JP2002267674A - 蛋白質あるいはペプチドの分析方法 - Google Patents
蛋白質あるいはペプチドの分析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素を用いず効率的に蛋白質の翻訳後修飾を
解析する方法であって、例えばリン酸化アミノ酸の区別
が不可能、あるいは特別な施設や専用の装置が必要とい
う欠点をなくし、また、試料中の蛋白質の修飾部位及び
修飾量を定量的に分析ができ、定量性決定のために各処
理段階が増えることがない蛋白質あるいはペプチドの分
析方法を提供する。 【解決手段】 蛋白質あるいはペプチドを酸（チオエス
テルまたはヒドラジン）と被解析蛋白質あるいはペプチ
ドとを一定の条件で反応させる。その結果、蛋白質ある
いはペプチドの様々な修飾状態を検出でき、それぞれ特
定の修飾基の定性と修飾アミノ酸の位置を化学的方法と
質量分析装置を用いて蛋白質あるいはペプチドについて
効率的な解析が可能になる。
解析する方法であって、例えばリン酸化アミノ酸の区別
が不可能、あるいは特別な施設や専用の装置が必要とい
う欠点をなくし、また、試料中の蛋白質の修飾部位及び
修飾量を定量的に分析ができ、定量性決定のために各処
理段階が増えることがない蛋白質あるいはペプチドの分
析方法を提供する。 【解決手段】 蛋白質あるいはペプチドを酸（チオエス
テルまたはヒドラジン）と被解析蛋白質あるいはペプチ
ドとを一定の条件で反応させる。その結果、蛋白質ある
いはペプチドの様々な修飾状態を検出でき、それぞれ特
定の修飾基の定性と修飾アミノ酸の位置を化学的方法と
質量分析装置を用いて蛋白質あるいはペプチドについて
効率的な解析が可能になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質あるいはペ
プチドの分析、特にそれらの翻訳後修飾状態を酵素を用
いずに構造解析する方法に関する。
プチドの分析、特にそれらの翻訳後修飾状態を酵素を用
いずに構造解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの蛋白質は翻訳後に種々の修飾を受
けるが、その中でもリン酸化はさまざまな蛋白質の生理
活性や酵素活性を変化させ、細胞内情報伝達や細胞内代
謝活性を司るものとしては主要な翻訳後修飾であり、細
胞内における蛋白質のリン酸化の状態を決定することは
非常に重要である。
けるが、その中でもリン酸化はさまざまな蛋白質の生理
活性や酵素活性を変化させ、細胞内情報伝達や細胞内代
謝活性を司るものとしては主要な翻訳後修飾であり、細
胞内における蛋白質のリン酸化の状態を決定することは
非常に重要である。
【０００３】蛋白質リン酸化の検出方法には、放射性同
位元素を用いる方法や抗体を用いる方法などが知られて
いる（例えば、小田：同位体ラベルによるプロテオーム
変動解析第１１１−１２２頁、柳田、高橋：リン酸化蛋
白質の検出、第８５−９１頁、実験医学別冊プロテオー
ム解析法、２０００年、羊土社）。
位元素を用いる方法や抗体を用いる方法などが知られて
いる（例えば、小田：同位体ラベルによるプロテオーム
変動解析第１１１−１２２頁、柳田、高橋：リン酸化蛋
白質の検出、第８５−９１頁、実験医学別冊プロテオー
ム解析法、２０００年、羊土社）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、放射性同位元
素を用いる方法はチロシンリン酸化とセリンリン酸化あ
るいはスレオニンリン酸化の区別ができずまた特別な施
設や専用の装置が必要という欠点があった。
素を用いる方法はチロシンリン酸化とセリンリン酸化あ
るいはスレオニンリン酸化の区別ができずまた特別な施
設や専用の装置が必要という欠点があった。
【０００５】また、抗体を用いる方法は、同じリン酸化
アミノ酸を認識する抗体でも、リン酸化アミノ酸を含む
蛋白質の種類によって、抗体の結合特異性が異なるた
め、試料中の異種蛋白質間のリン酸化量を単純に比較で
きず、リン酸化決定のために酵素免疫測定（エンザイム
イムノアッセイ）が必要になり工程が増えるという欠点
があった。
アミノ酸を認識する抗体でも、リン酸化アミノ酸を含む
蛋白質の種類によって、抗体の結合特異性が異なるた
め、試料中の異種蛋白質間のリン酸化量を単純に比較で
きず、リン酸化決定のために酵素免疫測定（エンザイム
イムノアッセイ）が必要になり工程が増えるという欠点
があった。
【０００６】リン酸化に限らず、硫酸化、糖化など蛋白
質あるいはペプチドの様々な修飾状態を、酵素を用いず
に高精度、高効率で決定する方法はなかった。
質あるいはペプチドの様々な修飾状態を、酵素を用いず
に高精度、高効率で決定する方法はなかった。
【０００７】そこで、本発明の技術的課題は、酵素や特
別な装置を用いなくて蛋白質あるいはペプチドの分析方
法、特にそれらの翻訳後修飾状態を構造解析することが
できる新規な分析方法を提供することにある。
別な装置を用いなくて蛋白質あるいはペプチドの分析方
法、特にそれらの翻訳後修飾状態を構造解析することが
できる新規な分析方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、酸と被解析蛋
白質あるいはペプチドとを反応させるプロセスを有する
技術、酸はペンタフルオロプロピオン酸もしくはヘプタ
フルオロ酪酸である技術、酸にはジチオトレイトール
（ＤＴＴ）もしくはメルカプトエタノールを含む技術、
反応温度は７０℃から１００℃の範囲である技術、反応
時間が６時間から１６時間である技術、反応を気相もし
くは液体中で行なう技術、また、上記酸をＳエチルトリ
フルオロチオアセテート（ＣＦ３ＣＯＳＣ２Ｈ５）に替
えた技術、上記酸を含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・ｎ
Ｈ２Ｏ：ｎは整数）に替えた技術を提供するものであ
る。
白質あるいはペプチドとを反応させるプロセスを有する
技術、酸はペンタフルオロプロピオン酸もしくはヘプタ
フルオロ酪酸である技術、酸にはジチオトレイトール
（ＤＴＴ）もしくはメルカプトエタノールを含む技術、
反応温度は７０℃から１００℃の範囲である技術、反応
時間が６時間から１６時間である技術、反応を気相もし
くは液体中で行なう技術、また、上記酸をＳエチルトリ
フルオロチオアセテート（ＣＦ３ＣＯＳＣ２Ｈ５）に替
えた技術、上記酸を含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・ｎ
Ｈ２Ｏ：ｎは整数）に替えた技術を提供するものであ
る。
【０００９】すなわち、本発明によれば、蛋白質あるい
はペプチドと酸との反応プロセスを用いた分析方法であ
って、前記蛋白質あるいはペプチドを、化学式ＣｍＦ
２ｍ＋ １ＣＯＯＨ（但し、ｍは正の整数）で示される酸
の内の少なくとも一種又は、その誘導体，又はその水溶
液と反応させることを特徴とする蛋白質あるいはペプチ
ドの分析方法が得られる。
はペプチドと酸との反応プロセスを用いた分析方法であ
って、前記蛋白質あるいはペプチドを、化学式ＣｍＦ
２ｍ＋ １ＣＯＯＨ（但し、ｍは正の整数）で示される酸
の内の少なくとも一種又は、その誘導体，又はその水溶
液と反応させることを特徴とする蛋白質あるいはペプチ
ドの分析方法が得られる。
【００１０】また、本発明によれば、前記蛋白質あるい
はペプチドの分析方法において、前記酸又はその水溶液
は、ペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯ
Ｈ）、もしくはヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ７ＣＯＯ
Ｈ）もしくはペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５Ｃ
ＯＯＨ）水溶液、もしくはヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ
７ＣＯＯＨ）水溶液であることを特徴とする蛋白質ある
いはペプチドの分析方法が得られる。
はペプチドの分析方法において、前記酸又はその水溶液
は、ペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯ
Ｈ）、もしくはヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ７ＣＯＯ
Ｈ）もしくはペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５Ｃ
ＯＯＨ）水溶液、もしくはヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ
７ＣＯＯＨ）水溶液であることを特徴とする蛋白質ある
いはペプチドの分析方法が得られる。
【００１１】また、本発明によれば、前記蛋白質あるい
はペプチドの分析方法において、前記酸は、ジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）もしくはメルカプトエタノールを含
むことを特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法
が得られる。
はペプチドの分析方法において、前記酸は、ジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）もしくはメルカプトエタノールを含
むことを特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法
が得られる。
【００１２】また、本発明によれば、前記いずれかに一
つの蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記
酸の水溶液濃度は０．１％から５％の範囲であることを
特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られ
る。
つの蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記
酸の水溶液濃度は０．１％から５％の範囲であることを
特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られ
る。
【００１３】また、本発明によれば、前記いずれか一つ
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応温
度は７０℃から１００℃の範囲であることを特徴とする
蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られる。
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応温
度は７０℃から１００℃の範囲であることを特徴とする
蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られる。
【００１４】また、本発明によれば、前記いずれか一つ
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応時
間が６時間から１６時間の範囲であることを特徴とする
蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られる。
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応時
間が６時間から１６時間の範囲であることを特徴とする
蛋白質あるいはペプチドの分析方法が得られる。
【００１５】また、本発明によれば、前記いずれか一つ
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応は
液相あるいは気相反応であることを特徴とする蛋白質あ
るいはペプチドの分析方法が得られる。
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応は
液相あるいは気相反応であることを特徴とする蛋白質あ
るいはペプチドの分析方法が得られる。
【００１６】また、本発明によれば、前記いずれか一つ
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記酸
の誘導体として、Ｓエチルトリフルオロ酢酸（ＣＦ３Ｃ
ＯＳＣ２Ｈ５）を用いたことを特徴とする蛋白質あるい
はペプチドの分析方法が得られる。
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記酸
の誘導体として、Ｓエチルトリフルオロ酢酸（ＣＦ３Ｃ
ＯＳＣ２Ｈ５）を用いたことを特徴とする蛋白質あるい
はペプチドの分析方法が得られる。
【００１７】また、本発明によれば、前記いずれか一つ
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記酸
の水溶液として、前記ＣｍＦ２ｍ＋１ＣＯＯＨの代わり
に含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・ｎＨ２Ｏ：ｎは整
数）を用いたことを特徴とする蛋白質あるいはペプチド
の分析方法が得られる。
の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記酸
の水溶液として、前記ＣｍＦ２ｍ＋１ＣＯＯＨの代わり
に含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・ｎＨ２Ｏ：ｎは整
数）を用いたことを特徴とする蛋白質あるいはペプチド
の分析方法が得られる。
【００１８】このように、本発明の方法によって、リン
酸化、硫酸化、糖化など蛋白質あるいはペプチドの様々
な修飾状態を検出できる。それぞれ特定の修飾アミノ酸
を含むペプチド断片から化学的処理により修飾基を脱離
させ、質量分析装置等を用いて解析することにより、修
飾蛋白質あるいはペプチドの効率的な解析が可能にな
る。
酸化、硫酸化、糖化など蛋白質あるいはペプチドの様々
な修飾状態を検出できる。それぞれ特定の修飾アミノ酸
を含むペプチド断片から化学的処理により修飾基を脱離
させ、質量分析装置等を用いて解析することにより、修
飾蛋白質あるいはペプチドの効率的な解析が可能にな
る。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の発明の実施の形態
について図面を参照しながら説明する。
について図面を参照しながら説明する。
【００２０】図１は本発明の各実施の形態に共通な技術
の一連のプロセスを示す概念フローを示す図である。
の一連のプロセスを示す概念フローを示す図である。
【００２１】図１に示すように、本発明においては、蛋
白質あるいはペプチドを用意し（ステップＳ１）、次に
気相または液体中での酸と作用させ（ステップＳ２）、
次に酸の種類に応じた特定温度・時間で反応させ（ステ
ップＳ３）、さらに、遊離されたペプチドと修飾基を回
収し（ステップＳ４）、質量分析装置による同定を行う
（ステップＳ５）。
白質あるいはペプチドを用意し（ステップＳ１）、次に
気相または液体中での酸と作用させ（ステップＳ２）、
次に酸の種類に応じた特定温度・時間で反応させ（ステ
ップＳ３）、さらに、遊離されたペプチドと修飾基を回
収し（ステップＳ４）、質量分析装置による同定を行う
（ステップＳ５）。
【００２２】次に、本発明の実施の形態について更に具
体的に説明する。
体的に説明する。
【００２３】（第１の実施の形態）本発明の効果を実証
するためのモデル被検査物質としてヒートショック蛋白
質のペプチドを用いた。このペプチドは、リン酸化され
ており、既に１文字略号形式で示す配列：ＣＬＮＲＱＬ
Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）ＳＧＶＳＥＩＲ（以下、配列１と呼
ぶ）のようなアミノ酸配列構造を有することが分かって
いる。すなわち、それは１４残基のアミノ酸からなり、
その配列中にセリン残基（Ｓ：Ｓｅｒ）を３つ持ち、Ｎ
末端から７番目のＳｅｒのみがリン酸化されている。本
実施の形態では、それを被検査試料物質として扱い、リ
ン酸化に関する情報を求めた。
するためのモデル被検査物質としてヒートショック蛋白
質のペプチドを用いた。このペプチドは、リン酸化され
ており、既に１文字略号形式で示す配列：ＣＬＮＲＱＬ
Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）ＳＧＶＳＥＩＲ（以下、配列１と呼
ぶ）のようなアミノ酸配列構造を有することが分かって
いる。すなわち、それは１４残基のアミノ酸からなり、
その配列中にセリン残基（Ｓ：Ｓｅｒ）を３つ持ち、Ｎ
末端から７番目のＳｅｒのみがリン酸化されている。本
実施の形態では、それを被検査試料物質として扱い、リ
ン酸化に関する情報を求めた。
【００２４】反応容器には、ガラスチューブ容器（１３
×１００ｍｍ）を用いた。まず、減圧乾燥させたペプチ
ド３００ｐｍｏｌｅをこの容器に入れた。この本発明者
らが用いた容器に対しては、５−５００ｐｍｏｌｅ程度
であれば適切である。その後、同じ容器に、Ｎａｃａｌ
ａｉ Ｔｅｓｑｕｅ 社製 １００μｌの５％ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）を含む Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ 社製０．２％ペンタフルオロプロピオン
酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯＨ）水溶液を入れた。更にその後、
ガラスチューブ全体を減圧し、アルゴンガス（Ａｒ）を
入れて封入した。このガラスチューブを９０℃で８時間
保持し、試料とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むペ
ンタフルオロプロピオン酸水溶液を液相反応させた。
×１００ｍｍ）を用いた。まず、減圧乾燥させたペプチ
ド３００ｐｍｏｌｅをこの容器に入れた。この本発明者
らが用いた容器に対しては、５−５００ｐｍｏｌｅ程度
であれば適切である。その後、同じ容器に、Ｎａｃａｌ
ａｉ Ｔｅｓｑｕｅ 社製 １００μｌの５％ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）を含む Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ 社製０．２％ペンタフルオロプロピオン
酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯＨ）水溶液を入れた。更にその後、
ガラスチューブ全体を減圧し、アルゴンガス（Ａｒ）を
入れて封入した。このガラスチューブを９０℃で８時間
保持し、試料とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むペ
ンタフルオロプロピオン酸水溶液を液相反応させた。
【００２５】その後、サンプルを真空乾燥させ、２μｌ
の６７％酢酸に溶解させた後、そのうちの１μｌを１μ
ｌのｍ−ニトロベンジルアルコール（Ｏ２ＮＣ６Ｈ４Ｃ
Ｈ２ＯＨ）と混合し、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析
計（ＨＸ‐１１０ＭＳ：ＪＥＯＬ製）で解析した。加速
電圧は１０ｋＶでキセノンガスをイオン化ガスとした。
その結果、図２に示す如く３０％のリン酸基の脱離が観
察された。
の６７％酢酸に溶解させた後、そのうちの１μｌを１μ
ｌのｍ−ニトロベンジルアルコール（Ｏ２ＮＣ６Ｈ４Ｃ
Ｈ２ＯＨ）と混合し、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析
計（ＨＸ‐１１０ＭＳ：ＪＥＯＬ製）で解析した。加速
電圧は１０ｋＶでキセノンガスをイオン化ガスとした。
その結果、図２に示す如く３０％のリン酸基の脱離が観
察された。
【００２６】すなわち、本発明によって、蛋白質あるい
はペプチドのリン酸化の有無を酵素を用いずに検証可能
であることが確認できた。
はペプチドのリン酸化の有無を酵素を用いずに検証可能
であることが確認できた。
【００２７】本蛋白質に本実施の形態で述べた処理を施
せば、予めいくつかの特定のペプチドに分割され、その
各々のペプチドについて、リン酸の脱離反応も同時に行
なわれ、リン酸基脱離反応があった特定のペプチドが元
々リン酸化されていたことがわかる。
せば、予めいくつかの特定のペプチドに分割され、その
各々のペプチドについて、リン酸の脱離反応も同時に行
なわれ、リン酸基脱離反応があった特定のペプチドが元
々リン酸化されていたことがわかる。
【００２８】このように、本発明によって、酵素を用い
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドのリン酸化部位
が特定できる。
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドのリン酸化部位
が特定できる。
【００２９】（第２の実施の形態）第２の実施の形態と
して、チロシンフォスファターゼのペプチドを用いた。
このペプチドはリン酸化されており、１文字略号形式で
示すアミノ酸配列構造、Ｙ（ＰＯ３Ｈ２）ＰＶＭＬ（以
下、配列２と呼ぶ）を有することが分かっている。
して、チロシンフォスファターゼのペプチドを用いた。
このペプチドはリン酸化されており、１文字略号形式で
示すアミノ酸配列構造、Ｙ（ＰＯ３Ｈ２）ＰＶＭＬ（以
下、配列２と呼ぶ）を有することが分かっている。
【００３０】すなわち、５残基のアミノ酸からなるこの
ペプチドは、Ｎ末端のチロシン残基がリン酸化されてい
る。本実施の形態では、それを被検査試料物質として扱
い、リン酸化に関する情報を求めた。
ペプチドは、Ｎ末端のチロシン残基がリン酸化されてい
る。本実施の形態では、それを被検査試料物質として扱
い、リン酸化に関する情報を求めた。
【００３１】反応容器には、大小２重のガラスチューブ
が入れ子状になった容器を用いた。まず、このペプチド
３００ｐｍｏｌｅを小ガラスチューブ（６×４０ｍｍ）
に入れた。試料の量は容器に依存するが、本発明者が用
いた容器に対しては、５−５００ｐｍｏｌｅ程度であれ
ば適切である。同じチューブに、Ｎａｃａｋｉ Ｔｅｓ
ｑｕｅ 社製 １００μｌの５％ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を含む Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ 社製 ０．２％ペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２
Ｆ５ＣＯＯＨ）水溶液を入れ、ガラスチューブを減圧後
アルゴンガス（Ａｒ）を入れて封入した。このガラスチ
ューブを９０℃で８時間保持し、試料とジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）を含むペンタフルオロプロピオン酸を気
相反応させた。
が入れ子状になった容器を用いた。まず、このペプチド
３００ｐｍｏｌｅを小ガラスチューブ（６×４０ｍｍ）
に入れた。試料の量は容器に依存するが、本発明者が用
いた容器に対しては、５−５００ｐｍｏｌｅ程度であれ
ば適切である。同じチューブに、Ｎａｃａｋｉ Ｔｅｓ
ｑｕｅ 社製 １００μｌの５％ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を含む Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ 社製 ０．２％ペンタフルオロプロピオン酸（Ｃ２
Ｆ５ＣＯＯＨ）水溶液を入れ、ガラスチューブを減圧後
アルゴンガス（Ａｒ）を入れて封入した。このガラスチ
ューブを９０℃で８時間保持し、試料とジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）を含むペンタフルオロプロピオン酸を気
相反応させた。
【００３２】上記反応プロセスは、第１の実施の形態に
示したような、液相反応で行うこともできる。
示したような、液相反応で行うこともできる。
【００３３】その後サンプルを真空乾燥させ、２μｌの
６７％酢酸に溶解させた後、そのうちの１μｌを１μｌ
のｍ−ニトロベンジルアルコール（Ｏ２ＮＣ６Ｈ４ＣＨ
２ＯＨ）と混合し、ＦＡＢ質量分析計（ＨＸ‐１１０Ｍ
Ｓ：ＪＥＯＬ製）で解析した。加速電圧は１０ｋＶでキ
セノンガスをイオン化ガスとした。その結果、図３に示
す如く９０％のリン酸基の脱離が観察された。すなわ
ち、本発明によって、蛋白質あるいはペプチドのリン酸
化の有無を酵素を用いずに検証可能であることが確認で
きた。もし、本蛋白質に本実施の形態で述べたプロセス
を施せば、いくつかのペプチドに分割され、同時にリン
酸基脱離反応が生じ、ペプチドが元々リン酸化されてい
たことがわかる。
６７％酢酸に溶解させた後、そのうちの１μｌを１μｌ
のｍ−ニトロベンジルアルコール（Ｏ２ＮＣ６Ｈ４ＣＨ
２ＯＨ）と混合し、ＦＡＢ質量分析計（ＨＸ‐１１０Ｍ
Ｓ：ＪＥＯＬ製）で解析した。加速電圧は１０ｋＶでキ
セノンガスをイオン化ガスとした。その結果、図３に示
す如く９０％のリン酸基の脱離が観察された。すなわ
ち、本発明によって、蛋白質あるいはペプチドのリン酸
化の有無を酵素を用いずに検証可能であることが確認で
きた。もし、本蛋白質に本実施の形態で述べたプロセス
を施せば、いくつかのペプチドに分割され、同時にリン
酸基脱離反応が生じ、ペプチドが元々リン酸化されてい
たことがわかる。
【００３４】このように、本発明によって、酵素を用い
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドのリン酸化部位
が特定できる。
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドのリン酸化部位
が特定できる。
【００３５】（第３の実施の形態）第３の実施の形態と
して、ＤＹ−（ＳＯ３Ｈ）ＭＧＭＤＦ−ＮＨ２（１文字
略号形式で示すアミノ酸）のアミノ酸配列からなるペプ
チドを用いた。このペプチドはチロシン残基が硫酸化さ
れている。
して、ＤＹ−（ＳＯ３Ｈ）ＭＧＭＤＦ−ＮＨ２（１文字
略号形式で示すアミノ酸）のアミノ酸配列からなるペプ
チドを用いた。このペプチドはチロシン残基が硫酸化さ
れている。
【００３６】減圧乾燥させたＤＹ−（ＳＯ３Ｈ）ＭＧＭ
ＤＦ−ＮＨ２の５０ｐｍｏｌｅを小ガラスチューブ（６
×４０ｍｍ）に入れ、大ガラスチューブ（１３×１００
ｍｍ）に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ 社製
Ｓエチルトリフルオロ酢酸（ＣＦ３ＣＯＳＣ２Ｈ５）
１００μｌを入れ、そこに上記の小ガラスチューブを挿
入した。大ガラスチューブ全体を減圧後アルゴンガス
（Ａｒ）を入れて封入し、このガラスチューブを５０℃
で２４時間保持し、反応をすすめた。その後サンプルを
Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅ
ｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＭＡＬＤ
Ｉ）−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）−質量
分析計（ＭＳ）、窒素レーザー、２重マイクロチャネル
プレート検出器で分析した。（装置：Ｖｏｙａｇｅｒ
ｄｅｌａｙｅｄ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＲＰ ＴＯＦ
−ＭＳ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，ＭＡ，ＵＳＡ／ＶＳＬ−３３７ＮＤ：Ｌａｓｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；３３７ｎｍ；３ ｎｓ
ｅｃ ｐｕｌｓｅ ｌｅｎｇｔｈ／Ｇａｌｉｌｅｏ，Ｍ
Ａ，ＵＳＡ）
ＤＦ−ＮＨ２の５０ｐｍｏｌｅを小ガラスチューブ（６
×４０ｍｍ）に入れ、大ガラスチューブ（１３×１００
ｍｍ）に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ 社製
Ｓエチルトリフルオロ酢酸（ＣＦ３ＣＯＳＣ２Ｈ５）
１００μｌを入れ、そこに上記の小ガラスチューブを挿
入した。大ガラスチューブ全体を減圧後アルゴンガス
（Ａｒ）を入れて封入し、このガラスチューブを５０℃
で２４時間保持し、反応をすすめた。その後サンプルを
Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅ
ｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＭＡＬＤ
Ｉ）−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）−質量
分析計（ＭＳ）、窒素レーザー、２重マイクロチャネル
プレート検出器で分析した。（装置：Ｖｏｙａｇｅｒ
ｄｅｌａｙｅｄ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＲＰ ＴＯＦ
−ＭＳ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，ＭＡ，ＵＳＡ／ＶＳＬ−３３７ＮＤ：Ｌａｓｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；３３７ｎｍ；３ ｎｓ
ｅｃ ｐｕｌｓｅ ｌｅｎｇｔｈ／Ｇａｌｉｌｅｏ，Ｍ
Ａ，ＵＳＡ）
【００３７】イオンソース加速電圧は２０ｋＶとし、検
査モードはリニア、遅延抽出とした。試料は真空乾燥
後、２μｌの０．１％のトリフッ化酢酸に溶解させ、そ
の溶液１μｌを１μｌのつぎに示すマトリックス液と混
合した。そのマトリックス液は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ から入手した ｓｉｎａｐｉ
ｎｉｃ酸 １ｍｇ（あるいはアルファシアノ４−ヒドロ
キシシナミック酸 １ｍｇ）と１００μｌの０．１％の
トリフッ化酢酸、アセトニトリル混合液（体積比１：
１）との混合液である。その溶液１μｌを装置の試料板
に挿入し、溶媒は室温の空気中で除去した。
査モードはリニア、遅延抽出とした。試料は真空乾燥
後、２μｌの０．１％のトリフッ化酢酸に溶解させ、そ
の溶液１μｌを１μｌのつぎに示すマトリックス液と混
合した。そのマトリックス液は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ から入手した ｓｉｎａｐｉ
ｎｉｃ酸 １ｍｇ（あるいはアルファシアノ４−ヒドロ
キシシナミック酸 １ｍｇ）と１００μｌの０．１％の
トリフッ化酢酸、アセトニトリル混合液（体積比１：
１）との混合液である。その溶液１μｌを装置の試料板
に挿入し、溶媒は室温の空気中で除去した。
【００３８】質量分析の結果を図４に示す。図４から硫
酸化チロシン部分（ＨＳＯ３−Ｔｙｒ）の７５％の硫酸
部分（ＨＳＯ３）が脱離していることが確認できる。こ
のように、本発明技術によって、酵素を用いずに、簡便
に、蛋白質あるいはペプチドの硫酸化部位が特定できる
ことが確認できた。
酸化チロシン部分（ＨＳＯ３−Ｔｙｒ）の７５％の硫酸
部分（ＨＳＯ３）が脱離していることが確認できる。こ
のように、本発明技術によって、酵素を用いずに、簡便
に、蛋白質あるいはペプチドの硫酸化部位が特定できる
ことが確認できた。
【００３９】（第４の実施の形態）第４の実施の形態と
して、アスパラギンが糖修飾されたもの（Ａｓｎ Ｎ−
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のモデルペプチドとして
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）３）を用いて
以下に示すような反応を行なった。
して、アスパラギンが糖修飾されたもの（Ａｓｎ Ｎ−
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のモデルペプチドとして
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）３）を用いて
以下に示すような反応を行なった。
【００４０】減圧乾燥させたＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ（Ａｃ）３）の５０ｐｍｏｌｅを小ガラスチュー
ブ（６×４０ｍｍ）に入れ、大ガラスチューブ（１３×
１００ｍｍ）に、含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２
ＯまたはＮＨ２ＮＨ２・４Ｈ ２Ｏ）１００μｌを入れ、
そこに上記の小ガラスチューブを挿入した。大ガラスチ
ューブ全体を減圧後アルゴンガス（Ａｒ）を入れて封入
し、このガラスチューブを３０℃で４時間（または１６
時間）保持し、気相反応をすすめた。この反応は、液相
反応でも行うことができる。反応後サンプルを真空乾燥
させて、第３の実施の形態と同じく質量分析を行なった
ところ、図５に示すように１００％の糖の脱離が観測さ
れた。
ＮＡｃ（Ａｃ）３）の５０ｐｍｏｌｅを小ガラスチュー
ブ（６×４０ｍｍ）に入れ、大ガラスチューブ（１３×
１００ｍｍ）に、含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２
ＯまたはＮＨ２ＮＨ２・４Ｈ ２Ｏ）１００μｌを入れ、
そこに上記の小ガラスチューブを挿入した。大ガラスチ
ューブ全体を減圧後アルゴンガス（Ａｒ）を入れて封入
し、このガラスチューブを３０℃で４時間（または１６
時間）保持し、気相反応をすすめた。この反応は、液相
反応でも行うことができる。反応後サンプルを真空乾燥
させて、第３の実施の形態と同じく質量分析を行なった
ところ、図５に示すように１００％の糖の脱離が観測さ
れた。
【００４１】このように、本発明によって、酵素を用い
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドの糖化部位が特
定できる。
ずに、簡便に、蛋白質あるいはペプチドの糖化部位が特
定できる。
【００４２】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
リン酸化、硫酸化、糖化など蛋白質あるいはペプチドの
様々な修飾状態を検出できる蛋白質あるいはペプチドの
分析方法を提供することができる。
リン酸化、硫酸化、糖化など蛋白質あるいはペプチドの
様々な修飾状態を検出できる蛋白質あるいはペプチドの
分析方法を提供することができる。
【００４３】また、本発明によれば、それぞれ特定の修
飾アミノ酸を含むペプチド断片から化学的処理により修
飾基を脱離させ、質量分析等で決定することにより、修
飾蛋白質あるいはペプチドの高精度、効率的な解析が可
能になる蛋白質あるいはペプチドの分析方法を提供する
ことができる。
飾アミノ酸を含むペプチド断片から化学的処理により修
飾基を脱離させ、質量分析等で決定することにより、修
飾蛋白質あるいはペプチドの高精度、効率的な解析が可
能になる蛋白質あるいはペプチドの分析方法を提供する
ことができる。
【図１】蛋白質あるいはペプチドの修飾基、修飾部位を
特定する本発明の基本概念を示す一連のプロセスを示す
フロー図である。
特定する本発明の基本概念を示す一連のプロセスを示す
フロー図である。
【図２】第１の実施の形態を説明するための３０％リン
酸基（Ｈ２ＰＯ３）脱離結果を示す図である。
酸基（Ｈ２ＰＯ３）脱離結果を示す図である。
【図３】第２の実施の形態を説明するための１００％リ
ン酸基（Ｈ２ＰＯ３）脱離結果を示す図である。
ン酸基（Ｈ２ＰＯ３）脱離結果を示す図である。
【図４】第３の実施の形態を説明するための７５％硫酸
基（ＨＳＯ３）脱離結果を示す図である。
基（ＨＳＯ３）脱離結果を示す図である。
【図５】第４の実施の形態を説明するための１００％糖
修飾基［（ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）２）＋Ｈ］＋の脱離結
果を示す図である。
修飾基［（ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）２）＋Ｈ］＋の脱離結
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石田 一郎 東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株 式会社内 (72)発明者 次田 晧 東京都中央区日本橋本町三丁目３番４号 東京理化器械株式会社内 (72)発明者 鍋谷 卓司 東京都中央区日本橋本町三丁目３番４号 東京理化器械株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 DA20 DA36 DA80 FA12 FA40 FB20
Claims (9)
- 【請求項１】 蛋白質あるいはペプチドと酸との反応プ
ロセスを用いた分析方法であって、前記蛋白質あるいは
ペプチドを、化学式ＣｍＦ２ｍ＋１ＣＯＯＨ（但し、ｍ
は正の整数）で示される酸の内の少なくとも一種又は、
その誘導体，又はその水溶液と反応させることを特徴と
する蛋白質あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の蛋白質あるいはペプチド
の分析方法において、前記酸又はその水溶液は、ペンタ
フルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯＨ）、もしくは
ヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ７ＣＯＯＨ）もしくはペン
タフルオロプロピオン酸（Ｃ２Ｆ５ＣＯＯＨ）水溶液、
もしくはヘプタフルオロ酪酸（Ｃ３Ｆ ７ＣＯＯＨ）水溶
液であることを特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分
析方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の蛋白質あるいはペ
プチドの分析方法において、前記酸は、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）もしくはメルカプトエタノールを含むこ
とを特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項４】 請求項１乃至３の内のいずれかに一つに
記載の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前
記酸の水溶液濃度は０．１％から５％の範囲であること
を特徴とする蛋白質あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項５】 請求項１乃至４の内のいずれかに記載の
蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応温度
は７０℃から１００℃の範囲であることを特徴とする蛋
白質あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項６】 請求項１乃至５の内のいずれか一つに記
載の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応
時間が６時間から１６時間の範囲であることを特徴とす
る蛋白質あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項７】 請求項１乃至６の内のいずれか一つに記
載の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、反応
は液相あるいは気相反応であることを特徴とする蛋白質
あるいはペプチドの分析方法。 - 【請求項８】 請求項１乃至７の内のいずれか一つに記
載の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記
酸の誘導体として、Ｓエチルトリフルオロ酢酸（ＣＦ３
ＣＯＳＣ２Ｈ５）を用いたことを特徴とする蛋白質ある
いはペプチドの分析方法。 - 【請求項９】 請求項１乃至７の内のいずれか一つに記
載の蛋白質あるいはペプチドの分析方法において、前記
酸の水溶液として、前記ＣｍＦ２ｍ＋１ＣＯＯＨの代わ
りに含水ヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２・ｎＨ２Ｏ：ｎは整
数）を用いたことを特徴とする蛋白質あるいはペプチド
の分析方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001072042A JP2002267674A (ja) | 2001-03-14 | 2001-03-14 | 蛋白質あるいはペプチドの分析方法 |
| US10/097,010 US7112446B2 (en) | 2001-03-14 | 2002-03-14 | Method for analyzing protein or peptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001072042A JP2002267674A (ja) | 2001-03-14 | 2001-03-14 | 蛋白質あるいはペプチドの分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002267674A true JP2002267674A (ja) | 2002-09-18 |
Family
ID=18929679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001072042A Withdrawn JP2002267674A (ja) | 2001-03-14 | 2001-03-14 | 蛋白質あるいはペプチドの分析方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7112446B2 (ja) |
| JP (1) | JP2002267674A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100698466B1 (ko) | 2006-11-30 | 2007-03-21 | 한국정보통신대학교 산학협력단 | 질량 변화량 목록을 이용한 상향식 단백질 변형 탐색 방법및 프로그램 저장 매체 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4403908B2 (ja) * | 2004-07-27 | 2010-01-27 | 住友電気工業株式会社 | ペプチドまたはタンパク質のリン酸化解析装置、リン酸化判別プログラム及びそのプログラムの記録媒体 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5521097A (en) * | 1991-08-28 | 1996-05-28 | Seiko Instruments Inc. | Method of determining amino acid sequence of protein or peptide from carboxy-terminal |
| US5578452A (en) * | 1992-01-16 | 1996-11-26 | Biogenex Laboratories | Enhancement of immunochemical staining in aldehyde-fixed tissues |
| JP2879661B2 (ja) * | 1996-05-09 | 1999-04-05 | セイコーインスツルメンツ株式会社 | タンパク質あるいはペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 |
| US6818454B2 (en) * | 2001-02-16 | 2004-11-16 | Battelle Memorial Institute | Phosphoprotein binding agents and methods of their use |
-
2001
- 2001-03-14 JP JP2001072042A patent/JP2002267674A/ja not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-03-14 US US10/097,010 patent/US7112446B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100698466B1 (ko) | 2006-11-30 | 2007-03-21 | 한국정보통신대학교 산학협력단 | 질량 변화량 목록을 이용한 상향식 단백질 변형 탐색 방법및 프로그램 저장 매체 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7112446B2 (en) | 2006-09-26 |
| US20040014229A1 (en) | 2004-01-22 |
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|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
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