KR20130063229A

KR20130063229A - 단클론항체를 이용한 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단키트

Info

Publication number: KR20130063229A
Application number: KR1020110129644A
Authority: KR
Inventors: 김영호; 김희
Original assignee: (주) 메디프론디비티
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2013-06-14

Abstract

본 발명은 트랜스티레틴 (transthyretin) 단백질에 특이적인 항체인 IgM형 T33 단클론항체를 이용하여 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명의 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 알츠하이머병 진단 도구로서 기존의 검사법에 비해 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하고 효율적으로 진단할 수 있어 알츠하이머병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단클론항체를 이용한 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단키트 {BLOOD DIAGNOSTIC KIT FOR DIAGNOSING ALZHEIMER'S DISEASE USING BY IGM T33 MONCLONAL ANTIBODY}

본 발명의 목적은 혈액을 이용한 알츠하이머병의 용이하고 효과적인 진단 키트를 제공하는 것이다.

[문헌 1] Hardy J. 등, Science, 297:353-6, 2002

[문헌 2] Selkoe D.J., Neuron, 32:177-80, 2001

[문헌 3] Blake C. C. 등, J. Mol . Biol ., 121:339-356, 1978

[문헌 4] Hagen G. A. 등, J. Clin . Endocrinol ., 37:415422, 1973

[문헌 5] Goodman D. S., Raz A., J. Lipid . Res ., 13:338347, 1972

[문헌 5] Ando Y. 등, Arch Neurol, 62: 1057-1062, 2005

[문헌 6] Shirahama T. 등, Am . J. Pathol ., 107:4150, 1982

[문헌 7] Schwarzman A. L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 9:8368-8372, 1994

[문헌 8] Tsuzuki K. 등, Neurosci . Lett ., 281:1714, 2000

[문헌 9] Stein T. D. 등, J. Neurosci ., 22:73808, 2002

[문헌 10] Tang Y. P. 등, J. Alzheimers Dis ., 6:413420, 2004

[문헌 11] Riisoen H., Acta . Neurol . Scand ., 78:4559, 1988

[문헌 12] Serot J. M. 등, J. Neurol . Neurosur . Ps ., 63:5068, 1997

[문헌 13] Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing

본 발명은 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 IgM형 T33 단클론항체를 이용하여 혈액 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는 진단 키트에 관한 것이다.

알츠하이머병 (Alzheimer's Disease)은 나이가 들어감에 따라 나타나는 퇴행성 신경질환의 일종으로 기억력 상실이 그 특징으로 나타난다. 고령화 사회로 접어들면서 그 환자수가 급속히 증가하고 있는 추세이며 알츠하이머병에 대한 사회적, 경제적 부담이 사회문제로 대두되어질 만큼 심각한 상태이다.

알츠하이머병의 병리학적 특징으로는 환자의 뇌에 노인반점(senile plaques)과 신경섬유뭉치(neurofibrillary tangles)가 관찰되며 이로 인하여 신경세포의 소실이 뚜렷이 나타나게 된다. 노인반점의 80% 이상을 베타-아밀로이드(β-amyloid; Aβ)라는 독성 단백질이 차지하고 있는데, 현재 이 베타-아밀로이드 단백질이 알츠하이머병의 주요 병인으로 생각되고 있다. 베타-아밀로이드 단백질은 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein, APP)이 β-세크레타제(β-secretase)와 γ-세크레타제에 의해 순차적으로 잘려져 나온 40 혹은 42개의 아미노산으로 구성되어져 있다. 베타-아밀로이드의 생물학적 기능은 아직 알려져 있지 않으나, 이것이 침착되어 세포 사멸이나 염증반응을 포함하는 일련의 작용들을 촉발시킴으로써 결국 기억 소실을 일으키는 일차 요인으로 작용한다는 것이 다양한 증거들에 의해 뒷받침되고 있다(Hardy J. 등, Science, 297:353-6, 2002). 이 같은 베타-아밀로이드의 침착은 베타-아밀로이드의 과생성 또는 수용성 베타-아밀로이드의 섬유화 (fibrillization)의 증가라는 두 가지 기전으로 분류하여 설명될 수 있는데 (Selkoe D.J., Neuron, 32:177-80, 2001), 이 중 베타-아밀로이드의 섬유화와 관련하여 트랜스티레틴이라는 단백질이 주목받고 있다.

트랜스티레틴(Transthyretin; TTR)은 분자량 55 kDa (508 아미노산)의 단백질로서 베타 평면구조를 가지는 동일한 4개의 단량체(14 kDa)로 구성된 단백질이다 (Blake C. C. 등, J. Mol . Biol ., 121:339-356, 1978).

트랜스티레틴은 뇌량(choroid plexus) 및 간에서 생성되어 각각 뇌척수액 (cerebrospinal fluid: CSF)과 혈액으로 분비되며, L-티록신(T4) 및 레티놀(비타민 A)의 전달자로서 주로 알려져 있다. 뇌척수액 및 혈액 내 티록신 전달의 각각 80%와 20%를 담당하며(Hagen G. A. 등, J. Clin . Endocrinol ., 37:415422, 1973), 레티놀과 레티놀-결합 단백질 (retinol-binding protein; RPB) 복합체에 결합하여 이들을 안정화시키고, 레티놀을 주요 저장 장소인 간으로부터 원하는 세포로 운반하는 간접 운반자의 역할을 수행한다(Goodman D. S., Raz A., J. Lipid . Res ., 13:338347, 1972).

이 외에도, 영양 저하와 장기적인 염증 (chronic inflammation)을 반영하는 척도로도 주목을 받아 왔으며, 트랜스티레틴의 유전자에 변이가 일어난 경우, 가족적 아밀로이드 다발 신경병증(familial amyloidotic polyneuropathy; FAP)이라는 치명적인 유전 질병을 일으킬 수 있다는 것이 알려져 있다(Ando Y. 등, Arch Neurol, 62: 1057-1062, 2005).

알츠하이머병 (AD)의 병리와 관련해서는, 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 나타나는 병변의 하나인 신경섬유뭉치 (neurofibrillary tangle)와 초로성 반점 (neuritic plaques)에서 트랜스티레틴의 존재가 확인되었으며(Shirahama T. 등, Am. J. Pathol ., 107:4150, 1982), 생체외 (in vitro) 조건에서 수용성 베타-아밀로이드에 결합하여 이의 섬유화를 차단한다는 연구 결과가 슈왈츠만 등에 의해 보고된 바 있다 (Schwarzman A. L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 9:8368-8372, 1994). 더욱이, 정상인의 사후 신장조직을 이용하여 수행한 생체외 결합 분석(in vitro binding assay) 결과 트랜스티레틴이 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂와 복합체를 형성하고 있음이 확인되었다(Tsuzuki K. 등, Neurosci . Lett ., 281:1714, 2000).

돌연변이 APP (APP695SWE)를 과발현시킨 알츠하이머병 쥐 모델을 이용한 생체내 (in vivo) 실험에서는, 트랜스티레틴을 해마 (hippocampus)에서 과발현시킬 경우 알츠하이머병-유사 신경퇴행 (AD-like neurodegeneration)이 감소되는 것이 관찰되었고(Stein T. D. 등, J. Neurosci ., 22:73808, 2002), 에스트로겐이 트랜스티레틴 유전자 발현을 증가시킴으로써 알츠하이머병의 발병 위험을 낮춘다는 사실도 보고되었다 (Tang Y. P. 등, J. Alzheimers Dis ., 6:413420, 2004).

상기와 같은 연구들을 종합해 볼 때, 트랜스티레틴은 알츠하이머병에서 노인반을 형성하는 주 물질인 베타-아밀로이드와 결합하여 이의 섬유화를 막음으로써 알츠하이머병 환자에게서 일어나는 유해한 병리학적 사건들을 차단하는 기능을 한다는 것을 예측할 수 있다.

현재까지 트랜스티레틴을 대상으로 한 알츠하이머병 관련 연구는 대부분 뇌척수액 내에 존재하는 트랜스티레틴의 변화에 초점을 맞추어 왔는데, 이에 따르면 뇌척수액 내 트랜스티레틴의 농도가 알츠하이머병 환자에서 유의하게 감소되어있었다(문헌 [Riisoen H., Acta . Neurol . Scand ., 78:4559, 1988] 및 [Serot J. M. 등, J. Neurol . Neurosur . Ps ., 63:5068, 1997]). 반면, 트랜스티레틴의 또 다른 분비 장소인 혈액에 관하여는 알츠하이머병에 따른 변화 양상에 관련된 보고가 전혀 이루어지지 않은 상태이다.

현재 임상적으로 사용되는 알츠하이머병의 진단은 자기공명영상법 (MRI), SPECT (single-photon emission computed tomography) 등을 이용하여 특정 뇌조직 (해마, 피질 등)의 변화양상을 관찰하고, MMSE (mini-mental status examination)와 같은 문진을 통하여 행동과 지각능력의 변화관찰을 종합하여 알츠하이머병으로서 진단을 내리게 된다. 이 외에도, 환자의 뇌척수액으로부터 Aβ₄₂와 Aβ₄₀ 펩티드의 농도비를 측정하여 알츠하이머병 여부를 진단하는 방법이 매우 높은 정확도를 보이는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 진단방법은 고령의 알츠하이머병 환자로부터 뇌척수액을 채취해야하는 어려움이 있어 실제 일반적 진단방법으로는 용이하게 사용될 수 없는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 혈액내 트랜스티레틴 (TTR)의 농도가 알츠하이머병 환자에서 정상인과 비교하여 유의하게 감소해 있다는 사실을 밝히고, 특히 인간 트랜스티레틴 (Transthyretin; TTR) 단백질에 특이적으로 결합하는 IgM형 T33 단클론항체를 발견하고 이의 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료 중 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정함으로서 알츠하이머병을 진단하기 위한 진단 키트로서 알츠하이머병을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인간 트랜스티레틴 (Transthyretin; TTR) 단백질에 특이적으로 결합하는 IgM형 T33 단클론항체를 이용하여 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료 중 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 진단 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 알츠하이머병 환자 및 정상인으로부터 혈청을 채취하여 트랜스티레틴의 농도를 확인한 결과, 알츠하이머병 환자의 혈액에서 트랜스티레틴의 농도가 통계적으로 현저하게 감소해 있음을 최초로 확인하고, 이러한 사실에 착안하여 혈중 트랜스티레틴의 농도를 측정함으로써 알츠하이머병을 진단하는, 일종의 생체외 분석방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 1) 혈액 시료 및 대조군이 코팅 또는 결합된 반응기에 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체, 구체적으로는 IgM 형 T33 단클론항체를 넣어 반응시키는 단계; 2) 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-표지체 접합체 (conjugate) 및 표지체의 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및 3) 혈액 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는, 혈액 시료 중의 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.

상기 반응기로는 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 (96 well plate), 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

상기 트랜스티레틴 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 인간 트랜스티레틴 항원 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난 (卵)으로부터 정제한 것이 바람직하고, 특히 토끼에 면역시켜 얻은 혈청에서 정제한 단일클론 항체가 바람직하다.

상기 트랜스티레틴을 특이적으로 인식하는 항체는 상업적으로 용이하게 입수할 수 있으며, 혹은 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

먼저, 트랜스티레틴 단백질을 공지된 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질의 형태로 제조한다. 예를 들면, NIH 프로그램 GenBank 상에 등록된 트랜스티레틴 유전자의 염기서열을 이용하여 트랜스티레틴 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 트랜스티레틴 단백질을 생산하는 형질전환체를 얻는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간 트랜스티레틴 재조합 단백질을 분리, 정제하는 단계에 의해 트랜스티레틴 재조합 단백질을 제조할 수 있으며, 이렇게 제조한 단백질을 항원으로 사용하여 통상의 방법으로 다중클론 항체를 제조할 수 있다.

인간의 트랜스티레틴 항원의 정제는 혈액 내에 존재하는 트랜스티레틴 단백질을 친화성크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 통해 분리정제한다. 분리정제 순서는 혈청을 분리한 후에 분리된 혈청을 이용하여 양이온 교환 수지 컬럼(anion exchange column)을 통과시키고 최종적으로 친화성크로마토그래피를 티록신(T4)가 결합된 bead를 이용하여 분리한 뒤에 겔여과법(gel filtration)으로 마지막 정제를 수행한다. 상기 정제공정을 가쳐 약 98% 순도를 가진 트랜스티레틴을 확보하여 하기 단클론 항체 생산에 이용한다.

트랜스티레틴 단클론 항체는 기본적인 방법으로 생산하였다. 트랜스티레틴으로 면역반응을 일으킨 생쥐의 비장세포를 분리하여 골수종세포와 시험관내에서 융합반응을 일으켜 불멸화된 B 세포를 얻고 이 불멸화된 B 세포를 개별 클론으로 분리한 후에 96 웰 플레이트를 이용하여 인간 트랜스티레틴을 이용하여 항체의 역가(titer)를 측정하고 일정량 이상의 역가를 보이는 항체클론으로부터 항체를 분리한 후에 Ig typing 을 실시하였다. IgG, IgM type 의 항체를 클론별로 트랜스티레틴 정량곡선을 그려 가장 용량의존성(dose dependency)이 잘 보이는 항체 클론을 선별한다. 항체 클론을 선별한 후에는 샌드위치 엘리자를 구성하기 위해 트랜스티레틴에 대한 정량곡선을 가장 잘 나타낸 항체를 이용하여 Dako 사의 다클론 항체와 조합으로 샌드위치 엘리자 방법를 실시하여 정량곡선을 잘 나타내면서 낮은 농도에서도 OD 값이 높게 나오는 단클론 항체를 선별하였다. 최종적으로 샌드위치엘리자 키트를 구성하는데 사용하기로 선별된 단클론 항체는 IgM type 의 33번 클론으로 결정하였다.

상기와 같이 준비된 트랜스티레틴에 특이적인 단클론 항체가 혈액 시료내의 트랜스티레틴과 결합하여 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-표지체 접합체(conjugate) 및 표지체의 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 방법으로는 당 분야에 공지된 면역학적 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법(Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법(Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid), 멀티플렉싱(multi-plexing)의 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

이후, 혈액 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교함으로써 혈액 시료 중의 트랜스티레틴의 농도를 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 선행발명에 이어 알츠하이머병을 효과적으로 진단하기 위하여 상기 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항체를 구성요소로 포함하는 알츠하이머병 진단키트를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명의 진단키트는,

1) 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 IgM 형 단클론항체;

2) 트랜스티레틴 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함함을 특징으로 한다.

상기 진단 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 트랜스티레틴 단백질을 정량분석 또는 정성분석 함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은, 상기 혈액 시료 중의 트랜스티레틴 농도를 측정하는 방법에서 언급된 것과 같은 통상의 ELISA, RIA, 샌드위치 ELISA, 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석, 면역형광측정법, 면역발광측정법 또는 면역크로마토그래피측정법 등의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단 키트를 제공할 수 있다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어 항-토끼 IgG-HRP 접합체 (anti-rabbit IgG-HRP conjugate)를 사용한다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 시료 내 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정한다.

상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액 (phosphate buffer), 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액이 더욱 바람직하다.

세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다. 블로킹 용액은 0.1% BSA를 함유하는 인산염 완충용액이, 반응 정지용액은 2 N의 황산용액이 바람직하다.

상기 진단 키트를 이용하여 혈액 시료내 트랜스티레틴 단백질을 검출함으로써 알츠하이머병을 진단하는 방법은 양성 및 음성 대조군과 혈액 시료에 트랜스티레틴 다중클론 항체를 각각 반응시키고, 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표지된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표시된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 상기 기질 함유 용액을 첨가하여 발색 반응시키고, 광밀도를 측정하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명에 따른 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 항원 단백질을 이용한 알츠하이머병 진단 방법 및 이를 이용한 진단 키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 기존에 사용하고 있는 방법과 비교하여 정확도 및 재현성이 높을 뿐만 아니라 매우 간편하여 알츠하이머병의 조기진단에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

본 연구를 통해 인간의 트랜스티레틴 특이적인 단클론 항체를 다수 확보하였으며 이들 항체의 특이성을 확인하고 샌드위치 엘리자 키트 구성을 최적화하기 위해 다양한 다클론 항체, 이차 항체 등을 조합하여 새로운 키트를 구성하였다. 생쥐를 면역화시켜 만든 단클론 항체 중에서 IgM type 의 T33 항체를 선별하여 최종 인간 트랜스티레틴 정량키트를 구성하였다. 이로서 기존의 트랜스티레틴을 보다 다 정확하게 정량할 수 있는 키트를 만들어 알츠하이머병의 바이오마커인 트랜스티레틴의 정량을 통해 진단에 기여할 수 있다.

도 1은 그룹1번 IgG type 항체들의 direct ELISA 값을 나타낸 도이며;
도 2은 그룹2번 IgG type 항체들의 direct ELISA 값을 나타낸 도이며;
도 3은 그룹3번 IgG type 항체들과 그룹4번 IgM type 항체들의 direct ELISA 값을 나타낸 도이며;
도 4은 그룹1번 IgG type 항체들의 sandwich ELISA (다클론 항체 코팅) 값을 나타낸 도이며;
도 5은 그룹1번 IgG type 항체들의 sandwich ELISA (단클론 항체 코팅) 값을 나타낸 도이며;
도 6은 그룹2번과 3번 IgG type 항체들의 sandwich ELISA (다클론 항체 코팅) 값을 나타낸 도이며;
도 7은 그룹2번과 3번 IgG type 항체들의 sandwich ELISA (단클론 항체 코팅) 값을 나타낸 도이며;
도 8은 그룹2번과 3번 IgG type 항체중 5개 선별하여 sandwich ELISA 값을 나타낸 도이며;
도 9은 T33-IgM 항체의 sandwich ELISA (다클론 항체 코팅) standard curve를 나타낸 도이며;
도 10은 T33-IgM 항체의 sandwich ELISA (단클론 항체 코팅) standard curve를 나타낸 도이며;
도 11은 웨스턴블랏을 통해 인간트랜스티레틴 항체들의 검출력을 실험하여 나타낸 도이며;
도 12은 본 연구에서 최종 구성한 sandwich ELISA를 이용하여 삼성의료원 샘플을 측정한 standard curve 값을 나타낸 도이며;
도 13은 본 연구에서 최종 구성한 sandwich ELISA를 이용하여 삼성의료원 샘플을 측정한 샘플의 정량값을 나타낸 도이며;
도 14은 본 연구에서 최종 구성한 sandwich ELISA를 이용하여 서울대병원 샘플을 측정한 standard curve 값을 나타낸 도이며;
도 15은 본 연구에서 최종 구성한 sandwich ELISA를 이용하여 서울대병원 샘플을 측정한 샘플의 정량값을 나타낸 도이며;
도 16은 Assaypro kit을 이용하여 삼성의료원 샘플을 측정한 standard curve 값과 정량값을 나타낸 도이며;
도 17은 본 연구에서 최종 구성한 sandwich ELISA kit 과 Assaypro kit을 비교실험하여 삼성의료원 샘플을 측정한 샘플의 정량값을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 단클론 항체의 선별

인간의 트렌스티레틴에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 선별과 샌드위치엘리자 구성에 적합한 항체의 선별과정은 하기와 같다.

1-1. 단클론 항체의 선별 (인간 트랜스티레틴 direct ELISA 방법 이용)

생쥐(Balb/c, 오리엔트바이오)에 인간 트랜스티레틴을 면역시켜 얻은 비장세포와 골수종세포를 융합시켜 얻은 다수의 세포주로부터 항체를 생산하였고(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing) 항체의 농도와 역가(titer)를 측정하고 면역글로블린 형태(immunoglobulin type)를 결정하기 위하여 기존 문헌에 개시된 방법을 이용하여 실험을 수행하였다(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing).

본 실험 결과는 하기 표 1 내지 표 4는 각각의 항체에 대한 농도와 형(type)을 나타낸 것이다. 항체 생산의 순서대로 그룹을 지어 확인하였다.

본 실험 결과, IgG type의 항체는 그룹(group) 1~3이고 그룹 4는 IgM type 의 항체로 확인되었다. 그룹 1은 11개, 그룹2는 18개, 그룹 3는 3개, 그룹 4는 3개 등이었다.

그룹1	Conc . ( mg / ml )	Vol . ( ml )
T4	2.26	2
T9	3.54	2
T18	1.64	2
T22	0.37	2
T24	0.72	2
T37	2.11	2
T38	1.69	2
T39	1.28	2
T40	0.94	2
T45	0.70	2
T47	1.35	2

그룹2	Conc.(mg/ml)	Vol.(ml)
T1	1.87	2
T5	2.8	2
T7	2.33	2
T8	2.31	2
T10	1.17	2
T12	1.83	2
T13	4.15	2
T14	0.88	2
T16	1.3	2
T17	0.56	2
T20	1.4	2
T26	0.62	2
T31	0.61	2
T32	2	2
T35	1.37	2
T41	1.63	2
T42	0.62	2
T44	1.78	2

그룹3	Conc. (mg/ml)	Vol. (ml)
T2	0.78	1.5
T29	1.308	1.5
T34	2.26	1.5

그룹4	Conc . ( mg / ml )	Vol . ( ml )
T2	3.775	1.5
T32	3.075	1.5
T33	0.958	1.5

1-2. 항체의 역가 측정

상기 단계에서 얻은 항체가 확보된 35개의 클론에서 각각 인간 트랜스티레틴을 포집하는 항체의 능력을 확인하기 위해 직접(direct) ELISA 방법으로 문헌에 개시된 방법을 응용하여 항체의 역가(titer) 측정을 수행하였다 (Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing).

본 direct ELISA 방법은 항원을 플레이트(plate)에 직접 도포하고 이것을 항체로 포집해보는 방법으로서 실험방법은 하기와 같은 순서로 수행하였다.

(1) 코팅(coating) 단계: RT(상온), O/N (20mM carbonate pH 9.6), 0.2ug/ml 농도 조건으로 인간 트랜스티레틴을 plate(2503, Corning) 에 코팅하고,

(2) 봉쇄(blocking) 단계: 상온(RT), 30분 (1% BSA in PBS) 조건으로 처리하고,

(3) 1차 항체(1’Ab) 반응 단계: 37℃, 1시간 (hybridoma cell sup.) 동안 반응시키고

(4) 세척(washing) 단계: 3회 세척으로 수행하고,

(5) 2차 항체 (2’Ab) 반응단계: 37’C, 30분간 (HRP conjugated goat anti mouseG/ Ig M) 반응시키고,

(6) 세척(washing) 단계: 3회 세척으로 수행하고,

(7) TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) 반응 상온에서 30분간 TMB 반응을 수행하고,

(8) 0.16 M sulfuric acid를 이용하여 반응을 정지시키고,

(9) 판독 단계: OD450 판독(reading)을 기기(ELISA reader, TECAN)로 수행하였다.

본 실험 결과,

하기 표 5 내지 표 8에 나타난 바와 같이, direct ELISA 결과에서 450nm에서 흡광도값이 0.5를 넘는 것이 역가(titer)가 좋은 것이다. 그룹 4의 IgM type 항체들의 역가는 낮았고 IgG 형(type) 항체들은 32개 중에 8개의 항체가 흡광도 0.5이하였고 대부분 0.5를 넘는 수치를 나타냈다.

그룹1	OD450
1/100 NMS	0.013
1/100 항혈청	0.815
T4	0.613
T9	0.671
T18	0.600
T22	0.597
T24	0.537
T37	0.519
T38	0.422
T39	0.193
T40	0.673
T45	0.457
T47	0.534

그룹2	OD450
1/100 NMS	0.013
1/100 항혈청	0.815
T1	0.562
T5	0.620
T7	0.568
T8	0.598
T10	0.629
T12	0.619
T13	0.438
T14	0.537
T16	0.609
T17	0.487
T20	0.717
T26	0.583
T31	0.566
T32	0.515
T35	0.555
T41	0.568
T42	0.618
T44	0.460

그룹3	OD450
1/100 NMS	0.013
1/100 항혈청	0.815
T2	0.604
T29	0.218
T34	0.134

그룹4	OD450
1/100 NMS	0.013
1/100 항혈청	0.815
T2	0.126
T32	0.354
T33	0.221

1-3. 항체농도에 따른 역가 측정

상기 단계에서 얻은 결과를 토대로 항체의 titer를 보다 세밀하게 확인하기 위해 코팅되는 인간트랜스티레틴의 농도를 점진적으로 높여가면서 문헌에 개시된 방법을 응용하여 항체의 역가(titer) 측정을 수행하였다(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing).

실험방법은 하기 표 9에 개시된 바와 같이 수행하였으며 각각의 항체는 0.5mg/ml stock 용액을 1/100 희석하여 실험하였다. 코팅하는 인간 트랜스티레틴은 0, 62.5, 125, 250 ng/ml의 농도로 준비하였다.

1	4℃에서 웰( Costa flat well OVN)에 완축액중(coating buffer; 0.05M Carbonate-bicarbonate, pH9.6) 희석된 100ul 단백질(TTR standard protein , Sigma )을 코팅하였다
2	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
3	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)에서 배양하였다.
4	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
5	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 희석된 단일 항체100ul를 배양하였다.
6	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
7	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 1: 2000 희석된 2차 항체(Anti-mouse HRP or Anti-Rabbit HRP) 100ul를 배양하였다.
8	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
9	상온에서 30분간 100ul TMB 용액으로 배양하였다.
10	정지용액(stop solution; 0.16M sulfuric acid)을 가하여 반응을 정지시키고 기기로 측정(450nm)하였다.

그룹 4의 IgM type 항체의 경우에는 동일한 방법을 수행하되(표 10) 이차항체를 넣는 step 9 에서 anti-mouse IgM secondary antibody를 사용하였고 희석배수는 1/20으로 하였다.

1	4℃에서 웰( Costa flat well OVN)에 완축액중(coating buffer; 0.05M Carbonate-bicarbonate, pH9.6) 희석된 100ul 단백질(TTR standard protein ; Sigma)을 첨가하였다
2	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
3	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)에서 배양하였다.
4	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
5	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 희석된 단일 항체100ul를 배양하였다.
6	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
7	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 1: 20 희석된 2차 항체( Anti - mouse IgM - HRP ) 100ul를 배양하였다.
8	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
9	상온에서 30분간 100ul TMB 용액으로 배양하였다.
10	정지용액(stop solution; 0.16M sulfuric acid)을 가하여 반응을 정지시키고 기기로 측정(450nm)하였다.

상기 실험결과, 각각의 그룹별 direct ELISA 값은 도 1 내지 도 3에 나타냈으며, 인간의 트랜스티레틴을 바닥에 깔고 이를 측정하는 항체의 역가를 확인한 것으로 흡광도가 높을수록 좋은 역가를 가지는 것이다. 각각의 항체에 대한 흡광도는 Y 축에 표시하고 X 축은 각각의 항체를 나타내었다. 도1은-도3은 IgG type 의 항체와 IgM type 항체에 대한 direct ELISA 흡광도 값을 나타내었다.

인간트랜스티레틴 direct ELISA를 통해 확인된 항체들의 역가(titer) 및 배경(background) 문제를 종합적으로 검토하여 보면, 트랜스티레틴이 없는 음성구간에서 흡광도가 매우 낮아야하고 트랜스티레틴이 농도에 따라 증가할 때 함께 잘 증가해주며 최고 농도에서 흡광도값이 가능한 1.0 이상이 되는 항체가 샌드위치 엘리자를 위한 구성에 필요할 것으로 생각되었다. 각 항체의 역가를 확인하여 표준(standard) 물질의 용량의존성(dose dependency)를 보이는 것을 하기 표 11에 정리하였다.

그룹 1	그룹 2	그룹 3	그룹 4
T18	T5	T2	T33 - IgM
T22	T12
T37	T13
T39	T14
T40	T16
T45	T17
T47	T20
	T35
	T41
	T42
7 ea	10 ea	1 ea	1 ea

1-2. 최적 항체의 선별 1

실험예 1-1에서 선별된 항체 총 19개에 대해 샌드위치 엘리자 구성이 적합한지 확인하기 위해 DAKO 사의 다클론 항체(polyclonal antibody, DAKO)를 구입하여 Dako 사의 다클론 항체와 본 연구에서 선별한 단클론 항체를 교차로 코팅 또는 검출 항체로 사용하여 어떠한 조합이 가장 인간 트랜스티레틴을 정량적으로 잘 검출하는지 확인하기 위하여 문헌에 개시된 샌드위치(sandwich) ELISA 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing).

우선 그룹1에서 선별한 7개의 항체를 DAKO 사의 다클론 항체와 교차 실험을 실시하였다. 샌드위치 엘리자 방법은 하기 표 12 및 표 13에 설명한 바와 같다.

1	4℃에서 웰( Costa flat well OVN)에 완축액중(coating buffer; 0.05M Carbonate-bicarbonate, pH9.6) 희석된 100ul capture antibody(1:1000D)을 첨가하였다
2	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
3	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)에서 배양하였다.
4	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
5	상온에서 1시간 동안 차단용 완충액으로 희석된 100ul TTR 표준액(TTR standard; Sigma)을 첨가하였다.
6	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
7	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 희석된 detection antibody 100ul를 배양하였다.
8	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
9	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 1: 2000 희석된 2차 항체secondary antibody(Anti-mouse HRP) 100ul를 배양하였다.
10	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
11	상온에서 30분간 100ul TMB 용액으로 배양하였다.
12	정지용액(stop solution; 0.16M sulfuric acid)을 가하여 반응을 정지시키고 기기로 측정(450nm)하였다.

사용된 항원 및 항체 제조

항원(antigen) : TTR Standard 1mg/ml=> dilution with blocking buffer 0, 62.5, 125, 250ng/ml

포획 항체(Capture antibody) : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

탐지 항체(detection antibody) : TTR monoclonal antibody 7ea 0.5mg/ml 1:100 dilution

2차 항체(Secondary antibody) : Anti-mouse IgG antibody 1:2000 dilution with blocking buffer

본 실험 결과, DAKO 다클론 항체를 코팅하고 그룹1에서 선별한 항체로 검출해보면 도 4와 같이 표준(standard) 물질의 용량(dose)에 따라 흡광도가 증가하지 않아 샌드위치 엘리자로 조합이 적절하지 않음을 확인하였다.

1-3. 최적 항체의 선별 2

실험예 1-2의 결과를 토대로 하여 이번에는 역으로 코팅과 검출 항체를 바꾸어 샌드위치 엘리자를 문헌에 개시된 샌드위치(sandwich) ELISA 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Publishing, 표14).

사용된 항원 및 항체 제조

antigen : TTR Standard 1mg/ml=> dilution with blocking buffer 0, 62.5, 125, 250ng/ml

Capture antibody : TTR monoclonal antibody 7ea 0.5mg/ml 1:100 dilution

detection antibody : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

Secondary antibody : Anti-rabbit IgG antibody 1:2000 dilution with blocking buffer

본 실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 표준(standard) 물질에 대해 용량 의존성(dose dependency)를 보이지만 background가 매우 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

1-4. 항원-항체 반응 검증

T18과 T40 항체에 대해 희석배수나 표준(standard) 물질의 양에 변화를 주어서 보다 정확한 항원-항체 반응을 확인하였다.

본 실험 결과, 하기 표 15 내지 표 16에 나타난 바와 같이, T18과 T40 항체의 경우 1:200 희석하여 코팅항체로 사용하고 DAKO 항체로 검출했을 때 dose dependency가 잘 보였으나 여전히 배경(background)문제는 존재했고 첫 번째 그룹에서는 T18 항체의 행동 패턴(pattern)이 가장 좋았음.

	T18 1:200D
TTR conc. (ng/ml)	AVR	SD
0	0.291	0.010
62.5	0.318	0.009
125	0.352	0.018
250	0.424	0.012
500	0.588	0.023
1000	0.843	0.020
2000	1.342	0.011
4000	1.899	0.045

T40	T40 1:200D
TTR conc.(ng/ml)	AVR	SD
0	0.227	0.004
62.5	0.242	0.001
125	0.256	0.004
250	0.282	0.004
500	0.341	0.001
1000	0.440	0.016
2000	0.614	0.008
4000	0.899	0.007

상기와 동일한 방법으로 그룹 2, 3차에서 선택된 항체 각각을 다클론 항체 코팅, 단클론 항체 검출 방법으로 샌드위치 엘리자를 수행하였다.(표 17)

Capture antibody : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

detection antibody : TTR monoclonal antibody 11ea 0.5mg/ml 1:100 dilution

Secondary antibody : Anti-mouse IgG antibody 1:2000 dilution with blocking buffer

본 실험 결과, 그룹 2, 3차에서 선택된 11개의 항체에 대해 DAKO 다클론 항체로 코팅 후 standard 물질을 검출해보았으나 dose dependency 가 보이지 않음을 확인하였다.(도 6)

추가적으로 상기 방법과 유사한 과정으로 단클론 항체 코팅과 다클론 항체 검출 방법으로 바꾸어 실시하였다.(표 18)

Capture antibody : TTR monoclonal antibody 11ea 0.5mg/ml 1:100 dilution

detection antibody : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

본 실험 결과, T17과 T41의 경우 background 가 높아 결과 그래프에서 제외하고 나머지 항체에 대해 결과를 확인하면 도 7과 같다.

상기 실험 결과 전체적으로 흡광도가 낮아 standard 양을 늘려서 재실험을 수행하여보았다. 재실험은 T5, T13, T14, T20, T35 다섯개의 항체에 대해서만 수행하였다 (희석배수는 1:200).

본 실험 결과, 다섯 개의 항체 중에서는 T13과 T20이 dose dependency를 잘 보였으나 여전히 standard 농도를 올려야 흡광도가 1이상 되는 것으로 항체의 titer 가 다른 것에 비해 낮은 것으로 생각되었다.

추가적으로 상기 방법과 유사한 과정으로 그룹4의 IgM type 항체는 T33의 경우만 샌드위치 엘리자를 실험하였다.(표 19)

antigen : TTR Standard 1mg/ml=> dilution with blocking buffer 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000ng/ml

Capture antibody : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

detection antibody : TTR monoclonal antibody T33-IgM 0.5mg/ml 1:1000 dilution

Secondary antibody : Anti-mouse IgM antibody 1:20 dilution with blocking buffer

본 실험 결과, DAKO 다클론 항체를 코팅 항체로 하고 단클론 항체를 검출항체로 했을 때 그룹 1~3 에 해당하는 IgG type 항체들은 standard curve가 그려지지 않았는데 IgM type 항체의 경우 curve가 그려졌으며 또한 T33-IgM 항체의 경우에 1/100 희석을 하지 않고 더 많이 희석해도 충분히 OD 값이 올라가므로 titer가 좋음을 알 수 있었다(표 20 및 도 9).

T33 - IgM detection 1:1000 Dilution
TTR (ng/ml)	OD450nm		AVR	SD
0	0.047	0.047	0.047	0.000
7.8125	0.139	0.115	0.127	0.017
15.625	0.193	0.272	0.233	0.056
31.25	0.312	0.225	0.269	0.062
61.5	0.352	0.38	0.366	0.020
125	0.692	0.68	0.686	0.008
250	0.782	0.734	0.758	0.034
500	1.347	0.831	1.089	0.365
1000	1.102	0.974	1.038	0.091
2000	1.109	1.05	1.080	0.042
4000	1.034	1.049	1.042	0.011

추가적으로 상기 방법과 유사한 과정으로 반대로 T33을 코팅하고 DAKO 다클론 항체를 검출 항체로 실험을 수행하였다.(표 21)

Capture antibody : TTR monoclonal antibody T33-IgM 0.5mg/ml 1:200 dilution

detection antibody : DAKO TTR polyclonal antibody 0.5mg/ml=> 1:1000 dilution

antigen : TTR Standard 1mg/ml=> dilution with blocking buffer 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000ng/mlSecondary antibody : Anti-rabbit IgG antibody 1:2000 dilution with blocking buffer

TTR conc.	AVR	SD
0	0.080	0.001
62.5	0.402	0.033
125	0.678	0.040
250	1.097	0.059
500	1.654	0.052

본 실험 결과, T33-IgM 항체의 경우 DAKO 사의 다클론 항체와 코팅항체, 검출항체의 자리를 바꾸어 실험을 해도 다 잘 작동됨을 알았고 background 도 매우 낮음을 알 수 있었다. 그리고 항체의 titer도 높아 추후 샌드위치 엘리자 키트를 제작하기에 적절한 것으로 평가되었다.(표 22 및 도 10)

1-5. T33 - IgM 항체의 효능 검증

T33-IgM 항체의 특징을 확인하기 위해 상업적으로 구입 가능한 항체들과 그 효능을 비교하였다. 효능의 비교는 타사의 항체와 함께 인간 트랜스티레틴의 어떤 구조를 검출할 수 있는지 Western blot을 통해 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Methods in Enzymology 및 표 23).

인간트랜스티레틴 1mg/vial 의 powder 를 1ml 에 녹인다.

100 ng의 트랜스티레틴을 sample loading buffer 에 섞은 후 -/+ boiling 한 후에 4~12% NuPAGE/MES buffer 조건에서 gel running 을 하고 PVDF membrane 으로 transfer 한다.

Gel 의 일부는 은염색 수행 (Sigma Silver staining kit 이용).

PVDF membrane 으로 transfer 한 것은 3개로 나누어 서로 다른 항체를 이용하여 Western blot을 수행한다.

실험에 사용한 항체;
#1. LabFrontier anti-TTR polyclonal antibody (1:2000)
#2. Santacruz anti-TTR monoclonal antibody (1:1000)
#3. T33-IgM-HRP (1:1000)

본 실험 결과, 타사 #1 항체의 경우 주로 denatured (or monomer) 상태의 TTR 에 높은 reactivity를 보였고, 타사 #2 항체의 경우 non-denatured(or aggregated) 상태의 TTR 에 보다 높은 reactivity를 보였다. 또한 자사의 T33-IgM type 항체의 경우 주로 denatured(or monomer)와 non-denatured(or aggregated) 상태의 트랜스티레틴에 대해 모두 높은 reactivity를 보였다. 따라서 T33-IgM 항체의 경우 상업적으로 구입할 수 있는 타사의 항체에 비해 다양한 형태의 TTR 을 모두 검출 할 수 있는 장점을 가지고 있음을 확인하였다.(도 11)

실시예 2. 키트의 유효성 검증

상기 실시예에서 얻은 항체를 니용한 키트의 유효성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 환자 혈청을 이용한 샌드위치 엘리자로 키트의 유효성을 확인하였다.

2-1. 샌드위치 엘리자 방법

T13-IgG type의 항체와 T33-IgM type항체 두 가지를 이용하여 DAKO 다클론 항체와 조합하여 인간 트랜스티레틴 정량키트를 구성하여 알츠하이머병 환자 및 정상의 혈액을 이용하여 임상을 실시하였고 하기 표 24의 과정으로 샌드위치엘리자를 진행하였다. 이 실험에 사용된 정상 및 환자 혈청은 삼성의료원과 서울대병원의 IRB를 통과한 것으로 삼성의료원과 서울대병원의 진단검사의학과에서 제공된 것이다.

1	4℃에서 웰( Costa flat well OVN)에 완축액중(coating buffer; 0.05M Carbonate-bicarbonate, pH9.6) 희석된 100ul capture antibody (1:200D)을 첨가하였다
2	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
3	상온에서 2시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)에서 배양하였다.
4	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
5	상온에서 1시간 동안 100ul TTR standard 및 차단용 완충액으로 희석된 100ul 혈청 시료(serum sample )을 첨가하였다.
6	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
7	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 희석된 detection antibody 100ul를 배양하였다.
8	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
9	상온에서 1시간 동안 완충액(200ul, Blocking buffer; 5% BSA+PBS)으로 1: 2000 희석된 2차 항체secondary antibody(Anti-Rabbit HRP) 100ul를 배양하였다.
10	흡입(aspirate)시키고 PBST(생리식염수에 Tween 0.1%)으로 4회 세척하였다.
11	상온에서 10분간 100ul TMB 용액으로 배양하였다.
12	정지용액(stop solution; 0.16M sulfuric acid) 100ul을 가하여 반응을 정지시키고 기기로 측정(450nm)하였다.

본 실험 결과, T13-IgG type의 항체를 이용했을 경우에 키트 구성이 올바르게 되지 않았으며, T33-IgM type의 항체를 코팅하고 DAKO 다클론 항체를 검출항체로 키트를 구성하여 유의한 결과를 얻을 수 있었다. 혈청을 serial dilution하여 실험을 수행했고 1/250 ~ 1/4,000까지 희석을 해서 최종 1/4,000 희석의 경우에서 인간 트랜스티레틴이 잘 정량됨을 확인할 수 있었다. 또한 standard curve 는 R² 값이 0.9904 로 잘 그려졌으며, 삼성의료원 제공의 혈청내의 트랜스티레틴 정량치를 확인하여보니 정상인의 혈청보다 환자의 혈청에 트랜스티레틴의 양이 적음을 알 수 있었다.(도 12 내지 도 13)

또한, 동일한 조건에서 서울대병원에서 제공된 알츠하이머병 환자와 정상인의 혈청을 분석해보았다. 마찬가지로 standard curve 가 잘 그려졌으며 (R² 값이 0.9904) 정상인의 혈청보다 환자의 혈청에서 트랜스티레틴의 정량치가 낮게 나타났다.(도 14 내지 도 15)

1-2. 타 정량 키트와의 비교

본 발명에서 제작하여 사용하는 정량키트와 상업적으로 판매되는 정량키트 비교하기 위하여 비교용 키트(Assaypro human prealbumin ELISA kit; Assaypro Company, 30 Triad South Drive, St. Charles, MO 63304)을 구입하여 비교 실험을 하기 표 25와 같은 순서로 실험을 수행하였다.

본 실험에 사용된 혈청은 2006년에 수집된 삼성의료원의 정상 및 환자 혈청을 이용하였다.

1	각 웰에 50ul of 표준물질(standard)/웰(microplate well)로 가하고 상온에서 2시간 동안 배양하였다.
2	200ul 완충액(ELISA Wash buffer)으로 5회 세척하였다
3	상온에서 1시간 동안 50ul 비오틴화 항체(Biotinylated prealbumin antibody; 1:10 dilution with EIA diluent)으로 배양하였다.
4	200ul 완충액(ELISA Wash buffer)으로 5회 세척하였다
5	RT상온에서 30분 동안 50ul Streptavidin-peroxidase conjugate (1:10 dilution with EIA diluent)으로 배양하였다.
6	200ul 완충액(ELISA Wash buffer)으로 5회 세척하였다
7	상온에서 10분간 50ul 기질(Chromogen substrate)로 배양하였다.
8	정지용액(stop solution; 0.16M sulfuric acid) 50ul을 가하여 반응을 정지시키고 기기로 측정(450nm)하였다.

본 실험 결과, Assaypro에서 구입한 트랜스티레틴 정량키트의 결과도 유사하게 정상인에서 높고 환자에서 낮게 정량이 되었다(도 16). 상업적으로 구입할 수 있는 정량키트와 본 연구에서 개발한 키트를 비교하기 위해 두 개의 키트로 정량한 결과를 하기 표 26에 표시하였다.

2006년삼성의료원	MedifronTTR ELISA		Assaypro TTR ELISA
원액농도(ug/ml)	AVR	SD	AVR	SD
정상인군(4ea)	361.6	19.1	404.3	10.3
환자군(4ea)	251.6	53.1	257.6	40.6
% of control	AVR	SD	AVR	SD
정상인군(4ea)	100.0	5.3	100.0	2.5
환자군(4ea)	69.6	14.7	63.7	10.0

두 개의 서로 다른 엘리자 키트를 이용하여 얻은 결과로 매우 유사한 결과를 나타냄을 보아 본 발명의 키트 구성이 틀림이 없음을 입증할 수 있다.(도 17)

그 외 DAKO 다클론 항체외에 Labfrontier 의 다클론 항체를 대체해서 실험을 수행하거나 secondary antibody를 Chemicon, Sigma 등에서 구입을 하여 실험을 수행하여 최적의 조건을 확립했다.

최적화된 조건의 트랜스티레틴 정량키트(이하 메디프론 키트)를 이용하여 Assaypro kit (Assaypro human prealbumin ELISA kit)와 ICL kit (ICL human prealbumin ELISA kit) 세가지를 정량적으로 확인된 혈청샘플을 이용하여 정확도를 비교하였다.

하기 표 27에서 보는 것처럼 다이아몬드로 표시된 정량치에 본 연구에 사용한 키트와 Assaypro kit이 근접한 정량치를 나타내었으며 특히 1번 샘플의 경우 자사의 정량치가 더 가까웠으며 2번 샘플의 경우에는 타사의 정량치는 벗어났으나 메디프론 kit의 정량치는 정확히 일치했고 3, 4번 샘플의 경우에도 메디프론 kit 이 Assaypro kit 과 유사하거나 더 정확한 정량치를 보였다. ICL kit의 경우에는 전반적으로 낮은 농도로 정량곡선이 나와 정량의 유의성이 없었다.

Claims

인간 트랜스티레틴 (Transthyretin) 단백질에 특이적인 IgM 형 T33 단클론항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료 중 트랜스티레틴 단백질의 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하기 위한 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
1) 트랜스티레틴 단백질에 특이적인 IgM 형 T33 단클론항체;
2) 트랜스티레틴 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;
3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;
4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;
5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및
6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 2 항에 있어서,
2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
항원-항체 결합반응을 효소 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법 (sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법 (Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법 (Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid)으로 검출하는 것을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
트랜스티레틴 단백질에 특이적인 IgM 형 T33 단클론항체가 인간 트랜스티레틴 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난 (卵)으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 혈액용 진단 키트.