KR100567768B1

KR100567768B1 - 시료 중 재조합 단백질의 농도를 정량적으로 측정 가능한 바이오칩과 그를 이용한 측정 방법

Info

Publication number: KR100567768B1
Application number: KR1020030061626A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 신용범; 김민곤; 정진미; 노현수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-09-04
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2006-04-05
Also published as: KR20050024783A

Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 정량할 수 있는 바이오칩, 이를 이용한 재조합 단백질의 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로 금속 박막이 증착되어 있는 유리기판을 포함하는 SPR 바이오칩에 있어서, 재조합 단백질에 친화성을 가지는 물질이 상기 금속 박막상에 고정화되어 친화성 센서를 형성하고, 상기 친화성 센서 상에 마이크로어레이 형태로 점적된 상기 재조합 단백질과 결합정도를 측정함으로써 상기 재조합 단백질의 발현정도를 표지없이 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 정량용 SPR 바이오칩, 상기 바이오칩, 발광부 및 수광부를 포함하는 재조합 단백질의 농도 측정장치 및 상기 측정장치를 이용한 재조합 단백질의 농도의 측정방법에 관한 것이다. 본 발명의 측정장치는 바이오칩의 센서 표면에 재조합 단백질과 선택적으로 결합하는 물질이 고정화되어 있는 친화성 센서 표면을 형성하고 상기 친화성 센서 표면에 재조합 단백질을 마이크로어레이 형태로 2차원 배열로 결합시킴으로써, 수십 내지 수천 개의 재조합 단백질의 발현정도를 동시에 분석할 수 있다.

재조합 단백질, 초고속 측정장치, 바이오칩, 마이크로어레이

Description

시료 중 재조합 단백질의 농도를 정량적으로 측정 가능한 바이오칩과 그를 이용한 측정 방법{Biochip capable of quantitative analysis of recombinant protein in samples and method for quantitative analysis using the same}

도 1은 발현된 재조합 단백질의 분석에 사용되는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resoanace; SPR) 이미지 센서 측정장치 구조의 개략을 나타낸 단면도이고,

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10: 유전 매체(dielectric medium),

20: 굴절률 매칭 오일(index matching oil),

21: 유리기판, 22: 금속박막,

23: 시료, 30: 입사광원(light source),

40: 수광부(Photodetector), 50: 회전장치,

60: 광학필터, 70: 렌즈

도 2는 시료(23)가 물 또는 물보다 굴절률이 0.001 더 큰 임의의 용액일 경우, 도 1의 장치로 측정된 각도에 대한 반사율 변화를 나타낸 그래프이고,

도 3은 히스티딘이 태그된 인간 성장 호르몬의 발현을 전기영동으로 나타낸 사진이고,

레인 1: 단백질 크기 마커,

레인 2: 형질전환되지 않은 BL21(DE3) 숙주세포,

레인 3: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 전,

레인 4: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 후,

레인 5: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 후의 용해성 분획,

레인 6: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 후의 비용해성 분획

도 4는 IDA-금박막칩 위에서 찍은 히스티딘이 태그된 인간 성장 호르몬 유전자의 발현을 확인한 이미지를 나타낸 사진이고,

레인 1: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 후,

레인 2: 숙주세포 + 플라스미드 pEHUb-hGH : IPTG로 유도 전

도 5는 IDA-금박막칩 위에 마이크로어레이를 사용하여 히스티딘이 태그된 인간 성장 호르몬의 농도별로 배열하여 SPR 이미지 센서로 분석한 사진이고,

레인 1: 1.0 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 2: 0.75 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 3: 0.5 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 4: 0.25 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 5: 0.1 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 6: 0.075 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 7: 0.05 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 8: 0.025 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 9: 0.01 ㎎/㎖ 인간 성장 호르몬,

레인 10: 1 ㎎/㎖ BSA(bovine serum albumine)

도 6은 MBP(maltose binding protein)와 융합된 인터루킨-6 발현을 전기영동으로 확인한 사진이고,

레인 1: 단백질 크기 마커,

레인 2: 형질전환되지 않은 BL21(DE3) 숙주세포,

레인 3: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 전,

레인 4: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 후,

레인 5: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 후의 용해성 분획,

레인 6: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 후의 비용해성 분획

도 7은 사이클로덱스트린-금박막칩 위에서 찍은 MBP와 융합된 인터루킨-6의 발현을 확인한 이미지를 나타낸 사진이고,

레인 1: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 후,

레인 2: 숙주세포 + 플라스미드 pEMBP-hIL6 : IPTG로 유도 전

도 8은 GST(glutathione-S-transferase)가 융합된 인터루킨-6의 발현을 전기영동으로 확인한 사진이고,

레인 1: 단백질 크기 마커,

레인 2: 형질전환되지 않은 BL21(DE3) 숙주세포,

레인 3: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 전,

레인 4: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 후,

레인 5: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 후의 용해성 분획,

레인 6: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 후의 비용해성 분획

도 9는 글루타치온-금박막칩 위에서 찍은 GST가 융합된 인터루킨-6의 발현을 확인한 이미지를 나타낸 사진이다.

레인 1: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 후

레인 2: 숙주세포 + 플라스미드 pEGST-hIL6 : IPTG로 유도 전

본 발명은 재조합 단백질을 정량할 수 있는 바이오칩, 이를 이용한 재조합 단백질의 측정장치 및 측정방법에 관한 것이다.

재조합 단백질 발현 기술은 의약용 단백질, 효소, 항체 등의 제조 및 프로테오믹스 연구 등에 중요한 기술이다. 재조합 단백질의 숙주세포에서 발현 유무와 발현 정도를 확인하는 분석 기술은 재조합 단백질 생산에 있어서 핵심기술이라 할 수 있다. 재조합 단백질이 숙주세포 내에서 형질전환 되어 원하고자 하는 목적 단백질을 발현시켰는지의 여부를 확인하기 위하여 가장 많이 사용되는 방법은 전기영동법이다. 그 중에서도 전류를 흘려주면서 분자량에 따라 분리밴드가 나타나는 것을 확인하는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법이 가장 많이 사용된다. 단백질이 폴리아크릴아마이드의 다공성 젤을 통과하면서 분자량에 따라 이동도의 차이가 생기면서 분리밴드가 나타나는 것을 확인하기 위하여, 시료를 주입한 젤에 전류를 1시간정도 흘려주면서 (+)극 방향으로 젤을 따라 흐름이 일어나도록 한 뒤 염색과 탈염색의 과정을 거쳐 목적 밴드를 확인하게 된다. 이 방법은 재조합 단백질의 발현을 확인하는 방법으로 가장 많이 사용되고 있기는 하나, 동시에 분석할 수 있는 시료의 수가 10개 정도이며, 분석 시간도 10시간 이상 소요되는 단점이 있다. 또한 재조합 단백질 발현분석의 기존 방법인 SDS-PAGE법은 목적 밴드가 원하는 분자량에 단일밴드로 나타난 경우에는 분리와 확인이 쉽지만, 목적 밴드가 선명하지 않거나 비슷한 분자량의 밴드들이 겹쳐있는 경우에는 웨스턴 블럿(Western blot)과 같은 추가적인 방법으로 목적 밴드를 확인하는 작업을 거쳐야 한다. 이와 같이, SDS-PAGE법은 비교적 시간이 오래 걸리고 한 번에 분석할 수 있는 시료의 양이 한정되어 있으며, 수 마이크로리터 이상의 시료량을 필요로 하며, 목적 단백질만의 정량이 불가능한 경우가 있는 문제점이 있다.

재조합 단백질의 발현을 분석하는 최근 방법 중의 하나는 단백질의 친화성 결합과 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; 이하, 'SPR'이라 약칭함) 바이오센서 기술을 결합한 방법이다(Gershon, P.D. and Khilko, S. (1995) J. Immunological Methods, 183: 65-76; Baker, N.N. et al. (2002) Trends in Biotechnology, 20: 149-155). 표면 플라즈몬이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파하는 자유전자의 양자화된 진동이다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체를 지나 유전 매체의 임계각 이상의 각도로 금속박막에 입사하는 입사광에 의해 여기 되며 일정한 각도에서 공명을 일으킨다. 이러한 SPR이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는데 이용된다. 비아코아(Biacore)사에서는 센서칩 표면에 NTA(nitrilotriacetic acid)가 고정되어 있는 칩을 개발하여 시판하고 있다. NTA는 금속 이온과 착화합물을 형성하며 생체물질 구조 내 히스티딘이 존재하면 히스티딘이 니켈이온과 배위 결합으로 생체물질의 고정화가 가능하므로, SPR 바이오 센서로 고정화된 양을 측정할 수 있다. 따라서 재조합 단백질을 발현할 때, N-말단이나 C-말단에 히스티딘과 같은 친 화성 태그를 붙이면, NTA 센서칩을 이용한 SPR 바이오센서를 이용하여 재조합 단백질의 발현량을 측정할 수 있다. 그러나, SPR 바이오 센서와 친화성 결합을 활용한 분석법에서도 한 번에 분석할 수 있는 시료의 양이 제한되어 있는 문제점이 있다.

따라서, 상기 분석법들의 문제점을 해결하기 위한 장치로서 재조합 단백질을 2차원 배열 형태로 고정화하여 수십 내지 수천 종 이상의 발현 단백질을 동시에 분석하고자 하는 기술에 대한 필요성이 계속 제기되어왔다.

이에, 본 발명자들은 재조합 단백질 발현시 친화적 결합을 유도할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 등을 융합시키고, 이것과 친화성을 가지는 물질이 고정화되어 있는 센서 표면에 융합된 재조합 단백질을 2차원적으로 배열시켜 다양한 재조합 단백질의 발현정도를 동시에 분석이 가능하다는 것을 확인하고, 친화성 결합에 의하여 고정화된 단백질 배열을 SPR 이미지 센서를 이용하는 분석장치를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 빠른 시간 내에 다양한 재조합 단백질을 2차원 배열 형태로 고정화하고 동시에 재조합 단백질 발현 분석이 가능한 장치를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금속 박막이 증착되어 있는 유리기판을 포함하는 SPR 바이오칩에 있어서,
재조합 단백질에 친화성을 가지는 물질이 상기 금속 박막상에 고정화되어 친화성 센서를 형성하고, 상기 친화성 센서 상에 마이크로어레이 형태로 점적된 상기 재조합 단백질과 결합정도를 측정함으로써 상기 재조합 단백질의 발현정도를 표지없이 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 정량용 SPR 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 ⅰ) 유전매체; ⅱ) 상기 유전매체 위에 놓인 상기 SPR 바이오칩을 회전시키기 위한 회전장치; ⅲ) 상기 SPR 바이오칩의 하부에서 상기 유전매체를 통하여 상기 SPR 바이오칩의 유리기판에 빛을 조사함으로써, 상기 SPR 바이오칩의 금속박막에 플라스몬을 여기하는 발광부; 및 ⅳ) 상기 유리기판으로부터 반사되는 빛의 세기를 측정하기 위한 수광부를 포함하는 상기 SPR 바이오칩 상에 점적된 재조합 단백질의 발현정도를 정량하기 위한 측정장치를 제공한다.

아울러, 본 발명은 ⅰ) 상기 SPR 바이오칩에 재조합 단백질의 발현정도를 2차원적으로 배열하여 고정화시키는 단계; ⅱ) 상기 SPR 바이오칩을 회전장치에 장착하는 단계; ⅲ) 발광부로부터 광을 방출시키고, 방출된 광을 상기 바이오칩에 입사시키는 단계; 및 ⅳ) 상기 바이오칩으로부터 방출된 광을 수집하고 재조합 단백질 발현에 대한 정보를 검출하고 분석하는 단계를 포함하는 상기 측정장치를 이용한 재조합 단백질의 농도의 측정방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 금속 박막이 증착되어 있는 유리기판을 포함하는 SPR 바이오칩에 있어서,
재조합 단백질에 친화성을 가지는 물질이 상기 금속 박막상에 고정화되어 친화성 센서를 형성하고, 상기 친화성 센서 상에 마이크로어레이 형태로 점적된 상기 재조합 단백질과 결합정도를 측정함으로써 상기 재조합 단백질의 발현정도를 표지없이 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 정량용 SPR 바이오칩을 제공한다. 본 발명의 상기 바이오칩은 한 번에 수십 내지 수천 개의 발현된 재조합 단백질을 동시에 분석할 수 있도록 한다.

분자유전학적, 생리학적인 정보의 풍부 및 빠른 균체 성장속도 등의 장점으로 인하여 재조합 단백질 생산 숙주로 가장 많이 이용되고 있는 대장균은 대부분 목적 단백질을 세포 내에서 활성이 없는 불용성 응집체(inclusion body)의 형태로 생산하는 단점이 있다. 이에 상기 문제점의 해결을 위하여 '파트너'라고 불리우는 유전자와 발현하고자 하는 목적 유전자를 융합하여 발현함으로써 목적 단백질을 안정적으로 발현하고 또한 '파트너' 부분에 친화성 태그를 도입함으로써 분리정제도 수월하게 할 수 있는 유전자 융합기술이 개발되어왔다(Nilsson, B. et al. (1992) Curr. Opion. Struct. Biol., 2: 569-575; Nygren, P.A. et al., Trends Biotechnol., 12: 184-188).

따라서, 상기 재조합 단백질과 친화성 센서 표면은 다양하게 구성될 수 있다. 즉, 상기 재조합 단백질은 목적 단백질에 히스티딘 태그, MBP(maltose binding protein) 또는 GST(glutathione-S-transferase)를 포함하는 아미노산, 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질인 것이 바람직하다. 현재까지 목적 단백질의 안정적 발현 및 분리정제를 위하여 개발된 융합 파트너들 중에서 가장 많이 사용되고 있는 히스티딘 태그, MBP, GST는 이미 많은 실험을 통해 효율적임이 입증되어왔다.

또한, 상기 친화성을 갖는 물질은 IDA, 사이클로덱스트린 또는 글루타치온인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 친화성을 갖는 물질로서 NTA 또는 IDA(iminodiacetic acid)가 고정화될 경우, 재조합 단백질에 수 개의 히스티딘을 태그하여 발현시키면 된다. 이러한 친화성을 기반으로 하는 기술은 종래에 재조합 단백질의 분리정제에 이용되고 있는 기술이다(Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. and Belfrage, G. (1975) Nature, 258: 598-599; Kellerman, O.K. and Ferenci. T. (1982) Methods Emzymol., 90: 459-463; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene, 67: 31-40). 이와 같은 친화성을 이용한 재조합 단백질의 분리정제 기법들은 재조합 단백질의 발현량을 어레이 형태로 분석하고자 하는 본 발명에 활용될 수 있다.

또한, 상기 이미지 센서는 SPR 이미지 센서인 것이 것이 바람직하고, 상기 SPR 이미지 센서는 금속박막을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. SPR이 금속박막과 유전 매체의 경계면에서 일어나는 현상인 것을 이용하여, SPR 센서에서는 일정한 두께와 재질의 금속박막에 있어서 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정할 수 있다.

또한, 상기 이미지 센서는 엘립소메터(elipsometer), 석영 결정판 미량 천칭(Quartz Crystal Microbalance, QCM) 또는 표면 음파(Surface Acoustic) 센서를 사용할 수 있다.

이때, 상기 발광부는 단색광 레이저, 발광 다이오드 또는 다중 파장 대역의 백색 광원을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 수광부는 촬상소자(charge coupled device; CCD), 카메라를 포함하는 것이 바람직하다.

도 1은 재조합 단백질 어레이를 동시에 분석할 수 있는 측정 시스템의 하나로서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 이미지 센서 측정장치 구조의 개략도이다.

SPR 이미지 센서에서 이용되는 칩은 기본적으로는 기존의 SPR 센서 칩의 구조와 유사한 구조를 갖는다. SPR 이미지 센서는 유전 매체(dielectric medium; 10)와 교체 가능한 유리기판(21)을 광학적으로 결합하는 굴절률 매칭 오일(index matching oil; 20) 및 SPR을 유발하는 금속박막층(22)으로 구성된다. 이때, 유전 매체(10)는 입사광원(30)을 이용하여 금속박막(22)의 표면 플라즈몬을 여기 시키는 매체로서 통상 BK7, SF10과 같은 유리 재질로 이루어지는 프리즘으로 구성된다. 또한, 굴절률 매칭 오일(20)은 유전 매체(10)와 금속박막(22)이 증착되어 있는 유리기판(21)을 광학적으로 결합시켜주는 역할을 한다. 유리기판(21)과 금속박막(22)사이의 접착력을 증대시키기 위해 금속박막을 도포하기 전에 티타늄(titanium) 또는 크로미움(chromium)을 약 2 내지 4 ㎚의 두께로 도포하기도 한다. 이때, 유리기판(21)은 금속박막(22)이 증착되어 있어 교체가 가능하고, 금속박막(22)은 SPR 현상을 제공하며, 통상 40 내지 50 ㎚인 박막 두께로서 가장 많이 사용되는 재질로서 금(Au) 및 은(Ag)이 사용된다. 또한, 시료(23)는 표면 플라즈몬 장(field) 내에서의 굴절률의 변화 및 두께의 측정 대상이 되는 것으로, 기체, 액체 및 고체 등 모든 종류의 상(phase)을 가진 매질을 포함한다. 또한, 회전 장치(50)는 프리즘(10), 굴절률 매칭 오일(20), 유리기판(21), 금속박막(22) 및 시료(23)부를 지지하고 회전축을 중심으로 회전하여, 고정되어 있는 입사광(30)과의 입사각 측정이 가능한 원판이다.

입사광부(30)에서 발생되는 입사광을 광학렌즈(70)를 통해서 적당한 크기의 빔 사이즈로 확장하고 평행광으로 만든 후, 프리즘을 통과시켜 칩 표면에 입사시킨다. 이때, 입사광원(light source; 30)은 금속박막(22) 표면에서 플라즈몬을 여기시켜 공명을 일으키게 하는 역할하며, 기구의 동작원리에 따라 단색광의 레이저, 발광다이오드(light emitting diode; LED) 혹은 다중파장대역의 백색광 및 발광 다이오드 등이 쓰인다. 입사된 빔은 칩 표면에서 반사되고 이를 수광부(40)에서 측정한다.

수광부(Photodetector; 40)는 금속박막 표면으로부터 반사된 광의 세기를 측정하는 부분으로, 포토다이오드(photodiode), 광 증폭기(photomultiplier; PMT), 촬상소자(charge coupled device; CCD), 카메라와 같은 이미징 기구(imaging device) 등이 이에 속한다. 광학필터(60)는 입사광부(30)로서 백색광을 사용할 경우, 측정에 적합한 단일파장만을 통과시켜 입사시키는 광학필터(optical filter)이다. 렌즈(70)는 입사광부(30)로부터 발생되는 입사광(31)을 평행광으로 만들고, 시편에서 반사되는 반사광(41)을 수광부(40)로 집속하여 영상을 맺게 하는 렌즈이다.

도 2는 시료(23)가 물 또는 물보다 굴절률이 0.001 더 큰 임의의 용액일 경 우, 도 1의 장치로 측정된 각도에 대한 반사율 변화를 보여주고 있다. 칩 표면에 입사된 입사광은 특정한 입사각에서 SPR 현상을 일으켜 금속박막에 흡수되어 반사광의 세기가 최소값을 갖게 된다. 이때의 표면 플라즈몬 공명각은 칩 표면 굴절률의 변화, 즉 시료(23)의 양과 종류에 따라 달라지기 된다. 도 2에서 나타난 바와 같이 각도변화에 대한 반사광 세기의 변화율이 가장 큰 입사각(A)에 고정한 상태에서 시료(23)의 부분적인 굴절률 및 양적 변화에 따라 각기 다른 반사광의 세기가 측정되는데 이를 2차원적으로 재구성하면 칩의 표면상태를 이미지화할 수 있게 된다. 시료(23)를 마이크로어레이 형태로 찍은 칩을 굴절률 매칭 오일(20)을 도포한 프리즘(10)위에 올려놓고 SPR 현상이 일어나는 공명각 근처에서 각도를 고정하고 수광부와 연결된 CCD(Charge Coupled Device)를 통해 이미지를 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되 는 것은 아니다.

<실시예 1> 금속박막의 제조

<1-1> IDA-금박막칩 제조공정

95% 황산과 30% 과산화수소수를 부피비 3:1로 혼합한 용액에 금박막칩을 60 내지 65℃에서 20 내지 30분 동안 담지시킨 후 증류수, 에탄올 순으로 금박막칩을 깨끗하게 세척하였다. 금박막칩에 10 mM 머캅토언데카놀(mercaptoundecanol)을 녹인 에탄올 용액을 상온에서 20시간 정도 담지시켜 자기조립단 분자막이 형성되도록 하였다. 상기 금박막칩을 에탄올, 증류수 순으로 칩을 세척한 후 칩을 활성화하기 위하여, 0.4 M 수산화나트륨 용액과 2-메토시에틸에테르(2-methoxyethylether)를 부피비 1:1로 섞은 혼합액에 에피클로로히드린(epichlorohydrin)이 0.6 M 농도가 되도록 만든 용액을 금박막칩에 넣고 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 에탄올, 증류수 순으로 칩을 세척하였다. 칩 표면에 덱스트란을 코팅하기 위하여, 0.3 g/㎖의 농도로 덱스트란을 0.1 M 수산화나트륨 용액에 녹인 용액을 상기 금박막칩에 담지시킨 후 20 시간 동안 반응시켰다. 위의 반응용액을 버리고 증류수, 0.1 M 수산화나트륨 용액, 증류수 순으로 칩을 세척하였다. 상기 금박막 칩에 0.4 M 수산화나트륨 용액과 2-머캅토에틸에테르(2-mercaptoethylether) 용액을 부피비 1:1의 혼합액에 0.6 M의 농도로 에피클로로히드린을 녹인 용액을 넣고 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 에탄올, 증류수 순으로 칩을 세척하였다. 상기 금박막칩에 IDA를 도입하기 위하여 1.7 M 이미노디아세트 산(iminodiacetic acid; disodium salt)과 2 M 소듐카보네이트(sodium carbonate)를 녹인 수용액을 칩이 있는 용기에 넣고 60℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 칩을 세척하였다. 상기에서 제조된 칩에 니켈을 도입하기 위하여, 50 mM 니켈클로라이드(Nichel(Ⅱ) chloride) 용액을 칩이 있는 용기에 넣고 상온에서 3 내지 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 세척하였다.

<1-2> 사이클로덱스트린-금박막칩 제조공정

금박막에 덱스트란을 고정화하는 과정은 실시예 1-1과 동일하다. 덱스트란이 코팅된 금박막칩에 0.4 M 수산화나트륨 용액과 2-메토시에틸에테르를 부피비 1:1로 섞은 혼합액에 0.6 M 에피클로로히드린을 녹인 용액을 첨가하여 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 에탄올, 증류수 순으로 칩을 세척하였다. 사이클로덱스트린을 0.1 M 수산화나트륨 용액에 70 ㎎/㎖의 농도로 녹인 용액을 상기 금박막칩에 첨가하여 40℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 칩을 세척하였다. 상기 금박막칩의 미반응 활성화기를 저지하기 위하여, 1 M 에탄올아민 용액을 칩이 있는 용기에 넣고 37℃에서 3 내지 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 세척하였다.

<1-3> 글루타치온-금박막칩 제조공정

금박막에 덱스트란을 고정화하는 과정은 실시예 1-1과 동일하다. 0.4 M 수산 화나트륨 용액과 2-메토시에틸에테르를 부피비 1:1로 섞은 혼합액에 0.6 M 농도의 에피클로로히드린을 녹인 용액을 상기 덱스트란이 코팅된 금박막칩에 첨가하여 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 에탄올, 증류수 순으로 칩을 세척하였다. 환원 L-글루타치온을 44 mM이 되도록 녹인 pH 7.0, 100 mM 인산 완충용액을 상기 칩에 첨가하여 37℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 칩을 세척하였다. 상기의 방법으로 제조된 칩의 미반응 활성화기를 저지하기 위하여, 1 M 에탄올아민 용액을 상기 칩에 첨가하여 37℃에서 3 내지 4시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 버리고 증류수로 세척하였다.

<실시예 2> 히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴과 융합된 인간 성장 호르몬의 발현 분석

<2-1> 히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴 유전자 제작

N-말단에 6개의 히스티딘(histidine) 태그(tag)를 갖는 유비퀴틴 유전자(76개 아미노산을 코딩)의 제작을 위하여, 유비퀴틴 서열 유전자를 코딩하는 2개의 프라이머(서열번호 1, 서열번호 2)를 제작하였다. 히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴 유전자는 두 개의 프라이머를 이용하여 유비퀴틴 유전자의 모형 사슬로 사용될 사카로마이세스 세레비지에(Sacharomyces serevisiae) 게노믹(genomic) DNA(Invitrogen, 미국)와 함께 DNA 합성기(Applied Biosystems 391, 미국)로 합성하였으며, PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 N-말단 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하였다.

히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴이 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 N-말단에 Nde I 제한효소 절단부위를 프라이머에 도입하였고, 6개의 히스티딘 태그와 76개의 유비퀴틴이 발현될 수 있도록 설계하였으며, 최종적으로 하기의 실시예에서 인간성장 호르몬과 연결될 C-말단은 블런트(blunt)로 처리하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 1: 246 bp)은 제한효소 Nde I으로 절단한 후 아가로스젤에서 분리하였다.

<2-2> 인간 성장 호르몬 유전자의 제작

인간 성장 호르몬 유전자의 제작을 위하여, 인간 유래의 인간 성장 호르몬 유전자를 가진 pT2GH(한국생명공학연구원)를 모형사슬로 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 N-말단 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하였다.

상기 프라이머가 히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴과 연결될 수 있도록 N-말단은 블런트로 처리하였고 최종적으로 Xho I으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 2: 573 bp)은 제한효소 Xho I으로 절단하여 아가로스젤로 분리하였다.

<2-3> 유비퀴틴과 인간 성장 호르몬의 융합 단백질의 발현

플라스미드 pET-22b(+)(Merck, 독일)를 Nde I 과 Xho I으로 절단하여 약 5,500개 염기쌍의 단편 3을 분리하였다. 분리된 대장균 발현 벡터 단편 3을 상기에서 얻어진 단편 1, 2와 함께 리가제로 연결하여 플라스미드 pEHUb-hGH를 제작하 였다. 플라스미드 pEHUb-hGH는 T7 프로모터::히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴::hGH 유전자::T7 터미네이터를 상기 순서로 포함시키고 있다.

형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pEHUb-hGH, E. coli BL21(DE3)/pEMBP-hIL6(Merck, 독일), E. coli BL21(DE3)/pEGST-hIL6(Merck, 독일)를 LB(효모 추출물 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%) 고체배지에서 배양하였다. 배양된 균체는 앰피실린(ampicillin)이 50 ㎍/㎖ 들어있는 LB 액체배지에 접종하여 흡광도(optical density) 0.6까지 배양시킨 후, 1 mM 농도의 이소프로필(isopropyl)-B-D-티오칼락토피라노시드(thiogalactopyranoside)(이하, 'IPTG'라 칭함)를 첨가한 다음 4시간 동안 추가적으로 배양하여 단백질이 발현되도록 유도하였다. 음성 대조군으로 상기 형질전환된 대장균을 LB 액체배지에서 배양시키면서 IPTG를 첨가하지 않음으로써 발현 유도가 일어나지 않도록 하였다.

상기 과정에서 얻은 배양액을 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 균체를 회수하였다. 각각의 균체를 초음파 파쇄(Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min)하여 발현된 단백질들을 용해성 분획과 비용해성 분획으로 나누어 발현을 확인하였다. 분리된 균체는 전체 분획, 용해성 분획, 비용해성 분획으로 나누어 100 ㎕의 단백질 용해 완충액(12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브롬화페놀 블루)에 녹이고, 100℃에서 5분간 가열하여 생성된 용액 중 각 10 ㎕씩을 채취하여 전기영동 분석을 하였다. 0.75 ㎜ 두께의 12% 분리 젤(pH 8.8, 가로 20 cm, 세로 10 cm) 위에 5% 저장 젤(pH 6.8, 가로 10 ㎝, 세로 12.0 ㎝)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 100-300 V, 25 ㎃로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 염색하였다. 도 3은 상기 폴리아크릴아마이드 젤에 염색된 발현 단백질을 보여주고 있다. 유비퀴틴과 인간 성장 호르몬의 융합 단백질의 젤 스케닝 결과(BioRad Imaging Densitometer GS-700, 미국) IPTG 유도 후 발현율은 19.2%이었고, 전체 발현량 중 불용성 응집체에 32.3%, 용해성 분획에 67.7% 존재함을 확인하였다.

<2-4> SPR 이미지 센서를 이용한 융합 단백질의 측정

IPTG 첨가에 의해 단백질이 발현되도록 성장시킨 균체와 IPTG를 첨가하지 않아 단백질 발현을 유도하지 않은 균체의 파쇄액에 각각 부피비 20%가 되도록 에틸렌글리콜을 첨가하여 혼합용액을 만든 후 각각 종류별로 384 마이크로웰플레이트에 50 ㎕씩 분주하였다. 분주된 384 마이크로웰플레이트와 실시예 1-1을 통해 제작된 IDA-금박막칩을 마이크로어레이어(Protegen, CM-1000)에 위치시킨다. 내부습도를 60%를 유지하는 조건에서 구경 300 ㎛의 핀을 이용하여 칩 위에 마이크로웰플레이트 상에 분주된 균체의 파쇄액을 배열한다. 처음 줄은 히스티딘을 태그로 갖는 인간 성장 호르몬이 발현되도록 한 균체 파쇄액을 배열시켰으며, 두 번째 줄은 발현되지 않은 균체 파쇄액을 배열시켰다. 마이크로어레이어에서 같은 습도를 유지하면서 30분 동안 반응시킨 후, 세척용액(20 mM 소듐포스페이트(sodium phosphate), 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸(imidazole), pH 8.0)에 담지시킨 후, PBST 용액(10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.4)에 20분 동안 담지하여 미반응된 물질을 제거한 후, 증류수로 여러번 세척한 후 습기를 제거하였다. 상기 재조합 단백질이 배열된 칩을 SPR 이미지 센서에 장착하여 칩 표면에서 결합된 단백질에 대한 이미지를 분석하였다. 분석된 결과를 도 4에 나타내었다. 이미지 분석결과 발현된 균체 파쇄액 배열에서는 선명한 이미지를 얻을 수 있었으며, 발현되지 않은 균체 파쇄액 배열에서는 그렇지 않았다.

<실시예 3> 히스티딘 태그를 갖는 유비퀴틴과 융합된 인간성장호르몬의 농도별 분석

실시예 2와 동일한 방법에 의하여 제조된 히스티딘이 태그된 유비퀴틴이 융합된 인간 성장 호르몬을 친화성 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하여 에틸렌글리콜이 20% 첨가된 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)에 1.0, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.01 ㎎/㎖의 농도로 384 마이크로웰플에이트에 50 ㎕씩 분주하였다. 선택적 결합이 있는지 확인하기 위한 대조 실험으로 BSA(Bovine Serum Albumin)를 1 ㎎/㎖이 되도록 상기 완충용액에 녹인 용액을 50 ㎕ 분주하였다. 상기 용액을 마이크로어레이를 이용하여 IDA-금박막칩에 배열시켰다. 이 후 처리는 실시예 2와 동일하고, SPR 이미지 센서 분석의 결과를 도 5에 나타내었다. 이미지 분석결과 농도에 따라 배열의 선명도가 감소하며 0.01 ㎎/㎖ 까지 식별할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4> MBP(maltose binding protein)가 융합된 인터루킨-6의 발현 분석

<4-1> MPP 유전자 제작

MBP 유전자의 제작을 위하여 pMal-c2x(New England Biolabs, 미국)를 모형사슬로 PCR을 수행하였다(Perkin Elmer, GeneAmp PCR 2400, USA). PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 5로 기재되는 N-말단 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하였다.

프라이머는 N-말단에 Nde I 제한효소 절단 부위를 도입하였고 MBP를 코딩하는 유전자가 발현될 수 있도록 설계하였으며, C-말단은 EcoR I으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단 부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 4: 1116 bp)은 제한효소 Nde I과 EcoR I으로 절단하여 아가로스젤에서 분리하였다.

<4-2> 인간 인터루킨-6 유전자의 제작

인간 인터루킨-6 유전자의 제작은 pBKS-hIL6(Cytokine bank, 전북대학교)를 모형사슬로 PCR을 수행하였으며, PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 7로 기재되는 N-말단 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하였다.

프라이머가 MBP와 연결될 수 있도록 N-말단은 EcoR I으로 절단되도록 제한효소 절단부위를 도입하였고, C-말단은 최종적으로 Sal I으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 5: 555 bp)은 제한효소 EcoR I, Sal I으로 절단하여 아가로스젤에서 분리하였다.

<4-3> MBP와 인터루킨-6 융합 단백질의 발현

한편, 플라스미드 pET22b(Merck사, 독일)를 Nde I과 Sal I으로 절단하여 약 5500 염기쌍의 단편 6을 분리하였다. 분리된 대장균 발현 벡터 단편 6을 상기에서 각각 제한효소로 처리하여 단편 4, 5와 리가제를 이용하여 연결하였다. 완성된 벡터는 T7 촉진인자와 T7 종결인자에 의해 유전자의 번역이 이루어지고 MBP가 융합된 인터루킨-6 유전자가 발현될 수 있도록 제작되었으며 플라스미드 pEMBP-hIL6라고 명명하였다.

실시예 2와 동일한 균체 배양 과정을 거쳐 분석된 단백질의 SDS-PAGE 젤을 도 6에 나타내었다. MBP가 융합된 인터루킨-6 단백질의 젤 스케닝 결과(BioRad Imaging Densitometer GS-700, 미국) IPTG 유도 후 발현율은 40.3%이었고, 전체 발현량 중 불용성 응집체에 9.8%, 용해성 분획에 90.2% 존재함을 확인하였다.

<4-4> SPR 이미지 센서를 이용한 융합 단백질의 측정

도 6의 레인 4와 레인 5에 해당하는 단백질 용액에 각각 부피비 20%가 되도록 에틸렌글리콜을 첨가하여 혼합 용액을 만든 후 각각 384 마이크로웰플레이트에 50 ㎕씩 분주하였다.

분주된 384 마이크로웰플레이트와 실시예 1-2를 통해 제작된 사이클로덱스트린-금박막칩을 마이크로어레이어(Protegen, CM-1000)에 위치시켰다. 이하, 실험 방법은 실시예 2와 동일하며, 분석된 SPR 이미지 센서 결과는 도 7에 나타내었다. 이미지 분석결과 발현된 균체 파쇄액 배열에서는 선명한 이미지를 얻을 수 있었으며, 발현되지 않은 균체 파쇄액 배열에서는 그렇지 않았다.

<실시예 5> GST(glutathione-S-transferase)가 융합된 인터루킨-6의 발현 분석

<5-1> GST 유전자 제작

GST 유전자의 제작을 위하여 pET-43.1a(Merck, 독일)를 모형사슬로 PCR을 수행하였으며 PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 9로 기재되는 N-말단 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하였다.

GST 유전자가 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 N-말단에는 Nde I 제한효소 절단부위를 프라이머에 도입하였고, C-말단에는 EcoR I로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 7: 720 bp)은 제한효소 Nde I과 EcoR I로 절단한 후 아가로스젤에서 분리하였다.

<5-2> 인간 인터루킨-6 유전자의 제작

인간 인터루킨-6의 유전자의 제작은 실시예 4-2와 동일한 방법을 사용하여 단편 5를 분리하였다.

<5-3> GST와 인터루킨-6 융합 단백질의 발현

실시예 5-1과 5-2를 통하여 얻어진 2개의 단편(단편 7 및 단편 8)들과 함께 실시예 4-3과 동일한 방법으로 제작된 Nde I과 Sal I으로 절단하여 얻어진 약 5,500 염기쌍 pET22b 단편 6을 리가제로 각각 연결하였다. 완성된 벡터는 T7 촉진인자와 T7 종결인자에 의해 유전자의 번역이 이루어지고 GST가 융합된 인간 인터루킨-6 유전자가 발현될 수 있도록 제작되었으며 플라스미드는 pEGST-hIL6라고 명명 하였다. 상기 플라스미드는 E. coli BL21(DE3)에 발현되도록 하였다(Sambrook, J., Fritsch, E. E., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York, 1989).

실시예 2와 같은 균체 배양 과정을 거쳐 분석된 SDS-PAGE 젤을 도 8에 나타내었다. GST가 융합된 인터루킨-6 단백질의 젤 스케닝 결과(BioRad Imaging Densitometer GS-700, 미국) IPTG 유도 후 발현율은 24.6%이었고, 전체 발현량 중 불용성 응집체에 29.64%, 용해성 분획에 70.36% 존재함을 확인하였다.

<5-4> SPR 이미지 센서를 이용한 융합 단백질의 측정

도 8의 레인 4와 레인 5에 해당하는 단백질 용액에 각각 부피비 20%가 되도록 에틸렌글리콜을 첨가하여 혼합 용액을 만든 후, 각각 종류별로 마이크로웰플레이트(384웰)에 50 ㎕씩 분주하였다.

분주된 384 마이크로웰플레이트와 실시예 3을 통해 제작된 글루타치온-금박막칩을 마이크로어레이어(Protegen, CM-1000)에 위치시켰다. 이하, 실험 방법은 실시예 4와 동일하며 분석된 SPR 이미지 센서 결과는 도 9에 나타내었다. 이미지 분석결과 발현된 균체 파쇄액 배열에서는 선명한 이미지를 얻을 수 있었으며, 발현되지 않은 균체 파쇄액 배열에서는 그렇지 않았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 친화성 수용체가 붙여진 칩으로 마이 크로어레이를 제작하면 다양한 종류의 태그된 단백질을 대량으로 또한 극미량의 시료로 단백질 발현 여부를 분석하기가 용이할 뿐만 아니라 단백질 발현 여부를 보다 간단히 빠른 시간에 분석이 가능하다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Biochip capable of quantity measurement of recombinant protein and apparatus for measurement including thereof <130> 3p-08-22 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin N-terminal primer <400> 1 catatgcacc accaccacca ccaccaaatt ttcgtcaaaa ctctaaca 48 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin C-terminal primer <400> 2 accacccctc aacctcaaga cgaggtgaag agt 33 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pT2GH N-terminal primer <400> 3 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaac 36 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pT2GH C-terminal primer <400> 4 gtcgacctag aagccacagc tgccctccac aga 33 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMal-c2x N-terminal primer <400> 5 catatgaaaa tcgaagaagg taaactggta atctgg 36 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMal-c2x C-terminal primer <400> 6 gaattccttg tcgtcgtcgt cgaattcagt gtccgcgtct ttcagggctt c 51 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBKS-hIL6 N-terminal primer <400> 7 gaattcgccc cagtaccccc aggagaagat tccaaagatg tagccgcccc acacaga 57 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBKS-hIL6 C-terminal primer <400> 8 gtcgacctac atttgccgaa gagccctcag gctggactgc aggaactcct taaagct 57 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-43.1a N-terminal primer <400> 9 catatgtccc ctatactagg ttattggaaa attaagggcc ttgtgcaacc cactcgactt 60 60 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-43.1a C-terminal primer <400> 10 gtcgaccttg tcgtcgtcgt cgtcacgatg cggccgctcg agtcgacccg ggaattccgg 60 gga 63

Claims

금속 박막이 증착되어 있는 유리기판을 포함하는 SPR 바이오칩에 있어서,

재조합 단백질에 친화성을 가지는 물질이 상기 금속 박막상에 고정화되어 친화성 센서를 형성하고, 상기 친화성 센서 상에 마이크로어레이 형태로 점적된 상기 재조합 단백질과 결합정도를 측정함으로써 상기 재조합 단백질의 발현정도를 표지없이 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 정량용 SPR 바이오칩.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 히스티딘 태그, MBP(maltose binding protein) 또는 GST(glutathione-S-transferase)를 포함하는 아미노산, 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 SPR 바이오칩.
제 1항에 있어서, 상기 친화성을 가지는 물질은 IDA, 사이클로덱스트린 또는 글루타치온인 것을 특징으로 하는 SRP 바이오칩.
삭제
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삭제
ⅰ) 유전매체;

ⅱ) 상기 유전매체 및 그위에 놓인 제 1항의 SPR 바이오칩을 회전시키기 위한 회전장치;

ⅲ) 상기 SPR 바이오칩의 하부에서 상기 유전매체를 통하여 상기 SPR 바이오칩의 유리기판에 빛을 조사함으로써, 상기 SPR 바이오칩의 금속박막에 플라스몬을 여기하는 발광부; 및

ⅳ) 상기 유리기판으로부터 반사되는 빛의 세기를 측정하기 위한 수광부를 포함하는 제 1항의 SPR 바이오칩 상에 점적된 재조합 단백질의 발현정도를 정량하기 위한 측정장치.
제 7항에 있어서, 상기 발광부는 단색광 레이저, 발광 다이오드 또는 다중 파장 대역의 백색 광원을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정장치.
제 7항에 있어서, 상기 수광부는 촬상소자(charge coupled device; CCD), 카메라를 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 장치.
ⅰ) 제 1항의 SPR 바이오칩에 재조합 단백질의 발현정도를 2차원적으로 배열하여 고정화시키는 단계;

ⅱ) 상기 SPR 바이오칩을 회전장치에 장착하는 단계;

ⅲ) 발광부로부터 광을 방출시키고, 방출된 광을 상기 바이오칩에 입사시키는 단계; 및

ⅳ) 상기 바이오칩으로부터 방출된 광을 수집하고 재조합 단백질 발현에 대한 정보를 검출하고 분석하는 단계를 포함하는 제 7항의 측정장치를 이용한 재조합 단백질의 농도의 측정방법.