KR100845139B1 - 단백질-단백질 상호작용 측정을 위한 실시간 이중 색상분석방법 및 그 장치 - Google Patents

단백질-단백질 상호작용 측정을 위한 실시간 이중 색상분석방법 및 그 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파장 X의 형광 표지를 지닌 항원 A; 상기 항원 A에 결합되는 첫 번째 항체 안티-A; 및 상기 첫 번째 항체 안티-A에 결합되는 파장 Y의 형광 표지를 지닌 두 번째 항체 안티-B로 구성된 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 실시간 이중 색상 분석방법에 있어서, 상기 이중 색상 분석방법으로 검체 단백질의 상호작용을 효소 면역반응을 이용하여 측정하고, 그 결과를 파장 X 및 Y의 이중-파장의 색상을 통해 판독함을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법 및 그 장치를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 이중-파장 단일-분자 형광검출시스템을 이용하여 다른 형광 염료로 표지된 개별 단백질 분자의 실시간 형광 이미지가 시간의 지연 없이 동시에 모니터링 할 수 있는 실시간 이중 색상 분석방법을 제공하는 것이다.
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단백질-단백질 상호작용, 이중 색상, 분석방법, 효소, 형광, 키트

Description

단백질-단백질 상호작용 측정을 위한 실시간 이중 색상 분석방법 및 그 장치{Real-time dual color assay for detecting protein-protein interaction and an apparatus therefor}
도 1은 본 발명의 단백질-단백질 상호작용 측정을 위한 표지 항원, 첫 번째 항체 및 두 번째 항체 상보적 결합 반응단계를 나타내는 개략도이다.
도 2(a)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위해서 사용되는 기기를 나타내는 사진이다. 도 2(b)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위한 캐필러리 형태의 실험기구를 나타낸 개략도이다. 상기 도면에서 MS는 기계적 셔터; CL은 실린더형 렌즈; OL은 대물 렌즈; SC는 정사각형 모세관; TC는 열 커플. Ar+ 레이저(λex = 488 nm) 및 He/Ne 레이저(λex = 635 nm)는 각각 모세관의 좌측면 및 우측면을 통해 모세관 중심에 조사된다.
도 3은 본 발명의 실시간 이중 색상 분석시스템을 이용한 완충 수용액 내 (a) λex = 488 nm에서의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체의 형광 비디오 이미지(녹색), (b) λex = 635 nm에서의 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 형광 비디오 이미지(적색) 및 (c) 혼합 단백질 표본(Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 및 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체)의 형광 비디오 이미지를 나타낸 사진이다. ICCDN 노출 시간은 10 ms이고 프레임 속도는 10 ㎐이다.
도 4는 액틴 단백질 분자 및 200-nm 비드의 크기를 비교한 비디오 이미지 사진이다. 이때 사용된 시험기기는 도 2의 시험기기를 이용한 것이다.
도 5는 실시간 이중-색상 LIF 검출 시스템을 이용한 비특이적 단백질-단백질 상호작용에서의 농도 효과를 나타낸 비디오 이미지 사진이다. 녹색, FITC-표지 단백질 키나제 A; 적색, Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체. 실험 조건은 도 2에 나타난 바와 동일하다. 점선 화살표는 단백질 분자의 비특이적 결합을 나타내고, 직선 화살표는 단백질 분자의 응집을 나타낸다.
도 6은 실시간 이중-색상 LIF 검출시스템을 이용한 용액 내 단백질-단백질 상호작용의 상보적 결합을 나타낸 비디오 이미지 사진이다. 실험 조건은 도 2에 나타난 바와 동일하다. 녹색, Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체; 적색, Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체.
도 7은 실시간 이중-색상 LIF 검출시스템을 이용한 모세관 내 추진력 하의 반응 시간 함수로 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체(녹색)와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체(적색)의 상호작용을 나타낸 비디오 이미지 사진이다. 실험 조건은 도 2에 나타난 바와 동일하다.
도 8은 반응 시간 함수로서 다른 온도에서 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체(녹색)와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체(적색) 사이의 상호작용에 관련된 결합 분자 수(좌측 y-축) 및 분자 상대 백분율(우측 y-축)을 나타낸 그래프이다. 실험 조건은 도 2에 나타난 바와 동일하다. 에러 바는 5회 측정의 표준편차를 나타낸다. 적색 원형, 12℃; 청색 삼각형, 20℃; 황색 원형, 25℃; 흑색 사각형, 32℃.
본 발명은 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 실시간 이중 색상 분석방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 형광표지를 지닌 항원, 상기 항원에 결합되는 첫 번째 항체 및 상기 첫 번째 항체에 결합되는 형광표지를 지닌 두 번째 항체로 구성된 효소면역 분석방법을 이용하여 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 분석방법 및 그 장치에 관한 것이다.
단백질-단백질 상호작용은 모든 세포 과정 및 기능에서 중요한 역할을 한다. 면역 분석방법을 포함한 여러 분석방법들이 단백질-단백질 상호작용을 분석하는데 이용되었다. 초기 면역반응 분석기술에서 공통적인 방법은 일반적으로 2∼8℃의 저온에서 밤새 외인성 결합 파트너로 단백질을 인큐베이트시켜 분석에 사용하였다. 그러나 최근 1-2시간 정도의 단시간 내에 정확한 분석이 의학적 및 상업적 적용에 요구된다. 높은-처리량으로 단백질-단백질 상호작용 분석이 더욱 광범위하게 이용되는 경우 결합반응을 촉진시키고 분석시간을 단축시키고자 하는 요구가 더욱 더 중요하게 된다.
생체 내 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 다양한 분석방법이 개발되었다. 이는 효모 투(two)-하이브리드 시스템 방법, 표면 플라스몬 공명, 친화성 컬럼 방법, 등온 적정 열량측정법, 핵자기공명 분광법 또는 원자힘현미경(automic force microscopy, AFM), 평형 원심분리 방법, 표지 단백질 방법 및 직렬 친화 정제를 포함한다.
PCT 국제공개 WO 2004/19967호 '단백질-단백질 상호작용에 관여하는 아집단 을 분리하는 방법'에서는 화학 반응성 지지체 매트릭스를 사용하여 다른 단백질에 비공유 결합되는 단백질을 분리함으로써 칼슘 의존적 또는 기질 의존적 단백질 상호작용을 측정하기 위한 방법이 개시되어 있다.
그러나 이와 같은 단백질-단백질 상호작용을 측정을 위한 분석방법은 더욱 개량이 요구되고 있으며 이들 분석방법은 전문화되었으나, 다소 많은 양의 단백질을 필요로 하고 분광 프로브로의 상호작용 파트너의 표지를 혼동시킬 수 있는 문제가 발생하곤 한다.
현재 단백질-단백질 상호작용 측정에 형광 프로브가 빈번하게 이용되고 다양한 단백질 상호작용의 동력학, 친화 및 배좌 변화 연구에 다목적으로 이용된다. 그러나 단백질-단백질 상호작용 및 그들의 동력학은 복잡하고 불균질하다. 균일한 가설에 기반한 통상의 분석이 항상 실시간으로 단백질-단백질 상호작용의 동력학을 분석할 수 있는 것은 아니다. 따라서 완전한 상호작용 네트워크뿐만 아니라 단백질-단백질 상호작용의 특성화는 단일-분자 수준에서 이들 과정을 이해하는데 필수적이다.
단일-분자 검출(single-molecule detection, SMD) 기술은 생명과학 분야뿐만 아니라 분석화학 및 생물물리학에서 강력한 새로운 기술을 제공한다. 특히 SMD는 생체 내 단백질 상호작용을 시각화시킬 뿐만 아니라 시험관 내 매우 한정된 표본 상에서도 수행된다. 단일-분자 수준에서 단백질-단백질 상호작용의 조사 시 주요 접근인 AFM 및 형광 기술은 매우 보편적이 되었다. 그러나 AFM은 용액 내 용액 내에서 움직이는 시료에 대한 동력 분자의 실시간 검출에 적당하지 않다.
일부 형광 검출방법은 시험관 내 및 생체 세포 모두에서 단일-분자 수준으로 단백질 상호작용을 프로브로써 측정하는데 성공적으로 이용될 수 있다. 통상의 형광 검출 기술은 여기(excitation) 에너지원으로서 단일-파장 광만을 이용한다. 그러나 단일-파장 검출은 혼합물 내 개별 분자의 동력학뿐만 아니라 단백질-단백질 상호작용의 정확한 이미지를 제공할 수 없다.
본 발명에서는 단일-분자 수준에서 용액 내 온도-의존적 단백질-단백질 상호작용의 실시간 동력학을 조사하기 위해 이중-파장 레이저-유도 형광(laser-induced fluorescence, LIF) 검출 시스템을 응용하였다. 이중-파장 단일-분자 형광 검출 시스템을 이용하여 다른 형광 염료로 표지된 개별 단백질 분자의 실시간 형광 이미지가 시간의 지연 없이 동시에 실시간 모니터링 할 수 있게 함으로써 본 발명을 완성한 것이다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 단일-분자 수준에서 용액 내 온도 -의존적 단백질-단백질 상호작용의 실시간 동력학을 조사하기 위해 이중-파장 레이저-유도 형광 검출 방법을 개발코자 한 것이다. 본 발명에서는 이중-파장 단일-분자 형광 검출시스템을 제작하고 이를 이용하여 다른 형광 염료로 표지된 개별 단백질 분자의 실시간 형광 이미지가 시간의 지연 없이 동시에 모니터링 할 수 있는 실시간 이중 색상 분석방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 목적은 파장 X의 형광 표지를 지닌 검체 단백질 항원 A; 상기 검체 단백질 항원 A에 결합되는 첫 번째 항체 단백질 안티-A; 및 상기 첫 번째 항체 단백질 안티-A에 결합되는 파장 Y의 형광 표지를 지닌 두 번째 항체 단백질 안티-B로 구성된 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 실시간 이중 색상 분석방법에 있어서, 상기 이중 색상 분석방법으로 검체 항원 단백질과 항체 단백질의 상호작용을 효소 면역반응을 이용하여 측정하고, 그 결과를 파장 X 및 Y의 이중-파장의 색상을 통해 판독함을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법을 제공하는 것이다.
한편 상기 파장 X 및 Y는 각각 440 nm, 488 nm, 545 nm, 580 nm, 635 nm에서 선택된 파장임을 특징으로 한다.
또한 상기 실시간 이중 색상 분석방법 검체 단백질의 농도는 아토몰(aM) 내 지 펨토몰(fM) 수준까지 낮은 초미세량의 검체 단백질의 상호작용을 검출할 수 있음을 특징으로 한다.
또한 상기 실시간 이중 색상 분석방법은 12∼32℃의 실온에서 수행됨을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 또다른 목적은 ⅰ) 파장 X의 형광 표지를 지닌 검체 단백질 항원 A; 상기 검체 단백질 항원 A에 결합되는 첫 번째 항체 단백질 안티-A; 및 상기 첫 번째 항체 단백질 안티-A에 결합되는 파장 Y의 형광 표지를 지닌 두 번째 항체 단백질 안티-B로 구성된 검체 단백질을 삽입시킨 모세관; ⅱ) 상기 모세관 내의 단백질 상호작용을 판독하기 위한 레이저 광원 및 그 형광 파장을 판독하기 위한 광학 분석기구; 및 ⅲ) 광학 분석기구를 해독하기 위한 컴퓨터 기기 등으로 구성된 검체 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 실시간 이중 색상 분석장치를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 실시간 이중 색상 분석이용 기구 및 측정원리
도 1은 본 발명의 단백질-단백질 상호작용 측정을 위한 표지 항원, 첫 번째 항체 및 두 번째 항체 상보적 결합 반응단계를 나타내는 개략도이다.
단백질 키나제 A-FITC 컨쥬게이트는 Promega (Madison, USA)로부터 구입한 후, 항원-항체 결합 절차를 이용하여 Alexa Fluor 488-표지 액틴 컨쥬게이트를 표지 항원으로 준비하고, 항-액틴 항체를 4℃에서 60분간 인큐베이트시켜 첫 번째 항체로써 상기 표지 항원(Alexa Fluor 488-표지 액틴)-첫 번째 항체(표지되지 않은 항-액틴 항체) 복합체를 생성시킨다. Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체가 두 번째 항체로써 표지 항원(Alexa Fluor 488-표지 액틴)-첫 번째 항체(표지되지 않은 항-액틴 항체) 복합체를 함유한 반응 혼합물 용액에 첨가되었다.
도 2(a)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위해서 사용되는 기기를 나타내는 사진이다. 도 2(b)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위한 캐필러리 형태의 실험기구를 나타낸 개략도이다. 상기 도면에서 MS는 기계적 셔터; CL은 실린더형 렌즈; OL은 대물 렌즈; SC는 정사각형 모세관; TC는 열 커플. Ar+ 레이저(λex = 488 nm) 및 He/Ne 레이저(λex = 635 nm)는 각각 모세관의 좌측면 및 우측면을 통해 모세관 중심에 조사된다.
상기한 바와 같이 도 2는 실시간 이중 색상 분석방법에 사용되는 기기의 개 략도 및 사진을 나타낸 것이다. Dual-ViewTM(Optical Insight, LLC, Tucson, USA)이 장착된 Zeiss Axioskop2 현미경(Zeiss, 독일)이 대부분의 조사에 사용된다. Zeiss 40×/0.75 N.A. Plan-Neofluar 현미경 대물 렌즈(Zeiss, 독일)가 사용된다.
실시간 이중 색상 분석 기기를 이용한 단일-단백질 분자의 작용측정
도 3은 본 발명의 실시간 이중 색상 분석 시스템을 이용한 완충 수용액 내 (a) λex = 488 nm에서의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체의 형광 비디오 이미지(녹색), (b) λex = 635 nm에서의 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 형광 비디오 이미지(적색) 및 (c) 혼합 단백질 표본(Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 및 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체)의 형광 비디오 이미지를 나타낸 사진이다. ICCDN 노출 시간은 10 ms이고 프레임 속도는 10 ㎐이다.
도 3에 나타난 바와 같이 Ar+ 레이저로부터의 488 nm 및 He/Ne 레이저로부터의 635 nm의 이중-파장으로 동시에 여기되고 Dual-ViewTM로 관찰시 어떠한 시간의 손실도 없이 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 형광 이미지가 특정 파장 영역에서 모니터될 수 있 다. 혼합물 표본 내 개별 단백질 분자는 효과적으로 집중되고 상보적 단백질 분자와 상호작용하게 되고 이중-파장(여기 파장, λex = 488 및 635 nm) LIF 검출에 의해 측정된다.
모든 혼합된 단백질 표본이 이중-파장에 의해 동시-여기가 되나 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 분자는 488 nm 영역에서 명백하게 모니터링이 되고(도 3a의 녹색) Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 분자는 635 nm에서만 이미지가 나타난다(도 3b의 적색). 이중-파장 LIF 검출시스템은 어떠한 시간 지연 없이 다른 형광단으로 개별 단백질의 정확한 동시 이미지화를 제공할 수 있다.
수득되는 이미지 사이에 어떠한 시간 지연이 없기 때문에 단일 스냅사진에서의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 2가지 형광 방출 이미지(520 및 650 nm)의 동시 수득이 가능하다. 또한 각각의 특정 파장에서의 이미지가 중복되는 경우 혼합 표본 내 두 개의 다른 단백질 분자의 각각의 위치 측정이 가능한 것이다.
도 4는 액틴 단백질 분자 및 200-nm 비드의 크기를 비교한 비디오 이미지 사진이다. 이때 사용된 시험기기는 도 2의 시험기기를 이용한 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이 개별 Alexa Fluor 488-표지 액틴의 관찰 길이는 약 382±9.79(평균±표준편차) nm 또는 395 nm의 이론적 수치의 96±2.56%이었다(43 kDa = 1161-bp DNA = 395 nm). 액틴 단백질 분자의 크기는 200-nm 황-녹 형광 FluoSphere 비드와 거의 유사하다. 10 mM CHES 완충액과 함께 표본을 주입시키기 전에 모세관이 0.5% PVP로 역동적으로 코팅되는 경우 개별 단백질 분자는 모세관 내에서 용이하게 검출할 수 있다.
용액 내 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 사이의 단백질-단백질 상호작용의 실시간 결합 동력학이 실시간 이중-색상 LIF 검출 시스템을 이용하여 단일-분자 수준에서 조사되었다.
단백질 분자가 상보적 결합의 예가 아닌 경우에도 단백질 표본의 높은 농도(즉, 500 pM 이상)는 단백질 분자의 응집 및 비특이적 결합을 유발하였다. 비-상보적 단백질 결합의 비특이적 결합을 방지하기 위해 fM-aM 수준의 단백질 농도가 요구되고 단일-분자 수준에서 정확한 관찰을 가능하게 한다. 500 aM의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 사이의 결합 동력학 결과는 충돌 및 도킹 열역학 이론에 따라 더 낮은 온도에서 개별 단백질 분자 사이의 더욱 신속한 결합 및 해리가 발생한다. 결합 단백질 분자의 수는 20∼32℃ 범위의 온도 증가와 함께 감소하였다.
이는 단백질-단백질 상호작용 과정을 이해하는데 필수적인 전체 상호작용 네트워크뿐만 아니라 단백질-단백질 상호작용의 특성화가 단일-분자 수준에서 온도 및 농도에 의존적임을 나타낸다. 본 발명에서는 본 발명의 실시간 이중 색상 분석시스템을 이용하여 어떠한 시간 지연 없이 단일-분자 수준에서 단백질-단백질 상호작용의 실시간 동력학이 분석될 수 있었다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
시험용 시약
2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산(CHES)은 Sigma Chemcial Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입되었다. 10 mM CHES는 초순수(>15 ㏁) 내에 용해되었고 pH는 1 M NaOH(Showa Chemical Co. Ltd., 일본 동경)으로 10까지 적정되었다. 사용 전에 모든 완충액은 0.2-㎛ 막필터(MilliQTM/Milli-RO Water System, USA)를 통해 여과되었고 UV-B 램프(G15T8E, 280　315 nm, Philips, 네덜란드)를 이용하여 광-표백되었다. 모세관 내벽으로의 단백질 흡착을 방지하기 위해 Polyscience(Warrington, England, USA)에서 구입된 1 3000 000 Mr 폴리(비닐피롤리돈)(PVP)의 0.5% PVP(w/v)를 10 mM CHES 완충액에 용해시킴으로서 모세관 동력 코팅 매트릭스가 제 조되었다.
표본 준비
Alexa Fluor 488-표지 액틴 컨쥬게이트 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)로부터 구입되었다. 토끼 항-액틴 항체는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입되었다. 단백질 키나제 A-FITC 컨쥬게이트는 Promega (Madison, USA)로부터 구입되었다. 항원-항체 결합 절차를 이용하여 Alexa Fluor 488-표지 액틴 컨쥬게이트 및 항-액틴 항체가 4℃에서 60분간 인큐베이트시켜 항원(Alexa Fluor 488-표지 액틴)-항체(표지되지 않은 항-액틴 항체) 복합체를 생성시켰다. Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체가 항원(Alexa Fluor 488-표지 액틴)-항체(표지되지 않은 항-액틴 항체) 복합체를 함유한 반응 혼합물 용액에 첨가되었다(도 1).
모든 단백질 표본은 10 mM CHES 완충액 내의 1 μM 농도로 제조되었다. SMD 실험의 경우 단백질 표본은 실험 시작 직전에 10 mM CHES 완충액을 이용하여 500 aM-5 pM로 더욱 희석되었다. 단백질 크기는 10 mM CHES 완충액으로 500 aM 농도로 희석된 200 nm 황-녹색 형광 FluoSpheres 비드(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 이용하여 측정되었다.
실시간 이중 색상 분석시스템 및 기구
도 2(a)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위해서 사용되는 분석시스템을 나타내는 사진이다. 도 2(b)는 단일-단백질 분자를 모니터링하기 위한 캐필러리 형태의 실험기구를 나타낸 개략도이다. Dual-ViewTM(Optical Insight, LLC, Tucson, USA)이 장착된 Zeiss Axioskop2 현미경(Zeiss, 독일)이 대부분의 조사에 사용되었다. Zeiss 40×/0.75 N.A. Plan-Neofluar 현미경 대물 렌즈(Zeiss, 독일)가 사용되었다. Pentamax 512-EFT/1EA 강화 CCD 카메라(ICCD, Princeton Instruments, Princeton, NJ, USA)가 현미경 상부에 고정되었다. Dual-ViewTM는 대물 렌즈와 CCD 카메라 사이에 고정되었다. Dual-ViewTM 필터 박스는 4개의 거울, 2중 색성 필터(565dcxr, Chroma technology Corp., Rockingham, USA) 및 2개의 밴드-통로 필터(D680/35 및 D535/40, Chroma Technology Corp., Rockingham, USA)로 구성되었다.
두 개의 다른 레이저가 여기원(excitation source)으로 사용되었다: 파장 조정 가능 아르곤 이온 레이저(488 nm에서 최대 출력 150 mW; Melles Griot, Irvin, CA, USA) 및 635 nm 섬유 결합 레이저(635 nm에서 최대 출력 100 mW; B&W TEKINC, Newark, DE, USA)가 사용되었다. 모세관 창 중심에 빔을 집중시키기 위해 레이저빔은 50-mm 초점 길이 0.5-인치 원형-실린더-렌즈(Edmund Optic Inc., Barrington, NJ, USA)를 따라 집중되었다. 카메라의 디지털화 비율은 3으로 설정된 소프트웨어 제어기 증가 및 70으로 설정된 하드웨어 증가와 함께 5 ㎒(12 비트)이었다. 카메라는 외부 동시 발생 모드로 작동되었다.
레이저 빔은 광학 핀홀(pinhole)을 통해 투과되어 외래 광 및 플라스마 라인을 제거하고 레이저 직경을 감소시켰다. 광 표백을 감소시키기 위해 카메라가 작동하지 않을 때 레이저빔을 차단시키는데 Uniblitz 기계 셔터(모델 LS2Z2, Vincent Associates, Rochester, NY, USA)가 사용되었다. 셔터는 VMM-D1 셔터 드라이버(Vincent Associates, Rochester, NY, USA)에 의해 제어되었다. 실험 시간은 Stanford Research System model DG-535 4 채널 디지털/펄스 발생기(Stanford Research Systems Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 제어되었다. ICCD 카메라는 10 ms 지속 TTL 펄스로 0 ms 시간에 작동되었다.
표본 추출 빈도는 10 ms 노출 및 90 ms 지연으로 설정된 셔터 드라이버로 10 ㎐이었다. 불필요한 광을 제거하고 모든 단백질 분자의 이미지를 수득하기 위해 개별 단일-단백질 분자로부터의 형광은 Dual-ViewTM 필터 박스로 통과되었다. WinView/32TM(버전 2.5.14.1, Downingtown, PA, USA) 및 MetaMorph 6.3 소프트웨어(Universal Imaging Co., Downingtown, PA, USA)는 개별 단일 분자의 이미지를 수집하고 데이터를 처리하는데 이용되었다.
실시간 이중 색상 분석 측정용 모세관의 제조
A25-cm 길이×75-㎛ i.d.×375-㎛ o.d. 정사각형-형태 노출 융합-실리카 모세관(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA)은 모세관의 말단으로부터 12 cm에서 소거된 0.5-cm 창을 지닌 모든 SMD 실험에 사용되었다. 모세관은 모세관 받침에 고정되었고 양 말단은 저장기로서 사용되는 통상의 1.5 mL 미세원심분리 폴리프로필렌 시험관 내에 침지되었다. 사이펀(siphon) 작용 이외의 다른 효과를 방지하기 위해 400-㎛ Pin Vise Drill(SUPLECO, PA, USA)을 이용하여 저장기로 구멍이 뚫어졌다. 모세관은 5분간 물로, 3분간 0.1 M 수산화나트륨으로, 5분간 물로, 5분간 10 mM CHES 완충액으로 연속적으로 세척되었다. 최종적으로 혼합된 단백질 표본은 단백질 흡착을 방지하기 위해 1분간 0.5% PVP로 역동적 코팅 후 모세관에 도입되었다.
모든 시약은 5 mL 주사기로의 수력학적 주입에 의해 모세관 내로 도입되었다. 모세관 내 개별 단백질 분자를 작동시키거나 중지시키기 위해 작용 완충액 바이알간의 높이 차이가 제어되었다. 바이알은 비-작동 조건에 사용되는 높이와 동일한 높이에 놓였고 작동 조건에 대한 2 cm의 높이 차이가 존재하였다.
(실시예 1) 실시간 이중 색상 분석방법을 이용한 단일-단백질 분자의 직접적 관찰
도 3에 나타난 바와 같이 Ar+ 레이저로부터의 488 nm 및 He/Ne 레이저로부터의 635 nm의 이중-파장으로 동시에 여기되고 Dual-ViewTM로 관찰시 실시간으로 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 형광 이미지가 특정 파장 영역에서 모니터될 수 있었다. 혼합물 표본 내 개별 단백질 분자는 효과적으로 집중되고 상보적 단백질 분자와 상호작용하게 되고 이중-파장(여기 파장, λex = 488 및 635 nm) LIF 검출에 의해 검출되었다. 모든 혼합된 단백질 표본이 이중-파장에 의해 동시-여기되었으나 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 분자는 488 nm 영역에서 명백하게 모니터되었고(도 3a의 녹색) Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 분자는 635 nm에서만 이미지가 나타났다(도 3b의 적색). 이중-파장 LIF 검출 시스템은 실시간으로 다른 형광단으로 개별 단백질의 정확한 동시 이미지화를 제공하였다.
수득되는 이미지 사이에 어떠한 시간 지연이 없었기 때문에 단일 스냅사진에서의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 2가지 형광 방출 이미지(520 및 650 nm)의 동시 수득이 가능하였다. 또한 각각의 특정 파장에서의 이미지가 중복되는 경우 혼합 표본 내 2개의 다른 단백질 분자의 각각의 위치 측정이 가능하였다.
개별 Alexa Fluor 488-표지 액틴의 관찰 길이는 약 382±9.79(평균±표준편차) nm 또는 395 nm의 이론적 수치의 96±2.56%이었다(43 kDa = 1161-bp DNA = 395 nm). 액틴 단백질 분자의 크기는 200-nm 황-녹 형광 FluoSphere 비드와 거의 유사하였다(도 4). 10 mM CHES 완충액과 함께 표본을 주입시키기 전에 모세관이 0.5% PVP로 역동적으로 코팅되는 경우 개별 단백질 분자는 모세관 내에서 용이하게 검출되었다.
또한 실시간 이중 색상 분석방법은 5 fM 농도의 4.1ㅁ0.99(평균ㅁ표준편차)개 개별 단일 분자를 계산할 수 있었다. 5×10-15 M의 농도는 본 시스템 내의 제공된 검출 창에 4.5개 단일-단백질 분자만이 존재함을 의미한다. 이는 각각의 1.41 ㎕ 부피 또는 75 ㎛ 폭 × 75 ㎛ 깊이 × 25 cm 길이 모세관 영역 내에 이론적으로 4244개 단백질 분자가 존재하고, 40ㅧ 대물렌즈에서 Dual-ViewTM의 검출 창은 58.9 ㎛ × 265 ㎛이기 때문이다. 이러한 적은 검출 부피 및 초-저농도에서 관찰된 단백질 분자 수의 정확도는 약 91%이었다. 그러나 모세관 주입 영역 상의 흡착으로 인해 0.5% PVP로의 역동적 코팅 없이는 개별 단백질 분자가 관찰될 수 없었다. 이러한 결과는 PVP가 모세관 전기영동 내 융합-실리카 표면 및 융합-실리카/물 인터페이스 상의 단백질 분자의 흡착을 방지할 수 있다는 사실과 일치한다.
(실시예 2) 단백질-단백질 상호작용 상의 농도 효과
시험관 내에서 정제된 단백질의 상호작용을 특성화하기 위해 여러 기술이 수년간 개발되고 적용되었으며 더욱 개량되었다. 이들 기술은 특수화되고 다소 많은 양의 단백질을 요구한다. 본 발명에서는 상호작용이 실시간으로 검출되어 다양한 단백질 상호작용을 특성화하는데 중요하고 실험적으로 확고한 파라미터를 제공할 수 있기 때문에 평형 및 상호작용 동력학이 분석될 수 있었다. 1 s-1 내지 1ㅧ10-4s-1 범위의 속도 상수 및 100 pM 내지 100 μM 범위의 평형 해리 상수로 결합 동력학을 지닌 시스템 상의 조사가 가능하다. 따라서 상온에서 단일-분자 수준으로 표본 내 단백질의 농도에 의존적인 비특이적 단백질-단백질 상호작용의 실시간 이중-색상 형광 비디오 이미지(즉, FITC-표지 단백질 키나제 A 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체)가 수득될 수 있었다(도 5).
개별 단백질 분자의 이미지는 단백질 표본의 수력학적 주입 10분 후 10 ㎐ 프레임 비율로 직접 모니터링되었다. 수력학적 주입 및 중력 유동에 의한 단백질 분자의 작동은 표본 내로 모세관의 말단을 위치시킨 후 표본 컨테이너 및 모세관 말단을 2 cm 높이 차이로 이동시킴으로서 달성되었다. 실시간 이중 색상 분석 시스템은 신속한 광표백이 문제점인 단백질-단백질 상호작용의 이미지를 수득할 수 있었다.
그러나 단백질 표본이 상보적 상호작용(즉, 항원-항체 상호작용)의 예가 아닌 경우 비특이적 단백질-단백질 상호작용 및 FITC-표지 단백질 키나제 A와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 응집은 >500 pM 농도로 발생하였다(도 5c 및 d). 이는 단백질 분자가 상보적 결합을 정상적으로 나타내지 않더라도 높은 단백질 농도가 비특이적 단백질-단백질 상호작용을 유발할 수 있음을 나타낸다. 따라서 항원-항체 상호작용의 비-상보적 결합 표본 및 상보적 결합 표으로 60분간 비-추진 조건 하에 500 aM 이하에서 단백질-단백질 상호작용이 관찰될 수 있었다. 단백질-단백질 상호작용은 상보적 항원-항체 상호작용, Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 및 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 관찰 몇초 후 이내에만 나타났다(도 6).
(실시예 3) 단백질-단백질 상호작용에서의 온도 효과
복합체의 결합 친화력은 상관관계 KA = e-(ΔG/RT)에서 정의된 바와 같이 Gibbs 결합 자유 에너지 ΔG, 및 온도 T에 의존적이다. 동일한 친화력은 많은 다른 속도 상수의 다른 조합을 반영할 수 있다. 유사하게는 Gibbs 자유 에너지는 복합체 형성 동안 효과를 나타내는 비-공유결합력의 특정 화학적 특성에 따라 다르게 엔탈피와 엔트로피 변화의 많은 다른 조합을 반영할 수 있다. 더욱이 온도 반응의 특 성은 이들 힘의 화학적 특성을 나타낼 수 있다.
일반적으로 항원-항체 상호작용은 하기 기본 열역학적 원리를 따른다: 더 높은 온도는 더 높은 결합/해리 속도 상수를 유발한다. 따라서 온도와 50 fM 이하의 농도의 함수로서 실시간 단백질-단백질 상호작용의 동력학을 관찰하는 것이 가능하였고, 이는 개별 단백질 분자의 비특이적 결합을 나타내지 않았다(도 7). 분자가 모세관을 통해 용출되었기 때문에 개별 단백질 분자의 모니터링이 이중-색상 형광 방출의 반복된 출현 및 소멸을 나타내었으나 단백질 분자의 실시간 역동적 이미지는 어려움 없이 수득되었다. 모세관 내 추진력 하에 2개의 다른 단백질 표본이 혼합된 직후 단백질-단백질 결합의 증거는 없었다(도 7a). 개별 단백질 분자의 상보적 결합은 단백질 표본이 혼합되고 몇 초 후 발생하였다.
대부분의 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 분자는 상온에서 40∼80분 이내에 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체 분자와 연속적으로 결합되었다(도 7b 및 c). 그러나 상온에서 80분 후 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체와 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 분자 사이의 해리가 발생하기 시작하였다(도 7d).
용액 내 단백질-단백질 상호작용의 동력학은 실시간 이중 색상 분석시스템을 이용하여 단일-분자 수준에서 온도 함수(12, 20, 25 및 32℃)로서 조사되었다. 도 8에 나타난 바와 같이 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체(녹색)와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 분자(적색)의 결합을 위한 반응 시간 함수로서 분자 수(도 8의 좌측 y-축) 및 분자의 상대 백분율(도 8의 우측 y축)은 온도에 따라 변하였다(도 8).
개별 단백질 분자의 수는 비디오 이미지의 200 프레임 상의 결합 단백질 수를 계산함으로서 측정되었다. 200 프레임 동안 개별 단일-단백질 분자의 수는 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체의 경우 23±2(평균±표준편차 n=5)이고 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체의 경우 20±1이었다.
12 내지 32℃ 범위의 온도에서 단백질 분자간의 가장 높은 상대 결합(또는 결합 분자 수)은 2개의 다른 단백질 분자가 혼합되고 40∼50분 후 발생하였다. 결합 분자의 수 및 지속성은 반응 온도가 감소함에 따라 증가한 반면, 해리 속도는 감소하였다. 평균적으로 이들이 12℃, 20℃ 및 25℃에서 혼합되고 40∼50분 이내에 90%의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체가 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체에 결합되었다. 그러나 32℃에서는 단지 50%의 Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체가 결합되었다.
단백질-단백질 상호작용에 의한 결합 분자의 수는 이들이 혼합되고 50분까지 32℃에서 12℃로 온도를 감소시킴에 따라 증가하였다. 일반적으로 온도 증가가 결합 속도 상수와 해리 속도 상수 모두를 증가시키기 때문에 상대 결합 백분율은 온도 증가에 따라 증가하는 것으로 예측된다.
그러나 단일-분자 수준에서의 이들 결과는 일반적 예측과는 대조적이었다. 이들 결과는 충돌 및 도킹(docking) 열역학의 이론을 이용하여 해석될 수 있다: 온도가 이들 항원-항체 복합체의 충돌 및 도킹 단계에 차별적으로 효과를 나타낸다. 이러한 이론에 따라 온도가 충돌과 도킹 단계 사이의 자유 에너지 변화의 분포를 변화시킴으로서 친화력에 영향을 미친다. 도킹 단계는 충돌 단계보다 더 온도-민감성이고 더 높은 온도에서 에너지학적으로 덜 유리하다. 더 높은 온도에서 도킹에 더 긴 시간이 요구되고 오프-레이트(off-rate)의 명백한 증가는 충동 상태에 존재하는 더 많은 분자 비율을 반영한다.
따라서 온도 효과의 특성 및 규모는 단백질-단백질 상호작용의 결합 동력학의 특성이 될 수 있다: Alexa Fluor 488-표지 액틴/항-액틴 항체 복합체와 Alexa Fluor 633-표지 염소 항-토끼 IgG 항체 사이의 결합 동력학은 높은 온도(32℃)보다 낮은 온도(12∼25℃)에서 더욱 민감성인 것으로 나타났다.
본 발명의 효과는 단일-분자 수준에서 용액 내 온도-의존적 단백질-단백질 상호작용의 실시간 동력학을 조사하기 위해 이중-파장 레이저-유도 형광 검출 방법 및 그 장치를 제공하는 것이다. 본 발명에서는 이중-파장 단일-분자 형광 검출 시스템을 이용하여 다른 형광 염료로 표지된 개별 단백질 분자의 실시간 형광 이미지가 시간의 지연 없이 동시에 모니터링 할 수 있는 실시간 이중 색상 분석방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.

Claims (5)

  1. 파장 X의 형광 표지를 지닌 검체 단백질 항원 A;
    상기 검체 단백질 항원 A에 결합되는 첫 번째 항체 단백질 안티-A; 및
    상기 첫 번째 항체 단백질 안티-A에 결합되는 파장 Y의 형광 표지를 지닌 두 번째 항체 단백질 안티-B로 구성된 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 실시간 이중 색상 분석방법에 있어서,
    상기 이중 색상 분석방법으로 검체 항원 단백질과 항체 단백질의 상호작용을 효소 면역반응을 이용하여 측정하고, 그 결과를 파장 X 및 Y의 이중-파장의 색상을 통해 판독함을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 파장 X 및 Y는 각각 440 nm, 488 nm, 545 nm, 580 nm, 635 nm에서 선택된 파장임을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 실시간 이중 색상 분석방법 검체 단백질의 농도는 아토몰(aM) 내지 펨토몰(fM) 수준까지 낮은 초미세량의 검체 단백질의 상호작용을 검출할 수 있음을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법
  4. 제 1항에 있어서, 상기 실시간 이중 색상 분석방법은 12∼32℃의 실온에서 수행됨을 특징으로 하는 실시간 이중 색상 분석방법
  5. 삭제
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