蛋白质和亲核试剂在碱性条件下接触，来封闭侧链羧基衍生物。C-末端噁唑酮比活化的侧链羧基对亲核试剂的反应性弱。用这种方法可封闭所有反应性侧链官能基团。加入的亲核试剂优选带有惰性阴离子的盐。
5.水解C-末端噁唑酮，产生C-末端羧基。
6.使这些蛋白质和一活化剂接触，活化C-末端羧基。
7.使活化的末端羧基和一合适的试剂接触，通过C-末端固相捕获蛋白质。
8.使C-末端修饰的蛋白质和序列特异性切割剂接触。
9.在固相载体上捕获C-末端肽，并洗去非末端肽。
10.任选使捕获的肽的末端氨基与质谱敏化试剂反应。
11.从固相载体上释放捕获的C-末端肽。
12.回收释放的肽。
13.用质谱分析C-末端肽。
可如上述在本发明的一般方法中使用上述优选步骤的任一步骤、或上述优选步骤的组合。
在第三个优选方面，本发明提供了一种从一蛋白质群体产生一群末端肽的方法，包括步骤如下：
1.用Lys-C特异性切割酶，即切断一残基C-末端紧靠赖氨酸侧的肽键的试剂，完全消化一蛋白质群体。
2.使产生的肽与能和游离氨基反应的活化固相载体接触。
3.使载体上捕获的肽与能在每条肽的α-氨基处切断的试剂接触。所有不是C-末端的肽将具有一个将它们与固相载体共价连接的赖氨酸残基。从而可选择性的释放游离的C-末端肽。
4.回收释放的肽。
5.任选使释放的肽和试剂接触，来封闭反应性侧链。
6.任选使捕获的肽的末端氨基和质谱敏化试剂反应。
7.用质谱分析这些肽。
可如上述在本发明的一般方法中使用上述优选步骤的任一步骤、或上述优选步骤的组合。
为了仅使含有赖氨酸残基的片段通过两个氨基保持与固相载体结合，(从而除了含有赖氨酸基团以外所有片段都在释放步骤中从固相载体上释放)，优选在赖氨酸的侧链NH2不质子化的pH下使这些片段和固相载体结合。因此，该步骤优选在pH11-11.5下进行。
一群C-末端肽的产生
C-末端测序试剂的应用
下文讨论了本发明上述方面的不同优选例。
在本发明第一和第二优选方面的第一步中，将一群蛋白质优选非共价固定在固相载体上。可用Zitex(多孔Teflon，获自Norton Performance Plastics，Wayne，NJ)膜实施蛋白质在固相载体上的非共价固定(Bailey等，“用二苯基磷酸异硫氰酸酯对肽和蛋白质进行自动化羧基-末端序列分析”，蛋白质科学1：1622-1633，1992；Bailey等，生物化学年鉴，212：366-374，1933)。还可用聚二氟乙烯膜(Millipore)固定蛋白质。
本发明第一和第二个优选方面的步骤2涉及封闭一群蛋白质的反应性侧链。本领域熟知可选择性封闭反应性侧链官能基团。反应性侧链包括赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸常常自身交联，形成二硫键。为了本发明的目的，优选打断这些键。这可用巯基乙醇将二硫键还原成一对巯基来实现。可用碘乙酸(Aldrich)在弱碱条件下选择性封闭巯基，促使形成氢硫酸根离子(分子微生物学5：2293，1991)。合适的弱碱可能是碳酸盐。在其它实施例中，可用异硫氰酸化合物处理蛋白质群体。异硫氰酸几乎只与蛋白质N-末端的α-氨基反应，并和赖氨酸的ε-氨基反应，即在温和条件下，即室温和中性溶剂中与伯胺反应，产生脲衍生物。还可制备能与带羟基的侧链，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链，在合适的催化剂如吡啶或锡化合物，如月桂酸二丁基甲锡烷酯存在下起反应的试剂，以产生氨基甲酸乙酯。在另一个实施例中，可用甲硅烷化合物如三甲基氯硅烷(Sigma)处理蛋白质群体。这些化合物易于与大部分反应官能基团反应。胺衍生物在水溶液条件下不稳定，因此如果需要可水解回复成游离胺。上述例子是为了说明封闭反应性侧链官能团的方法，而不是为了要限制本发明的范围。本领域已知各式各样的保护基团，而且设想这些基团的大部分都能用于完成本发明的步骤。
在本发明第一和第二个优选方面的步骤3中，接着是活化羧基侧链。为了该目的，广泛使用了乙酸酐，它在羧基处产生混合酸酐。在一些实施例中，本发明第一和第二优选方面的步骤2可与步骤3联合。用酸酐化合物活化侧链羧基还导致封闭反应性侧链，如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。在联合步骤2和3的实施例中，所选活化剂作为反应性侧链的封闭剂优选是稳定的，因为某些酸酐衍生物在碱性或酸性条件下不稳定。例如三甲基乙酸酐在这些条件下，由于立体效应更为稳定。另选的一种更优选的活化剂是Woodwards ReagentK(N-乙基-5-苯基异噁唑-3-磺酸酯，购自Sigma)。在本发明该方面的另一个优选例中，通过用焦磷酸四苯酯(Aldrich)或氯化磷酸二苯酯等反应性磷酸酯处理，实现活化。根据美国专利号5,665,603，在肽测序方法中在肽或多肽C-末端产生羧基衍生物(它能反应形成乙内酰硫脲)所需的活化步骤，可在较温和条件下用酰基磷酸酯化合物，如氯化磷酸二苯酯或焦磷酸四苯酯(Aldrich)更有效的进行。C-末端羧基在碱存在下和反应性磷酸反应，使羧基去质子化。优选的碱是三乙胺，二异丙基乙胺或吡啶，即不和产生的酰基磷酸酯反应的碱。活化C-末端羧基的磷酸化反应优选使用等摩尔量的反应性磷酸和碱。大量过量的将这两种试剂加到以无质子极性溶剂(如乙腈(ACN)，二甲基甲酰胺或乙醚，优选ACN)配制的多肽中去。反应通常在室温下5-10分钟内，一般短于30分钟内完成。温度可变：反应可在55℃在自动测序仪(串联其它发生的反应)中进行。C-末端羧基的活化衍生物可自发性环化，形成噁唑酮中间物，同时侧链羧基仍被活化。
侧链羧基活化的衍生物和亲核试剂在碱性条件下反应，而C-末端噁唑酮基和亲核试剂的反应性弱得多(V.L.Boyd等，蛋白质结构分析的方法：109-118，Plenum Press，M.Z.Atassi和E.Appella编，1995)。因此，在本发明第一和第二优选方面的步骤4中使蛋白质群体在碱性条件下和亲核试剂接触。优选亲核试剂是伯胺化合物。如果使用胺亲核试剂，可氨基化侧链。优选的胺亲核试剂是哌啶、甲胺、乙胺或其它胺，加上合适的碱。为了进行氨基化反应，在无质子极性溶剂，优选乙腈中加入等摩尔量的碱和亲核试剂，这些试剂的量比大大超过蛋白质混合物。氨使活化的天冬氨酸残基产生天冬酰胺，使谷氨酸残基产生谷氨酰胺。这可减少肽质量的信息，因此氨可能不是优选的亲核试剂。在另一个实施例中，可用醇在酸性条件下酯化活化的侧链羧基衍生物。可在合适的无水酸性溶剂，如TFA中加入合适的醇，如甲醇。
在本发明的第一个优选方面中，可加入作为硫氰酸盐的亲核试剂。噁唑酮在酸性条件下和异硫氰酸盐反应，从而在碱性条件的起始阶段后，促进氨基化，反应物被三氟乙酸酸化，促进C-末端乙内酰硫脲的形成。
在本发明的第二个优选方面，可加入作为具有惰性基团的盐的胺亲核试剂，如羧酸盐。优选使用挥发性盐，以利于除去未用的试剂。用该方法可防止发生噁唑酮水解，在C-末端产生游离羧基。在另一个实施例中，可加入作为盐的胺亲核试剂和具有合适官能基团的生物素化试剂，来和噁唑酮反应。
在本发明的第一个方面加入了硫氰酸盐亲核试剂，接着用合适的酸，优选TFA酸化反应混合物，酸化促进C-末端噁唑酮基和硫氰酸盐反应，产生C-末端乙内酰硫脲衍生物。然后从衍生蛋白质上切下C-末端乙内酰硫脲，暴露出每个蛋白质中次末端氨基酸的羧基。可用各种方法，包括用酸或碱水解，从C-末端切下乙内酰硫脲。通过三甲基硅烷钠的醇溶液等试剂实现更优选的切割(J.M.Bailey等，蛋白质科学1：68-80，1992)
在本发明的第一和第二优选方面的步骤7中，然后使暴露的末端羧基和合适试剂反应，通过C-末端固相捕获蛋白质。生物素氨基己酰肼等试剂能和游离羧酸反应。5-(生物素氨基)戊胺等试剂可用来实现亲和素的捕获。在和该生物素化试剂反应前，必须活化游离羧酸末端。可用各种活化剂，但应优选不促进形成噁唑酮的。立体上形成位阻的酸酐化合物可能是合适的。在另一个实施例中，活化的末端羧基可与具有能与活化羧基反应的合适基团的官能化固相载体反应。游离氨基可能是合适的。为了选择性释放羧基，反应官能团应通过可切割接头和载体连接。本领域已知各种可切割的接头。光可切割的接头是本领域熟知的(Lloyd-Williams等，四面体49：11065-11133，1993)。还有许多化学可切割的接头，如硫酯可被羟胺切割。
在本发明第一和第二优选方面的步骤8中，然后用序列特异性切割剂处理C-末端修饰的蛋白质。优选切割剂是挥发性的化学试剂，使得易于除去未反应的试剂。合适的化学切割剂包括能切割甲硫氨酸残基的溴化氰和切割色氨酸残基的BNPS-粪臭素(D.L.Crimmins等，生物化学年鉴187：27-38，1990)。在其它实施例中，可使用序列特异性内切蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。凝血酶或其它酶。
在本发明第一和第二优选方面的步骤9中，将末端修饰的肽捕获在固相载体上。在末端羧基被生物素化的实施例中，接下来C-末端肽可被捕获在用链霉亲和素衍生的固相载体上。然后可洗去非末端肽。
在本发明的第一和第二优选方面的步骤10中，可任选的使捕获的C-末端肽和质谱敏化剂反应。质谱仪的离子探头极端灵敏，可检测到一个离子的到达。因此检测离子不是确定质谱仪灵敏度的限制因素。一般最大的限制因素是分析物的离子化。在一典型电子喷射源或FAB源中，一千个分析物分子中只有一个将确实离子化并被检测。为了改进该过程，需要在肽中引入能使肽预先离子化的敏化化合物以利于检测。优选的化合物包括季铵盐离子或金属离子鳌合剂。示范性化合物可能是4-(3-吡啶基甲基氨基羧丙基)苯基异硫氰酸酯(E.J.Bures等，“用于分步降解多肽的一群新试剂的合成和评估”，蛋白质结构分析方法，Plenum Press，New York，1995公开了用该化合物的异硫氰酸形式作为质谱敏化剂)。引入敏化基团不仅改进了灵敏度，而且减少了分析物分子竞争离子化的危险。这表示所有肽可更平均的存在在质谱中。
在本发明的第一和第二优选方面的步骤11中，接下来从固相载体上释放捕获的C-末端肽。在末端羧基生物素化的实施例中，可用酸处理，释放亲和素捕获的肽。优选采用TFA来促进回收释放的肽，因为它是挥发性的，易于蒸发而回收肽。
在本发明的第一和第二优选方面的步骤12中，回收释放的肽。在本发明第三和第四方面的步骤13中，用质谱分析肽。在一个实施例中，将肽包埋在合适载体上的MALDI基质中，如肉桂酸(cinammic acid)中，用MALDI质谱仪分析，来确定C-末端肽群体的肽质谱指纹。MALDI是优选分析技术，因为该离子化技术有利于形成[M+H]+离子。因此对于每条肽，在质谱中只有一个主峰。
在另一个实施例中，可将回收的肽溶于合适的溶剂中，并可用喷射输入系统，如电子喷射离子化质谱仪分析。可采用类似的Fast Atom Bombardment(FAB)和相关的界面。这可能包括在质谱分析前用相联的液相层析分离肽。可用毛细管电泳或HPLC或毛细管等电聚焦。动态FAB是特别优选的方法，因为该离子化方法促进离子产生的形式是它们存在于用来将它们引入质谱仪的基质中的形式。如果使用液体基质，这意味着存在于质谱中的离子必定和它们在溶液中的相同。由于在本发明中可封闭反应性侧链，而且可将质谱敏化剂引入要分析的肽中，因此确保所有肽在溶液中仅带一个电荷，在肽群体最终的质谱中由一个质量峰代表是可能的。可将串联质谱和喷射界面或FAB界面相连接。串联质谱可确定一条肽的序列信息，并鉴定该蛋白质的共价修饰。
DITC玻璃的使用
本节讨论了本发明第三个优选方面的各种实施例。
在本发明的第三个优选方面的步骤1中，用Lys-C特异性切割酶，如内切蛋白酶Lys-C(来自溶菌性酶基因，Boehringer Mannheim)完全消化一个蛋白质群体。
在本发明的第三个优选方面的步骤2中，使产生的肽和能与胺反应的固相载体接触。在一实施例中，肽群体和异硫氰酸玻璃(DITC玻璃，Sigma)在碱存在下反应。这通过游离氨基将所有肽捕获到固相载体上。
在本发明的第三个优选方面的步骤3中，使捕获的肽和一种试剂接触，该试剂在载体上每条肽的α-氨基处切割。在使用DITC玻璃的实施例中，用合适的挥发性酸(TFA)处理肽，该酸从载体上的每条肽切下N-末端氨基酸。所有不是C-末端的肽将具有将它们和固相载体共价连接的赖氨酸残基。这些游离C-末端肽被选择性释放。
在本发明的第三个优选方面的步骤4中，通过蒸发用来从载体上切下肽的TFA溶剂，可从TFA中回收释放的肽。
在本发明的第三个优选方面的步骤5中，可使释放的肽和试剂接触，来封闭反应性侧链。合适的试剂包括上述的那些。
在本发明的第三个优选方面的步骤6中，可任选的使肽和质谱敏化剂反应。见上述关于在本发明的第一和第二个优选方面的步骤10的讨论。
在本发明的第三个优选方面的步骤7中，用质谱分析肽。在一个实施例中，将肽包埋在固相载体上的MALDI基质，如肉桂酸(cinammic acid)中，用MALDI质谱仪分析，来确定C-末端肽群体的肽质谱指纹。
在本发明的其它优选方面中，可使用用质谱分析肽的其它方法。因此在其它实施例中，可将回收的肽溶于合适的溶剂中，并用喷射输入系统，如电子喷射离子化质谱仪来分析。可采用类似的Fast Atom Bombardment和相关的界面。这可能包括在质谱分析前用相联的液相层析分离。可将串联质谱和喷射界面或FAB界面相连接。串联质谱可确定一条肽的序列信息，并鉴定该蛋白质的共价修饰。
实施例
使用了一系列短计算机程序(用PERL写)来分析蛋白质序列的SWISSPROT公布的功能域数据库，来确定一给定生物仅根据其末端肽质量可能唯一地鉴定出哪部分蛋白质。从SWISSPROT数据库35版中抽出蛋白质。对流感嗜血菌(H.influenzae)基因群的数据进行了分析。该生物的基因群已被完全测序，并几乎鉴定到了所有预计的开放阅读框。在该数据库版本中存在1882个流感嗜血菌蛋白质。测试了用溴化氰切割甲硫氨酸和切割色氨酸的全貌。假设末端氨基酸不被分析蛋白全貌的化学试剂切下。
在全部实施例中，已假定质谱仪具有5000的质量分辨率。这意味着该仪器可分辨5000分之一的质量差异，或换言之可分辨质量为5000道尔顿的分子和质量为4999道尔顿的分子。还假设各肽仅产生一个单分子峰。
实施例1-用Lys-C和SCN切割
在本实施例中用内切蛋白酶Lys-C(在赖氨酸残基C-末端侧切割蛋白质)切割1882流感嗜血菌蛋白质。然后使肽和用苯基异硫氰酸酯基团衍生的固相载体反应，该基团易于和上述切割位点处产生的以及存在于赖氨酸侧链的伯胺反应。所有肽至少有1个赖氨酸残基，除了C-末端肽没有。所有肽通过它们的N-末端伯胺被捕获到固相载体上。也可通过赖氨酸侧链捕获所有非C-末端肽。可诱导苯基异硫氰酸酯切割所有肽的N-末端残基。携带赖氨酸残基的所有肽将仍结合在载体上，因为这些异硫氰酸衍生物不被切割。因此从固相载体上释放出C-末端肽。然后可分离C-末端肽。如需要，由于上述原因可进一步修饰它们。分离了C-末端肽和其它侧链修饰后，可用质谱分析这些肽。
假定其它侧链未被封闭，并直接分析未修饰的肽。
结果
分析1882个蛋白质的记录
7个蛋白质不具所用试剂的切割位点。
1个蛋白质具有870种肽质量(870种质量的末端肽)。
2个蛋白质具有155种肽质量。
3个蛋白质具有43种肽质量。
4个蛋白质具有19种肽质量。
5个蛋白质具有6种肽质量。
6个蛋白质具有9种肽质量。
7个蛋白质具有2种肽质量。
8个蛋白质具有3种肽质量。
9个蛋白质具有1种肽质量。
10个蛋白质具有1种肽质量。
11个蛋白质具有2种肽质量。
12个蛋白质具有2种肽质量。
13个蛋白质具有1种肽质量。
17个蛋白质具有1种肽质量。
19个蛋白质具有1种肽质量。
23个蛋白质具有1种肽质量。
33个蛋白质具有1种肽质量。
205个蛋白质具有1种肽质量。
该肽质量指纹唯一的仅根据末端肽的质量，鉴定了46.2％的蛋白质。
实施例2-封闭羟基侧链
在该实施例中，用甲硅烷保护基团封闭丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的携带反应性羟基的侧链，在这些侧链上产生三甲基甲硅烷衍生物。用合适的试剂，如四苯基焦磷酸酯活化侧链羧基，然后如上所述在碱存在的条件下与哌啶反应，将其转化成哌啶胺。
结果
分析1882个蛋白质的记录
7个蛋白质不具所用试剂的切割位点。
1个蛋白质具有937种肽质量。
2个蛋白质具有149种肽质量。
3个蛋白质具有34种肽质量。
4个蛋白质具有17种肽质量。
5个蛋白质具有6种肽质量。
6个蛋白质具有8种肽质量。
7个蛋白质具有2种肽质量。
8个蛋白质具有4种肽质量。
10个蛋白质具有2种肽质量。
11个蛋白质具有1种肽质量。
12个蛋白质具有1种肽质量。
13个蛋白质具有1种肽质量。
17个蛋白质具有1种肽质量。
19个蛋白质具有1种肽质量。
23个蛋白质具有1种肽质量。
33个蛋白质具有1种肽质量。
205个蛋白质具有1种肽质量。
该肽质量指纹唯一的仅根据末端肽的质量鉴定了49.8％蛋白质。
实施例3-C-末端捕获和溴化氰切割。
在该实施例中，将1882个流感嗜血菌蛋白质非共价固定在固相载体上。用三氟乙酸酐处理蛋白质。该试剂将封闭赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的反应性侧链，产生三氟乙酸衍生物。该试剂还将活化侧链和末端羧基。活化的C-末端羧基自发形成噁唑酮。洗去未反应的三氟乙酸酐。然后在非水溶液碱的存在下使活化的侧链和哌啶反应，在活化的侧链羧基处产生哌啶酰胺。接着水解C-末端噁唑酮，回复到原先的游离羧基，然后修饰该羧基，通过生物素化将其捕获到固相载体上。接着用在甲硫氨酸残基处切割的溴化氰切割该修饰的蛋白质。将产生的肽洗入惰性溶剂中，进行化学反应从固相载体上释放。选择性生物素化C-末端肽，使它们被亲和素化的载体捕获。这使非末端肽被洗去。接着从固相载体上释放C-末端肽，并用质谱分析。
结果
分析1882个蛋白质的记录。
18个蛋白质不具有所用试剂的切割位点。
1个蛋白质具有1461种肽质量。
2个蛋白质具有157种肽质量。
3个蛋白质具有21种肽质量。
4个蛋白质具有4种肽质量。
5个蛋白质具有2种肽质量。
6个蛋白质具有3种肽质量。
该肽质量指纹唯一的菌根据末端肽的质量鉴定了77.6％蛋白质。
实施例4-C-末端捕获和用BNPS-粪臭素切割
在该实施例中，如实施例3那样处理了1882个流感嗜血菌蛋白质(除了修饰C-末端羧基后使其被固相载体捕获)，用BNPS-粪臭素(3-溴-3-甲基-2-(o-硝基苯基磺酰基)假吲哚)而不是溴化氰在色氨酸残基处化学切割蛋白质。接着从固相载体上释放出产生的肽，并和亲和素化的载体一起培育。这可洗去非末端肽。然后从固相载体上释放C-末端肽，并用质谱分析。因此在这个实施例中，赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的反应性侧链又是三氟乙酸衍生物，而侧链羧基是哌啶酰胺衍生物。
结果
分析1882个蛋白质的记录
361个蛋白质不具有所用试剂的切割位点。
1个蛋白质具有1484种肽质量。
2个蛋白质具有163种肽质量。
3个蛋白质具有15种肽质量。
7个蛋白质具有1种肽质量。
该肽质量指纹唯一的仅基于末端肽的质量鉴定了78.9％蛋白质。
实施例5-组合两种蛋白质全貌
组合了用溴化氰切割的实施例3和用BNPS-粪臭素切割的实施例4产生的独特蛋白质列表，唯一的仅根据两种蛋白质分布全貌的质量，确定所鉴定的蛋白质之和。
在两种蛋白质全貌间唯一的分辨了1774个蛋白质。这个数量相当于唯一的仅根据末端肽的质量，分辨了SWISSPROT数据库中94.3％的流感嗜血菌蛋白质。这比较好的单一蛋白质全貌分辨率，提高了19.5％。

Claims (17)

1.一种确定一种多肽或一群多肽的特征的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)使含有一种或多种多肽的样品和第一切割剂接触，产生多肽片段；
(b)分离一种或多种多肽片段，各片段含有片段化产生它的多肽的N-末端或C-末端；
(c)用质谱鉴定分离的片段；
(d)用切割位点和第一种切割剂不同的第二种切割剂对样品重复步骤(a)-(c)；和
(e)确定步骤(c)和(d)鉴定的片段样品中一种或多种多肽的特征。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括重复(a)-(c)两次或多次，每次使用和前一种切割剂在不同位点切割的另一种切割剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(a)前包括一封闭步骤，该封闭步骤包括使样品中的多肽和一种或多种封闭剂反应，在多肽的一个或多个反应性侧链上引入封闭基团。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，重复封闭步骤和步骤(a)-(c)一次、两次或多次，每次在前一次封闭步骤相同的侧链引入封闭基团，但使用和前一次封闭步骤使用的对应封闭基团质量不同的封闭基团。
5.一种确定一种多肽或一群多肽的特征的方法，其特征在于，该方法包括：
(f)使含有一种或多种多肽的样品与第一封闭剂在第一封闭步骤中接触，以在该多肽的一条或多条反应性侧链上引入封闭基团；
(g)使样品和切割剂接触，产生多肽片段；
(h)分离一种或多种多肽片段，每条片段含有片段化产生它的多肽的N-末端或C-末端；
(j)用质谱鉴定分离的片段；
(k)在样品上用第二封闭剂重复步骤(f)-(j)，该封闭剂在第一封闭步骤的同一侧链上引入封闭基团，但使用和第一封闭步骤使用的封闭基团质量不同的封闭基团；和
(l)确定步骤(j)和(k)鉴定的片段样品中一种或多种多肽的特征。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，重复步骤(f)-(j)两次或多次，每次在前一次封闭步骤的同一侧链处引入封闭基团，但使用和前一次封闭步骤使用的封闭基团质量不同的封闭基团。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(k)包括重复步骤(f)-(j)一次、两次或多次，每次使用和前一次切割剂在不同位点切割的另一种切割剂。
8.如权利要求3-7所述的方法，其特征在于，待封闭的侧链包括下列一个或多个：
精氨酸的NH2侧链；
天冬酰胺的NH2侧链；
谷氨酰胺的NH2侧链；
赖氨酸的NH2侧链；
天冬氨酸的COOH侧链；
谷氨酸的COOH侧链；
丝氨酸的OH侧链；
苏氨酸的OH侧链；
甲状腺氨酸的OH侧链；
酪氨酸的OH侧链；和
半胱氨酸的SH侧链。
9.如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，通过将片段捕获到固相载体，如DITC玻璃或聚苯乙烯异硫氰酸酯上来分离片段。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述捕获涉及使片段和固相载体共价结合。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述片段通过其N-末端结合到固相上。
12.如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，每条分离的片段含有该多肽片段化产生的C-末端。
13.如前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所用的切割剂包含内切肽酶或化学切割剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所用的切割剂包括Lys-C内肽酶，异硫氰酸化合物、溴化氰、BNPS-粪臭素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或凝血酶。
15.如权利要求3-14任一项所述的方法，其特征在于，封闭剂含有一种或多种碘化乙酸化合物、异氰酸酯化合物、甲硅烷化合物、酸酐、乙烯基磺酸化合物和乙烯基吡啶衍生物。
16.一种确定组织中的一种或多种蛋白质表达的方法，其特征在于，该方法包括按照上述权利要求任一项所述的方法确定一群多肽的特征。
17.一种测试样品中一种或多种特异性多肽的方法，其特征在于，该方法包括按照权利要求1-15任一项所述的方法确定一群多肽的特征，并从一种或多种对应所述多肽的特异性片段的存在与否确定一种或多种特异性多肽的存在与否。
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