CN103582817B - 在细胞环境中于单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法，和测定在细胞溶质中激活的蛋白密度的方法 - Google Patents

在细胞环境中于单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法，和测定在细胞溶质中激活的蛋白密度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法。本发明通过以下方法实现：准备一个基片，在其上结合有第一蛋白结合分子，以形成分子筛，所述分子筛与第一蛋白结合；加入包含有第一蛋白的细胞溶质从而诱导第一蛋白与第一蛋白结合分子筛的结合；当第一蛋白和第一蛋白结合分子筛结合至基片后，向基片中加入含有标记物标记的第二蛋白的细胞溶质；分析在基片上第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。根据本发明，比较和分析可以在每一个细胞中进行，通过向第一蛋白中加入不同种类的细胞，观察第一蛋白与第二蛋白之间的相互作用，能够比较和分析出第一蛋白的激活水平。

Description

在细胞环境中于单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法，和测定在细胞溶质中激活的蛋白密度的方法
技术领域
本发明涉及一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，以及一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，更具体讲，涉及一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，该方法能够在单分子水平上，在实际细胞内环境中分析所述蛋白-蛋白相互作用，并且，通过改变提供用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后进行比较，还能够比较和证实每一种细胞状态和第一种蛋白的激活水平，以及一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，该方法能够定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度。
背景技术
细胞通过完成多种生物学功能而维持生命现象，如基因表达，细胞生长，细胞周期，代谢作用和通过多样的和复杂的蛋白-蛋白相互作用介导的信号转导等。因此，了解所述细胞内蛋白-蛋白相互作用和功能一直是我们理解生命现象的重要基础，并且，是我们开发新药和治疗疾病的重要组成部分。
一种在体外研究蛋白-蛋白相互作用的典型方法是亲和层析法。
对于蛋白质亲和层析法来说，纯化蛋白是困难的。另外，由于上述蛋白间的相互作用只进行了体外评估，该方法可能产生假阳性结果，因为蛋白在通过层析柱时可能通过静电相互作用而结合，这种结合不是在细胞中相互作用的结果。
就是说，为了实施定量测量，按照常规技术分析蛋白-蛋白相互作用的方法是在蛋白与其他细胞内物质分离的条件下来分析所述相互作用的，包括纯化存在于用于分析所述蛋白-蛋白相互作用的细胞中的每一种蛋白。因此，在其他蛋白等共存的实际细胞内环境中，在单分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用是受到限制的。
另外，当其他蛋白参与所述相互作用时，按照常规技术研究蛋白-蛋白相互作用的方法，还具有不能在实际细胞内环境条件下评估其他蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度之类的缺陷。
另外，在定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度时，还存在一些常规限制。
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，该方法能够在实际细胞内环境中，在单分子水平上分析蛋白-蛋白之间的相互作用，以及通过改变提供用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后进行比较，还能够比较和证实每一种细胞状态和第一蛋白的激活水平
另外，本发明的另一个目的是提供一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，该方法能够定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度。
技术方案
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种通过在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）准备至少两个基片，其中，在每个基片上结合有第一蛋白结合分子，所述第一蛋白结合分子为将要与第一蛋白结合的生物分子；（b）分别在第一基片和第二基片上诱导所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子之间的结合，包括将对照组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第一基片，并且将所述实验组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第二基片；（c）当所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子分别与所述第一基片和所述第二基片结合时，将包含标记物标记的第二蛋白的细胞的细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片；和（d）在所述细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片后，比较和分析在所述第一基片和所述第二基片上第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
优选地，在步骤中（b），所述对照组细胞是正常细胞，而所述实验组细胞是肿瘤细胞。
优选地，步骤（d）包括使用能产生近场的光学设备测量由标记与第一蛋白相结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
优选地，在步骤中（d），所述具有所述特定波长的荧光信号是在预定的时段内累加测量的。
优选地，在步骤中（d），所述具有特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量的。
优选地，步骤（b）包括将所述对照组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第一基片，并且将所述实验组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第二基片。
优选地，所述方法还包括在所述步骤（c）之前给所述基片提供缓冲液。
根据本发明的另一方面，提供了一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，包括：（a）准备一个结合有第一蛋白结合分子的基片，所述的第一蛋白结合分子为将要与第一蛋白结合的生物分子；（b）通过将包含第一蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片，诱导所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子的结合；（c）当所述第一种蛋白与所述基片上的第一蛋白结合分子结合时，提供包含标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物；和（d）分析所述基片上所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用。
优选地，所述方法还包括（e）重复步骤（b）-（d），包括在所述步骤（b）中按预定的比例提高所述包含第一蛋白的细胞溶胞产物的浓度。
优选地，步骤（d）包括在所述基片上任何成形的观察区域测量由标记与第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号的生成频率。
优选地，在步骤（d）中与第二蛋白相互作用的第一蛋白是与第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中被激活的第一蛋白。
优选地，所述步骤（d）包括使用生成近场的光学设备测量由标记与第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
根据本发明的另一方面，提供了一种方法测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度，包括：（a）准备至少两个基片，第一蛋白结合分子分别与这些基片结合，所述第一蛋白结合分子为将要与第一蛋白结合的生物分子；（b）分别在第一基片和第二基片上诱导第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合，包括将对照组细胞所包含的所述第一蛋白提供给所述两个基片中的第一基片，而将实验组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第二基片；（c）当所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子分别与所述第一基片和所述第二基片结合时，将包含标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片；和（d）在所述细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片后，比较和分析在所述第一基片和所述第二基片上第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
优选地，所述方法还包括（e）重复步骤（b）-（d），同时，在所述步骤（b）中按预定的比例提高对照组细胞溶胞产物和实验组细胞溶胞产物的浓度。
优选地，所述步骤（d）包括在所述基片上任何成形的观察区域比较和测量由标记与第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所生成的具有特定波长的荧光信号的生成频率。
优选地，在步骤（d）中与第二蛋白相互作用的第一蛋白是与第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中被激活的第一种蛋白。
优选地，步骤（d）包括使用生成近场的光学设备测量由标记与第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
有利效果
根据本发明，可以在实际细胞内环境中，在单分子水平上分析蛋白-蛋白之间的相互作用，并且，通过改变提供用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后，能够比较和证实每一种细胞状态和第一蛋白的激活水平。
另外，根据本发明，可以提供一种测定细胞溶胞产物中的活化蛋白浓度的方法，该方法能够比较和定量测定实验组细胞和对照组细胞的特定活化蛋白浓度。
附图说明
通过结合附图对本发明的典型实施方案进行详细说明，本发明的上述及其他目的、特征和优点对于本领域普通技术人员来说将更为清楚，其中：
图1表示根据本发明的一个实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图；
图2-图3表示根据本发明的一个实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的每一个步骤的示意图；
图4表示本发明的另一个实施方案的细胞状态的变化过程的示意图；
图5说明根据本发明的另一个实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图；
图6表示与对照组细胞中的第一蛋白结合的第一基片上观察到的信号的曲线图；
图7表示与实验组细胞中的第一蛋白结合的第二基片上观察到的信号的曲线图；
图8是说明根据本发明的另一个实施方案的比较对照组细胞和实验组细胞中活化蛋白浓度的方法的示意图；
图9表示在逐渐提高实验组细胞所包含的第一蛋白浓度的同时，测定第一蛋白和第二蛋白之间相互作用的实验结果的示意图；
图10和图11表示在提高实验组细胞所包含的第一蛋白浓度的同时，测定的荧光信号测量结果的曲线图；
图12和图13表示在提高对照组细胞所包含的第一蛋白浓度的同时，测定的荧光信号测量结果的曲线图；
图14表示在分别提高实验组细胞和对照组细胞所包含的第一蛋白浓度的同时，测定的频率变化相比较的曲线图。
具体实施方式
实施例
在下文中，将详细说明本发明的典型实施方案。不过，本发明不局限于下面披露的实施方案，而是能够以各种方式实施。披露了以下的实施方案，以便本领域普通技术人员能够体现并且实现本发明。
参见附图，下面详细说明本发明的典型实施方案。为了便于理解本发明，在对所有的附图进行说明时类似的附图标记表示类似的部件，并且，对相同部件的说明不再赘述。
图1说明根据本发明的一个实施方案的分析蛋白-蛋白相互作用的方法的程序框图。参见图1，对于根据本发明的一个实施方案的一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法来说，首先，分析者将第一蛋白结合抗体（一级抗体），即将要与所述第一蛋白结合的抗体，结合在一个基片上，该基片是用聚乙二醇（PEG）涂覆的石英载片，以便在单分子水平上分析两种特殊蛋白——第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用（S110）。
对于本发明的该实验来说，所述第一蛋白是h-Ras蛋白，而所述第二种蛋白是C-Raf的Ras-结合结构域（RBD）蛋白。
同时，根据本发明的一个实施方案，要与所述第一蛋白结合的抗体可以包括要与所述第一蛋白结合的生物分子，如除了抗体之外的具有能够与蛋白结合的特殊成分的DNA，RNA，或脂质体等。
随后，分析者通过将包含所述第一蛋白的细胞的细胞质溶胞产物提供给所述基片（S120），诱导所述第一蛋白和第一蛋白结合抗体之间的结合（S130）。
同时，为了实施上述步骤S120，除了所述细胞质溶胞产物（cytoplasmiclysate）之外，还可以使用其他细胞溶胞产物，如细胞溶解液（cytolysate），稀释的细胞质溶胞产物，稀释的或纯化的细胞溶解液等。
同时，根据本发明的一个实施方案，分析者可以进行预处理，以便在所述第一蛋白上表达预定的第一荧光蛋白，如m-Cherry等。在这种情况下，当所述第一蛋白结合抗体与所述第一蛋白结合时，分析者可以通过使用全内反射荧光显微镜观察基片的表面，根据在第一蛋白上表达的第一荧光蛋白引起的波长的变化（即，测量由第一荧光蛋白生成的单个分子信号），证实所述第一蛋白是否与结合在基片上的多个第一蛋白结合抗体结合。
就是说，当所述第一荧光蛋白在第一蛋白上表达时，无论所述第一蛋白是否与所述抗体结合，都可以通过所述全内反射荧光显微镜证实，因此，可以精确测定与结合在基片上的抗体结合的所述第一蛋白的数量及其结合密度。
一旦证实所述第一蛋白分别与结合在基片上的多个第一蛋白结合抗体结合，分析者通过将缓冲液提供给所述基片，从所述基片上除去所述细胞质溶胞产物所包含的除所述第一蛋白之外的其余物质（S140）。
随后，分析者通过所述第二蛋白的遗传学操作法，以上述步骤（S150）中使用的同一类型细胞中的不同相关细胞实施第二荧光蛋白的表达。同时，根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光分子可以通过物理化学方法结合或连接在所述第二蛋白上。
同时，为了使分析顺畅进行，上述步骤S150，可以在上述步骤S110之前实施。根据本发明的一个实施方案，由于所述第二荧光蛋白的波长范围优选不同于所述第一荧光蛋白的波长范围，当所述第一荧光蛋白为m-Cherry蛋白时，所述第二荧光蛋白可以是eGFPs（增强型绿色荧光蛋白），即一种绿色荧光蛋白。
随后，分析者将来自上述步骤S150的、具有在所述第二蛋白内部表达的第二荧光蛋白的细胞的全细胞质溶胞产物提供给所述基片（S160）。
如图3所示，多个结合在基片表面上的第一蛋白结合抗体的至少一部分与每一个第一蛋白结合。当包括第二蛋白的全细胞质溶胞产物被提供给所述基片表面时，所述基片表面的第一蛋白（细胞Ras）在和细胞内环境相同的条件下、在与包含在所述细胞质溶胞产物中的第二蛋白（eGFP-cRBD）和所述全细胞溶胞产物中的天然蛋白共存时，与第二蛋白相互作用。
简单讲，如图3所示，与结合在基片表面的每一个抗体（抗-Ras一级抗体）结合的每一个第一蛋白（细胞Ras）在和细胞内环境相同的条件下，在单分子水平上与所述第二蛋白（eGFP-cRBD）相互作用，以便重复结合和解开。
同时，为了实施上述步骤S160，除了所述细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物，稀释的或纯化的细胞溶解液等。
如图3所示，当所述第一蛋白与所述第二蛋白在单分子水平上结合时，分析者通过使用波长为473nm的全内反射荧光显微镜观察基片表面，能够证实由于eGFP，即在所述第二蛋白上表达的荧光蛋白的原故，导致基片的表面的波长从473nm改变到520nm。
就是说，通过检测由第二荧光蛋白（eGFP）产生的具有特定波长的带宽（520nm）的荧光信号，可以证实所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合状态，所述的第二荧光蛋白（eGFP）通过第一蛋白和第二蛋白之间的结合加载在所述基片表面。并且，在单分子水平上，分析者可以通过连续观察结合在所述基片表面的每一个抗体波长的变化，分析所述相互作用，如所述第一蛋白和所述第二蛋白之间结合和解开的频率等（S170）。
另外，在存在所述提供给上述步骤S160的基片的细胞质溶胞产物的条件下，实时测量具有特定波长的荧光信号，可以在与细胞内环境相同的环境下分析所述相互作用，如所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合和解开的频率等。
同时，根据本发明的一个实施方案，分析者可以比较和分析正常状态的细胞（对照组细胞）中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，以及非正常状态的细胞（实验组细胞）中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用。
如图4所示，根据本发明的一个实施方案，通过使从人体的乳腺组织中分离的细胞中的Ras蛋白的人工激活最大化，使该正常的乳腺组织细胞转化成肿瘤细胞，并且将正常的乳腺组织细胞用作对照组细胞，将转化为肿瘤细胞的乳腺组织细胞用作实验组细胞。
图5说明根据本发明的另一个实施方案的一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法的过程的程序框图。参见图5，对于根据本发明的另一个实施方案的一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法来说，首先，分析者准备了两个用聚乙二醇（PEG）涂覆的同样大小的石英载片基片。
随后，如图2所示，分析者将所述第一蛋白结合抗体（抗-Ras一级抗体），即要与所述第一蛋白结合的抗体结合在这两个基片（第一基片和第二基片）上（S210）。
同时，根据本发明的一个实施方案，要与所述第一蛋白结合的抗体可以包括要与所述第一蛋白结合的生物分子，如除了抗体之外的具有能够与蛋白结合的特殊成分的DNA，RNA，或脂质体等。
随后，分析者在所述每一个第一基片和第二基片上诱导第一蛋白和第一蛋白结合抗体（抗-Ras一级抗体）之间的结合，包括将包括第一蛋白的对照组细胞的细胞质溶胞产物提供给所述第一基片（S220），以及将包括第一蛋白的实验组细胞的细胞质溶胞产物提供给所述第二基片（S230）。
同时，根据本发明的一个实施方案，对照组细胞所包含的第一蛋白的浓度应当等于实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度。为达到这一要求，应当通过测量二者的浓度，证实对照组和实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度是否是一样的。当以上两种浓度彼此不同时，需通过稀释等方法将两种浓度调整到彼此相同之后，再实施上述步骤S230。
此时，按照常规技术的各种测定蛋白浓度的方法可用于测定所述蛋白浓度，还可以使用韩国专利申请号10-2011-0088074（申请人Tae-YoungYoon）中所披露的测定蛋白浓度的方法。同时，本发明收录了用韩国专利申请号10-2011-0088074说明书和附图作为其组成部分。
同时，为了实施上述步骤S230，除了所述细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物，稀释的或纯化的细胞溶解液等。
同时，根据本发明的一个实施方案，分析者可以进行预处理，以便在所述第一蛋白上表达预定的第一种荧光蛋白，如m-Cherry等。在这种情况下，当第一蛋白结合抗体与第一蛋白结合时，分析者可以通过使用全内反射荧光显微镜观察基片的表面，根据在第一蛋白上表达的第一荧光蛋白引起的波长的变化（即，测量由所述第一荧光蛋白产生的单分子信号），证实所述第一蛋白是否与结合在所述基片上的多个第一蛋白结合抗体结合。
就是说，当第一荧光蛋白在第一蛋白上表达时，无论所述第一蛋白是否与抗体结合，都可以通过全内反射荧光显微镜证实，因此，可以精确测定与结合在基片上的抗体结合的第一蛋白的数量及其结合密度。
一旦证实所述第一蛋白分别与结合在所述第一基片和所述第二基片上的多个第一蛋白结合抗体结合，分析者通过将缓冲液提供给所述基片，从所述基片上除去所述细胞质溶胞产物所包含的除所述第一蛋白之外的其余物质（S240）。
随后，分析者通过对存在于特定细胞中的第二蛋白实施遗传操作，操纵第二荧光蛋白的表达（S250）。同时，根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光蛋白可以通过物理化学方法结合或连接在所述第二蛋白上。
同时，为使分析顺畅进行，上述步骤S250，可以在上述步骤S210之前实施。根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光蛋白的波长范围优选不同于所述第一荧光蛋白的波长范围，当所述第一荧光蛋白为m-Cherry蛋白时，所述第二荧光蛋白可以是eGFPs（增强型绿色荧光蛋白），即绿色荧光蛋白。
随后，分析者将来自上述步骤S260的、具有在所述第二蛋白内部表达的第二荧光蛋白的细胞的全细胞质溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片（S260）。
同时，为了实施上述步骤S260，分别提供给所述第一基片和所述第二基片的细胞质溶胞产物中的第二蛋白的浓度应当彼此相同。为达到这一要求，应当通过测量二者的浓度，证实两种细胞质溶胞产物所包含的第二蛋白的浓度是否是一样的。当以上两种浓度彼此不同时，需通过稀释等方法将两种浓度调整到彼此相同之后，再实施上述步骤S260。
此时，按照常规技术的各种测定蛋白浓度的方法可用于测定所述蛋白浓度，还可以使用上述韩国专利申请号10-2011-0088074（申请人Tae-YoungYoon）中所披露的测定蛋白浓度的方法。
同时，为了实施上述步骤S220，除了所述细胞质溶胞产物之外，还可以使用细胞溶胞产物，如细胞溶解液，稀释的细胞质溶胞产物，稀释的或纯化的细胞溶解液等。
对照组细胞的第一蛋白和实验组细胞的第一蛋白与分别结合在所述第一基片和所述第二基片表面的多个第一蛋白结合抗体结合。如图3所示，当包括第二蛋白的全细胞质溶胞产物被提供给基片表面时，所述每一个基片表面的第一蛋白在和细胞内环境相同的条件下、在与包含在所述细胞质溶胞产物中的第二蛋白（eGFP-cRBD）和所述全细胞溶胞产物中的天然蛋白共存时与所述第二蛋白相互作用。
分析者可以通过检测由第二荧光蛋白（eGFP）产生的具有特定波长的荧光信号带宽（520nm），证实所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合状态，所述的第二荧光蛋白（eGFP）通过第一蛋白和第二蛋白之间的结合加载在基片的表面。并且，分析者可以通过连续观察结合在所述基片表面的每一个抗体波长的变化，比较和分析这种相互作用，如所述第一基片和所述第二基片上所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的结合和解开的频率等（S270）。
图6表示在与对照组细胞的第一蛋白结合的第一基片上观察到的信号的曲线图，而图7表示在与实验组细胞的第一蛋白结合的第二基片上观察到的信号的曲线图。
比较图6和图7，可以证实，实验组细胞，即肿瘤细胞中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，比对照组细胞，即正常细胞中所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用更为活跃。据此，分析者可以证实Ras蛋白，即肿瘤细胞中的第一蛋白被过度激活了。
同时，与所述第二蛋白相互作用的第一蛋白可以成为激活的第一种蛋白，因此，通过比较对照组细胞中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用和上述实验组细胞中第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，可以定量测定对照组细胞中第一蛋白的激活水平和实验组细胞中第一蛋白的激活水平。
为实现这一目的，本发明采用了如图8所示的方法。图8表示根据本发明的另一个实施方案，将对照组和实验组细胞中活化蛋白浓度进行比较的方法的示意图。
参见图8，分析者准备两个用聚乙二醇（PEG）涂覆的同样大小的石英载片基片，并且将第一蛋白结合抗体（抗-Ras一级抗体），即要与每一个第一蛋白结合的抗体结合在这两个基片（第一基片和第二基片）上，如图2所示（S310）。
随后，分析者分别在第一基片和第二基片上各自诱导第一蛋白和第一蛋白结合抗体（抗-Ras一级抗体）之间的结合，即通过将包含所述第一蛋白的所述对照组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第一基片（S320），而将包含所述第一蛋白的实验组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第二基片（S330）来进行的。
同时，根据本发明的一个实施方案，对照组细胞所包含的第一蛋白的浓度应当与实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度相等。为实现这一目的，应当通过测量二者的浓度，证实对照组和实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度是否是一样的。
当以上两种浓度彼此不同时，在通过稀释等方法将两种浓度调整到彼此相同之后，实施上述步骤S320-S220。
此时，按照常规技术的各种测定蛋白浓度的方法可用于测定所述蛋白浓度，还可以使用上述韩国专利申请号10-2011-0088074（申请人Tae-YoungYoon）中所披露的测定蛋白浓度的方法。
同时，根据本发明的一个实施方案，分析者可以进行预处理，以便在所述第一蛋白上表达预定的第一荧光蛋白，如m-Cherry等。在这种情况下，当所述第一蛋白结合抗体与所述第一蛋白结合时，分析者可以通过使用全内反射荧光显微镜观察基片的表面，根据在第一蛋白上表达的第一荧光蛋白引起的波长的变化（即，测量由所述第一荧光蛋白产生的单分子信号），证实所述第一蛋白是否与结合在基片上的多个第一蛋白结合抗体结合。
就是说，当第一荧光蛋白在第一蛋白上表达时，第一蛋白是否与抗体结合可以通过全内反射荧光显微镜证实，因此，可以精确测定与结合在基片上的抗体结合的第一蛋白的数量及其结合密度。
一旦证实第一蛋白与分别结合在第一基片和第二基片上的多个第一蛋白结合抗体结合，分析者便通过将缓冲液提供给所述基片，从所述基片上除去所述细胞质溶胞产物所包含的除第一蛋白之外的其余物质。
随后，分析者通过对特定细胞所存在的所述第二蛋白进行遗传学操作，操纵第二荧光蛋白的表达。同时，根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光蛋白可以通过物理化学方法结合或连接在所述第二种蛋白上。
同时，根据本发明的一个实施方案，所述第二荧光蛋白的波长范围优选不同于所述第一荧光蛋白的波长范围，当所述第一荧光蛋白为m-Cherry蛋白时，所述第二荧光蛋白可以是eGFPs（增强型绿色荧光蛋白），即一种绿色荧光蛋白。
随后，分析者将具有在第二蛋白内部表达的第二荧光蛋白的细胞的全细胞溶胞产物（celllysate）分别提供给所述第一基片和所述第二基片（S340）。
同时，为了实施上述步骤S340，准备分别提供给所述第一基片和所述第二基片的细胞溶胞产物中第二蛋白的浓度应该彼此相同。为达到这一要求，应当通过测量二者的浓度，证实两种细胞质溶胞产物所包含的第二蛋白的浓度是否是一样的。当以上两种浓度彼此不同时，需通过稀释等方法将两种浓度调整到彼此相同之后再实施上述步骤S340。
此时，按照常规技术的各种测定蛋白浓度的方法可用于测定所述蛋白浓度，还可以使用上述韩国专利申请号10-2011-0088074（申请人Tae-YoungYoon）中所披露的测定蛋白浓度的方法。
对照组细胞的第一蛋白和实验组细胞的第一蛋白与分别结合在第一基片和第二基片表面的多个第一蛋白结合抗体结合。如图3所示，当包括第二蛋白的全细胞溶胞产物，例如细胞质溶胞产物被提供给所述基片表面时，所述各基片表面的第一蛋白处在和细胞内环境相同的条件下，使得包含在所述细胞质溶胞产物中的第二蛋白（eGFP-cRBD）和所述全细胞溶胞产物中的天然蛋白共存的情况下，与第二蛋白相互作用。
分析者可以通过检测由第二荧光蛋白（eGFP）产生的具有特定波长的荧光信号带宽（520nm），证实所述第一种蛋白和所述第二种蛋白之间的结合状态，所述的第二荧光蛋白（eGFP）通过第一蛋白和第二蛋白之间的结合加载在基片的表面。并且，分析者可以通过连续观察结合在所述基片表面的每一个抗体波长的变化，比较和分析所述相互作用，如第一基片和第二基片上第一蛋白和第二蛋白之间的结合和解开的频率等（S350）。
更具体讲，分析者重复上述步骤S320-S350，同时逐渐并等同地提高在上述步骤S320和S330中提供给所述第一基片和所述第二基片的对照组的细胞溶胞产物所包含的第一蛋白的浓度和实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度。
图9是表示通过逐渐提高实验组细胞所包含的第一蛋白的浓度测定所述第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的实验结果的示意图。参见图9（a），将含有1nM浓度第一蛋白（HRas）的实验组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第二基片，以便诱导所述第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合，然后，在将包含所述标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片时，通过使用生成近场的光学设备，测定由标记在所述第二种蛋白上的标记物产生的具有特定波长的荧光信号。
具体讲，在与结合在第二基片上的第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中，只有被激活的第一蛋白与所述第二蛋白相互作用，使用上述光学设备测量，所述光学设备可以测量作为中心的每一个ROI（有意义的区域）的荧光信号生成频率，此前，设定任何1.1μm2大小的ROI，将感测超过预定阈值的具有特定波长的荧光信号的点作为中心。
同时，参见图9（b），将含有2nM浓度的第一蛋白（HRas）的实验组细胞的细胞溶胞产物提供给第二基片，以便诱导第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合，然后，在将包含标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片时，通过使用生成近场的光学设备，测定由标记在所述第二蛋白上的标记物产生的具有特定波长的荧光信号。
具体讲，在与结合在第二基片上的第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中，由于只有被激活的第一蛋白与第二蛋白相互作用，当包含所述第一蛋白的实验组细胞的细胞溶胞产物浓度提高两倍时，与图9（a）相比，检测超过预定阈值的具有特定波长的荧光信号的点看上去为其两倍（4ROI→8ROI）。
同时，由于实验组细胞的细胞溶胞产物的浓度仍然相对不高，仅观察了具有特定大小的一个ROI中的一对激活的第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
因此，在图9（b）中，平均测定的8个ROI的荧光信号生成频率与图9（a）中的荧光信号生成频率相等。
不过，由于所述第二基片的大小决定了ROI可配置的数量有限，当包括第一蛋白的实验组细胞溶胞产物的浓度至少超过阈值时，在如图9（c）所示的一个ROI中观察到至少两对激活的第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。
当实验组细胞溶胞产物的浓度超过上述阈值时，在每一个ROI中荧光信号生成频率的平均值开始增加，然后，随着实验组细胞溶胞产物的浓度持续提高，荧光信号生成频率的平均值持续增加。
根据本发明的一个实施方案，当所述第一基片和第二基片的大小为45×90μm2时，测定的包括所述第一蛋白（HRas）的肿瘤细胞的实验组细胞溶胞产物的阈值为5nM，其中，在大小为1.1μm2的每一个ROI中的荧光信号生成频率的平均值开始增加。
就是说，正如在图10中验证的，将包括浓度为3nM的第一蛋白（HRas）的实验组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第二基片，以便诱导所述第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合。由此，将包括标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片后，通过使用光学设备在多个ROIs中，作为其平均值测定由标记在第二蛋白上的标记物产生的具有特定波长的荧光信号生成频率时，，其荧光信号生成频率30秒内为8次。
不过，正如在图11中验证的，将包括超过阈值浓度（5nM）的浓度为41.3nM的所述第一蛋白（HRas）的实验组细胞的细胞溶胞产物提供给第二基片，以便诱导第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合。由此，将包括标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片后，通过使用生成近场的光学设备，在多个ROIs中，作为其平均值测定由标记在所述第二蛋白上的标记物产生的具有特定波长的荧光信号生成频率时，，其荧光信号生成频率30秒内为20次。
就是说，在提高实验组细胞，即包括所述第一蛋白（HRas）的肿瘤细胞的细胞溶胞产物的浓度值的同时，在多个ROIs中测定荧光信号频率的平均值。结果如图14所示，可以看出，在5nM，即阈值浓度值时，该平均值保持稳定，然后，在超过所述阈值浓度值之后该平均值则升高。
根据上述阈值浓度值，分析者可以计算出实验组细胞的细胞溶胞产物所包含的第一蛋白中被激活的第一蛋白的比例。
另外，通过用对照组细胞重复上述实验，比较对照组细胞和实验组细胞的阈值浓度值，分析者可以定量计算出对照组细胞所包含的被激活的第一蛋白的浓度和实验组细胞所包含的被激活的第一蛋白浓度的比例。
就是说，在上述实验组细胞的实验过程的同时或之前或之后，分析者沿用为获得实验组细胞的阈值浓度值所采用的实验程序，同时，缓慢提高包括第一蛋白（HRas）的对照组细胞的细胞溶胞产物浓度，在相同条件下测定对照组细胞的阈值浓度值。
同时，对于提高对照组细胞的细胞溶胞产物的浓度，优选以与提高实验组细胞的细胞溶胞产物浓度相同的比例提高。
就是说，参见图12，分析者通过将包括浓度为3.5nM的第一蛋白（HRas）的对照组细胞的细胞溶胞产物提供给第二基片，诱导所述第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合。由此，将包括标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片后，通过使用生成近场的光学设备，在多个ROIs中，作为其平均值，测定由标记在所述第二蛋白上的标记物产生的具有特定波长的荧光信号生成频率时，，其荧光信号生成频率仅为30秒内6次。
同时，由此，在提高所述对照组细胞的细胞溶胞产物的浓度时，在多个ROIs中测定的荧光信号生成频率平均值稳定在在30秒内6次。
不过，正如在图13中验证的，将包括浓度为49nM的第一蛋白（HRas）的对照组细胞的细胞溶胞产物提供给第二基片，以便诱导所述第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合。由此，将包括标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物提供给所述第二基片后，通过使用生成近场的光学设备，在多个ROIs中，作为其平均值，测定由标记在所述第二蛋白上的标记物生成的具有特定波长的荧光信号生成频率时，其荧光信号生成频率为30秒内7次，可见有所提高。
由此，在提高所述对照组细胞溶胞产物的浓度的同时，测定荧光信号频率的平均值。结果，如图14所证实的，可以看出，在超过浓度为50nM的阈值浓度值之后明显升高。
从上述实验结果可以看出，基于以下事实：测定的实验组细胞的阈值浓度值为5nM，而对照组细胞的阈值浓度值为50nM，分析者可以证实以下事实：实验组细胞，即肿瘤细胞所包含的激活的第一蛋白，是对照细胞，即正常细胞所包含的激活的第一蛋白的10倍。
根据本发明，通过改变提供的用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后，可以比较并验证每一种细胞状态和第一蛋白的激活水平。
另外，根据本发明，可以在实际细胞内环境中，在单分子水平上分析蛋白-蛋白之间的相互作用。
另外，根据本发明，可以定量测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度。
尽管业已结合某些典型实施方案对本发明进行了图解和说明，本领域技术人员可以理解的是，在不脱离由权利要求书限定的本发明的构思和范围的前提下，可以对公开的形式和细节做出各种改变。
工业应用性
本发明可用于医药工业。

Claims (6)

1.一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，包括：
(a)准备一个结合有第一蛋白结合分子的基片，所述的第一蛋白结合分子为准备与第一蛋白结合的生物分子；
(b)通过将包含第一蛋白的细胞溶胞产物提供给所述基片，诱导所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子的结合；
(c)当所述第一蛋白与所述基片上的第一蛋白结合分子结合时，提供包含标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物；
(d)分析所述基片上所述第一蛋白和所述第二蛋白之间的相互作用，其中，与所述第二蛋白相互作用的第一蛋白，是与第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中被激活的第一蛋白；和
(e)重复步骤(b)-(d)，包括在重复步骤的步骤(b)中按预定的比例提高包含第一蛋白的细胞溶胞产物的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)包括在所述基片上任何成形的观察区域测量由标记与所述第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号的生成频率。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)包括使用生成近场的光学设备测量由标记与所述第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
4.一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，包括：
(a)准备至少两个基片，第一蛋白结合分子分别与这些基片结合，所述第一蛋白结合分子为将要与第一蛋白结合的生物分子；
(b)分别在第一基片和第二基片上诱导第一蛋白和第一蛋白结合分子之间的结合，包括将对照组细胞所包含的所述第一蛋白提供给所述两个基片中的第一基片，并且将实验组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第二基片；
(c)当所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子分别与所述第一基片和所述第二基片结合时，将包含标记物标记的第二蛋白的细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片；
(d)将所述细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片后，比较和分析在所述第一基片和所述第二基片上第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用，其中，与所述第二蛋白相互作用的第一蛋白是与第一蛋白结合分子结合的第一蛋白中被激活的第一蛋白；和
(e)重复步骤(b)-(d)，同时，在重复步骤的步骤(b)中，按预定的比例提高所述对照组细胞溶胞产物和所述实验组-细胞溶胞产物的浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤(d)包括在所述基片上任何成形的观察区域比较和测量由标记与所述第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号的生成频率。
6.如权利要求4所述的方法，其中，步骤(d)包括使用生成近场的光学设备测量由标记与所述第一蛋白结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。
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