JPH10260184A - ７回膜貫通型オーファン受容体のリガンドの検出法 - Google Patents
７回膜貫通型オーファン受容体のリガンドの検出法Info
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- JPH10260184A JPH10260184A JP9066663A JP6666397A JPH10260184A JP H10260184 A JPH10260184 A JP H10260184A JP 9066663 A JP9066663 A JP 9066663A JP 6666397 A JP6666397 A JP 6666397A JP H10260184 A JPH10260184 A JP H10260184A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 哺乳動物オーファン受容体に対する不明の真
のリガンドを同定する。 【解決手段】 組換え遺伝子工学技術により、昆虫細胞
膜上に多量に発現させた７回膜貫通型受容体を細胞膜上
にもつバキュロウイルス感染昆虫細胞において、Ｇタン
パク質関連シグナル伝達系を通じて、受容体と候補リガ
ンドが結合する際に生じる細胞内Ｃａ2+の増加を、蛍光
発光試薬を用いて測定する高感度リガンド検出法を開発
する。
のリガンドを同定する。 【解決手段】 組換え遺伝子工学技術により、昆虫細胞
膜上に多量に発現させた７回膜貫通型受容体を細胞膜上
にもつバキュロウイルス感染昆虫細胞において、Ｇタン
パク質関連シグナル伝達系を通じて、受容体と候補リガ
ンドが結合する際に生じる細胞内Ｃａ2+の増加を、蛍光
発光試薬を用いて測定する高感度リガンド検出法を開発
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞表面受容体と
リガンドが結合することに伴って増加する多量の細胞内
Ｃａ2+量を、蛍光試薬を用いて測定することにより、新
規リガンドを探索するリガンドの検出法に関する。
リガンドが結合することに伴って増加する多量の細胞内
Ｃａ2+量を、蛍光試薬を用いて測定することにより、新
規リガンドを探索するリガンドの検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞に存在して、外からの刺激を認識・
伝達するための構造を持つ受容体に結合するリガンドの
存在が知られている。たとえばエンドセリン（ＥＴ）は
ＥＴ受容体の、アセチルコリンは神経伝達物質受容体の
リガンドに相当する。しかしながら、生理的に重要な受
容体の生体内における真のリガンドはきわめて微量であ
るため、真のリガンドを同定することは困難である。一
方、最近の遺伝子工学の進歩により、正体が不明ではあ
るが、明らかに受容体をコードすると予想される遺伝子
がヒトゲノム解析計画を始めとする大規模なゲノム解析
の結果、多々見つかっている。殊に、７回膜貫通型受容
体遺伝子は、細胞膜を７回貫通する特徴的な塩基配列を
有するため、またパルミチン酸やミリスチン酸のような
脂肪酸を結合するシステインに富む領域があること、お
よび糖鎖添加やリン酸化に関する特定の塩基配列（また
はアミノ酸配列）があることなどにより、遺伝子塩基配
列の解析が終了した時点で、当該ＤＮＡが７回膜貫通型
受容体をコードしていることを判別することは、比較的
容易である。たとえば、Ruiz-Avila L. らは苦味感知に
係わると思われる７回膜貫通型受容体をコードする遺伝
子を、脊椎動物の味覚細胞からクローニングしているが
（Nature 376, 80-85, 1995)、それらが嗅覚能力に関与
することは察知できるものの、これらの受容体に結合す
るリガンドを探索、検出するには至っていない。これ
は、ひとえに高感度に微量に存在する天然のリガンドを
検出する技術が、現代科学の最先端においても欠けてい
るからである。
伝達するための構造を持つ受容体に結合するリガンドの
存在が知られている。たとえばエンドセリン（ＥＴ）は
ＥＴ受容体の、アセチルコリンは神経伝達物質受容体の
リガンドに相当する。しかしながら、生理的に重要な受
容体の生体内における真のリガンドはきわめて微量であ
るため、真のリガンドを同定することは困難である。一
方、最近の遺伝子工学の進歩により、正体が不明ではあ
るが、明らかに受容体をコードすると予想される遺伝子
がヒトゲノム解析計画を始めとする大規模なゲノム解析
の結果、多々見つかっている。殊に、７回膜貫通型受容
体遺伝子は、細胞膜を７回貫通する特徴的な塩基配列を
有するため、またパルミチン酸やミリスチン酸のような
脂肪酸を結合するシステインに富む領域があること、お
よび糖鎖添加やリン酸化に関する特定の塩基配列（また
はアミノ酸配列）があることなどにより、遺伝子塩基配
列の解析が終了した時点で、当該ＤＮＡが７回膜貫通型
受容体をコードしていることを判別することは、比較的
容易である。たとえば、Ruiz-Avila L. らは苦味感知に
係わると思われる７回膜貫通型受容体をコードする遺伝
子を、脊椎動物の味覚細胞からクローニングしているが
（Nature 376, 80-85, 1995)、それらが嗅覚能力に関与
することは察知できるものの、これらの受容体に結合す
るリガンドを探索、検出するには至っていない。これ
は、ひとえに高感度に微量に存在する天然のリガンドを
検出する技術が、現代科学の最先端においても欠けてい
るからである。
【０００３】受容体とリガンドの結合を高感度で測定す
る検出法が考案されたならば、真のリガンドを同定する
ことが可能であると思われる。鋭敏なリガンドの検出法
が確立され、真のリガンドを検出し同定できれば、当該
受容体の機能を調節する化合物を薬化学の技術により合
成したり、リガンドがタンパク質である場合は、遺伝子
工学技術により大量に製造することができ、これを基に
して医薬品の開発が可能となる。たとえばアルツハイマ
ー受容体に対する未知のリガンドを見つけ出すことがで
きれば、機能分子を修飾する創薬研究へと繋がることが
期待される。一方、向精神薬に強い親和性を示すセロト
ニン受容体などに対する阻害剤の検索も可能と思われ
る。
る検出法が考案されたならば、真のリガンドを同定する
ことが可能であると思われる。鋭敏なリガンドの検出法
が確立され、真のリガンドを検出し同定できれば、当該
受容体の機能を調節する化合物を薬化学の技術により合
成したり、リガンドがタンパク質である場合は、遺伝子
工学技術により大量に製造することができ、これを基に
して医薬品の開発が可能となる。たとえばアルツハイマ
ー受容体に対する未知のリガンドを見つけ出すことがで
きれば、機能分子を修飾する創薬研究へと繋がることが
期待される。一方、向精神薬に強い親和性を示すセロト
ニン受容体などに対する阻害剤の検索も可能と思われ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】組換え遺伝子技術によ
り、昆虫細胞膜上に多量に発現させたヒト７回膜貫通型
受容体とリガンドの結合反応に伴って生じる昆虫細胞内
Ｃａ2+の増加を、蛍光試薬を用いて測定する高感度リガ
ンド検出法を開発することにより、哺乳動物オーファン
受容体に対する不明の真のリガンドを同定することを目
的とする。
り、昆虫細胞膜上に多量に発現させたヒト７回膜貫通型
受容体とリガンドの結合反応に伴って生じる昆虫細胞内
Ｃａ2+の増加を、蛍光試薬を用いて測定する高感度リガ
ンド検出法を開発することにより、哺乳動物オーファン
受容体に対する不明の真のリガンドを同定することを目
的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、バキュロウイ
ルス感染昆虫細胞で発現される７回膜貫通型受容体を、
該受容体リガンドと結合させ、細胞内Ｃａ2+の増加を測
定することを特徴とするリガンドの検出法である。
ルス感染昆虫細胞で発現される７回膜貫通型受容体を、
該受容体リガンドと結合させ、細胞内Ｃａ2+の増加を測
定することを特徴とするリガンドの検出法である。
【０００６】すなわち、本発明は、 １）Ｇタンパク質関連シグナル伝達系を通じて、ＥＴ受
容体のような７回膜貫通型受容体（蛋白質 核酸 酵素
36, 2381-2388, 1991）と該受容体リガンドが結合する
際に生じる昆虫細胞内Ｃａ2+の増加を応用して、高感度
に新規リガンドを検出する方法に関する。 ２）昆虫細胞が当該ヒト７回膜貫通型受容体を含まない
場合、哺乳動物オーファン受容体と候補リガンドの結合
反応のバックグランドは、昆虫細胞に由来するバックグ
ランドに左右されることはなく、優れた検出法となる。 ３）遺伝子工学で増幅した受容体が膜表面に多量に形成
されるので、リガンドに対する結合反応がより鋭敏とな
る受容体高発現系を用いた検出法に関する。 ４）受容体が哺乳動物オーファン受容体である検出法に
関する。 ５）潜在的リガンドを探索するための検出法に関する。 ６）リガンドが不明であり、受容体がオーファン受容体
として規定される検出法に関する。 ７）受容体が７回膜貫通型であり、かつＧタンパク質関
連受容体ファミリーである検出法に関する。 ８）検出試薬が蛍光発光試薬である検出法に関する。
容体のような７回膜貫通型受容体（蛋白質 核酸 酵素
36, 2381-2388, 1991）と該受容体リガンドが結合する
際に生じる昆虫細胞内Ｃａ2+の増加を応用して、高感度
に新規リガンドを検出する方法に関する。 ２）昆虫細胞が当該ヒト７回膜貫通型受容体を含まない
場合、哺乳動物オーファン受容体と候補リガンドの結合
反応のバックグランドは、昆虫細胞に由来するバックグ
ランドに左右されることはなく、優れた検出法となる。 ３）遺伝子工学で増幅した受容体が膜表面に多量に形成
されるので、リガンドに対する結合反応がより鋭敏とな
る受容体高発現系を用いた検出法に関する。 ４）受容体が哺乳動物オーファン受容体である検出法に
関する。 ５）潜在的リガンドを探索するための検出法に関する。 ６）リガンドが不明であり、受容体がオーファン受容体
として規定される検出法に関する。 ７）受容体が７回膜貫通型であり、かつＧタンパク質関
連受容体ファミリーである検出法に関する。 ８）検出試薬が蛍光発光試薬である検出法に関する。
【０００７】
１）哺乳動物オーファン受容体の遺伝子を含むバキュロ
ウイルスの構築。 哺乳動物オーファン受容体の遺伝子を含む組換えバキュ
ロウイルスを構築する方法は公知である（Mol. Cell. B
iol., 5, 2860-2865, 1985、蛋白質 核酸 酵素 35, 2
598-2612, 1990）。哺乳動物オーファン受容体ｃＤＮＡ
遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に繋ぐことに
より、組換えバキュロウイルスを構築することができ
る。
ウイルスの構築。 哺乳動物オーファン受容体の遺伝子を含む組換えバキュ
ロウイルスを構築する方法は公知である（Mol. Cell. B
iol., 5, 2860-2865, 1985、蛋白質 核酸 酵素 35, 2
598-2612, 1990）。哺乳動物オーファン受容体ｃＤＮＡ
遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に繋ぐことに
より、組換えバキュロウイルスを構築することができ
る。
【０００８】２）昆虫細胞の培養。 ＩＰＬ−４１昆虫培地（GIBCO Laboratory, New York,
USA)を含むフラスコへ、Ｓｆ９昆虫細胞（ハスモンヨト
ウの近縁種であるSpodoptera frugiperda の細胞、Phar
Mingen, San Diego, USA)を接種し、撹拌または静置に
より細胞を増殖させる。培養は２０〜３５℃で行うこと
ができるが、好ましくは２７℃であり、２×１０6 細胞
／mlのレベルまで増殖させる。
USA)を含むフラスコへ、Ｓｆ９昆虫細胞（ハスモンヨト
ウの近縁種であるSpodoptera frugiperda の細胞、Phar
Mingen, San Diego, USA)を接種し、撹拌または静置に
より細胞を増殖させる。培養は２０〜３５℃で行うこと
ができるが、好ましくは２７℃であり、２×１０6 細胞
／mlのレベルまで増殖させる。
【０００９】３）昆虫細胞に対する組換えバキュロウイ
ルスの感染。 ２×１０6 細胞／mlの細胞を組換えバキュロウイルス
（m.o.i.＝７）で感染させる。
ルスの感染。 ２×１０6 細胞／mlの細胞を組換えバキュロウイルス
（m.o.i.＝７）で感染させる。
【００１０】４）感染した昆虫細胞における受容体の発
現と細胞の生存。 バキュロウイルスの感染により、少なくとも感染後４日
間はＳｆ９細胞の５０％以上が生存している。一方、哺
乳動物オーファン受容体は、感染後２日目に４０％近く
が生成し、発現は４日目まで続く。受容体とリガンドの
結合反応に伴って生じる細胞内Ｃａ2+（〔Ｃａ2+〕ｉ）
の増加を測定するために、感染後２〜４日目の感染細胞
を回収し、１４０mMＮａＣｌ、４mMＫＣｌ、１mMＭｇＣ
ｌ2 、４mMＮａ2 ＨＰＯ4 、１１mMグルコース、５mMHe
pes(pH７．４）および２mg/ml ウシ血清アルブミンを含
有するHepes 緩衝液に懸濁する。感染細胞懸濁液は、不
凍液の２０％グリセロールを含有する培地中、−２０℃
において、少なくとも２日間、〔Ｃａ2+〕ｉ応答活性を
消失せずに貯蔵することができた。しかし、細胞をペレ
ット化して−８０℃において一晩凍結させた場合には、
〔Ｃａ2+〕ｉを仲介する能力は完全に消失した。
現と細胞の生存。 バキュロウイルスの感染により、少なくとも感染後４日
間はＳｆ９細胞の５０％以上が生存している。一方、哺
乳動物オーファン受容体は、感染後２日目に４０％近く
が生成し、発現は４日目まで続く。受容体とリガンドの
結合反応に伴って生じる細胞内Ｃａ2+（〔Ｃａ2+〕ｉ）
の増加を測定するために、感染後２〜４日目の感染細胞
を回収し、１４０mMＮａＣｌ、４mMＫＣｌ、１mMＭｇＣ
ｌ2 、４mMＮａ2 ＨＰＯ4 、１１mMグルコース、５mMHe
pes(pH７．４）および２mg/ml ウシ血清アルブミンを含
有するHepes 緩衝液に懸濁する。感染細胞懸濁液は、不
凍液の２０％グリセロールを含有する培地中、−２０℃
において、少なくとも２日間、〔Ｃａ2+〕ｉ応答活性を
消失せずに貯蔵することができた。しかし、細胞をペレ
ット化して−８０℃において一晩凍結させた場合には、
〔Ｃａ2+〕ｉを仲介する能力は完全に消失した。
【００１１】５）受容体とリガンドの結合反応に対する
高感度検出法。 組換えバキュロウイルスを感染させた２〜４日目の昆虫
細胞を、上記のHepes緩衝液で洗浄し、Ｃａ2+に対する
蛍光発光試薬（たとえば、Fura−２（１−〔２−５″−
カルボキシオザゾリル−２′）−６−アミノベンゾフラ
ン−５−オキシ〕−２−（２′−アミノ−５′メチルフ
ェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラ酢酸ペ
ンタカリウム塩。同仁化学）を細胞に取り込ませた。取
り込まれなかった蛍光発光試薬を遠心分離により除去し
た後、上記のHepes 緩衝液に懸濁した細胞をキュベット
へ移す。そこへ候補リガンドを最終濃度１×１０-9〜１
×１０-12Mとなるように添加し、２０℃もしくは室温で
インキュベートする。受容体とリガンドの結合反応に伴
って生じる〔Ｃａ2+〕ｉの増加に対応する蛍光の放出量
をCell-Ion Analyzer により測定する。
高感度検出法。 組換えバキュロウイルスを感染させた２〜４日目の昆虫
細胞を、上記のHepes緩衝液で洗浄し、Ｃａ2+に対する
蛍光発光試薬（たとえば、Fura−２（１−〔２−５″−
カルボキシオザゾリル−２′）−６−アミノベンゾフラ
ン−５−オキシ〕−２−（２′−アミノ−５′メチルフ
ェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラ酢酸ペ
ンタカリウム塩。同仁化学）を細胞に取り込ませた。取
り込まれなかった蛍光発光試薬を遠心分離により除去し
た後、上記のHepes 緩衝液に懸濁した細胞をキュベット
へ移す。そこへ候補リガンドを最終濃度１×１０-9〜１
×１０-12Mとなるように添加し、２０℃もしくは室温で
インキュベートする。受容体とリガンドの結合反応に伴
って生じる〔Ｃａ2+〕ｉの増加に対応する蛍光の放出量
をCell-Ion Analyzer により測定する。
【００１２】候補リガンドと哺乳動物オーファン受容体
の応答活性は、組換えバキュロウイルスの感染時間に依
存する。すなわち、感染２日目の昆虫細胞で応答活性が
開始され、３日間の感染細胞で応答活性は最高に到達
し、そして４日目以降の細胞では減少していく。その
後、６日目までは、応答曲線は細胞の生存率速度論に従
う。このように、哺乳動物オーファン受容体を発現し、
かつ生存し得る細胞のみが、候補リガンドに応答して高
感度に〔Ｃａ2+〕ｉを誘導することができる。
の応答活性は、組換えバキュロウイルスの感染時間に依
存する。すなわち、感染２日目の昆虫細胞で応答活性が
開始され、３日間の感染細胞で応答活性は最高に到達
し、そして４日目以降の細胞では減少していく。その
後、６日目までは、応答曲線は細胞の生存率速度論に従
う。このように、哺乳動物オーファン受容体を発現し、
かつ生存し得る細胞のみが、候補リガンドに応答して高
感度に〔Ｃａ2+〕ｉを誘導することができる。
【００１３】また、哺乳動物オーファン受容体を発現す
るＳｆ９細胞はリガンドの濃度に応答して、きわめて鋭
敏な様相で〔Ｃａ2+〕ｉを誘導する。濃度１×１０-9〜
１×１０-12Mの範囲で検出が可能であるが、好ましくは
１×１０-9M がよい。これとは対照的に、非感染Ｓｆ９
細胞または野性型ウイルスで感染させた細胞では、候補
リガンドの検出はできない。
るＳｆ９細胞はリガンドの濃度に応答して、きわめて鋭
敏な様相で〔Ｃａ2+〕ｉを誘導する。濃度１×１０-9〜
１×１０-12Mの範囲で検出が可能であるが、好ましくは
１×１０-9M がよい。これとは対照的に、非感染Ｓｆ９
細胞または野性型ウイルスで感染させた細胞では、候補
リガンドの検出はできない。
【００１４】哺乳動物オーファン受容体と昆虫シグナル
伝達系の異種組合せにより生じるＣａ2+増加は、Ｃａ2+
の流入（Ｃａ2+チャンネルによって仲介される持続性Ｃ
ａ2+の増加）と一過性Ｃａ2+の増加（細胞内貯蔵分から
のＣａ2+の放出）を含む。すなわち、Ｃａ2+の増加は２
相性を示し、初期の鋭いピークである一過性Ｃａ2+放出
と、それに続く持続性Ｃａ2+増加で構成される。
伝達系の異種組合せにより生じるＣａ2+増加は、Ｃａ2+
の流入（Ｃａ2+チャンネルによって仲介される持続性Ｃ
ａ2+の増加）と一過性Ｃａ2+の増加（細胞内貯蔵分から
のＣａ2+の放出）を含む。すなわち、Ｃａ2+の増加は２
相性を示し、初期の鋭いピークである一過性Ｃａ2+放出
と、それに続く持続性Ｃａ2+増加で構成される。
【００１５】
〈実施例１〉８ＬのＩＰＬ−４１培地を含む撹拌フラス
コへＳｆ９昆虫細胞を接種し、２×１０6 細胞／mlのレ
ベルまで増殖させた。このＳｆ９細胞を、ヒトＥＴB 受
容体ｃＤＮＡ遺伝子をもつ組換えバキュロウイルスで感
染させ（m.o.i.＝７）、感染後２日目に８００×ｇで１
０分間遠心分離してＳｆ９細胞を回収した。１４０mMＮ
ａＣｌ、４mMＫＣｌ、１mMＭｇＣｌ2 、４mMＮａ2 ＨＰ
Ｏ4 、１１mMグルコース、５mMHepes(pH７．４）および
２mg/ml ウシ血清アルブミンを含有するHepes緩衝液５m
l中に、１〜２×１０6 細胞になるように感染細胞を懸
濁させた。遠心分離によって細胞を沈殿させて、同一の
Hepes 緩衝液５mlに再懸濁させた。この懸濁液に蛍光発
光試薬Fura−２を最終濃度１０μM になるように添加
し、混合物を２０℃でインキュベートして、細胞にFura
−２を取り込ませた。１時間後、Hepes 緩衝液を換えて
遠心分離を繰り返すことによって、取り込まれなかった
Fura−２を細胞から除去し、最終的に細胞をHepes 緩衝
液４．５mlに再懸濁させた。このFura−２を与えた細胞
をHepes 緩衝液で２〜４×１０6 細胞／mlになるように
希釈し、細胞懸濁液（０．５ml）を蛍光定量分析用に設
計された１mlキュベットに入れた。この細胞懸濁液に、
最終濃度１×１０-9M となるようにＥＴ−１溶液１０μ
l をマイクロシリンジにより撹拌下で添加し、３４０nm
の紫外線で励起された蛍光の放出量（波長３８０および
５００nm）をCell-Ion Analyzer (Nippon Bunko, Toky
o, Japan)によってモニターし、、３８０nm／３４０nm
の比を放出指標としてプロットした。
コへＳｆ９昆虫細胞を接種し、２×１０6 細胞／mlのレ
ベルまで増殖させた。このＳｆ９細胞を、ヒトＥＴB 受
容体ｃＤＮＡ遺伝子をもつ組換えバキュロウイルスで感
染させ（m.o.i.＝７）、感染後２日目に８００×ｇで１
０分間遠心分離してＳｆ９細胞を回収した。１４０mMＮ
ａＣｌ、４mMＫＣｌ、１mMＭｇＣｌ2 、４mMＮａ2 ＨＰ
Ｏ4 、１１mMグルコース、５mMHepes(pH７．４）および
２mg/ml ウシ血清アルブミンを含有するHepes緩衝液５m
l中に、１〜２×１０6 細胞になるように感染細胞を懸
濁させた。遠心分離によって細胞を沈殿させて、同一の
Hepes 緩衝液５mlに再懸濁させた。この懸濁液に蛍光発
光試薬Fura−２を最終濃度１０μM になるように添加
し、混合物を２０℃でインキュベートして、細胞にFura
−２を取り込ませた。１時間後、Hepes 緩衝液を換えて
遠心分離を繰り返すことによって、取り込まれなかった
Fura−２を細胞から除去し、最終的に細胞をHepes 緩衝
液４．５mlに再懸濁させた。このFura−２を与えた細胞
をHepes 緩衝液で２〜４×１０6 細胞／mlになるように
希釈し、細胞懸濁液（０．５ml）を蛍光定量分析用に設
計された１mlキュベットに入れた。この細胞懸濁液に、
最終濃度１×１０-9M となるようにＥＴ−１溶液１０μ
l をマイクロシリンジにより撹拌下で添加し、３４０nm
の紫外線で励起された蛍光の放出量（波長３８０および
５００nm）をCell-Ion Analyzer (Nippon Bunko, Toky
o, Japan)によってモニターし、、３８０nm／３４０nm
の比を放出指標としてプロットした。
【００１６】その結果、ヒトＥＴB 受容体を発現するＳ
ｆ９細胞はＥＴ−１リガンドに応答して、きわめて鋭敏
な様相で〔Ｃａ2+〕ｉを誘導した（図１）。これとは対
照的に、非感染Ｓｆ９細胞または野性型ウイルスで感染
させた細胞は、この活性を示さなかった。
ｆ９細胞はＥＴ−１リガンドに応答して、きわめて鋭敏
な様相で〔Ｃａ2+〕ｉを誘導した（図１）。これとは対
照的に、非感染Ｓｆ９細胞または野性型ウイルスで感染
させた細胞は、この活性を示さなかった。
【００１７】〈実施例２〉ＥＴ−１をリガンドとし、Ｅ
ＴA を受容体とする結合反応においても、実質的に実施
例１と同様の結果が得られた。
ＴA を受容体とする結合反応においても、実質的に実施
例１と同様の結果が得られた。
【００１８】〈実施例３〉また、ＥＴA およびＥＴB ２
つの受容体へのＥＴ−２およびＥＴ−３の結合様相にお
いても、実施例１と同様の誘導が示された。
つの受容体へのＥＴ−２およびＥＴ−３の結合様相にお
いても、実施例１と同様の誘導が示された。
【００１９】〈実施例４〉さらに、この高感度検出法を
利用して、哺乳動物オーファン受容体に特異的なアンタ
ゴニストを探索することもできる。たとえば、ＥＴ類似
体の環状ペンタペプチドである、ＢＱ１２３（Life Sc
i., 50, 247-255, 1992）は、濃度１μM において、Ｅ
Ｔ−１とＥＴA 受容体の結合反応を阻害する。ＢＱ１２
３がＥＴA 受容体に結合してこの受容体を休眠状態と
し、ＥＴ−１の結合をも妨害して、それによるシグナル
伝達を妨害することが示唆される。また、哺乳類の電圧
依存性Ｌ型Ｃａ2+チャンネルの周知の阻害剤であるニフ
ェジピン（nifedipine）は、濃度５０μM において、５
×１０-10MＥＴ−１とＥＴA 受容体の結合を５０％阻害
する。こうした応答活性に対するアンタゴニストの発見
は、医薬開発への道具として利用できる。
利用して、哺乳動物オーファン受容体に特異的なアンタ
ゴニストを探索することもできる。たとえば、ＥＴ類似
体の環状ペンタペプチドである、ＢＱ１２３（Life Sc
i., 50, 247-255, 1992）は、濃度１μM において、Ｅ
Ｔ−１とＥＴA 受容体の結合反応を阻害する。ＢＱ１２
３がＥＴA 受容体に結合してこの受容体を休眠状態と
し、ＥＴ−１の結合をも妨害して、それによるシグナル
伝達を妨害することが示唆される。また、哺乳類の電圧
依存性Ｌ型Ｃａ2+チャンネルの周知の阻害剤であるニフ
ェジピン（nifedipine）は、濃度５０μM において、５
×１０-10MＥＴ−１とＥＴA 受容体の結合を５０％阻害
する。こうした応答活性に対するアンタゴニストの発見
は、医薬開発への道具として利用できる。
【００２０】
【発明の効果】昆虫細胞において、７回膜貫通型受容体
とリガンドの結合反応に伴って生じる細胞内Ｃａ2+の増
加を、蛍光発光試薬を用いて測定する高感度リガンド検
出法を開発することにより、哺乳動物オーファン受容体
に対する不明の真のリガンドが同定できる。
とリガンドの結合反応に伴って生じる細胞内Ｃａ2+の増
加を、蛍光発光試薬を用いて測定する高感度リガンド検
出法を開発することにより、哺乳動物オーファン受容体
に対する不明の真のリガンドが同定できる。
【図１】昆虫細胞Ｓｆ９膜表面上に発現されたヒトＥＴ
B 受容体とＥＴ−１リガンドの結合反応によって生じる
Ｃａ2+の増加を示す図である。
B 受容体とＥＴ−１リガンドの結合反応によって生じる
Ｃａ2+の増加を示す図である。
Claims (5)
- 【請求項１】 バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現さ
れる７回膜貫通型受容体を、該受容体リガンドと結合さ
せ、細胞内Ｃａ2+の増加を測定することを特徴とするリ
ガンドの検出法。 - 【請求項２】 受容体が、哺乳動物オーファン受容体で
ある、請求項１記載の検出法。 - 【請求項３】 潜在的リガンドを検索するための、請求
項１記載の検出法。 - 【請求項４】 受容体が７回膜貫通型であり、かつＧタ
ンパク質関連受容体ファミリーである、請求項１記載の
検出法。 - 【請求項５】 検出試薬が蛍光発光試薬である、請求項
１記載の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9066663A JPH10260184A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ７回膜貫通型オーファン受容体のリガンドの検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9066663A JPH10260184A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ７回膜貫通型オーファン受容体のリガンドの検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10260184A true JPH10260184A (ja) | 1998-09-29 |
Family
ID=13322375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9066663A Pending JPH10260184A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ７回膜貫通型オーファン受容体のリガンドの検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10260184A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022786A1 (ja) * | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Toudai Tlo, Ltd. | 蛍光共鳴エネルギー転移を用いた蛋白質の分析方法 |
-
1997
- 1997-03-19 JP JP9066663A patent/JPH10260184A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022786A1 (ja) * | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Toudai Tlo, Ltd. | 蛍光共鳴エネルギー転移を用いた蛋白質の分析方法 |
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