JP5767746B2 - 細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法 - Google Patents

細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用分析方法を利用した、細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法に関し、また実際細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子水準まで分析することができると共に、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を観測するに際して第１タンパク質を提供する細胞の種類を異ならしめてこれを比較することによって、各細胞の状態及び第１タンパク質の活性化程度を比較診断することができるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を利用した、実験群細胞と対照群細胞での活性化された特定タンパク質の濃度を定量的に比較測定することができる細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法に関する。
細胞は、多様で且つ複雑なタンパク質−タンパク質相互作用を通じて遺伝子表現、細胞成長、細胞周期、代謝、信号伝逹などの様々な生物学的機能を行うことによって、生命現象を維持している。したがって、細胞内でのタンパク質−タンパク質相互作用及び相互作用の機能を理解することは、生命現象を理解する礎石となり、新薬開発及び疾病治療の重要な基盤になる。
試験管内でタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法としては、代表的な方法として親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍｏａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法がある。
タンパク質親和性クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の場合、精製されたタンパク質を用意しなければならないという不都合がある。また、タンパク質間の相互作用確認が試験管内で起きるので、細胞内では相互作用しないタンパク質がカラムを通過する間に、静電気的相互作用によって結合するもののように見られる偽陽性（False positive）結果を導き出すことができる。
すなわち、定量的測定のために従来技術によるタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を分析するために、細胞内に存在するそれぞれのタンパク質を精製し、これらを細胞内の他の物質と分離した状態で相互作用を分析するので、他のタンパク質などが混在している実際細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子水準で分析することはできないという限界がある。
しかも、従来技術によるタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法は、他の状態の細胞で提供されるタンパク質の特定タンパク質との相互作用の観察によってその活性化程度を比較診断することができないという限界がある。
また、従来、実験群細胞と対照群細胞での活性化された特定タンパク質の濃度を定量的に比較測定することができないという限界があった。
したがって、本発明の目的は、実際細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子水準まで分析することを利用した、細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を観測するに際して第１タンパク質を提供する細胞の種類を異ならしめてこれを比較することによって、各細胞の状態及び第１タンパク質の活性化程度を比較診断することができるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を利用した、実験群細胞と対照群細胞での活性化された特定タンパク質の濃度を定量的に比較測定することができる細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法を提供することにある。
上記目的を達成するための本発明による細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法において、
（ａ）第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板を具備する段階と；
（ｂ）前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液を前記基板に供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；
（ｃ）前記基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
（ｄ）前記基板での前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；
（ｅ）前記（ｂ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度を所定の比率で増加させながら、前記（ｂ）段階乃至前記（ｄ）段階を繰り返す段階と；
を含み、
前記（ｄ）段階は、
前記基板上の任意に設定された観測領域での、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生周期を測定する段階；前記複数の観測領域での蛍光信号の周波数の平均値を測定する段階；測定した前記周波数の平均値が増加する時点の前記（ｅ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度値である臨界濃度値を獲得する段階；及び前記臨界濃度値に基づいて前記第１タンパク質の濃度を測定する段階；を含み
前記（ｄ）段階で前記第２タンパク質と相互作用をする前記第１タンパク質は、前記第１タンパク質結合分子体に結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質である（以下、該細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法を「第１の態様」ということがある）。
また、前記（ｄ）段階は、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする。
一方、細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法において、
（ａ）対照群細胞溶液に含まれる第１タンパク質と実験群細胞溶液に含まれる第１タンパク質とがそれぞれ結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体がそれぞれ付着した少なくとも２つの基板を具備する段階と；
（ｂ）前記対照群細胞溶液に含まれた第１タンパク質を前記２つの基板のうち第１基板に供給し、前記実験群細胞溶液に含まれた第１タンパク質を前記２つの基板のうち第２基板に供給し、前記第１基板及び前記第２基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合をそれぞれ誘導する段階と；
（ｃ）前記第１基板及び前記第２基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体がそれぞれ結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を前記第１基板及び第２基板にそれぞれ供給する段階と；
（ｄ）前記第１基板及び前記第２基板での前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を比較分析する段階と；
（ｅ）前記（ｂ）段階での前記対照群細胞溶液及び前記実験群細胞溶液中の前記第１タンパク質の濃度を所定の比率でそれぞれ増加させながら、前記（ｂ）段階乃至前記（ｄ）段階を繰り返す段階と；を含み、
前記（ｄ）段階は、前記第１基板及び前記第２基板上のそれぞれ任意に設定された複数の観測領域での、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生周期をそれぞれ測定する段階；
前記第１基板及び前記第２基板上のそれぞれ任意に設定された前記複数の観測領域での、蛍光信号の周波数の平均値をそれぞれ測定する段階；
前記第１基板及び前記第２基板でそれぞれ測定した前記周波数の平均値が増加する時点の前記（ｅ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度値である臨界濃度値をそれぞれ獲得する段階；及び
前記第１基板及び前記第２基板でそれぞれ獲得した前記臨界濃度値に基づいて前記第１タンパク質の濃度を測定する段階；を含み
前記（ｄ）段階で前記第２タンパク質と相互作用をする前記第１タンパク質は、前記第１タンパク質結合分子体に結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質である（以下、該細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法を「第２の態様」ということがある）。
好ましくは、前記対照群細胞は正常状態の細胞であり、前記実験群細胞は非正常状態の細胞又は前記正常状態の細胞から変化した癌細胞を含む細胞である。
また、前記（ｄ）段階は、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする。
本発明によれば、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を観測するに際して第１タンパク質を提供する細胞の種類を異ならしめてこれを比較することによって、各細胞の状態及び第１タンパク質の活性化程度を比較診断することができる。
なお、本発明によれば、実際細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子水準まで分析することができる。
なお、本発明によれば、実験群細胞と対照群細胞での活性化された特定タンパク質の濃度を定量的に測定することができる。
本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。 本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法の各段階を説明する図である。 本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法の各段階を説明する図である。 本発明の他の実施例での細胞状態変化過程を説明する図である。 本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。 対照群細胞内の第１タンパク質が結合された第１基板で観測された信号を示すグラフである。 実験群細胞内の第１タンパク質が結合された第２基板で観測された信号を示すグラフである。 本発明の他の実施例による実験群細胞と対照群細胞での活性化されたタンパク質の濃度比較方法を説明する図である。 実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度を順次に増加させながら第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を測定した実験結果を示す図である。 実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度増加によって測定された蛍光信号を測定したグラフである。 実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度増加によって測定された蛍光信号を測定したグラフである。 対照群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度増加によって測定された蛍光信号を測定したグラフである。 対照群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度増加によって測定された蛍光信号を測定したグラフである。 実験群細胞及び対照群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度増加によってそれぞれ測定された周波数の変化を比較するグラフである。
以下、図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。図面において、同一の構成要素は、できるだけ同一の参照符号で示していることに留意しなければならない。また、本発明の同一の構成に対する説明は繰り返して記載しない。

（１）細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法（第１の態様）
図１は、本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。図１を参照して、本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明すれば、まず、分析者は、特定の２つのタンパク質である第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子水準で分析するために、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）コーティング処理されたクオーツスライド（Ｑｕａｒｔｚ Ｓｌｉｄｅ）である基板に、第１タンパク質と結合される抗体である第１タンパク質結合抗体（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を図２のように付着する（Ｓ１１０）。
本発明による実験において、第１タンパク質は、ｈ−Ｒａｓタンパク質であり、第２タンパク質は、Ｃ−ＲａｆのＲａｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）タンパク質である。
一方、本発明を実施するに際して、第１タンパク質と結合する抗体には、抗体以外にも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質と結合する特定成分を有するリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの第１タンパク質と結合する生体分子体が使用されることができる。
次に、分析者は、第１タンパク質が含まれている細胞の細胞質原液を基板に供給することによって（Ｓ１２０）、第１タンパク質と第１タンパク質結合抗体の結合を誘導する（Ｓ１３０）。
一方、前述したＳ２２０段階を実施するに際して、細胞質原液だけでなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈または精製された細胞原液などの細胞溶液が使用されることができる。
一方、本発明を実施するに際して、分析者は、第１タンパク質にｍ−Ｃｈｅｒｒｙなどの所定の第１蛍光タンパク質が発現されるように事前処理することができ、この場合に、第１タンパク質結合抗体と第１タンパク質が結合された場合に、分析者が全反射顕微鏡を利用した基板の表面観察を行うと、分析者は、第１タンパク質に発現されている第１蛍光タンパク質による波長変化から（すなわち、第１蛍光タンパク質から発生する個々の単分子信号を測定し）基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体に第１タンパク質が結合されたか否かを確認することができる。
すなわち、第１タンパク質に第１蛍光タンパク質が発現された場合には、第１タンパク質の抗体との結合可否を全反射顕微鏡を用いて把握することができるので、基板に付着した抗体と結合された第１タンパク質の個数及びそれによる結合密度を正確に測定することができる。
基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体にそれぞれ第１タンパク質が結合されたものと確認されれば、分析者は、基板にバッファー溶液を供給することによって、第１タンパク質を除いた細胞質原液に含まれている残りの物質を基板上で除去する（Ｓ１４０）。
次に、分析者は、前述した細胞と同一の他の細胞で当該細胞に存在する第２タンパク質に遺伝子組換えを通じて第２蛍光タンパク質が発現されるように操作する（Ｓ１５０）。一方、本発明を実施するに際して、第２蛍光分子を物理化学的な方法によって第２タンパク質に付着または連結させることもできる。
一方、前述したＳ１５０段階は、円滑な分析の進行のために、前述したＳ１１０段階前にあらかじめ行うこともでき、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質は、第１蛍光タンパク質と異なる波長領域を有することが好ましいので、第１蛍光タンパク質がｍ−Ｃｈｅｒｒｙタンパク質である場合に、第２蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質であるｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）になることができる。
次に、分析者は、前述したＳ１５０段階での、内部の第２タンパク質に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液全体を基板に供給する（Ｓ１６０）。
基板の表面に付着している複数の第１タンパク質結合抗体の少なくとも一部は、それぞれ第１タンパク質が結合されており、このような基板の表面に第２タンパク質が含まれている細胞質原液全体が図３のように供給されれば、基板表面の第１タンパク質（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒａｓ）は、細胞質原液に含まれている第２タンパク質（ｅＧＦＰ−ｃＲＢＤ）及び細胞内の他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が共存する細胞内環境と同一の状態で第２タンパク質と相互作用をする。
要するに、図３のように、基板表面上に付着したそれぞれの抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｓ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に結合されているそれぞれの第１タンパク質（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒａｓ）は、第２タンパク質（ｅＧＦＰ−ｃＲＢＤ）と細胞内環境と同一の状態で単一分子水準で結合と分離を繰り返す相互作用をする。
一方、前述したＳ１６０段階を実施するに際して、細胞質原液だけでなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈または精製された細胞原液などの細胞溶液が使用されることができる。
図３のように、第１タンパク質と第２タンパク質間の単一分子水準での結合がある場合に、分析者が４７３ｎｍの波長を有する全反射顕微鏡を用いて基板の表面を観察すれば、第２タンパク質に発現されている蛍光タンパク質であるｅＧＦＰによって、基板表面での波長が４７３ｎｍから５２０ｎｍに変化することを確認することができる。
すなわち、第１タンパク質と第２タンパク質間の結合を通じて基板表面に位置する第２蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から発生する特定波長帯域（５２０ｎｍ）の蛍光信号の検出を通じて第１タンパク質と第２タンパク質の結合状態を確認することができ、分析者は、基板表面上に付着したそれぞれの抗体での波長の変化を持続的に観察することによって、第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を単分子水準で分析することができる（Ｓ１７０）。
なお、本発明では、前述したＳ１６０段階で基板に供給された細胞質原液が存在する状況で、特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することによって、第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を細胞環境と同一の環境で分析することができる。
また、細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法は、前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液を前記基板に供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階で、の前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度を所定の比率で増加させながら、前記結合を誘導する段階乃至前記相互作用を分析する段階を繰り返す段階を含み、
前記相互作用を分析する段階は、前記基板上の任意に設定された観測領域での、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生周期を測定する段階、
前記複数の観測領域での蛍光信号の周波数の平均値を測定する段階、
測定した前記周波数の平均値が増加する時点の前記結合を誘導する段階乃至前記相互作用を分析する段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度値である臨界濃度値を獲得する段階、及び前記臨界濃度値に基づいて前記第１タンパク質の濃度を測定する段階、を含み
前記相互作用を分析する段階で前記第２タンパク質と相互作用をする前記第１タンパク質は、前記第１タンパク質結合分子体に結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質である。
尚、前記（ｄ）段階で、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号は、近接場を発生させる光学装置を利用して、細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度を測定することができる。
（２）細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法（第２の態様）
一方、本発明を実施するに際して、分析者は、それぞれ正常状態の細胞（対照群細胞）内にある第１タンパク質と第２タンパク質との相互作用と、非正常状態の細胞（実験群細胞）内にある第１タンパク質と第２タンパク質との相互作用を比較分析することもできる。
本発明に対する実験において、人体の乳房組職から分離した細胞で人為的にＲａｓタンパク質の活性を極大化することによって、図４のように正常乳房組職細胞を癌細胞に変化させ、正常乳房組職細胞を対照群細胞として使用し、癌細胞に変化した乳房組職細胞を実験群細胞として使用した。
図５は、本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。図５を参照して、本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明すれば、まず、分析者は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）コーティング処理された同一のサイズのクオーツスライド（ＱｕａｒｔｚＳｌｉｄｅ）基板を２つ用意する。
次に、分析者は、２つの基板（第１基板、第２基板）の両方に第１タンパク質と結合される抗体である第１タンパク質結合抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｓ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を図２のように付着する（Ｓ２１０）。
一方、本発明を実施するに際して、第１タンパク質と結合する抗体には、抗体以外にも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質と結合する特定成分を有するリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの第１タンパク質と結合する生体分子体が使用されることができる。
次に、分析者は、第１タンパク質が含まれている対照群細胞の細胞質原液を第１基板に供給し、第１タンパク質が含まれている実験群細胞の細胞質原液を第２基板に供給することによって（Ｓ２２０）、第１基板及び第２基板それぞれで第１タンパク質と第１タンパク質結合抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｓ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の結合を誘導する（Ｓ２３０）。
一方、本発明を実施するに際して、対照群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度と実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度は、同一でなければならないし、このために、対照群細胞及び実験群細胞にそれぞれ含まれた第１タンパク質の濃度を測定し、両方の濃度が同一であるか否かを確認しなければならないし、同一ではない場合には、希釈化などの方法を通じて両方の濃度が同一になるように調整した後、前述したＳ２３０段階を行わなければならない。
ここで、タンパク質の濃度を測定するに際して、従来技術による多様なタンパク質濃度測定方法が使用されることができ、韓国特許出願第１０−２０１１−００８８０７４号（出願人：ユンテヨン）でのタンパク質濃度測定方法が活用されることもできる。一方、本明細書では、韓国特許出願第１０−２０１１−００８８０７４号の明細書及び図面の記載内容をその一部として含む。
一方、前述したＳ２３０段階を実施するに際して、細胞質原液だけでなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈または精製された細胞原液などの細胞溶液が使用されることができる。
一方、本発明を実施するに際して、分析者は、第１タンパク質にｍ−Ｃｈｅｒｒｙなどの所定の第１蛍光タンパク質が発現されるように事前処理することもでき、この場合に、第１タンパク質結合抗体と第１タンパク質が結合された場合に、分析者が全反射顕微鏡を利用した基板の表面観察を行うと、分析者は、第１タンパク質に発現されている第１蛍光タンパク質による波長変化から（すなわち、第１蛍光タンパク質から発生する個々の単分子信号を測定し）基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体に第１タンパク質が結合されたか否かを確認することができる。
すなわち、第１タンパク質に第１蛍光タンパク質が発現された場合には、第１タンパク質の抗体との結合可否を全反射顕微鏡を用いて把握することができるので、基板に付着した抗体と結合された第１タンパク質の個数及びそれによる結合密度を正確に測定することができる。
第１基板及び第２基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体にそれぞれ第１タンパク質が結合されたものと確認されれば、分析者は、基板にバッファー溶液を供給することによって、第１タンパク質を除いた細胞質原液に含まれている残りの物質を基板上で除去する（Ｓ２４０）。
次に、分析者は、特定細胞に存在する第２タンパク質に遺伝子組換えを通じて第２蛍光タンパク質が発現されるように操作する（Ｓ２５０）。一方、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質を物理化学的な方法によって第２タンパク質に付着または連結させることもできる。
一方、前述したＳ２５０段階は、円滑な分析の進行のために前述したＳ２１０段階前にあらかじめ行うこともでき、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質は、第１蛍光タンパク質と異なる波長領域を有することが好ましいので、第１蛍光タンパク質がｍ−Ｃｈｅｒｒｙタンパク質である場合に、第２蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質であるｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）になることができる。
次に、分析者は、前述したＳ２５０段階での、内部の第２タンパク質に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液全体を第１基板及び第２基板にそれぞれ供給する（Ｓ２６０）。
一方、前述したＳ２６０段階を実施するに際して、第１基板及び第２基板にそれぞれ供給される細胞質原液での第２タンパク質の濃度は、同一でなければならないし、このために、２つの細胞質原液にそれぞれ含まれた第２タンパク質の濃度を測定し、両方の濃度が同一であるか否かを確認しなければならないし、同一ではない場合には、希釈化などの方法を通じて両方の濃度が同一になるように調整した後、前述したＳ２６０段階を行わなければならない。
ここで、タンパク質の濃度を測定するに際して、従来技術による多様なタンパク質濃度測定方法が使用されることができ、前述した韓国特許出願第１０−２０１１−００８８０７４号（出願人：ユンテヨン）でのタンパク質濃度測定方法が活用されることもできる。
一方、前述したＳ２２０段階を実施するに際して、細胞質原液だけでなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈または精製された細胞原液などの細胞溶液が使用されることができる。
第１基板及び第２基板の表面にそれぞれ付着している複数の第１タンパク質結合抗体には、それぞれ対照群細胞の第１タンパク質及び実験群細胞の第１タンパク質が結合されており、このような基板の表面に第２タンパク質が含まれている細胞質原液全体が図３のように供給されれば、それぞれの基板表面の第１タンパク質（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒａｓ）は、細胞質原液に含まれている第２タンパク質（ｅＧＦＰ−ｃＲＢＤ）及び細胞内の他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が共存する細胞内環境と同一の状態で第２タンパク質と相互作用をする。
分析者は、第１タンパク質と第２タンパク質間の結合を通じて基板表面に位置する第２蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から発生する特定波長帯域（５２０ｎｍ）の蛍光信号の検出を通じて第１タンパク質と第２タンパク質の結合状態を確認することができ、分析者は、基板表面上に付着したそれぞれの抗体での波長の変化を持続的に観察することによって、
第１基板と第２基板での第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を単分子水準で比較分析することができる（Ｓ２７０）。
図６は、対照群細胞内の第１タンパク質が結合された第１基板で観測された信号を示すグラフであり、図７は、実験群細胞内の第１タンパク質が結合された第２基板で観測された信号を示すグラフである。
図６と図７を比較すれば、正常細胞である対照群細胞内の第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用よりも癌細胞である実験群細胞内の第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用がさらに活発であることを確認することができる。これから、分析者は、癌細胞内の第１タンパク質であるＲａｓタンパク質が過剰で活性化されていることを診断することができる。
一方、第２タンパク質と相互作用をする第１タンパク質は、活性化された第１タンパク質になるので、前述した対照群細胞での第１タンパク質と第２タンパク質との相互作用と実験群細胞での第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を比較することによって、対照群細胞での第１タンパク質の活性化程度と実験群細胞での第１タンパク質の活性化程度を定量的に測定することができる。
このために、本発明では、図８と同一の方法を使用した。図８は、本発明の他の実施例による実験群細胞と対照群細胞での活性化されたタンパク質の濃度比較方法を説明する図である。
図８を参照すれば、分析者は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）コーティング処理された同一のサイズのクオーツスライド（Ｑｕａｒｔｚ Ｓｌｉｄｅ）基板を２個用意し、２個の基板（第１基板、第２基板）にそれぞれ第１タンパク質と結合される抗体である第１タンパク質結合抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｓ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を図２のように付着する（Ｓ３１０）。
次に、分析者は、第１タンパク質が含まれている対照群細胞の細胞溶液を第１基板に供給し、（Ｓ３２０）、第１タンパク質が含まれている実験群細胞の細胞溶液を第２基板に供給することによって（Ｓ３３０）、第１基板及び第２基板それぞれで第１タンパク質と第１タンパク質結合抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｓ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の結合を誘導する。
一方、本発明を実施するに際して、対照群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度と実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度は、同一でなければならないし、このために、対照群細胞及び実験群細胞にそれぞれ含まれた第１タンパク質の濃度を測定し、両方の濃度が同一であるか否かを確認しなければならない。
もし、同一ではない場合には、希釈化などの方法を通じて両方の濃度が同一になるように調整した後、前述したＳ３２０〜Ｓ３３０段階を行わなければならない。
ここで、タンパク質の濃度を測定するに際して、従来技術による多様なタンパク質濃度測定方法が使用されることができ、前述した韓国特許出願第１０−２０１１−００８８０７４号（出願人：ユンテヨン）でのタンパク質濃度測定方法が活用されることもできる。
一方、本発明を実施するに際して、分析者は、第１タンパク質にｍ−Ｃｈｅｒｒｙなどの所定の第１蛍光タンパク質が発現されるように事前処理することもでき、この場合に、第１タンパク質結合抗体と第１タンパク質が結合された場合に、分析者が全反射顕微鏡を利用した基板の表面観察を行うと、分析者は、第１タンパク質に発現されている第１蛍光タンパク質による波長変化から（すなわち、第１蛍光タンパク質から発生する個々の単分子信号を測定し）基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体に第１タンパク質が結合されたか否かを確認することができる。
すなわち、第１タンパク質に第１蛍光タンパク質が発現された場合には、第１タンパク質の抗体との結合可否を全反射顕微鏡を用いて把握することができるので、基板に付着した抗体と結合された第１タンパク質の個数及びそれによる結合密度を正確に測定することができる。
第１基板及び第２基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体にそれぞれ第１タンパク質が結合されたものと確認されれば、分析者は、基板にバッファー溶液を供給することによって、第１タンパク質を除いた細胞質原液に含まれている残りの物質を基板上で除去する。
次に、分析者は、特定細胞に存在する第２タンパク質に遺伝子組換えを通じて第２蛍光タンパク質が発現されるように操作する。一方、本発明を実施するに際して、第２蛍光分子を物理化学的な方法によって第２タンパク質に付着または連結させることもできる。
一方、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質は、第１蛍光タンパク質と異なる波長領域を有することが好ましいので、第１蛍光タンパク質がｍ−Ｃｈｅｒｒｙタンパク質である場合に、第２蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質であるｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）になることができる。
次に、分析者は、内部の第２タンパク質に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞溶液全体を第１基板及び第２基板にそれぞれ供給する（Ｓ３４０）。
一方、前述したＳ３４０段階を実施するに際して、第１基板及び第２基板にそれぞれ供給される細胞溶液での第２タンパク質の濃度は、同一でなければならないし、このために２つの細胞質原液にそれぞれ含まれた第２タンパク質の濃度を測定し、両方の濃度が同一であるか否かを確認しなければならないし、同一ではない場合には、希釈化などの方法を通じて両方の濃度が同一になるように調整した後、前述したＳ３４０段階を行わなければならない。
ここで、タンパク質の濃度を測定するに際して、従来技術による多様なタンパク質濃度測定方法が使用されることができ、前述した韓国特許出願第１０−２０１１−００８８０７４号（出願人：ユンテヨン）でのタンパク質濃度測定方法が活用されることもできる。
第１基板及び第２基板の表面にそれぞれ付着している複数の第１タンパク質結合抗体には、それぞれ対照群細胞の第１タンパク質及び実験群細胞の第１タンパク質が結合されており、このような基板の表面に第２タンパク質が含まれている細胞質原液などの細胞溶液全体が図３のように供給されれば、それぞれの基板表面の第１タンパク質（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒａｓ）は、細胞質原液に含まれている第２タンパク質（ｅＧＦＰ−ｃＲＢＤ）及び細胞内の他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が共存する細胞内環境と同一の状態で第２タンパク質と相互作用をする。
分析者は、第１タンパク質と第２タンパク質間の結合を通じて基板表面に位置する第２蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から発生する特定波長帯域（５２０ｎｍ）の蛍光信号の検出を通じて第１タンパク質と第２タンパク質の結合状態を確認することができ、分析者は、基板表面上に付着したそれぞれの抗体での波長の変化を持続的に観察することによって、第１基板と第２基板での第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を単分子水準で比較分析することができる（Ｓ３５０）。
より具体的に説明すれば、分析者は、前述したＳ３２０段階及びＳ３３０段階で第１基板及び第２基板にそれぞれ供給される対照群細胞溶液に含まれた第１タンパク質の濃度と実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度を順次に同一に増加させながら前述したＳ３２０段階乃至Ｓ３５０段階を繰り返す。
図９は、実験群細胞に含まれた第１タンパク質の濃度を順次に増加させながら第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を測定した実験結果を示す図である。図９の（ａ）を参照すれば、１ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた実験群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定した。
具体的に、第２基板に付着した第１タンパク質結合分子体と結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質だけが第２タンパク質と相互作用をするので、前述した光学装置を利用した測定で、所定の臨界値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超過する特定波長の蛍光信号が感知される地点を中心に光学装置は１．１μｍ２サイズの任意の観測領域（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）を設定し、以後にそれぞれのＲＯＩを中心に蛍光信号の発生周期を測定する。
一方、図９の（ｂ）では、２ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた実験群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定した。
具体的に、第２基板に付着した第１タンパク質結合分子体と結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質だけが第２タンパク質と相互作用をするので、第１タンパク質が含まれた実験群細胞の細胞溶液の濃度が２倍に増加した以上、所定の臨界値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超過する特定波長の蛍光信号が感知される地点は、図９の（ａ）と比較して２倍多く観測される（４個のＲＯＩ→８個のＲＯＩ）。
一方、まだ実験群細胞の細胞溶液の濃度が比較的高くないため、一定のサイズを有する１つのＲＯＩ内で活性化された第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用の対が１つずつだけ観測されている。
したがって、図９の（ｂ）で、８個のＲＯＩで平均的に測定される蛍光信号の発生周期は、図９の（ａ）と同一に現われる。
しかし、第２基板のサイズによってＲＯＩの設定可能な個数は、制限されているので、第１タンパク質が含まれた実験群細胞溶液の濃度が臨界値以上を超過すれば、図９の（ｃ）のように、１つのＲＯＩ内で活性化された第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用の対が２個以上ずつ観測される。
このように実験群細胞溶液の濃度が臨界値を超過すれば、各ＲＯＩでの蛍光信号の発生周期の平均値は、増加し始まり、以後、実験群細胞溶液の濃度が継続的に増加するほど、各ＲＯＩでの蛍光信号の発生周期の平均値は継続的に増加する。
本発明によって実施した実験では、第１基板及び第２基板のサイズが４５×９０μｍ２の場合に、１．１μｍ２サイズの各ＲＯＩでの蛍光信号の発生周期の平均値の増加が始まった第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた癌細胞である実験群細胞溶液濃度の臨界値は、５ｎＭとして測定された。
すなわち、図１０で確認することができるように、３ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた実験群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生頻度を近接場を発生させる光学装置を利用して複数のＲＯＩでその平均値で測定した場合に、蛍光信号の発生頻度が３０秒間８回に過ぎなかった。
しかし、図１１で確認することができるように、臨界濃度値（５ｎＭ）を超過する４１．３ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた実験群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生頻度を近接場を発生させる光学装置を利用して複数のＲＯＩでその平均値で測定した場合には、蛍光信号の発生頻度が３０秒間２０回として測定された。
すなわち、第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた癌細胞である実験群細胞の細胞溶液の濃度値を増加させながら、複数のＲＯＩでの蛍光信号の周波数の平均値を測定した結果、図１４のように、臨界濃度値である５ｎＭまでは一定に維持されてから、臨界濃度値を超過した以後からは増加することを確認することができる。
ここでの臨界濃度値に基づいて、分析者は、実験群細胞の細胞溶液に含まれた第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質の比率を計算することができる。
しかも、分析者は、対照群細胞で前述したような実験を繰り返すことによって、対照群細胞での臨界濃度値と実験群細胞での臨界濃度値を比較することによって、対照群細胞内に含まれた活性化された第１タンパク質の濃度と実験群細胞内に含まれた活性化された第１タンパク質の濃度の比率を定量的に計算することができる。
すなわち、分析者は、実験群細胞での臨界濃度値を獲得するための前記の実験手続と併行して、または実験群細胞に対する実験手続の前または後に第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた対照群細胞の細胞溶液の濃度を徐々に増加させながら、同一の条件の下で対照群細胞での臨界濃度値を測定する。
一方、対照群細胞の細胞溶液の濃度を増加させるに際して、実験群細胞での細胞溶液の濃度増加比率と同一の比率で増加させることが好ましい。
すなわち、図１２を参照すれば、分析者が３．５ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた対照群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生頻度を近接場を発生させる光学装置を利用して複数のＲＯＩでその平均値で測定した場合に、蛍光信号の発生頻度が３０秒間６回に過ぎなかった。
一方、以後に、対照群細胞の細胞溶液の濃度を増加させた場合にも、複数のＲＯＩでその平均値で測定した蛍光信号の発生頻度は、３０秒間６回と一定であった。
但し、図１３で確認することができるように、４９ｎＭ濃度の第１タンパク質（ＨＲａｓ）が含まれた対照群細胞の細胞溶液を第２基板に供給し、第１タンパク質と第１タンパク質結合分子体の結合を誘導した後、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を第２基板に供給した状態で第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生頻度を近接場を発生させる光学装置を利用して複数のＲＯＩでその平均値で測定した場合には、蛍光信号の発生頻度が３０秒間７回とわずかに増加した値が測定された。
その後、対照群細胞溶液の濃度を増加させながら蛍光信号の周波数の平均値を測定した結果、図１４で確認されるもののように、５０ｎＭ濃度を臨界濃度値にして臨界濃度値を超過した以後から明らかに増加することを確認することができた。
以上の実験から、実験群細胞での臨界濃度値が５ｎＭであり、対照群細胞での臨界濃度値が５０ｎＭと測定された事実に基づいて、分析者は、癌細胞である実験群細胞内に含まれた活性化された第１タンパク質の濃度が正常細胞である対照群細胞に含まれた活性化された第１タンパク質の濃度より１０倍程度大きいという事実を確認することができる。
以上では、本発明の好ましい実施例及び応用例について図示し説明したが、本発明は、前述した特定の実施例及び応用例に限定されず、請求範囲で請求する本発明の要旨を逸脱することなく、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって多様な変形実施が可能であることは勿論であり、このような変形実施は、本発明の技術的思想や見込みから個別的に理解されるべきものではない。
本発明は、医療産業分野での産業上利用可能性が認められる。

Claims (5)

  1. 細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法において、
    （ａ）第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板を具備する段階と；
    （ｂ）前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液を前記基板に供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；
    （ｃ）前記基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
    （ｄ）前記基板での前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；
    （ｅ）前記（ｂ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度を所定の比率で増加させながら、前記（ｂ）段階乃至前記（ｄ）段階を繰り返す段階と；
    を含み、
    前記（ｄ）段階は、
    前記基板上の任意に設定された観測領域での、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生周期を測定する段階；前記複数の観測領域での蛍光信号の周波数の平均値を測定する段階；測定した前記周波数の平均値が増加する時点の前記（ｅ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度値である臨界濃度値を獲得する段階；及び前記臨界濃度値に基づいて前記第１タンパク質の濃度を測定する段階；を含み
    前記（ｄ）段階で前記第２タンパク質と相互作用をする前記第１タンパク質は、前記第１タンパク質結合分子体に結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質である、
    細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法。
  2. 前記（ｄ）段階は、
    前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法。
  3. 細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法において、
    （ａ）対照群細胞溶液に含まれる第１タンパク質と実験群細胞溶液に含まれる第１タンパク質とがそれぞれ結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体がそれぞれ付着した少なくとも２つの基板を具備する段階と；
    （ｂ）前記対照群細胞溶液に含まれた第１タンパク質を前記２つの基板のうち第１基板に供給し、前記実験群細胞溶液に含まれた第１タンパク質を前記２つの基板のうち第２基板に供給し、前記第１基板及び前記第２基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合をそれぞれ誘導する段階と；
    （ｃ）前記第１基板及び前記第２基板で前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体がそれぞれ結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞溶液を前記第１基板及び第２基板にそれぞれ供給する段階と；
    （ｄ）前記第１基板及び前記第２基板での前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を比較分析する段階と；
    （ｅ）前記（ｂ）段階での前記対照群細胞溶液及び前記実験群細胞溶液中の前記第１タンパク質の濃度を所定の比率でそれぞれ増加させながら、前記（ｂ）段階乃至前記（ｄ）段階を繰り返す段階と；
    を含み、
    前記（ｄ）段階は、
    前記第１基板及び前記第２基板上のそれぞれ任意に設定された複数の観測領域での、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号の発生周期をそれぞれ測定する段階；
    前記第１基板及び前記第２基板上のそれぞれ任意に設定された前記複数の観測領域での、
    蛍光信号の周波数の平均値をそれぞれ測定する段階；
    前記第１基板及び前記第２基板でそれぞれ測定した前記周波数の平均値が増加する時点の前記（ｅ）段階での前記第１タンパク質が含まれた細胞溶液の濃度値である臨界濃度値をそれぞれ獲得する段階；及び
    前記第１基板及び前記第２基板でそれぞれ獲得した前記臨界濃度値に基づいて前記第１タンパク質の濃度を測定する段階；を含み
    前記（ｄ）段階で前記第２タンパク質と相互作用をする前記第１タンパク質は、前記第１タンパク質結合分子体に結合された第１タンパク質のうち活性化された第１タンパク質である、
    細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法。
  4. 前記対照群細胞は正常状態の細胞であり、前記実験群細胞は非正常状態の細胞又は、前記正常状態の細胞から変化した癌細胞を含む細胞であることを特徴とする請求項３に記載の細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法。
  5. 前記（ｄ）段階は、
    前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の細胞溶液での活性化されたタンパク質濃度測定方法。
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