KR100815504B1

KR100815504B1 - 혈액 내 트렌스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단키트

Info

Publication number: KR100815504B1
Application number: KR1020060088110A
Authority: KR
Inventors: 묵인희; 손지훈
Original assignee: (주) 디지탈바이오텍; 주식회사 에스디
Priority date: 2006-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2008-03-20
Also published as: KR20080023942A

Abstract

본 발명은 트랜스티레틴 (transthyretin) 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명의 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 알츠하이머병 진단 도구로서 기존의 검사법에 비해 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하고 효율적으로 진단할 수 있어 알츠하이머병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈액 내 트렌스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단키트 {BLOOD DIAGNOSTIC KIT FOR DIAGNOSING ALZHEIMER'S DISEASE BY ASSESSING TRANSTHYRETIN LEVEL IN BLOOD}

본 발명은 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는 진단 키트에 관한 것이다.

알츠하이머병 (Alzheimer's Disease)은 나이가 들어감에 따라 나타나는 퇴행성 신경질환의 일종으로 기억력 상실이 그 특징으로 나타난다. 고령화 사회로 접어들면서 그 환자수가 급속히 증가하고 있는 추세이며 알츠하이머병에 대한 사회적, 경제적 부담이 사회문제로 대두되어질 만큼 심각한 상태이다.

알츠하이머병의 병리학적 특징으로는 환자의 뇌에 노인반점 (senile plaques)과 신경섬유뭉치 (neurofibrillary tangles)가 관찰되며 이로 인하여 신경세포의 소실이 뚜렷이 나타나게 된다. 노인반점의 80% 이상을 베타-아밀로이드 (β-amyloid; Aβ)라는 독성 단백질이 차지하고 있는데, 현재 이 베타-아밀로이드 단백질이 알츠하이머병의 주요 병인으로 생각되고 있다. 베타-아밀로이드 단백질은 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein, APP)이 β-세크레타제 (β-secretase)와 γ-세크레타제에 의해 순차적으로 잘려져 나온 40 혹은 42개의 아미노산으로 구성되어져 있다. 베타-아밀로이드의 생물학적 기능은 아직 알려져 있지 않으나, 이것이 침착되어 세포 사멸이나 염증반응을 포함하는 일련의 작용들을 촉발시킴으로써 결국 기억 소실을 일으키는 일차 요인으로 작용한다는 것이 다양한 증거들에 의해 뒷받침되고 있다 (Hardy J. 등, Science, 297:353-6, 2002). 이 같은 베타-아밀로이드의 침착은 베타-아밀로이드의 과생성 또는 수용성 베타-아밀로이드의 섬유화 (fibrillization)의 증가라는 두 가지 기전으로 분류하여 설명될 수 있는데 (Selkoe D.J., Neuron, 32:177-80, 2001), 이 중 베타-아밀로이드의 섬유화와 관련하여 트랜스티레틴이라는 단백질이 주목받고 있다.

트랜스티레틴 (Transthyretin; TTR)은 분자량 55 kDa (508 아미노산)의 단백질로서 베타 평면구조를 가지는 동일한 4개의 단량체 (14 kDa)로 구성된 단백질이다 (Blake C. C. 등, J. Mol. Biol., 121:339-356, 1978).

트랜스티레틴은 뇌량 (choroid plexus) 및 간에서 생성되어 각각 뇌척수액 (cerebrospinal fluid: CSF)과 혈액으로 분비되며, L-티록신 (T4) 및 레티놀 (비타민 A)의 전달자로서 주로 알려져 있다. 뇌척수액 및 혈액 내 티록신 전달의 각각 80%와 20%를 담당하며 (Hagen G. A. 등, J. Clin. Endocrinol., 37:415422, 1973), 레티놀과 레티놀-결합 단백질 (retinol-binding protein; RPB) 복합체에 결합하여 이들을 안정화시키고, 레티놀을 주요 저장 장소인 간으로부터 원하는 세포로 운반하는 간접 운반자의 역할을 수행한다 (Goodman D. S., Raz A., J. Lipid. Res., 13:338347, 1972).

이 외에도, 영양 저하와 장기적인 염증 (chronic inflammation)을 반영하는 척도로도 주목을 받아 왔으며, 트랜스티레틴의 유전자에 변이가 일어난 경우, 가족적 아밀로이드 다발 신경병증 (familial amyloidotic polyneuropathy; FAP)이라는 치명적인 유전 질병을 일으킬 수 있다는 것이 알려져 있다 (Ando Y. 등, Arch Neurol, 62: 1057-1062, 2005).

알츠하이머병 (AD)의 병리와 관련해서는, 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 나타나는 병변의 하나인 신경섬유뭉치 (neurofibrillary tangle)와 초로성 반점 (neuritic plaques)에서 트랜스티레틴의 존재가 확인되었으며 (Shirahama T. 등, Am. J. Pathol., 107:4150, 1982), 생체외 (in vitro) 조건에서 수용성 베타-아밀로이드에 결합하여 이의 섬유화를 차단한다는 연구 결과가 슈왈츠만 등에 의해 보고된 바 있다 (Schwarzman A. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 9:8368-8372, 1994). 더욱이, 정상인의 사후 신장조직을 이용하여 수행한 생체외 결합 분석 (in vitro binding assay) 결과 트랜스티레틴이 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂와 복합체를 형성하고 있음이 확인되었다 (Tsuzuki K. 등, Neurosci. Lett., 281:1714, 2000).

돌연변이 APP (APP695SWE)를 과발현시킨 알츠하이머병 쥐 모델을 이용한 생체내 (in vivo) 실험에서는, 트랜스티레틴을 해마 (hippocampus)에서 과발현시킬 경우 알츠하이머병-유사 신경퇴행 (AD-like neurodegeneration)이 감소되는 것이 관찰되었고 (Stein T. D. 등, J. Neurosci., 22:73808, 2002), 에스트로겐이 트랜스티레틴 유전자 발현을 증가시킴으로써 알츠하이머병의 발병 위험을 낮춘다는 사실도 보고되었다 (Tang Y. P. 등, J. Alzheimers Dis., 6:413420, 2004).

상기와 같은 연구들을 종합해 볼 때, 트랜스티레틴은 알츠하이머병에서 노인반을 형성하는 주 물질인 베타-아밀로이드와 결합하여 이의 섬유화를 막음으로써 알츠하이머병 환자에게서 일어나는 유해한 병리학적 사건들을 차단하는 기능을 한다는 것을 예측할 수 있다.

현재까지 트랜스티레틴을 대상으로 한 알츠하이머병 관련 연구는 대부분 뇌척수액 내에 존재하는 트랜스티레틴의 변화에 촛점을 맞추어 왔는데, 이에 따르면 뇌척수액 내 트랜스티레틴의 농도가 알츠하이머병 환자에서 유의하게 감소되어 있었다 (문헌 [Riisoen H., Acta. Neurol. Scand., 78:4559, 1988] 및 [Serot J. M. 등, J. Neurol. Neurosur. Ps., 63:5068, 1997] 참조). 반면, 트랜스티레틴의 또 다른 분비 장소인 혈액에 관하여는 알츠하이머병에 따른 변화 양상에 관련된 보고가 전혀 이루어지지 않은 상태이다.

현재 임상적으로 사용되는 알츠하이머병의 진단은 자기공명영상법 (MRI), SPECT (single-photon emission computed tomography) 등을 이용하여 특정 뇌조직 (해마, 피질 등)의 변화양상을 관찰하고, MMSE (mini-mental status examination)와 같은 문진을 통하여 행동과 지각능력의 변화관찰을 종합하여 알츠하이머병으로서 진단을 내리게 된다. 이 외에도, 환자의 뇌척수액으로부터 Aβ₄₂와 Aβ₄₀ 펩티드의 농도비를 측정하여 알츠하이머병 여부를 진단하는 방법이 매우 높은 정확도를 보이는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 진단방법은 고령의 알츠하이머병 환자로부터 뇌척수액을 채취해야하는 어려움이 있어 실제 일반적 진단방법으로는 용이하게 사용될 수 없는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 혈액내 트랜스티레틴 (TTR)의 농도가 알츠하이머병 환자에서 정상인과 비교하여 유의하게 감소해 있다는 사실을 최초로 밝히고, 이를 적용한 진단 키트가 알츠하이머병을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈액을 이용한 알츠하이머병의 용이하고 효과적인 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인간 트랜스티레틴 (Transthyretin; TTR) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료 중 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 진단 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 알츠하이머병 환자 및 정상인으로부터 혈청을 채취하여 트랜스티레틴의 농도를 확인한 결과, 알츠하이머병 환자의 혈액에서 트랜스티레틴의 농도가 통계적으로 현저하게 (p<0.0001) 감소해 있음을 최초로 확인하고, 이러한 사실에 착안하여 혈중 트랜스티레틴의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는, 일종의 생체외 분석방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 1) 혈액 시료 및 대조군이 코팅 또는 결합된 반응기에 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 넣어 반응시키는 단계; 2) 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-표지체 접합체 (conjugate) 및 표지체의 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및 3) 혈액 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는, 혈액 시료 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.

상기 반응기로는 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 (96 well plate), 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

상기 트랜스티레틴 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 인간 트랜스티레틴 항원 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난 (卵)으로부터 정제한 것이 바람직하고, 특히 토끼에 면역시켜 얻은 혈청에서 정제한 다중클론 (poluclonal) 항체가 바람직하다.

상기 트랜스티레틴을 특이적으로 인식하는 항체는 상업적으로 용이하게 입수할 수 있으며, 혹은 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

먼저, 트랜스티레틴 단백질을 공지된 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질의 형태로 제조한다. 예를 들면, NIH 프로그램 GenBank 상에 등록된 트랜스티레틴 유전자의 염기서열을 이용하여 트랜스티레틴 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 트랜스티레틴 단백질을 생산하는 형질전환체를 얻는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간 트랜스티레틴 재조합 단백질을 분리, 정제하는 단계에 의해 트랜스티레틴 재조합 단백질을 제조할 수 있으며, 이렇게 제조한 단백질을 항원으로 사용하여 통상의 방법으로 다중클론 항체를 제조할 수 있다.

상기와 같이 준비된 트랜스티레틴에 특이적인 항체가 혈액 시료내의 트랜스티레틴과 결합하여 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-표지체 접합체(conjugate) 및 표지체의 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 방법으로는 당분야에 공지된 면역학적 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 효소 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법 (sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법 (Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법 (Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid) 의 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

이후, 혈액 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교함으로써 혈액 시료 중의 트랜스티레틴의 농도를 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 알츠하이머병을 효과적으로 진단하기 위하여 상기 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 구성요소로 포함하는 알츠하이머병 진단키트를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명의 진단키트는,

1) 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체;

2) 트랜스티레틴 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함한다.

상기 진단 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 트랜스티레틴 단백질을 정량분석 또는 정성분석 함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은, 상기 혈액 시료 중의 트랜스티레틴 농도를 측정하는 방법에서 언급된 것과 같은 통상의 ELISA, RIA, 샌드위치 ELISA, 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석, 면역형광측정법, 면역발광측정법 또는 면역크로마토그래피측정법 등의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단 키트를 제공할 수 있다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어 항-토끼 IgG-HRP 접합체 (anti-rabbit IgG-HRP conjugate)를 사용한다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 시료 내 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정한다.

상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액 (phosphate buffer), 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다. 블로킹 용액은 0.1% BSA를 함유하는 인산염 완충용액이, 반응 정지용액은 2 N의 황산용액이 바람직하다.

상기 진단 키트를 이용하여 혈액 시료내 트랜스티레틴 단백질을 검출함으로써 알츠하이머병을 진단하는 방법은 양성 및 음성 대조군과 혈액 시료에 트랜스티레틴 다중클론 항체를 각각 반응시키고, 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표지된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표시된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 상기 기질 함유 용액을 첨가하여 발색 반응시키고, 광밀도를 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 진단 키트로 대조군과 알츠하이머병 환자군에서의 혈중 트랜스티레틴 농도를 측정한 결과, 알츠하이머병 환자군에서의 농도가 정상인과 비교하여 18±2.8%로 유의하게 감소 (P<0.0001)한 것으로 나타났다. 아울러, MMSE 값과 트랜스티레틴의 농도를 비교해 본 결과, 이들간에 통계적으로 유의한 상관관계 (피어슨 상관 계수 r = 0.516; P < 0.0001)를 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항원 단백질을 이용한 알츠하이머병 진단 방법 및 이를 이용한 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 기존에 사용하고 있는 방법과 비교하여 정확도 및 재현성이 높을 뿐만 아니라 매우 간편하여 알츠하이머병의 조기진단에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예: 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅

1. 시험군 및 대조군 선정 및 MMSE 검사

본 연구에는 서울대학교 병원에 내원한 28명의 잠재적 (probable) 알츠하이머병 환자 (평균 나이 63.9±7.8세)와 28명의 정상인 (평균 나이 61.5±8.4세)으로부터 채혈된 혈액이 사용되었다. 알츠하이머병으로 진단된 환자들은 문진 (問診), 신경학적 진찰, 뇌 영상촬영기법인 자기공명영상 (magnetic resonance Imaging; MRI) 혹은 양전자방사단층촬영(positron emission tomography; PET) 등의 검사를 통하여 NINCDS-ADRDA (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke / Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)에서 제시하는 잠재적 (probable) 알츠하이머병 진단 척도에 합당하였다 (Mckhann G. 등, Neurology, 34:939-44, 1984).

대조군 (정상인) 및 시험군 (알츠하이머병 환자) 각각의 특성을 정리하여 하기 표 1에 나타내었다.

검사에 응한 56명 중 4명을 제외한 52명을 대상으로 최소 인지기능 검사(mini-mental state examination; 이하, MMSE)를 수행하였다. MMSE란, 현재 전세계적으로 가장 널리 이용되는 치매 선별 검사로 인지기능의 정도를 대변한다.

본 시험에서는 시험군에서 평균 MMSE 점수 = 20.9±2.9 (범위 12 내지 24), 대조군에서 평균 MMSE 점수 = 26.7±1.4 (범위 25 내지 30)를 기록하였다.

2. 혈액 채취 및 혈청 분리

환자의 혈액을 표준채혈기법에 따라 채혈한 후, 곧바로 응고 활성제 (clot activator)가 처리된 폴리프로필렌 진공채혈관 (Vacuplus, Medigene, Seoul)으로 옮겼다. 상기 혈액을 상온에서 30분간 배양 후, 1100×g에서 15분간 원심분리하여 피브리노겐 (fibrinogen)과 혈액내 세포성분을 제거한 후 상층액으로 분리된 혈청을 얻었다.

3. 웨스턴 블롯팅

상기에서 준비한 혈청을 1×방사능면역침강 완충액 (radioimmunoprecipitation buffer) (RIPA:150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산 (deoxycholic acid), 0.1% SDS 및 50 mM Tris, pH 8.0)으로 1: 25로 희석한 후, 동일량을 10% 트리신 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전개하여 단백질을 분획하여 PDVF (polyvinylidene difluoride) 막 (Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼다.

상기 막을 BSA (bovine serum albumin)를 TBS-T(Tris buffered saline(pH 7.75)/0.05% tween-20)에 3%로 용해시킨 용액에 1: 2,000으로 희석시킨 토끼 항-인간 트랜스티레틴 1차 항체 (Lab frontier, Seoul) 용액으로 처리하여 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 그 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 항-토끼 IgG 2차 항체 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)를 BSA (bovine serum albumin)를 TBS-T (Tris buffered saline (pH 7.75)/0.05% tween-20)에 3%로 용해시킨 용액에 1: 5,000으로 희석시켜 상기의 막에 처리한 후, 다시 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 일어난 단백질은 ECL (Enhanced chemiluminescence; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)로 검출하고, 상 분석기 (Image analyzer; LAS-3000, Fuji, Japan)를 이용하여 분석하였다.

4. 결과 분석 및 MMSE 값과의 비교 분석

검출된 단백질의 양은 농도계 (densitometer; Multi gauge 3.0, Fuji, Japan)로 분석하였고, 모든 비교 수치는 % 평균±SEM (측정표준오차)으로 표현하였다. 대조군과 시험군 사이의 통계적 유의성은 Unpaired t-test로, MMSE 값과 트랜스티레틴 농도와의 상관관계는 피어슨 상관법 (Pearson correlation)으로 분석하였다. 모든 통계적 자료처리는 Graphpad Instat 3.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) 및 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다.

정상인과 알츠하이머병 환자의 혈청내에 존재하는 트랜스티레틴의 발현량을 비교해 보았을 때, 알츠하이머병 환자군에서의 농도가 정상인과 비교하여 18±2.8%로 유의하게 감소 (P<0.0001)한 것으로 나타났다 (도 1a). 아울러, 한 대조군 내의 개인차에 의한 트랜스티레틴 농도의 변화는 대조군 (±3%)과 시험군 (±2.8%) 사이에서 차이를 보이지 않았다. 도 1b에서는 상기 결과를 박스 플롯 분석하여 그래프로 나타내었는데, 그래프에서 박스는 25%에서 75%의 범위를 나타내고, 바는 5%에서 95%의 범위를 나타내며, 각 점은 개개인을 나타낸다. 대조군에서 보이는 트랜스티레틴 농도의 평균을 100으로 보았을 때, 시험군 총 28명 중 10.7%에 해당하는 3명을 제외하고는 모두 정상군에서의 평균값보다 낮은 농도를 나타냈다 (도 1b).

한편, MMSE 검사를 수행한 52명의 MMSE 값과 트랜스티레틴의 농도를 비교해 본 결과, 이들간에 통계적으로 유의한 상관관계 (피어슨 상관 계수 r = 0.516; P < 0.0001)를 확인할 수 있었다 (도 2).

따라서, 상기 결과들로부터 알츠하이머병을 진단하기 위해서 알츠하이머병 환자의 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 이를 정상인과 비교하여 그 값이 상대적으로 떨어지면 (정상인 대비 18±2.8 % 이상 감소) 알츠하이머병의 위험성이 있는 것으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

추가적으로, 알츠하이머병 환자의 혈청에서의 항-Aβ 자가항체의 농도가 정상인에 비해 유의하게 낮았다는 연구 결과 (So J. O. 등, Dementia and Neurocognitive Disorders, 3:37-41, 2004)에 근거하여, 혈청 트랜스티레틴의 농도가 낮아져 있는 알츠하이머병 환자의 항-Aβ 자가항체의 농도를 측정해 본 결과, 이 농도 역시 정상인과 비교하여 유의하게 낮아져 있음 (P<0.05)을 추가로 확인하였다.

상기의 결과는 뇌척수액에 비해 상대적으로 채취가 간편하고 안전한 환자의 혈액을 사용하여 트랜스티레틴과 항-Aβ 자가항체라는 두 가지 표적으로 알츠하이머병을 보다 용이하고 정확하게 진단할 수 있는 가능성을 보여준다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 이용한, 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 알츠하이머병 진단 도구로서 기존의 검사법에 비해 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하고 효율적으로 알츠하이머병을 진단할 수 있어 알츠하이머병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 진단 키트로 알츠하이머병 환자 (시험군) 및 정상인 (대조군)의 혈청내 트랜스티레틴 농도를 비교한 결과를 나타낸 것이고,

도 1b는 상기 데이터를 박스 플롯 분석 (Box plot analysis)한 결과를 나타낸 것이며,

도 2는 혈청 내 트랜스티레틴의 농도와 최소 인지기능 검사 (mini-mental state examination; MMSE) 점수와의 상관관계를 나타낸 그래프이다.

Claims

인간 트랜스티레틴 (Transthyretin) 단백질에 특이적인 항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료 중 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,

1) 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체;

2) 트랜스티레틴 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 2 항에 있어서,

2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,

항원-항체 결합반응을 효소 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법 (sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법 (Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법 (Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid)으로 검출하는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,

트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체가 인간 트랜스티레틴 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난 (卵)으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.