KR101339819B1 - 세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법 - Google Patents

세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법 Download PDF

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Abstract

세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법이 개시된다. 본 발명은, 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하고, 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하며, 기판에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 기판에 공급하고, 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 과정을 통해 구현된다. 본 발명에 따르면, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있게 된다.

Description

세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법{Method for analyzing single protein-protein interactions in whole cell lysates, and Method for Measuring Activated Protein's Concentration in Cell Solution}
본 발명은 단백질-단백질 상호작용 분석 방법, 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 있는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 관한 것이다.
세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포내에서의 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다.
시험관 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법으로는 대표적인 방법으로는 친화성 크로마토 그래피(affinity chromoatography) 방법이 있다.
단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)의 경우, 정제된 단백질이 준비되어야하는 어려움이 있다. 또한 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내에서 일어나므로, 세포내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 결합하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과를 도출 할 수 있다.
즉, 정량적 측정을 위해서 종래 기술에 따른 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법은 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해서 세포 내에 존재하는 각각의 단백질을 정제하여 이들을 세포 내의 다른 물질들과 분리한 상태에서 상호작용을 분석하기 때문에, 다른 단백질 등이 혼재되어 있는 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준에서 분석할 수는 없다는 한계가 있다.
뿐만 아니라, 종래 기술에 따른 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법은 다른 상태의 세포에서 제공되는 단백질의 특정 단백질과의 상호 작용의 관찰에 따라 그 활성화 정도를 비교 진단할 수 없다는 한계가 있다.
또한, 종래에는 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 없다는 한계가 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 제공함에 있다.
아울러, 본 발명의 목적은 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 있는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법은, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석하기 위한 방법에 있어서, (a) 상기 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 두 개의 기판을 구비하는 단계; (b) 대조군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계; (c) 상기 제1 기판 및 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포의 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및 (d) 상기 세포 용액이 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급된 상태에서, 상기 제1 기판 및 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계에서, 상기 대조군 세포는 정상 세포이며, 상기 실험군 세포는 암 세포인 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
또한, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 특정 파장의 형광 신호를 소정의 시간 동안 적분 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 기판에 상기 공급된 세포 용액이 존재하는 상황에서, 상기 특정 파장의 형광 신호를 실시간 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (b) 단계는, 상기 대조군 세포의 세포 용액을 제1 기판에 공급하고, 상기 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (c) 단계 이전에, 상기 기판에 버퍼 용액을 공급하는 단계를 더 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서, (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하는 단계; (b) 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하여 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하는 단계; (c) 상기 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하는 단계; 및 (d) 상기 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 기판 상의 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서, (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 적어도 두 개의 기판을 구비하는 단계; (b) 대조군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계; (c) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및 (d) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 대조군 세포 용액 및 상기 실험군 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판 상의 각각 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 비교 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있게 된다.
아울러, 본 발명에 따르면, 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있게 된다.
아울러, 본 발명에 따르면, 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 측정할 수 있게 된다
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도,
도 2 내지 도 3은 본 발명에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법의 각 단계를 설명하는 도면,
도 4는 본 발명의 다른 실시예에서의 세포 상태 변화 과정을 설명하는 도면,
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도,
도 6은 대조군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제1 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프 도면,
도 7은 실험군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제2 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프 도면,
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 단백질의 농도 비교 방법을 설명하는 도면,
도 9는 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 증가시켜가면서 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 측정한 실험 결과를 나타내는 도면,
도 10 및 도 11은 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 측정된 형광 신호를 측정한 그래프 도면,
도 12 및 도 13은 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 측정된 형광 신호를 측정한 그래프 도면, 및
도 14는 실험군 세포 및 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 각각 측정된 주파수의 변화를 비교하는 그래프 도면이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 도면들 중 동일한 구성요소들은 가능한 한 어느 곳에서든지 동일한 부호들로 나타내고 있음에 유의해야 한다. 또한 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도이다. 도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하면, 먼저, 분석자는 특정한 두 개의 단백질인 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 단일 분자 수준에서 분석하기 위해서, 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide)인 기판에, 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S110).
본 발명에 따른 실험에 있어서, 제1 단백질은 h-Ras 단백질이고, 제2 단백질은 C-Raf의 Ras-binding domain(RBD) 단백질로 하였다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제1 단백질과 결합하는 항체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 제1 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 세포의 세포질 원액을 기판에 공급함으로써(S120), 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체의 결합을 유도한다(S130).
한편, 전술한 S220 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다(S140).
그 다음, 분석자는 전술한 세포와 동일한 다른 세포에서 해당 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다(S150). 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 분자를 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S150 단계는 원활한 분석의 진행을 위해 전술한 S110 단계 이전에 미리 실행할 수도 있을 것이며, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 전술한 S150 단계에서의, 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포질 원액 전체를 기판에 공급한다(S160).
기판의 표면에 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체의 적어도 일부는 각각 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
요컨대, 도 3에서와 같이 기판 표면상에 부착된 각각의 항체(Anti-Ras Primary antibody)에 결합되어 있는 각각의 제1 단백질(Cellular Ras)은 제2 단백질(eGFP-cRBD)과 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 단일 분자 수준에서 결합과 분리를 반복하는 상호 작용을 하게 되는 것이다.
한편, 전술한 S160 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
도 3에서와 같이 제1 단백질과 제2 단백질 간의 단일 분자 수준에서의 결합이 있는 경우에 분석자가 473nm의 파장을 갖는 전반사 현미경을 통해 기판의 표면을 관찰하면, 제2 단백질에 발현되어 있는 형광 단백질인 eGFP에 의해, 기판 표면에서의 파장이 473nm에서 520nm로 변화하는 것을 확인할 수 있다.
즉, 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써, 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 분석할 수 있게 된다(S170).
아울러, 본 발명에서는 전술한 S160 단계에서 기판에 공급된 세포질 원액이 존재하는 상황에서, 특정 파장의 형광 신호를 실시간 측정함으로써 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 세포 환경과 동일한 환경에서 분석할 수 있게 되는 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 분석자는 각각 정상 상태의 세포(대조군 세포) 내에 있는 제1 단백질의 제2 단백질과의 상호작용과 비정상 상태의 세포(실험군 세포) 내에 있는 제1 단백질의 제2 단백질과의 상호 작용을 비교 분석할 수도 있을 것이다.
본 발명에 대한 실험에 있어서, 인체의 유방조직에서 분리된 세포에서 인위적으로 Ras 단백질의 활성을 극대화함으로써 도 4에서와 같이 정상 유방 조직 세포를 암세포로 변화시켰으며, 정상 유방 조직 세포를 대조군 세포로 사용하였으며, 암세포로 변화된 유방 조직 세포를 실험군 세포로 사용하였다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도이다. 도 5을 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하면, 먼저, 분석자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 동일한 크기의 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide) 기판 두 개를 준비한다.
그 다음 분석자는 두 개의 기판(제1 기판, 제2 기판)에 모두 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S210).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제1 단백질과 결합하는 항체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 제1 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 대조군 세포의 세포질 원액을 제1 기판에 공급하고, 제1 단백질이 포함되어 있는 실험군 세포의 세포질 원액을 제2 기판에 공급함으로써(S220), 제1 기판 및 제2 기판 각각에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)의 결합을 유도한다(S230).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 대조군 세포와 실험군 세포에 각각 포함된 제1 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S230 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서는, 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있으며, 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다. 한편, 본 명세서에서는 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호의 명세서 및 도면의 기재 내용을 그 일부로 포함한다.
한편, 전술한 S230 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수도 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
제1 기판 및 제2 기판 상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다(S240).
그 다음, 분석자는 특정 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다(S250). 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 단백질을 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S250 단계는 원활한 분석의 진행을 위해 전술한 S210 단계 이전에 미리 실행할 수도 있을 것이며, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 전술한 S250 단계에서의, 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포질 원액 전체를 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급한다(S260).
한편, 전술한 S260 단계를 실시함에 있어서도, 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급되는 세포질 원액에서의 제2 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 두 개의 세포질 원액에 각각 포함된 제2 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S260 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있을 것이며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S220 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
제1 기판과 제2 기판의 표면에 각각 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체에는 각각 대조군 세포의 제1 단백질 및 실험군 세포의 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 각각의 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
분석자는 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써,
제1 기판과 제2 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 비교 분석할 수 있게 된다(S270).
도 6은 대조군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제1 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프이고, 도 7은 실험군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제2 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프이다.
도 6과 도 7을 비교하면, 정상 세포인 대조군 세포 내의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용보다 암세포인 실험군 세포 내의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용이 보다 더 활발한 것을 확인할 수 있다. 이로부터 분석자는 암세포 내의 제1 단백질인 Ras 단백질이 과잉으로 활성화되어 있다는 것을 진단할 수 있게 된다.
한편, 제2 단백질과 상호 작용을 하는 제1 단백질은 활성화된 제1 단백질이 될 것이므로, 상술한 대조군 세포에서의 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호 작용과 실험군 세포에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 비교함으로써 대조군 세포에서의 제1 단백질의 활성화 정도와 실험군 세포에서의 제1 단백질의 활성화 정도를 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
이를 위해 본 발명에서는 도 8에서와 같은 방법을 사용하였다. 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 단백질의 농도 비교 방법을 설명하는 도면이다.
도 8을 참조하면, 분석자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 동일한 크기의 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide) 기판 두 개를 준비하고, 두 개의 기판(제1 기판, 제2 기판)에 각각 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S310).
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 대조군 세포의 세포 용액을 제1 기판에 공급하고(S320), 제1 단백질이 포함되어 있는 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급함으로써(S330), 제1 기판 및 제2 기판 각각에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)의 결합을 유도한다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 대조군 세포와 실험군 세포에 각각 포함된 제1 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 한다.
만약, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S320 내지 S330 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도, 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있으며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수도 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
제1 기판 및 제2 기판 상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다.
그 다음, 분석자는 특정 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다. 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 분자를 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포 용액 전체를 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급한다(S340).
한편, 전술한 S340 단계를 실시함에 있어서도, 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급되는 세포 용액에서의 제2 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 두 개의 세포질 원액에 각각 포함된 제2 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S340 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있을 것이며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
제1 기판과 제2 기판의 표면에 각각 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체에는 각각 대조군 세포의 제1 단백질 및 실험군 세포의 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 등의 세포 용액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 각각의 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
분석자는 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써, 제1 기판과 제2 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 비교 분석할 수 있게 된다(S350).
보다 구체적으로 설명하면, 분석자는 전술한 S320 단계 및 S330 단계에서 제1 기판과 제2 기판에 각각 공급되는 대조군 세포 용액에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 동일하게 증가시키면서 전술한 S320 단계 내지 S350 단계를 반복한다.
도 9는 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 증가시켜가면서 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 측정한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 도 9의 (a)를 참조하면, 1nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 제2 기판에 부착된 제1 단백질 결합 분자체와 결합된 제1 단백질 중에서 활성화된 제1 단백질만이 제2 단백질과 상호 작용을 하게 되는 것이므로, 전술한 광학장치를 이용한 측정에서, 소정의 임계값(Threshold)을 초과하는 특정 파장의 형광 신호가 감지되는 지점을 중심으로 광학장치는 1.1μm2 크기의 임의의 관측 영역(Region of Interest:ROI)을 설정하고 이후에 각각의 ROI를 중심으로 형광 신호의 발생 주기를 측정하게 된다.
한편, 도 9의 (b)에서는, 2nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 제2 기판에 부착된 제1 단백질 결합 분자체와 결합된 제1 단백질 중에서 활성화된 제1 단백질만이 제2 단백질과 상호 작용을 하게 되는 것이므로, 제1 단백질이 포함된 실험군 세포의 세포 용액의 농도가 2배로 증가된 이상 소정의 임계값(Threshold)을 초과하는 특정 파장의 형광 신호가 감지되는 지점은 도 9의 (a)에서와 비교할 때 2배 많이 관측된다(4개의 ROI→8개의 ROI).
한편, 아직은 실험군 세포의 세포 용액의 농도가 비교적 높지 않기 때문에, 일정 크기를 갖는 하나의 ROI 내에서 활성화된 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용의 쌍이 하나씩만 관측되고 있다.
그렇기 때문에 도 9의 (b)에서 8개의 ROI에서 평균적으로 측정되는 형광 신호의 발생 주기는 도 9의 (a)에서와 동일하게 나타난다.
그렇지만, 제2 기판의 크기에 따라 ROI의 설정 가능한 개수는 제한이 되어 있기 때문에, 제1 단백질이 포함된 실험군 세포 용액의 농도가 임계값 이상을 넘어서게 되면 도 9의 (c)에서와 같이, 하나의 ROI 내에서 활성화된 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용의 쌍이 2개 이상씩 관측되게 된다.
이와 같이 실험군 세포 용액의 농도가 임계값을 초과하게 되면, 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값은 증가를 시작하게 되며, 이후 실험군 세포 용액의 농도가 계속적으로 증가할수록 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값은 계속적으로 증가하게 된다.
본 발명에 따라 실시한 실험에서는 제1 기판 및 제2 기판의 크기가 45×90μm2인 경우에 1.1μm2 크기의 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값의 증가가 시작된 제1 단백질(HRas)이 포함된 암세포인 실험군 세포 용액 농도의 임계값은 5nM로 측정되었다.
즉, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 8회에 불과하였다.
하지만, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 임계 농도값(5nM)을 초과하는 41.3nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에는 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 20회로 측정되었다.
즉, 제1 단백질(HRas)이 포함된 암세포인 실험군 세포의 세포 용액의 농도값을 증가시켜가며, 복수의 ROI에서의 형광 신호의 주파수의 평균값을 측정한 결과, 도 14에서와 같이 임계 농도값인 5nM까지는 일정하게 유지되다가, 임계 농도값을 초과한 이후부터는 증가됨을 확인할 수 있다.
여기서의 임계 농도값에 기초해서 분석자는 실험군 세포의 세포 용액에 포함된 제1 단백질 중 활성화된 제1 단백질의 비율을 계산할 수 있게 된다.
뿐만 아니라, 분석자는 대조군 세포에서 전술한 바와 같은 실험을 반복함으로써 대조군 세포에서의 임계 농도값과 실험군 세포에서의 임계 농도값을 비교함으로써, 대조군 세포내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도의 비율을 정량적으로 계산할 수 있다.
즉, 분석자는 실험군 세포에서의 임계 농도값을 획득하기 위한 상기의 실험 절차와 병행하여, 또는 실험군 세포에 대한 실험 절차 이전 또는 이후에 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 서서히 증가시켜 가며 동일한 조건하에서 대조군 세포에서의 임계 농도값을 측정하게 된다.
한편, 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 증가시킴에 있어서는 실험군 세포에서의 세포 용액의 농도 증가 비율과 동일한 비율로 증가시키는 것이 바람직할 것이다.
즉, 도 12를 참조하면, 분석자가 3.5nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 6회에 불과하였다.
한편, 이후 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 증가시킨 경우에도 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 형광 신호의 발생 빈도는 30초 동안 6회로 일정하였다.
다만, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 49nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에는 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 7회로 경미하게 증가된 값이 측정되었다.
이후 대조군 세포 용액의 농도를 증가시켜가며 형광 신호의 주파수의 평균값을 측정한 결과 도 14에서 확인되는 바와 같이, 50nM 농도를 임계 농도값으로 임계 농도값을 초과한 이후부터 뚜렷하게 증가됨을 확인할 수 있었다.
이상의 실험으로부터, 실험군 세포에서의 임계 농도값이 5nM이고, 대조군 세포에서의 임계 농도값이 50nM으로 측정된 사실에 기초하여, 분석자는 암세포인 실험군 세포 내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도가 정상 세포인 대조군 세포에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도보다 10배 만큼 크다는 사실을 확인할 수 있게 된다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예 및 응용예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 응용예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.

Claims (5)

  1. 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서,
    (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하는 단계;
    (b) 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하여 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하는 단계;
    (c) 상기 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하는 단계;
    (d) 상기 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 단계; 및
    (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계
    를 포함하며,
    상기 (d) 단계는,
    상기 기판 상의 임의로 설정된 복수개의 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 측정하는 단계; 상기 복수개의 관측 영역에서의 형광 신호의 주파수의 평균값을 측정하는 단계; 및 측정된 상기 주파수의 평균값이 증가되는 시점의 상기 (b) 단계에서의 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액의 농도값인 임계 농도값을 획득하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.

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