CN103608677A - 在单分子水平上在细胞环境中分析蛋白-蛋白相互作用的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法和装置。本发明通过以下步骤的方法实现：提供第一蛋白于第一基片，在该基片上，生物分子筛与第一蛋白上的第一标记结合，从而诱导生物分子筛与第一蛋白上的第一标记的结合；在生物分子筛与第一标记结合后，提供含有第二标记第二蛋白的细胞的胞液于该基片；在将胞液提供给所述基片的同时，分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。通过本发明的方法，甚至能够在细胞的实际环境中在单分子水平上分析蛋白-蛋白之间的相互作用。

Description

在单分子水平上在细胞环境中分析蛋白-蛋白相互作用的方法和装置
技术领域
本发明涉及一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法。更具体讲，本发明涉及一种用于在正常细胞内环境条件下在单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用，以及在实际细胞内环境条件下分析不同蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度的方法和装置。
背景技术
细胞通过完成多种生物学功能而维持生命现象，如基因表达，细胞生长，细胞周期，代谢作用和通过多样的和复杂的蛋白-蛋白相互作用介导的信号转导等。因此，了解所述细胞内蛋白-蛋白相互作用的性质和功能一直是我们理解基本细胞过程的重要基础，并且，还在我们开发新药和治疗疾病的能力方面发挥了重要作用。
一种在体外研究蛋白-蛋白相互作用的典型方法是亲和层析法。
对于蛋白质亲和层析法来说，蛋白要经过严格而且复杂的纯化处理。不利的是，由于上述蛋白间的相互作用只进行了体外评估，该方法可能产生假阳性结果。例如，蛋白在通过层析柱时可能通过静电相互作用而结合。
为了进行定量测量，按照常规技术分析蛋白-蛋白相互作用的方法是在分离条件下分析所述相互作用的。换言之，所研究的蛋白的相互作用是在没有其他细胞内物质的条件下评估的，包括从细胞环境中分离并纯化每一种蛋白，并且分析所述蛋白-蛋白相互作用。不利的是，所述常规技术限制或妨碍了在所述正常细胞内环境条件下（例如，在存在其他蛋白等的条件下），在单分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用的能力.
另外，按照常规技术研究蛋白-蛋白相互作用的方法还具有不能在实际细胞内环境条件下评估其他蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度的缺陷。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种用于分析蛋白-蛋白相互作用的方法和装置，所述方法和装置能够在所述正常细胞内环境条件下，在单分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用。另外，本发明的另一个目的是当不同蛋白出现在正常细胞内环境中时，评估不同蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度。
技术方案
因此，本发明的一个典型实施方案提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一标记物标记的，所述第一标记物与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；（b）使用含有由第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；和（c）在细胞溶胞产物中，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，第一蛋白与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；（b）使用含有由第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；和（c）在细胞溶胞产物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
根据一种优选实施方案，步骤（c）包括使用产生近场的光学设备测量具有特定波长的荧光信号，所述的具有特定波长的荧光信号由包含在与所述第一蛋白结合的第二蛋白中的标记物所产生。优选地，在步骤（c）中，所述具有特定波长的荧光信号是在预定时段内累加测量的。优选地，在步骤（c）中，所述具有特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量的。
优选地，步骤（a）包括提供包含第一蛋白的细胞溶胞产物.
优选地，所述方法还包括在所述步骤（b）之前给所述基片提供缓冲液。
优选地，所述第一标记物和所述第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一标记物标记的，所述标记物与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；（c）在细胞溶胞产物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第一分析值；（d）使用来自步骤（b）的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物组成的细胞溶胞产物混合物孵育来自步骤（a）的与基片结合的第一蛋白；（e）然后在来自细胞溶胞产物混合物的其他蛋白存在的条件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第二分析值；和（f）比较和分析所述第一和第二分析值。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；（c）分析所述第一蛋白和所述细胞溶胞产物中的第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第一分析值；（d）使用来自所述步骤（b）的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物组成的细胞溶胞产物混合物孵育来自步骤（a）的与所述基片结合的第一蛋白；（e）然后在来自细胞溶胞产物混合物的其他蛋白存在的条件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第二分析值；和（f）比较和分析所述第一和第二分析值。
优选地，所述步骤（c）包括当第二蛋白与所述第一蛋白结合时，使用生成近场的光学设备，测量由标记所述第二蛋白的第二标记物生成的具有特定波长的荧光信号。
优选地，在所述步骤（c）中，所述具有特定波长的荧光信号是在预定时段内累加测量的。
优选地，在所述步骤（c）中，所述具有特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量的。
优选地，所述步骤（a）包括提供包含所述第一蛋白的细胞溶胞产物。
优选地，所述方法还包括在所述步骤（b）之前给所述基片提供缓冲液。
优选地，所述第一标记物和所述第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的装置，包括：一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子与标记第一蛋白的第一标记物特异性结合，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，以便诱导所述生物分子和所述第一标记物结合，然后将含有所述第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；以及一个光学测量元件，用于检测随着细胞溶胞产物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的装置，包括：一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子与所述第一蛋白特异性结合，其中，提供第一蛋白给所述基片，并且与所述生物分子结合，然后将含有第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；以及一个光学测量元件，用于检测随着细胞溶胞产物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化。.
根据一种优选实施方案，所述光学测量元件在预定时段内累加测量具有第二波长的荧光信号。
优选地，所述光学测量元件在所述细胞溶胞产物存在的条件下实时测量所述具有第二波长的荧光信号。
优选地，所述第一标记物和所述第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
优选地，所述装置还包括一个信号分析元件，用于分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的装置，包括：一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子与标记所述第一蛋白的第一标记物特异性结合，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，以便诱导所述生物分子和所述第一标记物结合，然后将含有所述第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；一个光学测量元件，用于检测随着细胞溶胞产物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化；以及一个信号分析元件，用于通过分析具有第二波长的荧光信号获得表示所述相互作用的动态图像的第一分析值，所述的具有第二波长的荧光信号由所述光学测量元件通过图像处理测量的；其中，一个包括与其结合的生物分子的新基片被加载在所述样品加载元件上，所述生物分子与标记所述加载于加载元件上的第一蛋白的第一标记物特异性结合，然后将包含由所述第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物构成的细胞溶胞产物混合物提供给所述新基片，以便随着提供给所述新基片的细胞溶胞产物混合物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，由所述光学测量元件检测在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化，接着信号分析元件通过分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号获得第二分析值。
根据本发明的另一方面，提供了一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的装置，包括：一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子与第一蛋白特异性结合，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，并且与所述生物分子结合，然后将含有第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；一个光学测量元件，用于检测随着所述细胞溶胞产物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化；以及一个信号分析元件，通过分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号获得第二分析值；其中，一个包括与其结合的生物分子的新基片被加载在所述样品加载元件上，所述生物分子与标记加载于加载元件上的所述第一蛋白的第一标记物特异性结合，然后将包含由第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物构成的细胞溶胞产物混合物提供给所述新基片，以便随着提供给所述新基片的细胞溶胞产物混合物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，由所述光学测量元件检测所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化，并且所述信号分析元件通过分析由所述光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号获得第二分析值。
根据一种优选实施方案，所述装置还包括一个信号诊断元件，用于比较和分析所述第一分析值和所述第二分析值。
优选地，所述光学测量元件在预定时段内累加测量所述具有第二波长的荧光信号。
优选地，所述光学测量元件在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量。
优选地，所述第一标记物和第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
有益效果
根据本发明，可以在正常细胞内环境的条件下，在单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用，还可以在实际细胞内环境条件下分析不同蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度。
附图说明
通过结合附图对本发明的典型实施方案进行详细说明，本领域普通技术人员可以理解本发明的上述及其他目的、特征和优点，其中：
图1表示根据本发明的一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图；
图2-图4表示根据本发明的一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的每一个步骤的示意图；
图5表示根据本发明的另一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图；
图6表示实施图1-图5所示分析蛋白-蛋白相互作用的方法的装置的典型结构的功能块图；和
图7表示通过根据本发明的一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的装置的一个光学测量元件测量信号的示意图。
具体实施方式
实施例
在下文中，将详细说明本发明的典型实施方案。不过，本发明不局限于下面披露的实施方案，而是能够以各种方式实施。披露以下的实施方案，以便本领域普通技术人员能够体现并且实现本发明。
参见附图，下面详细说明本发明的典型实施方案。为了便于理解本发明，在对所有的附图进行说明时，类似的附图标记表示类似的部件，并且，对相同部件的说明不再赘述。
图1是说明根据本发明的一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的程序框图。参见图1，在相关细胞中，分析者通过遗传学操作在所述第一蛋白（即具有第一标记物的第一蛋白）上实施第一荧光蛋白标记，即第一蛋白的标记物的表达，以便在在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用（S110）。根据本发明的一个典型实施方案，所述第一荧光蛋白可以通过物理化学方法结合（attached）或连接（connected）在所述第一蛋白上。
根据本发明的一个典型实施方案，所述第一蛋白是h-Ras蛋白，所述第二蛋白是C-Raf的Ras-结合结构域（RBD）蛋白，而所述第一荧光蛋白是m-Cherry蛋白。
随后，分析者将第一荧光蛋白-结合抗体结合在在基片上，所述的第一荧光蛋白-结合抗体将与作为上述步骤S110中所述的第一蛋白的标记物的第一荧光蛋白结合，所述基片是用聚乙二醇（PEG）涂覆的石英载片，如图2所示（S120）。
根据本发明的一个典型实施方案，与所述第一荧光蛋白结合的、具有能与蛋白相结合的特殊结构的生物分子，如DNA，RNA，脂质体等也可以用作抗体的替代物。
然后，分析者通过将在上述步骤S110中制备的细胞的胞质溶胞产物提供给所述基片（S130），以诱导所述第一荧光蛋白-结合抗体和所述第一荧光蛋白标记——第一标记物，在第一蛋白上相结合（S140），其中，在所述细胞的胞质溶胞产物中，所述第一荧光蛋白被标记在所述第一蛋白上。
同时，按照上述步骤S130，除了所述细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，例如，细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物和稀释的细胞溶解液等。
如图3所示，分析者通过使用全内反射荧光显微镜观察基片表面，根据当第一荧光蛋白与结合在所述基片上的第一荧光蛋白-结合抗体结合时，由第一荧光蛋白所发射出的波长的变化（即，测量由所述第一荧光蛋白产生的独特的单分子信号），能够证实所述第一荧光蛋白是否与多个结合在所述基片上的第一荧光蛋白-结合抗体结合。
根据本发明的一个典型实施方案，位于与抗体结合的第一蛋白上的蛋白标记物，即第一标记物不一定总是荧光蛋白，不过，所述第一蛋白上的蛋白标记物可以优选荧光蛋白，因为当其不是荧光蛋白时，就不能通过所述全内反射荧光显微镜证实其是否与抗体结合。
换言之，根据本发明，第一蛋白上的预定的蛋白标记，即第一标记物，起着抗原作用，与结合在所述基片上的抗体结合。因此，结合在上述第一蛋白上的第一标记物，预定的抗原，甚至不一定是蛋白，相反，它们也可以是能与抗体结合的化合物。
就是说，由于当第一蛋白上的蛋白标记是荧光蛋白时，其是否与抗体结合，能够用全内反射荧光显微镜来加以证实，因此，可以精确测量与结合在所述基片上的抗体结合的荧光蛋白数量及其结合密度。
一旦第一荧光蛋白分别与结合在所述基片上的多个第一荧光蛋白-结合抗体结合，分析者通过将缓冲液提供给所述基片，从基片上除去除了用第一荧光蛋白标记的第一蛋白之外的细胞质溶胞产物所包含的其余物质（S150）。
随后，分析者通过对第二蛋白的遗传学操作，以上述步骤S110中使用的同一类型细胞中的相关细胞实施第二荧光蛋白标记，即所述第二蛋白的标记物，在第二蛋白（即具有第二标记物的第二蛋白）上的表达（S160）。根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光蛋白可以通过物理化学方法结合或连接在所述第二蛋白上。在本发明的一个实施方案中，所述第二标记物发射与所述第一标记物不同波长的荧光。
上述步骤S160可以提前随着上述步骤S110一起实施，以便使分析顺畅、连续。根据本发明的一个典型实施方案，由于第二荧光蛋白优选具有不同于第一荧光蛋白的波长范围，当所述第一荧光蛋白为m-Cherry蛋白时，所述第二荧光蛋白可以选择增强型绿色荧光蛋白（eGFP），它属于一种绿色荧光蛋白。
分析者将上述步骤S160的含有第二蛋白上表达的第二荧光蛋白标记的全细胞质溶胞产物提供给所述基片（S170）。
上述步骤S170中，除了所述细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物和稀释的细胞溶解液等。
所述第一蛋白分别通过第一荧光蛋白与结合在所述基片表面的多个第一荧光蛋白-结合抗体结合。当含有所述第二蛋白的全细胞质溶胞产物被提供给上述基片的表面时，基片表面上的第一蛋白在与细胞内环境相同的条件下，其中细胞质溶胞产物中包含的第二蛋白与全细胞溶胞产物中的天然蛋白共存时，与第二蛋白相互作用。
更具体讲，如图4所示，通过第一荧光蛋白与每一个结合在基片表面上的抗体结合的每一个第一蛋白，可以在单分子水平上，在细胞内进行的反复结合和解开的相同环境条件下，与第二蛋白反复地结合和解开。
如图4所示，当在所述第一蛋白和所述第二蛋白之间，在单分子水平上发生结合时，分析者通过能生成近场的光学设备，如波长为473nm的全内反射荧光显微镜观察基片的表面，能够证实由于eGFP，即所述第二蛋白上的第二荧光蛋白标记的作用，基片的表面的波长从473nm变化到520nm。
换言之，通过检查由于第一蛋白和第二蛋白的结合，其靠近基片表面的所述第二荧光蛋白（eGFP）所产生的特定波长带宽（520nm）的荧光信号，能够可证实第一蛋白和第二蛋白之间的结合/解开状态，然后，分析者在单分子水平上通过持续观察基片上每一个结合/解开位置上波长的变化，能够对这种相互作用进行分析，例如第一蛋白和第二蛋白之间的结合和解开的频率等（S180）。
另外，所述相互作用，如第一蛋白和第二蛋白之间的结合和解开的频率等，，通过在存在上述步骤S170中提供给所述基片的细胞质溶胞产物的条件下，实时测定具有特定波长的荧光信号，可以在相当于正常细胞内条件的环境下进行分析。
在提供给所述基片的细胞质溶胞产物中漂浮和移动的过程中，没有与所述第一蛋白结合的第二蛋白可能移动到更接近基片的表面。因此，在通过所述全内反射荧光显微镜观察所述表面时，这可能由于eGFP，即，所述第二蛋白上的第二荧光蛋白标记，导致基片表面的波长从473nm改变到520nm，从而在蛋白-蛋白相互作用的分析中引入误差。
因此，根据本发明的一个实施方案，当波长的变化是通过全内反射荧光显微镜在基片的表面测量时，波长的变化优选是在预定时段内累加测量的。
由于漂浮在细胞质溶胞产物中的没有与所述第一蛋白结合的第二蛋白运动速度非常快，所以尽管所述第二蛋白在漂浮和移动中暂时的移动到接近基片的表面的位置，但是它们又会在累加测量期间再次离开基片的表面。
为了证实以上假设，通过实验证实了当波长变化是在，例如50毫秒的整段时间内在基片的表面累加测量时，波长并没有改变。这里，例如使用不相互结合的突变蛋白，所述细胞质溶胞产物中的所有第二蛋白都是漂浮和移动的而没有与第一蛋白结合。
根据本发明的一个典型实施方案，上述步骤S180中，分析蛋白-蛋白相互作用的值被设定为第一分析值，而在以下的不同环境中的分析的蛋白-蛋白相互作用的值被设定为第二分析值，这样可以对两个值进行比较分析。
就是说，在将上述步骤S180中分析所述相互作用的值设定为第一分析值之后，分析者同样重复上述S110-S160。
为了实施上述步骤S170，分析者将来自，例如肿瘤细胞等的细胞质溶胞产物与不含上述步骤S160中所述第二荧光蛋白标记的第二蛋白的相关细胞的细胞质溶胞产物的混合物提供给所述基片（S190）。
为了实施上述步骤S190，除了所述混合的细胞质溶胞产物之外，还可以使用混合的细胞溶胞产物，如混合的细胞溶解液，稀释的混合的细胞质溶胞产物，稀释的混合的细胞溶解液等。
第一蛋白通过第一荧光蛋白分别与结合在基片表面上的多个第一荧光蛋白-结合抗体结合。当所研究的细胞质溶胞产物和包括所述第二蛋白的细胞质溶胞产物的混合物被提供给所述基片的表面时，会使得所述基片表面上的第一蛋白不仅与所述细胞质溶胞产物中的第二荧光蛋白标记的第二蛋白相互作用，而且还会与全细胞溶胞产物中共存的未标记的第二蛋白和天然蛋白相互作用。
换言之，与上述步骤S180不同，用第二荧光蛋白标记的第二蛋白与正进行研究的细胞溶胞产物中共存的未以第二荧光蛋白标记的第二蛋白，在与所述基片表面上的第一蛋白相互作用上展开竞争。另外，所述第二荧光蛋白标记的第二蛋白与第一蛋白的相互作用，会受到正进行研究的细胞中的其他蛋白的影响。
上述进行研究的细胞中的第二蛋白或该进行研究的细胞中的其他蛋白所产生的影响其程度，可以通过分析所述相互作用证实，如与上述步骤S180类似，由分析者通过使用生成近场的光学设备，如全内反射荧光显微镜等观察基片的表面，分析用第二荧光蛋白标记的第二蛋白和所述基片表面上的所述第一蛋白结合和解开的频率（S195）。
更具体讲，分析者可以通过比较和分析所述第二分析值，即上述步骤S195中用于分析的值，和上述第一分析值来分析其他细胞中的第二蛋白以及其他细胞中的其他蛋白对于第二蛋白和第一蛋白之间的相互作用的促进或抑制作用的程度。
图5是根据本发明的另一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图。如图5所示，通过将第一蛋白-结合抗体，而并非第一荧光蛋白-结合抗体结合在基片上，并且也就不在所述第一蛋白上表达第一荧光蛋白，从而在所述第一蛋白与结合在所述基片上的抗体直接结合的状态下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用。
参见图5，根据本发明的另一个典型实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，分析者将准备与第一蛋白结合的第一荧光蛋白-结合抗体结合在一个基片上，该基片是用聚乙二醇（PEG）涂覆的石英载片，以便在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，这两种蛋白的相互作用是特异性的（S210）。
根据本发明的一个典型实施方案，与第一荧光蛋白结合的具有能结合蛋白的特殊结构的生物分子，如DNA，RNA，脂质体等，也可用作所述抗体的替代物。随后，分析者将包含第一蛋白的细胞质溶胞产物（S220）提供给所述基片，诱导所述第一蛋白和所述第一蛋白-结合抗体之间的结合（S230）。
为了实施上述步骤S220，除了细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物，稀释的细胞溶解液等。
根据本发明的另一个典型实施方案，分析者可以进行预处理，以便在第一蛋白上表达预定的荧光蛋白标记，如m-Cherry。在这种情况下，当所述第一蛋白-结合抗体与所述第一蛋白结合时，分析者可以利用全内反射荧光显微镜观察基片的表面，根据由第一蛋白上的第一荧光蛋白标记所产生的波长的变化，证实所述第一蛋白是否与结合在所述基片上的多个第一蛋白-结合抗体结合。
然后，分析者通过将缓冲液提供给所述基片，从所述基片上除去细胞质溶胞产物所包含的除了第一蛋白之外的其余物质（S240）。随后，分析者通过在与上述细胞同一类型的不同细胞中对第二蛋白进行遗传学操作，操纵所述细胞表达荧光蛋白标记的第二蛋白（S250）。
上述步骤S250，可以在上述步骤S210之前实施，以便所述分析顺畅、连续。根据本发明的荧光优选实施方案，在所述第二蛋白上表达的荧光蛋白可以是eGFP。
随后，分析者将具有在第二蛋白上表达的荧光蛋白标记的细胞的全细胞质溶胞产物提供给所述基片（S260）。
为了实施上述步骤S260，除了细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物，稀释的细胞溶解液等。
多个结合在基片表面上的第一蛋白-结合抗体分别与第一蛋白结合。当包括第二蛋白的全细胞质溶胞产物被提供给上述基片的表面时，所述基片表面上的第一蛋白与包含在细胞质溶胞产物中的第二蛋白在与细胞内环境相同的条件下相互作用。
换言之，与结合在基片表面的抗体结合的第一蛋白各自在与正常细胞内环境相同的条件下与第二蛋白相互作用，正如它们在细胞中所进行的一样，在单分子水平上反复结合和解开。
当第一蛋白在单分子水平上与第二蛋白结合时，由于第二蛋白上的荧光蛋白标记，即eGFPs的作用，基片表面的波长从473nm变化到520nm；然后，分析者可以利用全内反射荧光显微镜观察基片的表面，根据上述波长变化，证实所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合状态，并对这种相互作用进行分析，例如通过连续观察结合在所述基片表面的每一个抗体波长的变化，分析第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合和解开的频率等（S270）。
另外，为了实施如图5所示的根据本发明的另一个实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，上述步骤S270中分析蛋白-蛋白相互作用的值被设定为第一分析值，在随后的不同环境中分析蛋白-蛋白相互作用的值被设定为第二分析值，然后对着两个值进行比较和分析。
换言之，将上述步骤S270中分析所述相互作用的值设定为第一分析值之后，分析者同样且反复地实施上述步骤S210-S250。
为了实施上述步骤，分析者提供了一种细胞质溶胞产物混合物，包括例如来自肿瘤细胞等的细胞质溶胞产物，以及上述步骤S260中的不含第二荧光蛋白标记的第二蛋白的相关细胞的细胞质溶胞产物的混合物（S280）。
为了实施上述步骤S280，除了混合的细胞质溶胞产物之外，还可以使用混合的细胞溶胞产物，如混合的细胞溶解液，稀释的混合的细胞质溶胞产物，稀释的混合的细胞溶解液等。
第一蛋白通过第一荧光蛋白分别与结合在基片表面上的多个第一荧光蛋白-结合抗体结合。当所研究的细胞质溶胞产物和包括所述第二蛋白的细胞质溶胞产物的混合物被提供给所述基片的表面时，会使得所述基片表面上的所述第一蛋白不仅与所述细胞质溶胞产物中的第二荧光蛋白标记的第二蛋白相互作用，而且还会与所述全细胞溶胞产物中共存的未标记的第二蛋白和天然蛋白相互作用。
换言之，与上述步骤S270不同，所述用第二荧光蛋白标记的第二蛋白，与所研究的细胞溶胞产物中共存的没有第二荧光蛋白标记的第二蛋白，在与基片表面上的所述第一蛋白的相互作用上展开竞争。另外，所述第二荧光蛋白标记的第二蛋白与所述第一蛋白的相互作用，受到所研究的细胞中的其他蛋白的影响。
上述所研究的细胞中的第二蛋白或所研究的细胞中的其他蛋白产生的影响程度，可以通过分析所述相互作用来证实，如与上述步骤S180类似，由分析者使用生成近场的光学设备，如全内反射荧光显微镜等观察基片的表面，分析用第二荧光蛋白标记的第二蛋白和所述基片表面上的所述第一蛋白结合和解开的频率（S290）。
更具体讲，分析者可以通过比较和分析第二分析值，即上述步骤S290中用于分析的值，和上述第一分析值，分析其他细胞中的其他蛋白和第二蛋白对所述第二蛋白和所述第一蛋白之间的相互作用，例如促进或抑制作用的影响程度。
同时，如图1-图5所示的根据本发明的分析蛋白-蛋白相互作用的方法，可以通过具有如图6所示结构的分析装置实施。
参见图6，根据本发明的一个典型实施方案，用于分析蛋白-蛋白相互作用的分析装置300包括一个光激发元件320，一个样品加载元件310，一个光学测量元件330，一个信号分析元件340，一个信号诊断元件360，和一个存储元件350。
首先，用于上述本发明的分析蛋白-蛋白相互作用的方法中的基片被加载在所述样品加载元件310上。光激发元件320在加载在所述样品加载元件310上的基片的表面产生具有第一波长的近场。
在将混合的细胞质溶胞产物或细胞质溶胞产物提供给所述基片后，光学测量元件330检测随着具有所述荧光蛋白的所述第二蛋白和结合在所述基片表面的所述第一蛋白之间的相互作用，在基片的表面发生的从所述第一波长到所述第二波长的波长变化。
根据本发明的一个实施方案，当第二蛋白具有的荧光蛋白是eGFP时，第一波长将为473nm，而第二波长将为520nm。
另外，光学测量元件330能够在预定时段内累加测量具有第二波长的荧光信号；还能够在所述基片上存在细胞质溶胞产物或混合的细胞质溶胞产物的条件下，实时测量具有第二波长的荧光信号；并且可以优选其对于以上测量具有单分子灵敏度。
同时，信号分析元件340分析由光学测量元件330通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号，以便计算一个分析值，然后将计算的分析值保存在存储元件350中。
另外，信号分析元件340，对根据光学测量元件330在各种情况下测量的第二波长的荧光信号，进行分别计算所得的值进行分析，所述各种情况包括将各种细胞质溶胞产物，如细胞质溶胞产物，混合的细胞质溶胞产物等不同物质提供给所述基片。然后，信号分析元件340将所述值保存在存储元件350中。
具体讲，如图7所示，信号分析元件340在由光学测量元件330测定的多个荧光信号中找到了用红色标记的信号基线。
所述信号基线在10-20秒之间升高，这意味着包括第二蛋白的细胞质溶胞产物或混合的细胞质溶胞产物到达了光学测量元件330的成像区。
同时，信号分析元件340测量在升高的信号基线周围产生的波动（例如，噪声），然后，根据所述噪声设定一个界定有意义的蛋白-蛋白相互作用阈值。
信号基线周围产生的噪声，可能是由那些没有与蛋白相互作用的第二蛋白在周围连续并且快速地运动所形成的，信号分析元件340将所述基线设定为不管上述相互作用如何，都不会被所述噪声超过的值。
当存在超过所述基线的信号时，信号分析元件340判断在相关的点上存在有意义的第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，测定所述相互作用的持续时间（τoff）和形成随后的所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合所需要的时间（τon），然后将上述值作为分析值保存在存储元件350中。
可以对信号分析元件340获得的相互作用的持续时间（τoff）和形成随后的第一蛋白和第二蛋白之间的结合所需要的时间（τon）进行分析，以便获得有关所述蛋白-蛋白相互作用的一系列数据。用信号诊断元件360比较和分析在将不同的细胞质溶胞产物提供给所述基片的每一种条件下计算的分析值，然后基于所述比较和分析的结果，根据预定的诊断算法，进行每一种细胞质条件的生物学和医学诊断的功能推测。
根据本发明，实际细胞内环境中的蛋白-蛋白相互作用可以在单分子水平上进行分析。
另外，根据本发明，当其他蛋白包含在相当于所述正常细胞内环境的细胞溶胞产物中时，可以分析其他蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度。
尽管业已结合某些典型实施方案对本发明进行了图解和说明，本领域技术人员可以理解的是，在不脱离由权利要求书限定的本发明的构思和范围的前提下，可以对公开的形式和细节做出各种改变。
工业应用性
本发明可用于医药工业。

Claims (28)

1.一种在单分子水平上分析蛋白相互作用的方法，包括：
（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一标记物标记的，所述第一标记物与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；
（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；
（c）在细胞溶胞产物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
2.一种在单分子水平上分析蛋白的方法，包括：
（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；
（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；
（c）在细胞溶胞产物中，分析所述第一蛋白和第二蛋白的相互作用。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤（c）包括当第二蛋白与第一蛋白结合时，使用生成近场的光学设备测量由标记第二蛋白的第二标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
4.如权利要求3所述的方法，在步骤（c）中，其中，所述具有所述特定波长的荧光信号是在预定的时段内累加测量的。
5.如权利要求3所述的方法，在步骤（c）中，其中，所述具有所述特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物中实时测量的。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤（a）包括孵育包含所述第一蛋白的细胞溶胞产物。
7.如权利要求6所述的方法，还包括在所述步骤（b）之前将所述基片用一种缓冲液孵育。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一标记物和第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
9.一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：
（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白是用第一标记物标记的，所述第一标记物与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；
（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；
（c）分析在细胞溶胞产物中，所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第一分析值；
（d）使用含有来自步骤（b）的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物的细胞溶胞产物混合物孵育来自步骤（a）的与所述基片结合的第一蛋白；
（e）在来自所述细胞溶胞产物混合物的其他蛋白存在的条件下，分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第二分析值；和
（f）比较和分析所述第一和第二分析值。
10.一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：
（a）将第一蛋白结合在基片上，其中，所述第一蛋白与固定在所述基片上的生物分子特异性结合；
（b）使用含有用第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物孵育与所述基片结合的第一蛋白；
（c）分析在细胞溶胞产物中，第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第一分析值；
（d）使用含有来自步骤（b）的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物的细胞溶胞产物混合物孵育来自步骤（a）的与所述基片结合的第一蛋白；
（e）在来自所述细胞溶胞产物混合物的其他蛋白存在的条件下分析所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，并且获得表示所述相互作用的动态图像的第二分析值；和
（f）比较和分析所述第一和第二分析值。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中，步骤（c）包括当第二蛋白与第一蛋白结合时，使用生成近场的光学设备测量由标记所述第二蛋白的第二标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
12.如权利要求11所述的方法，其中，在步骤（c）中，所述具有特定波长的荧光信号是在预定时段内累加测量的。
13.如权利要求11所述的方法，其中，在步骤（c）中，所述具特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量的。
14.如权利要求9或10所述的方法，其中，所述步骤（a）包括培养所述包含第一蛋白的细胞溶胞产物。
15.如权利要求14所述的方法，还包括在步骤（b）之前将所述基片用一种缓冲液孵育。
16.如权利要求9所述的方法，其中，所述第一标记物和第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
17.一种用于分析蛋白相互作用的装置，包括：
一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子特异性结合标记所述第一蛋白的第一标记物，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，以便诱导所述生物分子和所述第一标记物结合，然后将含有所述第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；
一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；和
一个光学测量元件，用于检测随着细胞溶胞产物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化。
18.一种在单分子水平上分析蛋白相互作用的装置，包括：
一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括结合的生物分子，所述生物分子特异性结合所述第一蛋白，其中，所述第一蛋白被提供给所述基片，并且与所述生物分子结合，并且将含有所述第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；
一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；和
一个光学测量元件，用于检测随着所述细胞溶胞产物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上产生的从第一波长到第二波长的变化。
19.如权利要求17或18所述的装置，其中，所述光学测量元件在预定时段内累加测量具有第二波长的荧光信号。
20.如权利要求17或18所述的装置，其中，所述光学测量元件在细胞溶胞产物存在的条件下实时测量具有第二波长的荧光信号。
21.如权利要求17所述的装置，其中，所述第一标记物和第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
22.如权利要求17或18所述的装置，还包括一个信号分析元件，用于分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号。
23.一种用于分析蛋白相互作用的装置，包括：
一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子特异性结合标记第一蛋白的第一标记物，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，以便诱导所述生物分子和所述第一标记物结合，然后将含有第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；
一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；和
一个光学测量元件，用于检测随着所述细胞溶胞产物中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上发生的从第一波长到第二波长的变化；
一个信号分析元件，通过分析具有第二波长的荧光信号，获得表示相互作用的动态图像的第一分析值，其中，具有第二波长的荧光信号由光学测量元件通过图像处理测量的；
其中，一个包括与其结合的生物分子的新基片被加载在所述样品加载元件上，所述生物分子与标记第一蛋白的第一标记物特异性结合，和
含有由第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物的细胞溶胞产物混合物被提供给所述新基片，
由此随着提供给所述新基片的细胞溶胞产物混合物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，所述光学测量元件检测在所述基片表面上发生的从所述第一波长到所述第二波长的变化，和
所述信号分析元件通过分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号获得第二分析值。
24.一种在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的装置，包括：
一个用于加载基片的样品加载元件，所述基片包括与其结合的生物分子，所述生物分子特异性结合第一蛋白，其中，提供所述第一蛋白给所述基片，并且与所述生物分子结合，然后将含有第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片；
一个光激发元件，用于在加载在所述样品加载元件上的基片表面产生具有第一波长的近场；和
一个光学测量元件，用于检测随着细胞溶胞产物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，在所述基片表面上发生的从第一波长到第二波长的变化；
一个信号分析元件，通过分析具有第二波长的荧光信号获得表示相互作用的动态图像的第一分析值，其中，具有第二波长的荧光信号由所述光学测量元件通过图像处理测量的；
其中，一个包括与其结合的生物分子的新基片被加载在所述样品加载元件上，所述生物分子特异性的与标记所述第一蛋白的第一标记物结合，和
包含由第二标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物和具有其他蛋白的另一种细胞溶胞产物的细胞溶胞产物混合物被提供给所述新基片，
由此，随着提供给所述新基片的细胞溶胞产物混合物中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，由所述光学测量元件检测所述基片表面上发生的从所述第一波长到所述第二波长的变化，和
所述信号分析元件通过分析由光学测量元件通过图像处理测量的具有第二波长的荧光信号获得第二分析值。
25.如权利要求23或24所述的装置，还包括一个信号诊断元件，用于比较和分析所述第一分析值和所述第二分析值。
26.如权利要求23或24所述的装置，其中，所述光学测量元件在预定时段内累加测量所述具有第二波长的荧光信号。
27.如权利要求23或24所述的装置，其中，所述光学测量元件在所述细胞溶胞产物存在的条件下实时测量。
28.如权利要求23所述的装置，其中，所述第一标记物和第二标记物是具有不同波长的荧光蛋白。
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