JP2879661B2 - タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 - Google Patents
タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質あるい
はペプチドの１次構造解析法に関する。特に、アミノ末
端（Ｎ末端）アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されて
いるタンパク質あるいはペプチドの、Ｎ末端からのアミ
ノ酸配列分析法に関する。
はペプチドの１次構造解析法に関する。特に、アミノ末
端（Ｎ末端）アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されて
いるタンパク質あるいはペプチドの、Ｎ末端からのアミ
ノ酸配列分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのタンパク質のＮ末端が修飾されて
いることが明らかにされてきている。タンパク質のうち
半数以上が何らかのＮ末端修飾を受けているといわれて
いる。タンパク質のＮ末端からアミノ酸配列分析は一般
的にエドマン分解法によって行われている。しかしなが
らこれらＮ末端が修飾されているタンパク質は、そのま
まではエドマン法を用いたアミノ酸配列分析ができな
い。
いることが明らかにされてきている。タンパク質のうち
半数以上が何らかのＮ末端修飾を受けているといわれて
いる。タンパク質のＮ末端からアミノ酸配列分析は一般
的にエドマン分解法によって行われている。しかしなが
らこれらＮ末端が修飾されているタンパク質は、そのま
まではエドマン法を用いたアミノ酸配列分析ができな
い。
【０００３】例えば、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ
基がアセチル化されているタンパク質（Ｎ−アセチルタ
ンパク質）がある。タンパク質のＮ末端修飾のうち８０
％以上がアセチル化であるといわれている。更にそのう
ちおよそ３０％がＮ末端セリンのα−アミノ基がアセチ
ル化されているタンパク質（Ｎ−アセチルセリルタンパ
ク質）であり、およそ１０％がＮ末端スレオニンのα−
アミノ基がアセチル化されているタンパク質（Ｎ−アセ
チルスレオニルタンパク質）であるといわれている。従
来これらＮ−アセチルタンパク質のＮ末端からのアミノ
酸配列を決定するためには、以下のような方法が報告さ
れている。
基がアセチル化されているタンパク質（Ｎ−アセチルタ
ンパク質）がある。タンパク質のＮ末端修飾のうち８０
％以上がアセチル化であるといわれている。更にそのう
ちおよそ３０％がＮ末端セリンのα−アミノ基がアセチ
ル化されているタンパク質（Ｎ−アセチルセリルタンパ
ク質）であり、およそ１０％がＮ末端スレオニンのα−
アミノ基がアセチル化されているタンパク質（Ｎ−アセ
チルスレオニルタンパク質）であるといわれている。従
来これらＮ−アセチルタンパク質のＮ末端からのアミノ
酸配列を決定するためには、以下のような方法が報告さ
れている。
【０００４】［従来法１］ （１）Ｎ−アセチルタンパク質をタンパク質分解酵素で
消化し複数のペプチド断片の混合物とする。 （２）新たに生成したペプチド断片のα−アミノ基にフ
ェニルイソチオシアナートを作用させ、チオカルバミル
化合物とする。ここでは、元の試料のＮ末端ペプチドの
Ｎ末端アミノ酸はアセチル化されているため作用を受け
ない。 （３）チオカルバミル化合物を過蟻酸で酸化してカルバ
ミル化合物とし、エドマン分解されないようにする。 （４）アセチルアミノ酸遊離酵素を作用させ、元の試料
のＮ末端ペプチドのＮ末端のアセチル化されたアミノ酸
を遊離する。 （５）以降エドマン法でアミノ酸配列を決定する。ここ
で作用を受けるのは、元の試料のＮ末端ペプチドだけで
ある（Tsunazawaet al.,J. Protein Chem（1992）１１
巻、３８２ページ）。
消化し複数のペプチド断片の混合物とする。 （２）新たに生成したペプチド断片のα−アミノ基にフ
ェニルイソチオシアナートを作用させ、チオカルバミル
化合物とする。ここでは、元の試料のＮ末端ペプチドの
Ｎ末端アミノ酸はアセチル化されているため作用を受け
ない。 （３）チオカルバミル化合物を過蟻酸で酸化してカルバ
ミル化合物とし、エドマン分解されないようにする。 （４）アセチルアミノ酸遊離酵素を作用させ、元の試料
のＮ末端ペプチドのＮ末端のアセチル化されたアミノ酸
を遊離する。 （５）以降エドマン法でアミノ酸配列を決定する。ここ
で作用を受けるのは、元の試料のＮ末端ペプチドだけで
ある（Tsunazawaet al.,J. Protein Chem（1992）１１
巻、３８２ページ）。
【０００５】［従来法２］ （１）Ｎ−アセチルタンパク質をタンパク質分解酵素で
消化し複数のペプチド断片の混合物とする。 （２）ゲルろ過でペプチド断片を精製する。 （３）ペプチド断片の混合物から、ＨＰＬＣを用いて元
の試料のＮ末端ペプチドを分取する。 （４）アセチルアミノ酸遊離酵素を作用させ、元の試料
のＮ末端ペプチドのＮ末端のアセチル化されたアミノ酸
を遊離する。 （５）以降エドマン法でアミノ酸配列を決定する（続生
化学実験講座２、タンパク質の化学（上）、日本生化学
会編、東京化学同人、２２７ページ）。
消化し複数のペプチド断片の混合物とする。 （２）ゲルろ過でペプチド断片を精製する。 （３）ペプチド断片の混合物から、ＨＰＬＣを用いて元
の試料のＮ末端ペプチドを分取する。 （４）アセチルアミノ酸遊離酵素を作用させ、元の試料
のＮ末端ペプチドのＮ末端のアセチル化されたアミノ酸
を遊離する。 （５）以降エドマン法でアミノ酸配列を決定する（続生
化学実験講座２、タンパク質の化学（上）、日本生化学
会編、東京化学同人、２２７ページ）。
【０００６】［従来法３］従来法２における１から３の
操作を実行する。得られた元の試料のＮ末端ペプチドを
質量分析してアミノ酸配列を分析する（続生化学実験講
座２、タンパク質の化学（上）、日本生化学会編、東京
化学同人、２２８ページ）。
操作を実行する。得られた元の試料のＮ末端ペプチドを
質量分析してアミノ酸配列を分析する（続生化学実験講
座２、タンパク質の化学（上）、日本生化学会編、東京
化学同人、２２８ページ）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法には、反応
条件が過酷なため試料が変化する、特別の機器の使用を
含む煩雑な工程を必要とし回収率が低い、酵素を使用す
るため酵素の基質特異性や活性がさまざまであることか
ら正確な分析が困難になることがある、という欠点があ
る。
条件が過酷なため試料が変化する、特別の機器の使用を
含む煩雑な工程を必要とし回収率が低い、酵素を使用す
るため酵素の基質特異性や活性がさまざまであることか
ら正確な分析が困難になることがある、という欠点があ
る。
【０００８】そこで本発明は、過酷な反応条件を用い
ず、特別の機器を使用を含む煩雑な工程を無くし、酵素
を用いることなく、Ｎ−アセチルセリルタンパク質また
はペプチドおよびＮ−アセチルスレオニルタンパク質ま
たはペプチド（Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質またはペプチド）のＮ末端からのアミノ酸配列
を決定する方法を提供しようとするものである。
ず、特別の機器を使用を含む煩雑な工程を無くし、酵素
を用いることなく、Ｎ−アセチルセリルタンパク質また
はペプチドおよびＮ−アセチルスレオニルタンパク質ま
たはペプチド（Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質またはペプチド）のＮ末端からのアミノ酸配列
を決定する方法を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の欠点を克服しＮ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸の配
列を決定するために、Ｎ末端のセリンまたはスレオニン
の水酸基がアセチル化されているタンパク質あるいはペ
プチド（Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク
質あるいはペプチド）に酸性条件下でイソチオシアナー
ト化合物を作用させてチオカルバミル化合物を得て、こ
のチオカルバミル化合物をエドマン分解法によって分析
することとした。このＯ−アセチルセリルまたはスレオ
ニルタンパク質あるいはペプチドは、Ｎ−アセチルセリ
ルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸を
作用させて得たものである。
の欠点を克服しＮ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸の配
列を決定するために、Ｎ末端のセリンまたはスレオニン
の水酸基がアセチル化されているタンパク質あるいはペ
プチド（Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク
質あるいはペプチド）に酸性条件下でイソチオシアナー
ト化合物を作用させてチオカルバミル化合物を得て、こ
のチオカルバミル化合物をエドマン分解法によって分析
することとした。このＯ−アセチルセリルまたはスレオ
ニルタンパク質あるいはペプチドは、Ｎ−アセチルセリ
ルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸を
作用させて得たものである。
【００１０】上記手段により、過酷な反応条件を用い
ず、特別の機器を使用を含む煩雑な工程を無くし、酵素
を用いることなく、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニ
ルタンパク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸
配列を決定することが可能になった。
ず、特別の機器を使用を含む煩雑な工程を無くし、酵素
を用いることなく、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニ
ルタンパク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸
配列を決定することが可能になった。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下実施例に基づいて本発明を詳
細に説明する。 （実施例１）図１は本発明の分析方法を示す工程図であ
る。図中の、Ｒ−、はアミノ酸の側鎖を示す。これは以
降の各図においても同じである。まず、Ｎ−アセチルセ
リルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸
を作用させて、Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドを得る。次に、このＯ−アセ
チルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチ
ドに酸性条件下でφ−ＮＣＳで表わされるイソチオシア
ナート化合物を作用させ、チオカルバミル化合物を得
る。以下、この試料をエドマン法を用いて分析すること
によって、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパ
ク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列分析
を決定することができる。
細に説明する。 （実施例１）図１は本発明の分析方法を示す工程図であ
る。図中の、Ｒ−、はアミノ酸の側鎖を示す。これは以
降の各図においても同じである。まず、Ｎ−アセチルセ
リルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸
を作用させて、Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドを得る。次に、このＯ−アセ
チルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチ
ドに酸性条件下でφ−ＮＣＳで表わされるイソチオシア
ナート化合物を作用させ、チオカルバミル化合物を得
る。以下、この試料をエドマン法を用いて分析すること
によって、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパ
ク質あるいはペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列分析
を決定することができる。
【００１２】（実施例２）ここでは実験方法の一例の詳
細を述べる。本発明のアミノ酸配列分析の操作手順は以
下の通りである。（図２参照） Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あるい
はペプチドを含む試料溶液、あるいはＮ−アセチルセリ
ルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドを保持
した膜をチューブに入れた後乾燥させる。
細を述べる。本発明のアミノ酸配列分析の操作手順は以
下の通りである。（図２参照） Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あるい
はペプチドを含む試料溶液、あるいはＮ−アセチルセリ
ルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチドを保持
した膜をチューブに入れた後乾燥させる。
【００１３】次に、ここに酸溶液を入れ蓋をし、酸を作
用させる。 ・反応条件 酸溶液 ：７５％ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰ
Ａ）水溶液 反応温度：５０℃ 反応時間：１時間 ここでは、ＰＦＰＡの代わりに、ヘプタフルオロ酪酸
（ＨＦＢＡ）を含む他の酸を用いることもできる。ここ
で、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸が作用し、Ｏ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドが得られる。
ここで、チューブ内の試料を乾燥させる。
用させる。 ・反応条件 酸溶液 ：７５％ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰ
Ａ）水溶液 反応温度：５０℃ 反応時間：１時間 ここでは、ＰＦＰＡの代わりに、ヘプタフルオロ酪酸
（ＨＦＢＡ）を含む他の酸を用いることもできる。ここ
で、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸が作用し、Ｏ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドが得られる。
ここで、チューブ内の試料を乾燥させる。
【００１４】次に、チューブににイソチオシアナート化
合物を含む溶液を入れ、試料に作用させる。 ・反応条件 イソチオシアナート化合物：４−スルフォフェニルイソチオシアナート（SPIT C)HO3S-C6H4-NCS ＳＰＩＴＣ濃度 ：０．５％ 溶媒 ：０．１Ｍピリジン−酢酸緩衝溶液（ｐＨ６．０） とアセトニトリルとを３対２の割合で混合したもの 反応温度 ：５０℃ 反応時間 ：３０分間 ここでは、ＳＰＩＴＣの代わりに、トリメチルシリルイ
ソチオシアナートを含む他のイソチオシアナート化合物
を用いることもできる。
合物を含む溶液を入れ、試料に作用させる。 ・反応条件 イソチオシアナート化合物：４−スルフォフェニルイソチオシアナート（SPIT C)HO3S-C6H4-NCS ＳＰＩＴＣ濃度 ：０．５％ 溶媒 ：０．１Ｍピリジン−酢酸緩衝溶液（ｐＨ６．０） とアセトニトリルとを３対２の割合で混合したもの 反応温度 ：５０℃ 反応時間 ：３０分間 ここでは、ＳＰＩＴＣの代わりに、トリメチルシリルイ
ソチオシアナートを含む他のイソチオシアナート化合物
を用いることもできる。
【００１５】ここで、Ｏ−アセチルセリルまたはスレオ
ニルタンパク質あるいはペプチドにイソチオシアナート
化合物が作用し、チオカルバミル化合物が得られる。そ
してこの試料をエドマン法を用いて分析し、得られる一
連のチオヒダントイン化合物を同定することによって、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定す
る。エドマン法を用いた分析方法の手順の詳細について
は公知であるのでここでは述べない。
ニルタンパク質あるいはペプチドにイソチオシアナート
化合物が作用し、チオカルバミル化合物が得られる。そ
してこの試料をエドマン法を用いて分析し、得られる一
連のチオヒダントイン化合物を同定することによって、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定す
る。エドマン法を用いた分析方法の手順の詳細について
は公知であるのでここでは述べない。
【００１６】（実施例３）ここでは、実施例２に記述し
た操作によって得られたチオカルバミル化合物にエドマ
ン分解法（図３参照）を用いることによって、アミノ酸
配列分析が可能であることを示す。試料として、配列番
号１のヘプタペプチド、アセチルセリル−グルタモイル
−アスパラギニル−プロリル−チロシル−バリル−バリ
ンアミドである(Ac-Ser-Gln-Asn-Pro-Tyr-Val-Val-NH2)
を用いた。図４は、得られたチオカルバミル化合物を質
量分析して得られた結果である。
た操作によって得られたチオカルバミル化合物にエドマ
ン分解法（図３参照）を用いることによって、アミノ酸
配列分析が可能であることを示す。試料として、配列番
号１のヘプタペプチド、アセチルセリル−グルタモイル
−アスパラギニル−プロリル−チロシル−バリル−バリ
ンアミドである(Ac-Ser-Gln-Asn-Pro-Tyr-Val-Val-NH2)
を用いた。図４は、得られたチオカルバミル化合物を質
量分析して得られた結果である。
【００１７】質量分析の条件は以下の通りである。 質量分析の条件 ・分析装置：二重収束質量分析計 ＨＸ−１１０（日本電子） ・測定条件： 加速電圧 １０ｋＶ 分解能 １，０００ イオン源 ＦＡＢ （高速粒子衝撃法） イオン化ガス Ｘｅ イオンモード 陽イオン ＦＡＢガン加速電圧 ６ｋＶ 検出器 ＭＵＬＴＩＰＬＩＥＲ 付加電圧 −２０ｋＶ データ処理システム ＤＡ５０００ マトリックス グリセロール：チオグリセロール：ｍ−ニトロベンジ ルアルコール(GLYCEROL:THIOGLYCEROL:m-NITROBENZYLALCOHOL)＝１：１：１ ・試料調製手順： 試料を減圧乾固する。 ６７％酢酸水溶液（あるいはジメチルホルムアミ
ド）に溶解する。 ターゲット上にマトリックスを１μｌのせる。 更にターゲット上に試料溶液を１μｌのせ、混和す
る。 イオン源に導入する。 配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチルペ
プチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバミル
化合物（分子量１０６２）に対応する分子イオンが検出
されている。
ド）に溶解する。 ターゲット上にマトリックスを１μｌのせる。 更にターゲット上に試料溶液を１μｌのせ、混和す
る。 イオン源に導入する。 配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチルペ
プチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバミル
化合物（分子量１０６２）に対応する分子イオンが検出
されている。
【００１８】次にこの化合物にトリフルオロ酢酸を作用
させる。これは、図３に示すようにアミノ酸配列分析を
行うためのエドマン反応における切断の工程である。す
なわち、タンパク質あるいはペプチドのＮ末端アミノ酸
のα−アミノ基にイソチオシアナート化合物が作用して
できたチオカルバミルタンパク質あるいはペプチドのＮ
末端側の第１アミノ酸残基と第２アミノ酸残基との間の
ペプチド結合が、酸によって特異的に切断される工程で
ある。
させる。これは、図３に示すようにアミノ酸配列分析を
行うためのエドマン反応における切断の工程である。す
なわち、タンパク質あるいはペプチドのＮ末端アミノ酸
のα−アミノ基にイソチオシアナート化合物が作用して
できたチオカルバミルタンパク質あるいはペプチドのＮ
末端側の第１アミノ酸残基と第２アミノ酸残基との間の
ペプチド結合が、酸によって特異的に切断される工程で
ある。
【００１９】反応条件は下記の通りである。 ・反応条件 反応試薬：トリフルオロ酢酸（無水） 反応温度：５０℃ 反応時間：３０分間 図５は、こうして得られた化合物を質量分析して得られ
た結果である。
た結果である。
【００２０】質量分析の条件は上述のものと同じであ
る。配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチ
ルペプチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバ
ミル化合物（分子量１０６２）に対応する分子イオンが
検出されなくなり、試料として用いたヘプタペプチドが
アミノ末端のアセチル化されたセリンを失ったヘキサペ
プチドであるグルタモイル−アスパラギニル−プロリル
−チロシル−バリル−バリンアミド(Gln-Asn-Pro-Tyr-V
al-Val-NH2)（分子量７１７）に対応する分子イオンが
検出されている。
る。配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチ
ルペプチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバ
ミル化合物（分子量１０６２）に対応する分子イオンが
検出されなくなり、試料として用いたヘプタペプチドが
アミノ末端のアセチル化されたセリンを失ったヘキサペ
プチドであるグルタモイル−アスパラギニル−プロリル
−チロシル−バリル−バリンアミド(Gln-Asn-Pro-Tyr-V
al-Val-NH2)（分子量７１７）に対応する分子イオンが
検出されている。
【００２１】よって、以降得られたチオカルバミル化合
物にエドマン分解法を用いることによってアミノ酸配列
分析が可能であることがわかる。また、この実施例にお
いて、ここで試料として用いた配列番号１のヘプタペプ
チドがアミノ末端のアセチル化されたセリンを失ったヘ
キサペプチドであるグルタモイル−アスパラギニル−プ
ロリル−チロシル−バリル−バリンアミド（Gln-Asn-Pr
o-Tyr-Val-Val-NH2)が得られたことから、ＳＰＩＴＣが
配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチルペ
プチドのＮ末端アミノ酸のα−アミノ基と反応して対応
するチオカルバミル化合物が生成したこと、更に前段階
において、配列番号１のヘプタペプチド（Ｎ−アセチル
ペプチド）に酸を作用させた際に配列番号１のヘプタペ
プチドに対応するＯ−アセチルペプチドが生成してＮ末
端アミノ酸のα−アミノ基が出現したこと、がわかる。
物にエドマン分解法を用いることによってアミノ酸配列
分析が可能であることがわかる。また、この実施例にお
いて、ここで試料として用いた配列番号１のヘプタペプ
チドがアミノ末端のアセチル化されたセリンを失ったヘ
キサペプチドであるグルタモイル−アスパラギニル−プ
ロリル−チロシル−バリル−バリンアミド（Gln-Asn-Pr
o-Tyr-Val-Val-NH2)が得られたことから、ＳＰＩＴＣが
配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチルペ
プチドのＮ末端アミノ酸のα−アミノ基と反応して対応
するチオカルバミル化合物が生成したこと、更に前段階
において、配列番号１のヘプタペプチド（Ｎ−アセチル
ペプチド）に酸を作用させた際に配列番号１のヘプタペ
プチドに対応するＯ−アセチルペプチドが生成してＮ末
端アミノ酸のα−アミノ基が出現したこと、がわかる。
【００２２】（実施例３）ここでは、ＳＰＩＴＣとＮ末
端アミノ酸のα−アミノ基とが反応して、対応するチオ
カルバミル化合物が生成する際の反応条件を検討した結
果を示す。試料として配列番号２のペンタペプチドであ
るロイシル−トリプトファニル−メチオニル−アルギニ
ル−フェニルアラニン(Leu-Trp-Met-Arg-Phe)を用い
た。
端アミノ酸のα−アミノ基とが反応して、対応するチオ
カルバミル化合物が生成する際の反応条件を検討した結
果を示す。試料として配列番号２のペンタペプチドであ
るロイシル−トリプトファニル−メチオニル−アルギニ
ル−フェニルアラニン(Leu-Trp-Met-Arg-Phe)を用い
た。
【００２３】検討した反応条件は下記の通りである。 ・反応条件 ＳＰＩＴＣ濃度：０．５％ 反応溶媒 緩衝溶液 ：０．１Ｍピリジン−酢酸緩衝溶液（１）ｐＨ４．０、（２） ｐＨ５．５、（３）ｐＨ６．０３条件 有機溶媒との混合：（１）無し、（２）緩衝溶液とアセトニトリルとを３対 ２の比で混合の２条件 反応温度 ：５０℃ 反応時間 ：３０分間
【００２４】実験手順は下記の通りである。 （１）上記の各条件下で、ＳＰＩＴＣと配列番号２のペ
ンタペプチドとを反応させる。 （２）反応生成物を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬ
Ｃ）で分析する。 （３）未反応の配列番号２のペンタペプチド由来のピー
ク面積（Ａとする）を未反応の配列番号２のペンタペプ
チド由来のピーク面積とＳＰＩＴＣと配列番号２のペン
タペプチドとの反応生成物由来のピーク面積（Ｂとす
る）との和と比較する。
ンタペプチドとを反応させる。 （２）反応生成物を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬ
Ｃ）で分析する。 （３）未反応の配列番号２のペンタペプチド由来のピー
ク面積（Ａとする）を未反応の配列番号２のペンタペプ
チド由来のピーク面積とＳＰＩＴＣと配列番号２のペン
タペプチドとの反応生成物由来のピーク面積（Ｂとす
る）との和と比較する。
【００２５】反応収率（％）の算出式は下記の通りであ
る。 （１−Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００ ＨＰＬＣ分析の条件は以下の通りである。 ・カラム ：資生堂 ＣＡＰＳＥＬＰＡＣＫ Ｃ−１８ ・濃度勾配溶出：Ａ液 ０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液 ８０％メタノールと０．１％ＴＦＡとを含む水溶液 ０− ５ｍｉｎ Ｂ液２０％ ５−２５ｍｉｎ Ｂ液２０→１００％（ＬＩＮＥＡＲ） ２５−３０ｍｉｎ Ｂ液１００％ ・検出 ：２８０ｎｍの吸収 ピークの同定には質量分析を用いた。質量分析の条件
は、実施例３に記載したものと同じである。結果を図６
から図１１に示す。反応条件と結果を示した図の対応を
まとめたのが下記表１である。
る。 （１−Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００ ＨＰＬＣ分析の条件は以下の通りである。 ・カラム ：資生堂 ＣＡＰＳＥＬＰＡＣＫ Ｃ−１８ ・濃度勾配溶出：Ａ液 ０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液 ８０％メタノールと０．１％ＴＦＡとを含む水溶液 ０− ５ｍｉｎ Ｂ液２０％ ５−２５ｍｉｎ Ｂ液２０→１００％（ＬＩＮＥＡＲ） ２５−３０ｍｉｎ Ｂ液１００％ ・検出 ：２８０ｎｍの吸収 ピークの同定には質量分析を用いた。質量分析の条件
は、実施例３に記載したものと同じである。結果を図６
から図１１に示す。反応条件と結果を示した図の対応を
まとめたのが下記表１である。
【００２６】
【表１】 反応収率をまとめたのが下記表２である。
【００２７】
【表２】 いずれも、ｐＨ６．０の緩衝溶液を用いた場合に反応収
率が高いことがわかる。これらのうち、アミノ酸配列分
析に用いる膜への含浸性のより高い、緩衝溶液（ｐＨ
６．０）にアセトニトリルを上記の比率で混合した溶
液、を上述の実施例において用いた。
率が高いことがわかる。これらのうち、アミノ酸配列分
析に用いる膜への含浸性のより高い、緩衝溶液（ｐＨ
６．０）にアセトニトリルを上記の比率で混合した溶
液、を上述の実施例において用いた。
【００２８】以上述べてきた結果をまとめると次のよう
になる。本発明においては、Ｎ末端のセリンまたはスレ
オニンのα−アミノ基がアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチド（Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニル
タンパク質あるいはペプチド）のＮ末端からのアミノ酸
の配列分析を遂行するために、Ｏ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸性条件下
でイソチオシアナート化合物を作用させてチオカルバミ
ル化合物を得て、このチオカルバミル化合物をエドマン
分解法によって分析することとした。このＯ−アセチル
セリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチド
は、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸を作用させて得たものである。これ
によって、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパ
ク質あるいはペプチドの、Ｎ末端からのアミノ酸配列を
決定することが可能になった。
になる。本発明においては、Ｎ末端のセリンまたはスレ
オニンのα−アミノ基がアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチド（Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニル
タンパク質あるいはペプチド）のＮ末端からのアミノ酸
の配列分析を遂行するために、Ｏ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸性条件下
でイソチオシアナート化合物を作用させてチオカルバミ
ル化合物を得て、このチオカルバミル化合物をエドマン
分解法によって分析することとした。このＯ−アセチル
セリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチド
は、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸を作用させて得たものである。これ
によって、Ｎ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパ
ク質あるいはペプチドの、Ｎ末端からのアミノ酸配列を
決定することが可能になった。
【００２９】
【発明の効果】本発明の重要な点は下記の通りである。
Ｎ末端のセリンまたはスレオニンのα−アミノ基がアセ
チル化されたタンパク質あるいはペプチド（Ｎ−アセチ
ルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチ
ド）のＮ末端からのアミノ酸の配列分析を遂行するため
に、Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸性条件下でイソチオシアナート化合
物を作用させてチオカルバミル化合物を得て、このチオ
カルバミル化合物をエドマン分解法によって分析するこ
ととした。このＯ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドは、Ｎ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸を作用さ
せて得たものである。
Ｎ末端のセリンまたはスレオニンのα−アミノ基がアセ
チル化されたタンパク質あるいはペプチド（Ｎ−アセチ
ルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチ
ド）のＮ末端からのアミノ酸の配列分析を遂行するため
に、Ｏ−アセチルセリルまたはスレオニルタンパク質あ
るいはペプチドに酸性条件下でイソチオシアナート化合
物を作用させてチオカルバミル化合物を得て、このチオ
カルバミル化合物をエドマン分解法によって分析するこ
ととした。このＯ−アセチルセリルまたはスレオニルタ
ンパク質あるいはペプチドは、Ｎ−アセチルセリルまた
はスレオニルタンパク質あるいはペプチドに酸を作用さ
せて得たものである。
【００３０】これによって、特別の機器を使用を含む煩
雑な工程を無くし、酵素を用いることなく、Ｎ−アセチ
ルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチド
の、Ｎ末端からのアミノ酸配列を決定することが可能に
なった。よって、本発明によるタンパク質あるいはペプ
チドのＮ末端からのアミノ酸配列を決定する方法はその
工業的価値が大である。
雑な工程を無くし、酵素を用いることなく、Ｎ−アセチ
ルセリルまたはスレオニルタンパク質あるいはペプチド
の、Ｎ末端からのアミノ酸配列を決定することが可能に
なった。よって、本発明によるタンパク質あるいはペプ
チドのＮ末端からのアミノ酸配列を決定する方法はその
工業的価値が大である。
【００３１】
配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図１】本発明の分析方法を示す工程図である。
【図２】本発明の実験手順を示すための反応式である。
【図３】エドマン分解法の工程図である。
【図４】チオカルバミル化合物を質量分析した結果であ
る。
る。
【図５】チオカルバミル化合物を酸処理して得られた化
合物を質量分析した結果である。
合物を質量分析した結果である。
【図６】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
【図７】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
【図８】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
【図９】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
【図１０】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドと
の反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
の反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
【図１１】ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドと
の反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
の反応収率を調べるためのＨＰＬＣ分析の結果である。
１ 配列番号１のヘプタペプチドに対応するＯ−アセチ
ルペプチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバ
ミル化合物（分子量１０６２）、に対応する分子イオン
由来の信号 ２ 配列番号１のヘプタペプチドがアミノ末端のアセチ
ル化されたセリンを失ったヘキサペプチド（分子量７１
７）、に対応する分子イオン由来の信号 ３ 配列番号２のペンタペプチド由来のピーク ４ ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの反応
生成物由来のピーク
ルペプチドにＳＰＩＴＣが作用して得られるチオカルバ
ミル化合物（分子量１０６２）、に対応する分子イオン
由来の信号 ２ 配列番号１のヘプタペプチドがアミノ末端のアセチ
ル化されたセリンを失ったヘキサペプチド（分子量７１
７）、に対応する分子イオン由来の信号 ３ 配列番号２のペンタペプチド由来のピーク ４ ＳＰＩＴＣと配列番号２のペンタペプチドとの反応
生成物由来のピーク
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 豊明 千葉県千葉市美浜区中瀬１丁目８番地 セイコー電子工業株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/68
Claims (3)
- 【請求項１】 アミノ末端アミノ酸残基の水酸基がアセ
チル化されたタンパク質あるいはペプチドに酸性条件下
でイソチオシアナート化合物を作用させてチオカルバミ
ル化合物を得ることを特徴とする、タンパク質あるいは
ペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項２】 前記アミノ末端アミノ酸残基の水酸基が
アセチル化されたタンパク質あるいはペプチドは、アミ
ノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基がアセチル化された
タンパク質あるいはペプチドに酸を作用させて得たもの
であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質あ
るいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 - 【請求項３】 前記アミノ末端アミノ酸残基の水酸基が
アセチル化されたタンパク質あるいはペプチドに酸性条
件下でイソチオシアナート化合物を作用させて得たチオ
カルバミル化合物をエドマン分解法によって分析するこ
とを特徴とする、請求項１記載のタンパク質あるいはペ
プチドのアミノ酸配列を決定する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8154580A JP2879661B2 (ja) | 1996-05-09 | 1996-06-14 | タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 |
| US08/854,187 US5962642A (en) | 1996-05-09 | 1997-05-09 | Method for sequencing of protein or peptide |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-115087 | 1996-05-09 | ||
| JP11508796 | 1996-05-09 | ||
| JP8154580A JP2879661B2 (ja) | 1996-05-09 | 1996-06-14 | タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1026624A JPH1026624A (ja) | 1998-01-27 |
| JP2879661B2 true JP2879661B2 (ja) | 1999-04-05 |
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ID=26453690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8154580A Expired - Fee Related JP2879661B2 (ja) | 1996-05-09 | 1996-06-14 | タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5962642A (ja) |
| JP (1) | JP2879661B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2002267674A (ja) * | 2001-03-14 | 2002-09-18 | Nec Corp | 蛋白質あるいはペプチドの分析方法 |
| KR100611313B1 (ko) * | 2004-06-30 | 2006-08-10 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리펩티드의 ｎ-말단 치환용 화합물, 이를 이용한폴리펩티드 내의 아미노산 서열분석 및 정량방법 |
| US20240200058A1 (en) * | 2022-12-06 | 2024-06-20 | Shifeng Li | Methods and appratus for protein and peptide sequencing |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5534440A (en) * | 1991-02-22 | 1996-07-09 | Biomedical Research Centre Limited | Compounds and methods for sequencing amino acids |
| JPH0694461B2 (ja) * | 1992-08-17 | 1994-11-24 | 一洋 今井 | ７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）イソチオシアネート及びそれを含むアミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質測定用組成 |
| US5468843A (en) * | 1994-09-08 | 1995-11-21 | Perkin-Elmer | Acetic anhydride activation for C-terminal protein sequencing |
-
1996
- 1996-06-14 JP JP8154580A patent/JP2879661B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-05-09 US US08/854,187 patent/US5962642A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5962642A (en) | 1999-10-05 |
| JPH1026624A (ja) | 1998-01-27 |
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