JP2010048660A - 励起光強度最適化方法及び蛍光相互相関分光装置用プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】光学系を変えずに、ＦＣＣＳにおける分子間相互作用解析の精度を向上させる方法及び該方法に用いられるプログラムの提供。
【解決手段】互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光による蛍光相互相関分光法における励起光強度を最適化する方法において、（ａ）第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と、第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とを含有する試料を調製する工程と、（ｂ）第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の、２以上の組み合わせを決定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、第１標的分子と第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、（ｄ）工程（ｃ）において算出されたみかけの結合率に基づき、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程とを有する励起光強度最適化方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光による蛍光相互相関分光法における励起光強度を最適化する方法、及び、該方法のための蛍光相互相関分光装置用プログラムに関する。

近年の光計測技術の発展は目覚ましく、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析することができる一分子蛍光分析技術が多くの分野で応用されつつある。このような一分子蛍光分析技術には、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）等がある。

一分子蛍光分析技術は、レーザ共焦点顕微鏡の光学系と、フォトンカウンティング（１光子検出）可能な超高感度の光検出装置とを用いて、試料溶液中の微小空間内の蛍光一分子レベルの蛍光シグナルを測定し、その蛍光シグナルの揺らぎや強度を、種々の方法により解析することにより、該蛍光分子の大きさや明るさ等の情報を得ることができる。このため、生物科学、医学、薬学等の分野では、一分子蛍光分析技術が、生体分子等の状態や運動の検出・観測に応用されており、例えば、タンパク質と核酸の結合反応や抗原抗体反応を解明する試みがなされている。

ＦＣＳは、検出された蛍光シグナルから、蛍光分子の並進拡散時間を求めることができる解析法である。並進拡散時間は分子の大きさによって異なるため、分子の相互作用や分解、凝集等の大きさの変化をモニターするために主に用いられる解析法である。例えば、分子間相互作用により複数の分子が結合している反応体は、相互作用していない分子よりも大きくなるため、該反応体の並進拡散時間はより長くなる。このため、並進拡散時間を求めることにより、分子間相互作用の有無を判別することができる。このように、ＦＣＳは、相互作用前後での分子サイズの変化が大きい場合、例えば約３倍以上あるような場合の解析に好適である。

一方、ＦＣＣＳは、それぞれ分光特性の異なる蛍光物質を用いて標識した分子同士の相互作用を解析する方法である。つまり、試料に対し、各蛍光物質に対応した励起光を同時に照射し、それぞれの分子から検出された蛍光シグナルの相互相関を解析することにより、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。このように、ＦＣＣＳは、ＦＣＳとは異なり、相互作用前後での分子サイズの変化に全く依存せずに分子間の相互作用を解析することが可能である。このため、相互作用前後での分子サイズの変化が小さい場合であっても好適に分子間相互作用を解析することができる。実際に、相互作用前後での分子サイズの変化が２倍程度しかないような場合にもＦＣＣＳによる解析は可能である（例えば、非特許文献１参照。）。
シュウィル（Schwille）、外２名、バイオフィジカル・ジャーナル（Biophysical Journal）、第７２巻、第１８７８〜１８８６ページ参照。

上述するように、一分子蛍光分析技術では、試料溶液中の微小空間内の蛍光シグナルを検出する。このため、ＦＣＣＳのように、波長の異なる励起光を使用する場合には、微小空間である一の観測領域に、両方の波長の励起光を照射する必要がある。しかしながら、実際には、使用する対物レンズ等の軸上色収差により、それぞれの波長の励起光の共焦点領域は完全には一致しない。このため、ＦＣＣＳでは、たとえ異なる蛍光物質を用いて標識した分子同士が１００％結合しているサンプルを測定した場合であっても、算出される両分子の結合率は５０〜６０％程度と、本来よりも低く算出されてしまい、目的の分子間相互作用の検出感度や精度が低下してしまうという重大な課題がある。

本発明は、光学系を変えることなく、ＦＣＣＳにおける分子間相互作用解析の精度を向上するための方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、各励起光のレーザ強度の組み合わせを適宜調整することにより、両波長のそれぞれの共焦点領域が重なる割合を大きくし得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光による蛍光相互相関分光法における励起光強度を最適化する方法において、（ａ）第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と、第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とを含有する試料を調製する工程と、（ｂ）前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の、２以上の組み合わせを決定する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、下記工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）をそれぞれ行い、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）において算出されたみかけの結合率に基づき、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程と、を有することを特徴とする励起光強度最適化方法を提供するものである；（ｃ−１）前記工程（ａ）において調製された試料に、前記工程（ｂ）において決定された組み合わせのうちの１の組み合わせとなるように励起光強度を調整した前記第１励起光と前記第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように同時に照射する工程、（ｃ−２）前記工程（ｃ−１）において、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する工程、（ｃ−３）前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第２蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関をとり、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出し、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程。
また、本発明は、前記工程（ｃ）が、（ｃ’）前記工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、下記工程（ｃ−１）〜（ｃ−４）をそれぞれ行い、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、であり、前記工程（ｄ）が、
（ｄ’）前記工程（ｃ’）において算出したみかけの結合率及び一分子当たりの明るさに基づき、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程と、
であることを特徴とする前記記載の励起光強度最適化方法を提供するものである；（ｃ−１）前記工程（ａ）において調製された試料に、前記工程（ｂ）において決定された組み合わせのうちの１の組み合わせとなるように励起光強度を調整した前記第１励起光と前記第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように同時に照射する工程、（ｃ−２）前記工程（ｃ−１）において、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する工程、（ｃ−３）前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第２蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関をとり、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出し、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程、（ｃ−４）前記工程（ｃ−３）の後、前記第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ、及び前記第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを、それぞれ算出する工程。
また、本発明は、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように、試料中に照射可能であり、各励起光の励起光強度を調整する励起光調整部、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する蛍光検出部とを有する共焦点光学系、並びに、第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせデータ、及び前記第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と前記第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とのみかけの結合率データを記憶する記憶部、を有する蛍光相互相関分光装置のためのプログラムであって、前記記憶部に、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の２以上の組み合わせデータを記憶する組み合わせデータ記憶手段、前記記憶部に記憶された組み合わせデータの中に、対応するみかけの結合率データが記憶されていない組み合わせがある場合には、記憶された組み合わせデータの中から、対応するみかけの結合率データが記憶されていない１の組み合わせデータを選択し、前記第１励起光及び前記第２励起光の励起光強度を、この選択された組み合わせデータの励起光強度となるように、前記励起光調整部を制御する励起光強度制御手段、前記共焦点光学系により、前記励起光強度制御手段により制御された励起光強度である前記第１励起光及び前記第２励起光を、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域とが重複領域を有するように、同時に前記試料に照射させた後、前記蛍光検出部により、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する蛍光検出手段、前記蛍光検出手段において検出された第１蛍光の蛍光強度及び第２蛍光の蛍光強度の、それぞれの自己相関関数及び相互相関関数を求める相関解析手段、前記相関解析手段により求められた相関関数から、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出する平均分子数算出手段、前記平均分子数算出手段において算出された第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を用いて、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する結合率算出手段、前記結合率算出手段により算出されたみかけの結合率を、前記記憶部に、記憶された組み合わせデータに対応させて記憶する結合率記憶手段、前記記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶されている場合に、全てのみかけの結合率データの中から最大値を決定する最大結合率決定手段、前記最大結合率決定手段において決定されたみかけの結合率データに対応する組み合わせデータにおける第１励起光及び第２励起光の励起光強度を、最適値とする励起光強度最適化手段、として機能させることを特徴とする蛍光相互相関分光装置用プログラムを提供するものである。
また、本発明は、前記記憶部に、一分子当たりの明るさの下限値を記憶する明るさ下限値記憶手段、前記相関解析手段において求められた相関関数と、前記平均分子数算出手段において算出された第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）及び第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）とを用いて、前記第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ及び前記第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを算出する明るさ算出手段、前記明るさ算出手段により算出された一分子当たりの明るさを、前記記憶部に、記憶された組み合わせデータに対応させて記憶する明るさ記憶手段、としてさらに機能させるものであり、前記最大結合率決定手段が、前記記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶されている場合に、対応する一分子当たりの明るさが、前記記憶部に記憶された下限値よりも大きい組み合わせデータを選抜し、これらの選抜された組み合わせデータに対応するみかけの結合率データの中から最大値を決定する手段であること、を特徴とする前記記載の蛍光相互相関分光装置用プログラムを提供するものである。

本発明の励起光強度最適化方法を用いることにより、光学系を変更することなく、ＦＣＣＳに用いられる互いに波長の異なる２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化することができる。このため、本発明の励起光強度最適化方法により最適化された組み合わせの励起光強度によりＦＣＣＳを行うことにより、目的の分子間相互作用を正確かつ高感度で検出することが可能となる。
また、本発明の蛍光相互相関分光装置用プログラムを用いることにより、ＦＣＣＳに用いられる励起光の励起光強度を簡便に最適化することができる。

本発明は、分子間相互作用の解析精度を向上させるために、励起光強度を最適化する方法に係る発明である。励起光強度を最適化することにより、光学系を変更することなく、分子間相互作用の解析精度を向上させることができる理由は明らかではないが、次のように推察される。
図１は、ＦＣＣＳに用いられる共焦点光学顕微鏡において、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光を同時に照射した場合の、対物レンズ等の軸上色収差により生じる共焦点領域のズレを示した概念図である。図中、「Ｖ_１」が第１励起光による第１共焦点領域であり、「Ｖ_２」が第２励起光による第２共焦点領域であり、「Ｖ_１２」が第１励起光による第１共焦点領域と第２励起光による第２共焦点領域との重複領域である。励起光強度を変更することにより、共焦点領域の位置や広さを若干変動させることができるため、第１励起光と第２励起光のそれぞれの強度を調整することにより、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレを小さくし、重複領域を広げることができるためと推察される。

本発明の励起光強度最適化方法は、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光による蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）における励起光強度を最適化する方法において、（ａ）第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と、第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とを含有する試料を調製する工程と、（ｂ）前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の、２以上の組み合わせを決定する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせにおける、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）において算出されたみかけの結合率に基づき、前記第１の励起光と前記第２の励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程と、を有するものである。
図２は、本発明の励起光強度最適化方法の一態様における工程（ｃ）及び（ｄ）のフローチャートである。図２中、左列はみかけの結合率のみから励起光強度を最適化する場合、右列はみかけの結合率に加えて、一分子当たりの明るさを考慮して励起光強度を最適化する場合である。以下、各工程について説明する。

まず、工程（ａ）として、第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と、第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とを含有する試料を調製する。蛍光標識に用いられる蛍光物質としては、例えば、各種類の分子を蛍光標識する場合に通常用いられる蛍光物質を用いることができる。該蛍光物質として、例えば、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、ローダミングリーン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、ＥＶＯｂｌｕｅ（登録商標）シリーズ（メルクバイオサイエンス社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅシリーズ（インビトロジェン社製）、Ｃｙ ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＡＴＴＯ ｄｙｅシリーズ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）等がある。長時間安定して検出できることから、ＴＡＭＲＡ、ローダミングリーン、ＥＶＯｂｌｕｅ（登録商標）５０、ＡＴＴＯ６３３等の一般的に退色しにくい蛍光物質であることがより好ましい。

第１蛍光物質と第２蛍光物質は、互いに分光特性が異なる、すなわち、異なる波長の励起光により異なる波長の蛍光を発する蛍光物質の組み合わせであればよく、上記で例示した蛍光物質の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、４８８ｎｍの励起光により蛍光を発し得るローダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８等を第１蛍光物質とし、６３３ｎｍの励起光により蛍光を発し得るＥＶＯｂｌｕｅ（登録商標）５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等を第２蛍光物質とすることができる。

本発明において用いられる標的分子は、蛍光物質を用いて標識し得る分子であって、ＦＣＣＳ解析に供され得る分子であれば、特に限定されるものではない。例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、低分子化合物等を用いることができ、該標的分子を蛍光物質により修飾することにより、本発明において用いられる第１標的分子及び第２標的分子を得ることができる。

標的分子を蛍光物質により標識する方法としては、特に限定されるものではなく、蛍光物質を用いて修飾する場合に通常用いられている方法により行うことができる。例えば、標的分子として、蛍光物質により修飾された核酸を用いる場合には、（i）光やプラチナを用いて、核酸の塩基に蛍光物質を共有結合させる方法、（ii）１種類の標的核酸に対して、それぞれ異なる蛍光物質で標識された２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、両末端に蛍光物質が結合したＰＣＲ産物を得る方法、（iii）蛍光物質を結合させたヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う方法、（iv）ターミナルデオキシジルトランスフェラーゼを用いて、蛍光物質を結合させたヌクレオチドを核酸の３’末端にテーリングする方法等がある。また、標的分子として、蛍光物質により修飾されたタンパク質やペプチドを用いる場合には、例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸同士を結合させるＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法や、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法等がある。

このようにして調製された標的分子を、適当な溶媒に溶解させたものを、本発明においてＦＣＣＳに供される試料とすることができる。該溶媒は、ＦＣＣＳにおいて測定可能な溶媒であれば特に限定されるものではないが、バッファーであることが好ましい。蛍光物質の中には、ｐＨの影響を受けやすいものもあるためである。該バッファーとして、例えば、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等が挙げられる。

本発明において用いられる第１標的分子及び第２標的分子は、実際に相互作用を検出する対象である分子であってもよく、励起光強度最適化のための分子であってもよい。励起光強度最適化のための分子としては、結合率が高いことが予め判明している組み合わせの２種類の分子、好ましくは結合率が１００％である組み合わせの２種類の分子を、それぞれ互いに分光特性の異なる蛍光物質により標識したものを用いることができる。その他、第１標的分子と第２標的分子とは一の分子であってもよく、具体的には、第１蛍光物質と第２蛍光物質の両方が結合している分子を用いてもよい。
例えば、第１蛍光物質と第２蛍光物質の両方が結合している分子を標的分子として用いた場合や、結合率がほぼ１００％である第１標的分子及び第２標的分子を用いた場合には、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレがない理想的な条件下でＦＣＣＳにより解析すると、第１励起光により検出された蛍光分子数と、第２励起光により検出された蛍光分子数は一致することが期待できる。

ＦＣＣＳを行った場合の、第１標的分子と第２標的分子のみかけの結合率（第１励起光と第２励起光の少なくとも一方により検出された標的分子全体に対する、第１励起光と第２励起光の両方により検出された標的分子の割合、以下、単に「みかけの結合率」ということがある。）は、第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域の広さの指標とすることができる。例えば、みかけの結合率が十分に大きい場合には、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレが小さくて重複領域が広く、このような測定条件でＦＣＣＳによる解析を行うことにより、相互作用の解析精度を向上させることができる。一方、みかけの結合率が小さい場合には、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレが大きく、このような測定条件では、目的の分子間相互作用を十分に検出し解析することが困難であると判断できる。

次に、工程（ｂ）として、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の、２以上の組み合わせを決定する。この決定された組み合わせの、全ての組み合わせの励起光強度において、以下の工程（ｃ）においてそれぞれＦＣＣＳを行い、算出されたみかけの結合率を比較検討する。これにより、第１蛍光物質を用いて標識された分子と第２蛍光物質を用いて標識された分子との分子間相互作用を、第１励起光と第２励起光を用いたＦＣＣＳにより解析する場合に最適な第１励起光の励起光強度と第２励起光の励起光強度を決定することができる。

励起光強度の上限値及び下限値、並びにその組み合わせは、使用する共焦点光学顕微鏡の光学系の仕様、励起光の波長や光源の種類、ＦＣＣＳ装置の機能、検出対象である蛍光物質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。励起光強度が小さすぎる場合には、測定される標的分子の一分子当たりの明るさが暗くなりすぎ、ＦＣＣＳ解析における精度が低下するおそれがある。逆に、励起光強度が大きすぎる場合には、標的分子の蛍光が退色しやすく、やはり、ＦＣＣＳ解析の精度に影響を及ぼすおそれがある。より具体的には、各励起光の励起光強度を、１０〜３００μＷ、好ましくは２５〜３００μＷの範囲内で複数の測定点を決定し、各波長の測定点を総当りで組み合わせることにより、第１励起光と第２励起光の励起光強度の組み合わせを決定することができる。なお、励起光強度の測定点の範囲は、第１励起光と第２励起光において同じ範囲であってもよく、異なる範囲であってもよい。例えば、第１励起光と第２励起光をいずれも２５〜３００μＷの範囲内で測定点を決定してもよく、第１励起光を２５〜３００μＷの範囲内で決定し、第２励起光を１０〜２００μＷの範囲内で決定してもよい。なお、第１蛍光物質や第２蛍光物質として、退色しやすい蛍光物質を用いる場合には、励起光強度を比較的小さい範囲で測定点を決定することが好ましい。

工程（ｂ）において、組み合わせと共に、各組み合わせの工程（ｃ）において測定する順番を決定してもよい。例えば、各組み合わせをランダムに測定してもよく、一方の励起光の励起光強度を一の測定点に固定し、他方の励起光の励起光強度を順次変更して全ての測定点を測定した後、固定していた励起光の励起光強度を他の測定点に固定し、同様に測定していくこともできる。なお、複数の組み合わせに係る測定を、一の試料を用いて行う場合には、励起光強度が小さい組み合わせから先に行うことが好ましい。励起光強度が小さい組み合わせから先に行うことにより、複数回励起光を照射することによる、試料中の標的分子中の蛍光物質に対する影響をより低く抑えることができるためである。

次に、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせにおける、第１標的分子と第２標的分子とのみかけの結合率を算出する。励起光強度を工程（ｂ）において決定した組み合わせの強度とした測定条件とした以外は、常法によりＦＣＣＳを行い、みかけの結合率を算出する。具体的には、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、以下の（ｃ−１）〜（ｃ−３）工程を行う。以下、各工程について説明する。

まず、工程（ｃ−１）として、工程（ａ）において調製された試料に、工程（ｂ）において決定された組み合わせのうちの１の組み合わせとなるように励起光強度を調整した第１励起光と第２励起光とを、第１励起光による第１共焦点領域と第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように同時に照射する。次に、工程（ｃ−２）として、工程（ｃ−１）において、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する。第１励起光が照射されることにより、試料中の第１共焦点領域に存在する第１標的分子中の第１蛍光物質から蛍光（第１蛍光）が発生する。一方で、第２励起光が照射されることにより、試料中の第２共焦点領域に存在する第２標的分子中の第２蛍光物質から蛍光（第２蛍光）が発生する。これらの発生した第１蛍光及び第２蛍光を、それぞれ別個に検出して得られた蛍光強度のデータに基づき、工程（ｃ−３）として、ＦＣＣＳ解析を行い、みかけの結合率を算出する。

具体的には、工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を算出し、工程（ｃ−２）において検出した第２蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を算出し、工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関をとり、第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出する。

一般的に、共焦点領域を縦長の回転楕円体とした場合に、単一の蛍光物質で標識された蛍光分子から検出された蛍光強度信号からは、下記式（１）のような自己相関カーブＧ（ｔ）を得ることができる。式（１）中、Ｎは共焦点領域中の平均分子数を、ｔ_Ｄは分子の拡散時間を、Ｗは共焦点領域の横方向の半径を、Ｚは共焦点領域の縦方向の半径を、それぞれ示している。平均分子数Ｎは、式（２）で表される自己相関カーブの縦軸切片（ｔ＝０）から算出することができる。

ＦＣＣＳによる解析においては、下記式（３）及び式（４）に示すように、第１蛍光の蛍光強度の自己相関カーブＧ_１（ｔ）の縦軸切片（ｔ＝０）から第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を、第２蛍光の蛍光強度の自己相関カーブＧ_２（ｔ）の縦軸切片（ｔ＝０）から第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を、それぞれ算出することができる。

一方、下記式（５）に示すように、第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関カーブＧ_１２（ｔ）の縦軸切片（ｔ＝０）、第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、及び第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）から、第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出することができる。

このようにして算出した第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）から、例えば下記式（６）に示すように、第１共焦点領域と第２共焦点領域中の標的分子の数に対する、第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の標的分子の数が占める割合（みかけの結合率）を算出することができる。

なお、本発明において算出されるみかけの結合率は、蛍光強度の組み合わせごとに比較できるものであればよく、必ずしも厳密に算出されなければならないものではない。たとえば、みかけの結合率を算出するための式として、上記式（６）以外にも、下記式（７）や（８）を用いてもよい。

図２のフローチャートに示すように、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、前記工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）を行い、それぞれの蛍光強度におけるみかけの結合率を算出する。具体的には、まず、工程（ｂ）において決定した組み合わせのうちの１つを選択し、工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）を行い、みかけの結合率を算出する。その後、工程（ｂ）において決定した組み合わせのうち、みかけの結合率を算出していない組み合わせの中から１つを選択し、工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）を行い、みかけの結合率を算出する。この操作を、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせにおけるみかけの結合率を算出するまで繰り返す。

なお、工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）を行う場合に、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに係る測定を１の試料で行ってもよく、複数の組み合わせに係る測定ごとに１の試料で行ってもよく、１の組み合わせに係る測定を１の試料で行ってもよい。全ての組み合わせに係る測定を１の試料に対して行うことにより、工程（ａ）において調製すべき試料の量を抑えることができる。また、測定ごとに試料を取り替える操作が不要となり、測定をより簡便に行うことができる。一方、１の試料に対しては１の組み合わせに係る測定のみを行うことにより、励起光の連続照射による蛍光物質の退色等の影響を抑えることができ、組み合わせの測定の順番等を考慮せずとも、より精度の高い測定が可能となる。

その後、工程（ｄ）として、工程（ｃ）において算出されたみかけの結合率に基づき、第１の励起光と第２の励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する。なお、「組み合わせを最適化する」とは、工程（ｂ）において決定した組み合わせの中から、第１蛍光物質により標識された分子と第２蛍光物質により標識された分子との相互作用を、第１励起光及び第２励起光を用いたＦＣＣＳにより解析する場合に、対物レンズ等の軸上色収差による影響、すなわち第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレの影響を最小にし得る第１励起光と第２励起光の励起光強度の組み合わせを決定することを意味する。

具体的には、例えば、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせのうち、工程（ｃ）において最も大きいみかけの結合率が算出された組み合わせが最適であると判断することができる。標的分子の検出感度が十分である場合には、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレが小さく、重複領域が広ければ広いほど、みかけの結合率は大きくなる。このため、工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせにおけるみかけの結合率の中から、最も大きいみかけの結合率が得られた組み合わせの場合に、第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレが最も小さく、重複領域が最大となることが期待できるためである。

ＦＣＣＳ解析においては、一般的に、一分子当たりの明るさが十分な明るさとなるように、第１の励起光と第２の励起光の励起光強度を調整することが好ましい。一分子当たりの明るさが暗すぎる場合には、標的分子の検出感度が低下し、ＦＣＣＳによる解析精度も低下するおそれがあるためである。本発明の励起光強度最適化方法においても、工程（ｃ−３）において算出されたみかけの結合率に加えて、標的分子の一分子当たりの明るさを考慮して、第１の励起光と第２の励起光の励起光強度の組み合わせを最適化してもよい。

具体的には、まず、工程（ｃ−３）の後、工程（ｃ−４）として、第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ、及び第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを、それぞれ算出する。標的分子の一分子当たりの明るさは、ＦＣＳやＦＣＣＳにおいて一般的に行われている演算方法により求めることができる。例えば、工程（ｃ−２）で検出された蛍光強度を、工程（ｃ−３）で算出された平均分子数で除することにより、一分子当たりの明るさを算出することができる。

その後、工程（ｃ−３）において算出したみかけの結合率及び工程（ｃ−４）において算出した一分子当たりの明るさに基づき、第１励起光と第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する。具体的には、図２のフローチャートに示すように、一分子当たりの明るさの制限が必要である場合に、下限値を予め設定し、工程（ｂ）において決定した組み合わせのうち、一分子当たりの明るさが設定した下限値以上である組み合わせをまず選抜し、この選抜された組み合わせの中で、最も大きいみかけの結合率が算出された組み合わせが、最適な組み合わせであると判断することができる。

標的分子の一分子当たりの明るさの下限値は、特に限定されるものではなく、ＦＣＣＳに用いられる共焦点光学系や蛍光検出手段の仕様、第１蛍光物質や第２蛍光物質の種類、第１励起光や第２励起光の波長等を考慮して、適宜決定することができる。一般的には、一分子当たりの明るさが１０ｋＨｚ以上であれば、十分な感度で検出することができるため、例えば、一分子当たりの明るさの下限値を１０ｋＨｚとしてもよい。一方で、退色しやすい蛍光物質を用いた場合には、一分子当たりの明るさを明るくするために励起光強度を大きくすると、退色により逆に検出感度が低下するおそれがあるため、例えば、一分子当たりの明るさの下限値を５ｋＨｚ程度としてもよい。なお、標的分子の一分子当たりの明るさの下限値は、第１励起光と第２励起光において同じ値を設定してもよく、異なる値を設定してもよい。

このように、本発明の励起光強度最適化方法により、第１励起光及び第２励起光の励起光強度を最適化することにより、共焦点光学系を変更することなく、簡便かつ効果的に、対物レンズ等の軸上色収差による第１共焦点領域と第２共焦点領域のズレの影響を抑制し得る。このため、第１蛍光物質により標識された分子と第２蛍光物質により標識された分子との相互作用を、これらの分子を含む試料に第１励起光及び第２励起光を照射し、ＦＣＣＳにより解析する場合に、第１励起光と第２励起光を、本発明の励起光強度最適化方法により最適化された励起光強度、すなわち、工程（ｄ）において最適化された組み合わせの励起光強度とすることにより、解析精度を向上させることができる。

本発明の励起光強度最適化方法は、ＦＣＣＳ解析を行うことが可能な共焦点光学系及び演算手段を有する装置を用いることにより行うことができる。このような装置としては、波長の異なる２種類の励起光を同時に共焦点領域に照射し、各励起光により発生した蛍光を別個に検出し得る共焦点光学顕微鏡と、検出された蛍光の蛍光強度から、自己相関関数及び相互相関関数を求めることができる演算手段を有していれば、特に限定されるものではなく、市販のＦＣＣＳ装置等を用いることもできる。

本発明の励起光強度最適化方法は、例えば、図３に示すような構成を有するＦＣＣＳ装置によって実行されてもよい。該ＦＣＣＳ装置により、本発明の励起光強度最適化方法における工程（ｃ）及び（ｄ）を全て自動的に行うことができる。該装置は、第１励起光を発する光源２ａ、第２励起光を発する光源２ｂ、光源２ａから発された励起光（レーザ光）の強度を調整する励起光調整部３ａ、光源２ｂから発されたレーザ光の強度を調整する励起光調整部３ｂ、対物レンズ４、試料をのせるステージ５、及び励起光照射により試料から発される蛍光を波長ごとに検出する蛍光検出部８を有する共焦点レーザ顕微鏡１を備える。励起光調整部３としては、一般的なレーザ顕微鏡等において、レーザ光量を調整するために用いられているものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、ＮＤ（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルター等を用いることにより、簡便に所望の励起光強度に調整することができる。

該ＦＣＣＳ装置は、さらに、通過するレーザ光が所望の強度となるように励起光調整部を制御する励起光強度制御部９、蛍光検出部８により検出された蛍光の強度から相関解析を行う相関解析部１０、相関解析部１０により求められた相関関数から各共焦点領域中の平均分子数を算出する平均分子数算出部１１、平均分子数算出部１１により算出された平均分子数から、試料中の第１標的分子と第２標的分子とのみかけの結合率を算出する結合率算出部１２、相関解析部１０により求められた相関関数と平均分子数算出部１１により算出された平均分子数から各共焦点領域中の一分子当たりの明るさを算出する明るさ算出部１３、第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の２以上の組み合わせデータ、結合率算出部１２により算出されたみかけの結合率、及び明るさ算出部１２により算出された一分子当たりの明るさを記憶する記憶部１４、記憶部１４に記憶されたみかけの結合率の中から最大値を決定する最大結合率決定部１５、及び最大結合率決定部１５において決定されたみかけの結合率データに対応する組み合わせデータにおける第１励起光及び第２励起光の励起光強度を最適値とする励起光強度最適化部１６を有する相関解析装置１７を備える。

その他、例えば、試料用容器としてマルチウェルプレートを用いて、複数のウェルに分注した試料を共焦点顕微鏡のステージに設置し、該ステージを測定ごとに自動的に移動させることにより、１の組み合わせに係る測定を１の試料で行う場合のように、一連の測定において複数の試料を用いる場合であっても、工程（ｃ）及び（ｄ）を全て自動的に行うことにより、一分子当たりの明るさを考慮した励起光強度の最適化を自動的に行うことができる。

図４は、該ＦＣＣＳ装置のフローチャートを示した図である。まず、予め、工程（ｂ）において決定された組み合わせを、記憶部１４に記憶させる。記憶された組み合わせデータの中から、対応するみかけの結合率データが記憶されていない１の組み合わせデータを選択し、第１励起光及び第２励起光の励起光強度を、この選択された組み合わせデータの励起光強度となるように、励起光調整部３を制御する。これにより、２つの光源２ａ、２ｂから発されたレーザ光は、選択された組み合わせとなるように励起光強度を調整された後、第１励起光又は第２励起光として対物レンズを通過して試料に照射される。

第１励起光及び第２励起光を、第１共焦点領域と第２共焦点領域とが重複領域を有するように、同時に試料に照射させた後、第１励起光の照射に応じて試料から発生した第１蛍光と、第２励起光の照射に応じて試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する。検出された蛍光強度のデータは相関解析部に送られ、相関解析部により、検出された第１蛍光の蛍光強度及び第２蛍光の蛍光強度の、それぞれの自己相関関数及び相互相関関数を求められる。平均分子数算出部によって、求められた相関関数から、上述した演算により、第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）が算出される。結合率算出部により、算出された平均分子数から、第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する。算出されたみかけの結合率は、記憶部に、励起光強度制御に用いた選択された組み合わせデータに対応させて記憶する。記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶された後、全てのみかけの結合率データの中から最大値を決定し、この決定されたみかけの結合率データに対応する組み合わせデータにおける第１励起光及び第２励起光の励起光強度を、最適値とする。

また、図５のフローチャートのように、一分子当たりの明るさを考慮した励起光強度の最適化を自動的に行うことができる。具体的には、記憶部に、予め設定した一分子当たりの明るさの下限値を記憶させ、相関関数を求めた後、第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ及び第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを、それぞれ算出し、記憶部に、算出された一分子当たりの明るさを、選択された組み合わせデータに対応させて記憶する。記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶された後、対応する一分子当たりの明るさが、設定した明るさの下限値よりも大きい組み合わせデータを選抜し、これらの選抜された組み合わせデータに対応するみかけの結合率データの中から、最大値を決定し、この決定されたみかけの結合率データに対応する組み合わせデータにおける第１励起光及び第２励起光の励起光強度を、最適値とする。

なお、図３中の相関解析装置１７が有する各機能を、コンピュータで実現するようにしても良い。その場合、これらの各機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現しても良い。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでも良い。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
第１励起光として４８８ｎｍ、第２励起光として６３３ｎｍ、第１蛍光物質としてローダミングリーン、第２蛍光物質としてＥＶＯｂｌｕｅ５０を用いて、ＦＣＣＳ解析における励起光強度の最適化を行った。ＦＣＣＳは、４８８ｎｍ用Ａｒレーザと６３３ｎｍ用Ｈｅ−Ｎｅレーザを光源とし、４８８ｎｍと６３３ｎｍを、互いの共焦点領域が重複領域を有するように試料中に同時に照射可能な共焦点系と、各励起光の照射に応じて発生した蛍光を別個に検出する蛍光検出部と、各励起光の励起光強度を調整する励起光調整部とを有する共焦点レーザ顕微鏡と、相関解析可能な演算部を有するＦＣＣＳ装置を用いて行った。
まず、５’末端にローダミングリーンを標識したオリゴＤＮＡを第１標的分子とし、このオリゴＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端にＥＶＯｂｌｕｅ５０を標識したオリゴＤＮＡを第２標的分子とし、両者をハイブリダイゼーションさせ、エキソヌクレアーゼＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）を用いて１本鎖ＤＮＡのみを分解した後、ＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を用いて精製した二重蛍光標識２本鎖ＤＮＡを作製した。該二重蛍光標識２本鎖ＤＮＡを最終的に２ｎＭに調製したものを、第１標的分子と第２標的分子とを含む測定サンプル（試料）とした。すなわち、該測定サンプル中では、第１標的分子と第２標的分子とがほぼ１００％結合している。
４８８ｎｍと６３３ｎｍの励起光強度の組み合わせとしては、各レーザ強度をそれぞれ２５、５０、１００、２００、３００μＷの５点とする計２５通りの組み合わせとした。
各組み合わせのレーザ強度において、ＦＣＣＳを行い、４８８ｎｍによる共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_４８８）、６３３ｎｍによる共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_６３３）、両共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_{４８８＋６３３}）、及び各共焦点領域中の一分子当たりの明るさを、それぞれ求めた。さらに、求めた平均分子数を用いて上記式（６）に従って第１標的分子と第２標的分子とのみかけの結合率を求めた。なお、ＦＣＣＳにおける１回の測定時間は１０秒とし、それぞれ３回ずつ測定した。
表１は、各組み合わせにおけるみかけの結合率の平均を示したものである。また、表２は、各組み合わせにおける一分子当たりの明るさの平均を示したものである。表２の各欄中、左値が４８８ｎｍによる共焦点領域中の一分子当たりの明るさを、右値が６３３ｎｍによる共焦点領域中の一分子当たりの明るさを、それぞれ示している。

表１記載の結果から、レーザ強度の組み合わせによって算出されるみかけの結合率が異なることがわかった。これらは全て同じサンプルを測定したものであることから、得られたみかけの結合率の差は、４８８ｎｍによる共焦点領域と６３３ｎｍによる共焦点領域の重複領域の差によるものと推察される。
分子間相互作用を高感度に検出するためには、このみかけの結合率が出来る限り高い値が得られる測定条件であることが好ましい。本実施例においては、全２５通りの組み合わせの中でみかけの結合率の最大値は６６．９％であり、４８８ｎｍと６３３ｎｍが共に２５μＷの組み合わせにおけるみかけの結合率であった。したがって、ローダミングリーンにより標識された分子とＥＶＯｂｌｕｅ５０により標識された分子との相互作用を解析する場合には、４８８ｎｍと６３３ｎｍを共に２５μＷとする条件でＦＣＣＳを行うことが好ましいことが明らかとなった。

一方、分子間相互作用をより高精度に解析するために、検出される一分子当たりの明るさの下限値を設定してもよい。例えば、本実施例において、検出される一分子当たりの明るさの下限値を両波長ともに１０ｋＨｚとした場合には、表２の結果から、一分子当たりの明るさが１０ｋＨｚ以上となる組み合わせとして、４８８ｎｍは２５〜３００μＷ、６３３ｎｍは５０〜３００μＷの計２０通りが選抜される。表１の結果から、この選抜された組み合わせの中でみかけの結合率の最大値は６５．９％であり、４８８ｎｍが２５μＷ、６３３ｎｍが５０μＷの組み合わせにおけるみかけの結合率であった。したがって、ローダミングリーンにより標識された分子とＥＶＯｂｌｕｅ５０により標識された分子との相互作用を解析する場合には、４８８ｎｍを２５μＷ、６３３ｎｍを５０μＷとする条件でＦＣＣＳを行うことにより、より高精度に解析し得ることが明らかとなった。
これらの結果から、本発明の励起光強度最適化方法を用いることにより、ＦＣＣＳ解析に適した励起光強度の情報を得られることが明らかである。

本発明の励起光強度最適化方法を用いることにより、光学系を変更することなく、ＦＣＣＳに用いられる互いに波長の異なる２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化することができるため、分子間相互作用を解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。

ＦＣＣＳに用いられる共焦点光学顕微鏡において、互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光を同時に照射した場合の、対物レンズ等の軸上色収差により生じる共焦点領域のズレを示した概念図である。 本発明の励起光強度最適化方法における工程（ｃ）〜（ｄ）の一態様のフローチャートである。 本発明の励起光強度最適化方法に用いられる装置の構成の一態様を示した図である。 本発明の励起光強度最適化方法に用いられるＦＣＣＳ装置用プログラムの一態様のフローチャートである。 本発明の励起光強度最適化方法のうち、一分子当たりの明るさを考慮した方法に用いられるＦＣＣＳ装置用プログラムの一態様のフローチャートである。

符号の説明

１…共焦点レーザ顕微鏡、２ａ…レーザ光源、２ｂ…レーザ光源、３ａ…励起光調整部、３ｂ…励起光調整部、４…対物レンズ、５…ステージ、６…試料、７…試料用容器、８…蛍光検出部、９…励起光強度制御部、１０…相関解析部、１１…平均分子数算出部、１２…結合率算出部、１３…明るさ算出部、１４…記憶部、１５…最大結合率決定部、１６…励起光最適化部、１７…相関解析装置

Claims (4)

1. 互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光による蛍光相互相関分光法における励起光強度を最適化する方法において、
   （ａ）第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と、第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とを含有する試料を調製する工程と、
   （ｂ）前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の、２以上の組み合わせを決定する工程と、
   （ｃ）前記工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、下記工程（ｃ−１）〜（ｃ−３）をそれぞれ行い、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、
   （ｄ）前記工程（ｃ）において算出されたみかけの結合率に基づき、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程と、
   を有することを特徴とする励起光強度最適化方法。
   （ｃ−１）前記工程（ａ）において調製された試料に、前記工程（ｂ）において決定された組み合わせのうちの１の組み合わせとなるように励起光強度を調整した前記第１励起光と前記第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように同時に照射する工程、
   （ｃ−２）前記工程（ｃ−１）において、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する工程、
   （ｃ−３）前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第２蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関をとり、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出し、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程。
2. 前記工程（ｃ）が、
   （ｃ’）前記工程（ｂ）において決定した全ての組み合わせに対して、下記工程（ｃ−１）〜（ｃ−４）をそれぞれ行い、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程と、
   であり、前記工程（ｄ）が、
   （ｄ’）前記工程（ｃ’）において算出したみかけの結合率及び一分子当たりの明るさに基づき、前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせを最適化する工程と、
   であることを特徴とする請求項１記載の励起光強度最適化方法。
   （ｃ−１）前記工程（ａ）において調製された試料に、前記工程（ｂ）において決定された組み合わせのうちの１の組み合わせとなるように励起光強度を調整した前記第１励起光と前記第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように同時に照射する工程、
   （ｃ−２）前記工程（ｃ−１）において、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する工程、
   （ｃ−３）前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第２蛍光の蛍光強度の自己相関をとり、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）を算出し、前記工程（ｃ−２）において検出した第１蛍光の蛍光強度と第２蛍光の蛍光強度の相互相関をとり、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出し、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する工程、
   （ｃ−４）前記工程（ｃ−３）の後、前記第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ、及び前記第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを、それぞれ算出する工程。
3. 互いに波長の異なる第１励起光と第２励起光とを、前記第１励起光による第１共焦点領域と前記第２励起光による第２共焦点領域とが重複領域を有するように、試料中に照射可能であり、各励起光の励起光強度を調整する励起光調整部、
   前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する蛍光検出部とを有する共焦点光学系、並びに、
   第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の組み合わせデータ、及び前記第１励起光により蛍光を発し得る第１蛍光物質を用いて標識された第１標的分子と前記第２励起光により蛍光を発し得る第２蛍光物質を用いて標識された第２標的分子とのみかけの結合率データを記憶する記憶部、
   を有する蛍光相互相関分光装置のためのプログラムであって、前記記憶部に、
   前記第１励起光と前記第２励起光の励起光強度の２以上の組み合わせデータを記憶する組み合わせデータ記憶手段、
   前記記憶部に記憶された組み合わせデータの中に、対応するみかけの結合率データが記憶されていない組み合わせがある場合には、記憶された組み合わせデータの中から、対応するみかけの結合率データが記憶されていない１の組み合わせデータを選択し、前記第１励起光及び前記第２励起光の励起光強度を、この選択された組み合わせデータの励起光強度となるように、前記励起光調整部を制御する励起光強度制御手段、
   前記共焦点光学系により、前記励起光強度制御手段により制御された励起光強度である前記第１励起光及び前記第２励起光を、前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域とが重複領域を有するように、同時に前記試料に照射させた後、前記蛍光検出部により、前記第１励起光の照射に応じて前記試料から発生した第１蛍光と、前記第２励起光の照射に応じて前記試料から発生した第２蛍光とを別個に検出する蛍光検出手段、
   前記蛍光検出手段において検出された第１蛍光の蛍光強度及び第２蛍光の蛍光強度の、それぞれの自己相関関数及び相互相関関数を求める相関解析手段、
   前記相関解析手段により求められた相関関数から、前記第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、前記第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び前記第１共焦点領域と前記第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を算出する平均分子数算出手段、
   前記平均分子数算出手段において算出された第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）、第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）、及び第１共焦点領域と第２共焦点領域の重複領域中の平均分子数（Ｎ_１２）を用いて、前記第１標的分子と前記第２標的分子とのみかけの結合率を算出する結合率算出手段、
   前記結合率算出手段により算出されたみかけの結合率を、前記記憶部に、励起光強度制御手段において選択された組み合わせデータに対応させて記憶する結合率記憶手段、
   前記記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶されている場合に、全てのみかけの結合率データの中から最大値を決定する最大結合率決定手段、
   前記最大結合率決定手段において決定されたみかけの結合率データに対応する組み合わせデータにおける第１励起光及び第２励起光の励起光強度を、最適値とする励起光強度最適化手段、
   として機能させることを特徴とする蛍光相互相関分光装置用プログラム。
4. 前記記憶部に、
   一分子当たりの明るさの下限値を記憶する明るさ下限値記憶手段、
   前記相関解析手段において求められた相関関数と、前記平均分子数算出手段において算出された第１共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_１）及び第２共焦点領域中の平均分子数（Ｎ_２）とを用いて、前記第１共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさ及び前記第２共焦点領域中の標的分子の一分子当たりの明るさを算出する明るさ算出手段、
   前記明るさ算出手段により算出された一分子当たりの明るさを、前記記憶部に、励起光強度制御手段において選択された組み合わせデータに対応させて記憶する明るさ記憶手段、
   としてさらに機能させるものであり、
   前記最大結合率決定手段が、前記記憶部に全ての組み合わせデータに対応するみかけの結合率データが記憶されている場合に、対応する一分子当たりの明るさが、前記記憶部に記憶された下限値よりも大きい組み合わせデータを選抜し、これらの選抜された組み合わせデータに対応するみかけの結合率データの中から最大値を決定する手段であること、
   を特徴とする請求項３記載の蛍光相互相関分光装置用プログラム。

Images