JP2004093527A

JP2004093527A - 蛍光共鳴エネルギー転移を用いた蛋白質の分析方法

Info

Publication number: JP2004093527A
Application number: JP2002258592A
Authority: JP
Inventors: Takao Hamakubo; 浜窪　隆雄; Tatsuhiko Kodama; 児玉　龍彦; Kenjiro Miyano; 宮野　健次郎; Kazuyuki Masuda; 増田　一之; Toshiko Sakihama; 先浜　俊子; Hiroharu Tamaru; 田丸　博晴; Hirotaka Ito; 伊藤　浩孝; Atsushi Miyawaki; 宮脇　敦史
Original assignee: Todai TLO Ltd; Center for Advanced Science and Technology Incubation Ltd
Current assignee: Todai TLO Ltd
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2004-03-25
Also published as: WO2004022786A1; AU2003261932A1

Abstract

【課題】蛋白質の相互作用を簡単に検出するための方法を提供すること。
【解決手段】蛍光蛋白質と融合した少なくとも１種類の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に該蛋白質を発現させ、該蛋白質の相互作用または構造変化を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することを含む、蛋白質の分析方法。
【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移を用いた蛋白質相互作用の分析方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出されるバキュロウイルス中に蛋白質を機能的に発現させ、該蛋白質の構造変化または他の蛋白質との相互作用を蛍光共鳴エネルギー転移を利用して分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バキュロウイルス発現系はバキュロウイルスの高発現蛋白質、特には多角体蛋白質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて、大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタンパク質を導入し、発現したタンパク質を精製する系バキュロの発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や金属イオンの配位などタンパクの機能に必要な翻訳後修飾がはいるなど利点が多いため膜受容体蛋白質の発現系として多用されている（Ｔａｔｅ　ＣＧ，　Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ　Ｒ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９９６，　１４，　ｐｐ４２６−４３０，　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；及び、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ　Ｒ，　Ｔａｔｅ　ＣＧ，　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　１９９５，　２８，　ｐｐ３１５−４２２，　Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｏｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ）。
【０００３】
バキュロウイルスには多角体蛋白質を被った多角体ウイルスとなって核内に存在する他にもう一つの生活環があり、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に感染するために，発芽型のウイルス（Ｂｕｄｄｅｄ　ｖｉｒｕｓ）となってＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外にでる。この際に上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイルスのエンベロープ上に回収されることがＬｏｉｓｅｌらによって報告された（Ｌｏｉｓｅｌ　ＴＰ，　Ａｎｓａｎａｙ　Ｈ，　Ｓｔ−Ｏｎｇｅ　Ｓ，　Ｇａｙ　Ｂ，　Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ　Ｐ，　Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ　ＡＤ，　Ｍａｒｕｌｌｏ　Ｓ，　Ｂｏｕｖｉｅｒ　Ｍ．，　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１９９７，　Ｎｏｖ．　１５（１２），　ｐｐ１３００−１３０４，　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｂｅｔａ　２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｒｏｍ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容体は糖鎖構造など機能的でないものが多いのにくらべ、ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されている。
【０００４】
Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ；　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７回膜貫通型受容体とも呼ばれ、ホルモン、光、臭い又は味などの刺激に反応してシグナルを細胞内に伝達する膜型受容体である（Ｔａｔｅ　ＣＧ，　Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ　Ｒ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９９６，　１４，　ｐｐ４２６−４３０，　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；及び、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ　Ｒ，　Ｔａｔｅ　ＣＧ，　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　１９９５，　２８，　ｐｐ３１５−４２２，　Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｏｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ）。ヒトゲノム上には、におい受容体を含めて７００種類程度の遺伝子が存在することが知られている（Ｖｅｎｔｅｒ　ＪＧ，　Ａｄａｍｓ　ＭＤ，　ＭｙｅｒｓＥＷ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９１，　ｐｐ１３０４−１３５１，　２００１，　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ）。これらの多くは、ホルモンやケモカインの受容体であることから、創薬のターゲットとして重要視されている。ＧＰＣＲはリガンドと結合して三量体Ｇ蛋白質を活性化し、三量体Ｇ蛋白質のＧαサブユニットを解離して、エフェクター蛋白質と相互作用を起こしてシグナルを伝播する。ＧＰＣＲはＧ蛋白質と共役することによって高親和性を保っており、このシグナルを検出することは、受容体に対するリガンドの特定や阻害剤のスクリーニングに重要である。
【０００５】
ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）は近接した蛍光物質間に起こるエネルギー転移の現象であり、蛍光供与体と蛍光受容体との距離および位置関係によって強さが決まることから、蛋白質のコンフォメーション変化や相互作用の検出に利用されている（Ｗｅｉｓｓ　Ｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３，　ｐｐ１６７６−１６８３，　１９９９，　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　Ｓｏｎｇｌｅ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）。また、イオン依存的にコンフォメーション変化を起こす蛋白質を用いて、生細胞でのイオン濃度変化のインジケーターとしても用いられている（Ｍｉｙａｗａｋｉ　Ａ，　Ｌｌｏｐｉｓ，　Ｈｅｉｍ　Ｒ，　ＭｃＣａｆｆｅｒｙ　ＪＭ，　Ａｄａｍｓ　ＪＡ，　Ｉｋｕｒａ　Ｍ，　＆　Ｔｓｉｅｎ　ＲＹ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３８８，　ｐｐ８８２−８８７，　１９９７，　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｃａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）。
【０００６】
ＦＲＥＴの蛋白質相互作用への応用はオワンクラゲに由来するＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の登場によって大きく進展した（Ｈａｈｎ　Ｋ．，　Ｔｏｕｔｃｈｋｉｎｅ　Ａ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４，　ｐｐ１６７−１７２，　２００２）。ＧＦＰは発光団のアミノ酸を変異させることにより蛍光スペクトルを変化させることができる。これにより、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）やＣＦＰ（ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）をドナーとし、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）をアクセプターとするＦＲＥＴの系が可能となった。ＧＦＰおよび上記変異蛋白質を目的蛋白質に組み込んで発現させることにより、生細胞での測定が可能となる。細胞内の反応を、ＦＲＥＴを用いた蛋白質相互作用により、リアルタイムで観察することが可能となった。
【０００７】
ＧＦＰを用いることのデメリットは、それ自体比較的分子量が大きいため、組み込んだ際に目的蛋白質のコンフォメーションが変わってしまい、機能が障害される可能性があることである。特にＧＰＣＲの場合、リガンドとの結合、Ｇ蛋白質との相互作用等の複雑なシステムの伝達が比較的小さいドメインで行われるため、受容体にＧＦＰを融合した場合、Ｇ蛋白質の共役の機能が障害されることが多い。また、Ｇ蛋白質自身も３量体形成、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応、ＧＰＣＲとの共役およびエフェクター蛋白質との相互作用など多岐にわたる機能を有するため、ＧＦＰをＧ蛋白質の機能を保ったまま融合させるのが困難であった。
【０００８】
Ｈｕｇｈｅｓらは、Ｇαｑ蛋白質のヘリカルドメインにＧＦＰを挿入することにより、受容体とのカップリングおよびホスホリパーゼＣやＧβγ依存性内向性Ｋチャンネルの活性化などが保たれることを報告している（Ｈｕｇｈｅｓ　Ｔ　Ｅ，　Ｚｈａｎｇ　Ｈ，　Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ　Ｄ　Ｅ，　ａｎｄ　Ｂｅｒｌｏｔ　ＣＨ．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２７６，　ｐｐ４２２７−４２３５，　２００１，　Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇα　ｑ−Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ＬｉｖｉｎｇＣｅｌｌｓ）。同様なことが、Ｇαｉ、Ｇαｓについても報告されている（Ｌｅａｎｅｙ　ＪＬ，　Ｂｅｎｉａｎｓ　Ａ，　Ｇｒａｖｅｓ　ＦＭ，　Ｔｉｎｋｅｒ　Ａ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔｓ；及びＹｕ　ＡＺ　ａｎｄ　Ｒａｓｅｎｉｃｋ　ＭＭ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，　６１（２），　ｐｐ３５２−３５９，　２００２，　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｇαｓ：　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）。受容体を介したシグナルの測定としては、粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）を用いたＧ蛋白質のサブユニット間のＦＲＥＴによる解離の測定が報告されているが、それ以外の細胞等への応用の報告はない（Ｊａｎｅｔｏｐｏｕｌｏｓ　Ｃ，　Ｊｉｎ，　Ｔ，　Ｄｅｖｒｅｏｔｅｓ　Ｐ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９１，　２４０８−２４１１，　２００１，　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蛋白質の相互作用を簡単に検出するための方法を提供することを解決すべき課題とした。より具体的には、本発明は、Ｇ蛋白質とそのエフェクター蛋白質との相互作用などのＧ蛋白質共役型受容体を介したシグナル伝達における蛋白質間の相互作用を簡単に検出するための方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、シグナル伝達における蛋白質間の相互作用を薬剤の存在下で検出することにより、新規な薬剤をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、バキュロウイルスにおいて機能的なＧＰＣＲとＧ蛋白質を発現する技術を用いて、蛍光ドナーとしてＣＦＰを導入したアデニレートシクラーゼを発現するリコンビナントウイルス、蛍光アクセプターとしてｃｉｔｒｉｎｅをＧαｓの内部配列に導入した融合蛋白質を発現するリコンビナントウイルス、さらにＤ１ドーパミン受容体を発現するリコンビナントウイルスを共感染させることにより、バキュロウイルスのエンベロープ上に受容体複合体を再構成し、ドーパミン刺激により活性化されたＧ蛋白質とアデニレートシクラーゼとの相互作用をＦＲＥＴにより測定することにより、リガンド結合による受容体を介したシグナル伝達を測定することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、蛍光蛋白質と融合した少なくとも１種類の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に該蛋白質を発現させ、該蛋白質の相互作用または構造変化を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することを含む、蛋白質の分析方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、第一の蛍光蛋白質と融合した第一の蛋白質をコードする遺伝子、及び第二の蛍光蛋白質と融合した第二の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に第一の蛋白質と第二の蛋白質とを同時発現させて該蛋白質同士を相互作用させ、該相互作用を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出する。
【００１３】
好ましくは、第一の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスと、第二の蛍光蛋白質と融合した第二の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養する　。
好ましくは、第一の蛋白質がＧ蛋白質であり、第二の蛋白質がＧ蛋白質のエフェクター蛋白質である。
【００１４】
好ましくは、Ｇ蛋白質共役型受容体をコードする組み換えバキュロウイルスを宿主にさらに感染させる。
好ましくは、Ｇ蛋白質共役型受容体に対するリガンドの存在下で宿主を培養する。
【００１５】
好ましくは、宿主から放出されるバキュロウイルスが発芽バキュロウイルスである。
好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の分析方法において、被験物質の存在下において蛋白質の相互作用を分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング方法により得られる、蛋白質の相互作用を促進又は阻害する物質が提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
本発明による蛋白質の分析方法は、蛍光蛋白質と融合した少なくとも１種類の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に該蛋白質を発現させ、該蛋白質の相互作用または構造変化を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することを特徴とする。
【００１８】
本発明の分析方法は、好ましくは、第一の蛍光蛋白質と融合した第一の蛋白質をコードする遺伝子、及び第二の蛍光蛋白質と融合した第二の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に第一の蛋白質と第二の蛋白質とを同時発現させて該蛋白質同士を相互作用させ、該相互作用を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することにより行う。上記のように２種類の蛋白質を共発現させる場合、上記２種類の蛋白質をコードする遺伝子は同一の組換えバキュロウィルス中に含めてもよいし、異なる組換えバキュロウイルス中に含めてもよい。
【００１９】
本発明では、第一の蛋白質としてＧ蛋白質を使用し、第二の蛋白質としてＧ蛋白質のエフェクター蛋白質を使用することが好ましい。この場合、Ｇ蛋白質共役型受容体をコードする組み換えバキュロウイルスを宿主にさらに感染させ、Ｇ蛋白質共役型受容体に対するリガンドの存在下で宿主を培養することにより、リガンドが受容体に結合することによる該受容体を介したシグナル伝達を測定することが可能である。
【００２０】
上述の通り、本明細書で言う「Ｇ蛋白質共役型受容体」とは７回膜貫通型受容体とも呼ばれ、ホルモン、光、臭い又は味などの刺激に反応してシグナルを細胞内に伝達する膜型受容体である。Ｇ蛋白質共役型受容体の多くは、ホルモンやケモカインの受容体であり、リガンドと結合して三量体Ｇ蛋白質を活性化し、三量体Ｇ蛋白質のＧαサブユニットを解離して、エフェクター蛋白質と相互作用を起こしてシグナルを伝播する。
【００２１】
本発明で言うＧ蛋白質とは、３量体Ｇ蛋白質が挙げられる。Ｇ蛋白質のαサブユニットとして次のものが挙げられる。ＧｓクラスのＧαｓ、Ｇαｏｌｆ。ＧｉクラスのＧαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇαｇｕｓｔ。Ｇｑ　クラスの　Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６。Ｇ１２クラスのＧα１２、Ｇα１３。またこれらαサブユニットと三量体を形成するβおよびγサブユニットとして、それぞれβ１からβ５までおよびγ１からγ１１までが挙げられる。
【００２２】
Ｇ蛋白質のエフェクター蛋白質としては、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼＣβ、及びＲｈｏＧＥＦなどが挙げられる。Ｇαｓ及びＧαｉはアデニレートシクラーゼを、ＧαｑはホスホリパーゼＣβを、Ｇα１２及びＧα１３はＲｈｏＧＥＦをぞれぞれエフェクター蛋白質とする。
【００２３】
また、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質（そのリガンドを括弧内に示す）の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（１）ロドプシン／βアドレナリン受容体様　Ｇ　タンパク質共役型受容体タンパク質として、ＢＬＴ１（ロイコトリエンＢ_４），ＥＴ_Ａ，　ＥＴ_Ｂ（エンドセリン），ＡＴ１（アンギオテンシン），ＥＤＧ（スフィンゴシンリン酸），ＣＣＲ，　ＣＸＣＲ　（ケモカイン），　α_１、α_２、β_１、β_２、β_３（ノルエピネフリン）、Ｍ_１，　Ｍ_２，　Ｍ_３（アセチルコリン）、５−ＨＴ_１Ａ（セロトニン）、ＮＫ−１（サブスタンスＰ）、Ｙ_１（ニューロペプチドＹ）、Ｂ_１，　Ｂ_２（ブラジキニン）、Ｖ１Ａ（バソプレッシン）、ＣＢ１，　ＣＢ２（アナンダマイド），　Ｄ１，　Ｄ２，　Ｄ３（ドーパミン），におい受容体，ＭＴ１，　ＭＴ２，　ＭＴ３（メラトニン），光受容体などが挙げられる。
（２）グルカゴン／ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ）／カルシトニン受容体様　Ｇ　タンパク質共役型受容体タンパク質として、カルシトニン受容体（カルシトニン）、ＶＩＰ_１，　ＶＩＰ_２　（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＣＲＦ１（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ），　　ＰＴＨ受容体（パラトルモン）などが挙げられる。
（３）代謝型神経伝達物質／カルシウム受容体様　Ｇ　タンパク質共役型受容体タンパク質として、ｍｇｌｕ_１，　ｍｇｌｕ_２（グルタミン酸）、ＧＡＢＡ_Ｂ（γ−アミノ酪酸），味受容体などが挙げられる。
（Ｇｅｔｈｅｒ，　Ｕ．　Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　（２０００）　２１，　９０−１１３）（１９９８　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　Ｉｏｎ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９８）
【００２４】
本発明の方法では、第一の蛋白質（例えば、Ｇ蛋白質）及び第二の蛋白質（例えば、Ｇ蛋白質のエフェクター蛋白質）を、それぞれ蛍光アクセプター及び蛍光ドナーとして作用する２種類の蛍光蛋白質の何れかとの融合蛋白質の形で発現させる。例えば、第一の蛋白質（例えば、Ｇ蛋白質）を蛍光アクセプター蛋白質と融合させ、第二の蛋白質（例えば、Ｇ蛋白質のエフェクター蛋白質）を蛍光ドナー蛋白質と融合させることができるし、あるいはその逆に第一の蛋白質を蛍光ドナー蛋白質と融合させ、第二の蛋白質を蛍光アクセプター蛋白質と融合させてもよい。
【００２５】
本発明では、２種類の異なる蛍光波長を有する蛍光蛋白質を使用し、これらの蛍光蛋白質の間で起きる蛍光共鳴エネルギートランスファーにより生じる蛍光を測定する。本発明で用いる蛍光蛋白質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＥＰ）、緑色蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＥＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）又はそれらの変異体などが挙げられる。
【００２６】
本明細書で言う、シアン蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、緑色蛋白質、赤色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質又はそれらの変異体とは、各々公知の蛍光蛋白質だけでなく、それらの変異体（例えば、上記蛍光蛋白質の蛍光強度を増強した、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰなど）の全てを包含する意味である。例えば、緑色蛍光蛋白質の遺伝子は単離され配列も決定されている（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９２），”Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｇｅｎｅ　１１１：２２９−２３３）。その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例えば、Ｒｏｇｅｒ　Ｙ．Ｔｓｉｅｎ，　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．　６７：５０９−４４、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ））由来のものを使用できる。
【００２７】
ＧＦＰ、ＹＦＰとそれらの変異体の一例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。なお、Ｆ９９Ｓという表示は、９９番目のアミノ酸残基がＦからＳに置換していることを示し、他のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。
【００２８】
野生型ＧＦＰ；
Ｆ９９Ｓ，Ｍ１５３Ｔ，Ｖ１６３Ａのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｆ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔ，Ｓ７２Ａ，Ｎ１４９Ｋ，Ｍ１５３Ｔ，Ｉ１６７Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ２０２Ｆ，Ｔ２０３Ｉのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｔ２０３Ｉ，Ｓ７２Ａ，Ｙ１４５Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｈのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｋ７９Ｒ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
【００２９】
本発明で用いる蛍光蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列などは公知である。蛍光蛋白質をコードする遺伝子は市販のものを使用することもできる。例えば、クロンテック社から市販されている、ＥＧＦＰベクター、ＥＹＦＰベクター、ＥＣＦＰベクター、ＥＢＦＰベクターなどを用いることができる。
【００３０】
本発明で用いることができる蛍光ドナー／蛍光アクセプターの組み合わせとしては、ＣＦＰ／ＹＦＰ又はＢＦＰ／ＧＦＰなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、以下の実施例に記載の通り、蛍光ドナーとしてＥＣＦＰを使用し、蛍光アクセプターとしてＹＦＰの改変体であるｃｉｔｒｉｎｅ（ＹＦＰ　Ｑ６９Ｍ改変体）を使用することができる。
蛍光蛋白質が融合蛋白質をコードする遺伝子の構築は、当業者に公知の通常の遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明では、上記した蛍光融合蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用する。
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
【００３２】
本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして用いることができる。
【００３３】
ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。
【００３４】
宿主としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などがＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫の卵巣組織から確立しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社あるいはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＡＴＣＣなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使用することもできる。
【００３５】
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。
先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。
トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００３６】
トランスファーベクターの種類は特に限定されない。トランスファーベクターの具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
【００３７】
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。
【００３８】
ここで宿主として用いる培養細胞とは、上記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
【００３９】
本発明の方法では、上記した組み換えウイルスを適当な宿主（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ　ｖｉｒｕｓ，　ＢＶ）を遠心などの分離操作によって回収することができる。なお、組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共感染させてもよい。
【００４０】
細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルスは、蛍光蛋白質と融合した融合蛋白質を含むものである。
【００４１】
上記のようにして調製した発芽型バキュロウイルスのＦＲＥＴ現象は、例えば、石英セル中でＢＶ画分懸濁液について、減光フィルターで２ｍＷ　程度の出力にした４１０　ｎｍ紫レーザーダイオード（日亜化学工業）を光源に励起し、ＧＧ４３５ロングパスフィルター（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて４３５　ｎｍより長波長側について測定することにより分析することができる。蛍光は、例えば、３０ｃｍ分光系（３００ｌｉｎｅｓ／ｃｍ；Ｂｌａｚｅ　５００ｎｍ）（Ａｃｔｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ）で分光し、液体窒素冷却ＣＣＤカメラ（５１２ｘ５１２ｐｉｘｅｌ；　深さ１６ｂｉｔ）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）にて検光することができる。蛍光ドナー／蛍光アクセプターの組み合わせとしてＣＦＰ／ＹＦＰを使用する場合には、ＣＦＰおよびＹＦＰの各波長積分範囲を４６５−４９５ｎｍおよび５１０−５４０ｎｍとして、蛍光強度の比を算出することができる。
【００４２】
本発明はさらに、上記した蛋白質の分析方法において、被験物質の存在下において蛋白質の相互作用を蛍光共鳴エネルギートランスファーを利用して分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００４３】
スクリーニングに供される被験物質としては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供される化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離することも可能である。
【００４４】
これらの被験物質は、膜型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用、膜型受容体蛋白質とＧ蛋白質との相互作用、又はＧ蛋白質とそのエフェクター蛋白質との相互作用を促進又は阻害することが予想される物質であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法により、膜型受容体蛋白質に対する阻害薬または活性化薬物、Ｇ蛋白質に対する阻害薬または活性化薬物、又はＧ蛋白質のエフェクターに対する阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本発明のスクリーニング方法により得られる、このような蛋白質の相互作用を促進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４５】
【実施例】
実施例１：ドパミン受容体Ｄ１を発現する組換えバキュロウイルスの調製
（１）細胞の培養と感染、および発芽型バキュロウイルスの収集
ヒト胎児脳ｃＤＮＡからＰＣＲ法により増幅して得られたヒトドパミン受容体　Ｄ１　（ＤＲ−Ｄ１）全長ｃＤＮＡ　をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｃ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み、ｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１を作成した。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＧｒａｃｅ’ｓ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ））で２７℃で１０　ｃｍ径ディッシュに継代培養した。大量培養は１　Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）にて完全培地に０．００１％　ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルスの作成は説明書（Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｓｆ９細胞にＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ　ＤＮＡ（ＡｐＭＮＰＶ由来）とｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１とを共感染させ組み換えウイルスを作成した。
【００４６】
（２）発芽型バキュロウイルスにおける受容体発現のＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔによる解析
Ｓｆ９細胞を１　Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に２ｘ１０^６個　／　ｍｌ　濃度で５００　ｍｌ培養し、（１）で作成した組み換えウイルスをＭＯＩ＝５で感染させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液は８００　ｘｇ、１０分間遠心し、沈澱および上清に分離した。８００　ｘｇの遠心後の上清を４０，０００　ｘｇ、２５分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁後、再度４０，０００　ｘｇ、２５分遠心した。沈澱をＰＢＳに懸濁し，　８００ｘｇ，　１０分遠心して凝集物を除いた後に、再度、４０，０００ｘｇ、２５分遠心して得られた沈澱をＰＢＳに懸濁して、発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。
ＢＶ画分におけるＤＲ−Ｄ１の発現はＨｉｓ−ｔａｇを認識する抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔにより確認した（図１）。
【００４７】
（３）発芽型バキュロウイルスにおける受容体に対するリガンド結合能解析
ＢＶ画分のリガンド結合能は、　７，８−^３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　結合実験により確認した。^３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ結合実験は、７，　８−^３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅを含むｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．４、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０　ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５　％　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ　ＢＳＡ）にＤＲ−Ｄ１　ＢＶ画分を加えて反応液量５００μｌとし、室温で９０分、反応させて行なった。反応液をフタル酸ジ−ｎ−ブチル／フタル酸ジオクチル１：１混合液５００μｌ　上に重層し、１５，０００ｘｇ，　１０分間、室温にて遠心して、ウイルスを沈澱として回収した。沈澱をｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄、風乾後、液体シンチレーションカウンターで、沈澱物中に含まれるトリチウムの量を測定することにより、受容体と結合した^３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの量を算出した。^３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合量は、反応液中に加えた標識ｄｏｐａｍｉｎｅの濃度依存的に増加した。更にこの^３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合は、非標識ｄｏｐａｍｉｎｅまたはＤＲ−Ｄ１アンタゴニスト（ＳＣＨ２３３９０）により、阻害された。以上より、発芽型バキュロウイルス上に発現したＤＲ−Ｄ１は、リガンド結合活性を有することが確認された。
【００４８】
実施例２：発芽型バキュロウイルスにおけるＧタンパク質共役型受容体活性化によるＧタンパク質およびエフェクタータンパク質の相互作用のＦＲＥＴ現象による検出
Ｇタンパク質は、共役する受容体への特異的リガンド結合により活性化され、活性化後にエフェクタータンパク質と総称される各種酵素と相互作用し、それら酵素分子の活性を調節する。アデニル酸シクラーゼは活性型Ｇｓ様Ｇタンパク質と相互作用することによりサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生を上昇させるエフェクタータンパク質である。ドパミン受容体はＧｓ様Ｇタンパク質と共役し、ドパミンの特異的結合によって活性型となったＧｓ様Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼと相互作用し活性を上昇することが報告されている。また、ドパミンは血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）への特異的結合を示さない。
【００４９】
（１）蛍光タンパク質融合シグナル分子組み換えバキュロウイルスの作成
ヒトＧα_ＳｃＤＮＡおよびヒトＶＩ型アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ　ＶＩ）ｃＤＮＡは、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲによってクローニングした。蛍光タンパク質であるＣｉｔｒｉｎｅ　（ＹＦＰ　Ｑ６９Ｍ改変体）　ｃＤＮＡは、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドについてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた塩基置換変異を行ない作成した。ヒトＧα_Ｓのヘリカルドメイン内にＣｉｔｒｉｎｅを融合発現するため、ヒトＧα_ＳｃＤＮＡおよびＣｉｔｒｉｎｅ　ｃＤＮＡをテンプレートＤＮＡとしたＯｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲにより、Ｇα_Ｓの１２７Ｄおよび１２８ＦのｃＤＮＡ間にＣｉｔｒｉｎｅのｃＤＮＡ配列を挿入した。この際、ＣｉｔｒｉｎｅのＮおよびＣ末端部にはリンカーとしてＳＧＧＧＧＳのペプチド鎖ｃＤＮＡをそれぞれ付加した。作成したＣｉｔｒｉｎｅ挿入Ｇα_ＳｃＤＮＡはｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組込んだ。ＥＣＦＰとアデニル酸シクラーゼを融合発現するため、クローニングしたＡＣ　ＶＩｃＤＮＡをｐＥＣＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組込み、ＥＣＦＰ遺伝子をＡＣ　ＶＩ遺伝子３’末端に融合させた。さらにこのＥＣＦＰ融合ＡＣＶＩ　ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組込んだ。実施例１（１）で示した組換えバキュロウイルスの作成法により、Ｃｉｔｒｉｎｅ挿入α_Ｓ（α_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ）組換えバキュロウイルスおよびＥＣＦＰ融合ＡＣ　ＶＩ（ＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰ）組換えバキュロウイルスを調製した。
また、ＰＡＦ受容体（ＰＡＦＲ）組換えバキュロウイルスは、ＰＡＦＲ　ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａに組込み、実施例１（１）で示した組換えバキュロウイルスの作成法により作成した。
【００５０】
（２）発芽型バキュロウイルスにおける蛍光タンパク質融合シグナル分子によるＦＲＥＴ現象検出
２ｘ１０^６細胞／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞２００　ｍｌに、ＤＲ−Ｄ１およびＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝１．５：１．５：１．５：１．５：２．０で共感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製しＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　ｐＨ７．５）バッファーへ懸濁した。また同様に、ＰＡＦＲおよびＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝１．５：１．５：１．５：１．５：２．０で共感染させ、発芽型バキュロウイルスを調製した。
【００５１】
各組み合わせで調製した発芽型バキュロウイルスの蛍光は、石英セル中０．５　ｍｇ／ｍｌ濃度ＢＶ画分懸濁液について、減光フィルターで２ｍＷ　程度の出力にした４１０　ｎｍ紫レーザーダイオード（日亜化学工業）を光源に励起し、ＧＧ４３５ロングパスフィルター（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて４３５　ｎｍより長波長側について測定した。蛍光は３０ｃｍ分光系（３００ｌｉｎｅｓ／ｃｍ；　Ｂｌａｚｅ　５００ｎｍ）（Ａｃｔｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ）で分光し、液体窒素冷却ＣＣＤカメラ（５１２ｘ５１２ｐｉｘｅｌ；　深さ１６ｂｉｔ）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）にて検光した。ＣＦＰおよびＹＦＰの各波長積分範囲を４６５−４９５ｎｍおよび５１０−５４０ｎｍとし、蛍光強度の比を算出した。
【００５２】
ＤＲ−Ｄ１およびＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させ得られた発芽型バキュロウイルスについて１００μＭドパミン　（Ｓｉｇｍａ）による刺激を行なった場合、蛍光強度比（ＹＦＰ／ＣＦＰ）の上昇が確認出来た（図２）。一方、ドパミンと結合しないＰＡＦＲおよびＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させ得られた発芽型バキュロウイルスでは１００μＭドパミン刺激による蛍光強度比（ＹＦＰ／ＣＦＰ）の上昇は認められなかった（図２）。以上のことから、発芽型バキュロウイルスにおけるドパミンのＤＲ−Ｄ１への特異的結合によるＧα_Ｓ−ＣｉｔｒｉｎｅおよびＡＣ　ＶＩ−ＥＣＦＰの相互作用、すなわち特異的リガンド刺激による受容体活性化後のシグナル伝達についてＦＲＥＴ現象による検出が可能であることが確認された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、Ｇ蛋白質とそのエフェクター蛋白質との相互作用などのＧ蛋白質共役型受容体を介したシグナル伝達における蛋白質間の相互作用を簡単に検出することが可能になった。本発明によれば、シグナル伝達における蛋白質間の相互作用を薬剤の存在下で検出することにより、新規な薬剤をスクリーニングすることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｄ１−ドーパミン受容体発現ウイルスと感染Ｓｆ９細胞を用いたウエスタンブロットの結果を示す。レーン１は野生型発芽ウイルス、レーン２はＤ１−ＤＲを発現する発芽ウイルス、レーン３は野生型Ｓｆ９細胞膜画分、レーン４はＤ１−ＤＲを発現したＳｆ９細胞膜画分を示す。
【図２】図２は、１００μＭドパミン刺激による受容体特異的ＦＲＥＴ現象の検出を示す。ＹＦＰ波長領域：４６５−４９５ｎｍ
ＣＦＰ波長領域：５１０−５４０ｎｍ
Ｄ１／Ｇｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ／ＡＣ６−ＥＣＦＰ：Ｄ１及びＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ６−ＥＣＦＰ共発現バキュロウイルス
ＰＡＦＲ／Ｇｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ／ＡＣ６−ＥＣＦＰ：ＰＡＦＲ及びＧα_Ｓ−Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ６−ＥＣＦＰ共発現バキュロウイルス

Claims

蛍光蛋白質と融合した少なくとも１種類の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に該蛋白質を発現させ、該蛋白質の相互作用または構造変化を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することを含む、蛋白質の分析方法。
第一の蛍光蛋白質と融合した第一の蛋白質をコードする遺伝子、及び第二の蛍光蛋白質と融合した第二の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出されるバキュロウイルス中に第一の蛋白質と第二の蛋白質とを同時発現させて該蛋白質同士を相互作用させ、該相互作用を蛍光共鳴エネルギートランスファーにより検出することを含む、請求項１に記載の分析方法。
第一の蛍光蛋白質と融合した第一の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスと、第二の蛍光蛋白質と融合した第二の蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養する、請求項２に記載の分析方法。
第一の蛋白質がＧ蛋白質であり、第二の蛋白質がＧ蛋白質のエフェクター蛋白質である、請求項２又は３に記載の方法。
Ｇ蛋白質共役型受容体をコードする組み換えバキュロウイルスを宿主にさらに感染させる、請求項１から４の何れかに記載の方法。
Ｇ蛋白質共役型受容体に対するリガンドの存在下で宿主を培養する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
宿主から放出されるバキュロウイルスが発芽バキュロウイルスである、請求項１から６の何れかに記載の分析方法。
宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請求項１から７の何れかに記載の分析方法。
請求項１から８の何れかに記載の分析方法において、被験物質の存在下において蛋白質の相互作用を分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。
請求項９に記載のスクリーニングする方法により得られる、蛋白質の相互作用を促進又は阻害する物質。