CN103733047A - 目标粒子的检测方法 - Google Patents

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Abstract

该目标粒子的检测方法具有：(a)调制包含目标粒子、和与前述目标粒子结合的1种或2种以上的发光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使每1分子前述目标粒子与2分子以上的前述发光探针结合的工序；和(b)以每1粒子的光信号的强度作为指标通过扫描分子计数法计算工序(a)中调制的试样溶液中存在的、结合有发光探针的目标粒子的分子数的工序；前述发光探针为结合有同种发光物质的1种或2种以上的探针。

Description

目标粒子的检测方法
技术领域
本发明涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统来检测被发光探针标记的粒子的方法。本申请基于2011年8月11日在日本提交的日本特愿2011-175862号主张优先权，本文援引其内容。
背景技术
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光的微弱光。提出了使用前述微弱光的检测技术，进行生物分子等分子间相互作用或者结合/解离反应的检测的各种装置或方法。提出有例如，荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如，参照专利文献1、2和非专利文献1～3)。上述方法中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测定来自在试样溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积。)内出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度。另外，基于由该测定的荧光强度的自相关函数的值确定的、微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子的个数的平均值，能够取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息。此外，能够检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。此外，提出有利用荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如，专利文献3)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如，专利文献4)。上述方法中，生成与FCS同样检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图，对于该直方图的分布拟合统计学模型式。由此，算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和滞留于共焦体积内的分子的个数的平均值，根据这些信息，推测分子的结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献7中提出了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光粒子。
特别的是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度与现有的方法相比较，低浓度和微量就足够(每次测定使用的量为数十μL左右)。另外，根据上述方法，其测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此，特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够低廉且迅速地进行实验或检测。
另一方面，将作为检测对象的目标粒子用发光探针进行标记并通过FIDA等检测的方法中，试样溶液中与目标粒子结合的发光探针以及不与目标粒子结合的发光探针共存的情况下，重要的是能够将两者区别而检测。例如，专利文献8中公开有，使用用容易与自由基反应而褪色的荧光色素标记的发光探针，在防褪色剂的存在下进行FIDA。由此，在由与目标粒子结合的发光探针检测到的荧光强度、由不与目标粒子结合的发光探针检测到的荧光强度之间设置差异、将两者区别而检测的方法。
其他的，专利文献9中，作为放大来自发光探针的信号的方法，公开有例如利用配体与受体的结合反应，使多个发光探针结合到一个目标粒子的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2005-098876号公报
专利文献2:日本特开2008-292371号公报
专利文献3:日本专利第4023523号公报
专利文献4：日本国际公开2008-080417号公报
专利文献5:日本特开2007-20565号公报
专利文献6:日本特开2008-116440号公报
专利文献7:日本特开平4-337446号公报
专利文献8:日本特开2009-250721号公报
专利文献9:日本特开2000-106876号公报
非专利文献
非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。
非专利文献2：Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、R.Rigler著、Springer、柏林、2000年、第204～224页。
非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6巻、第2号、第271～277页。
发明内容
发明要解决的问题
上述的FCS、FIDA和PCH等光分析技术中，通过统计学处理计算所测量的荧光强度随时间波动的大小。另外，基于该波动的大小确定在试样溶液中的微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度需要调制成在平衡状态下在秒数量级长度的一次检测时间内有能够统计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内。试样溶液中的成为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度优选调制成在微小区域内经常地存在一个左右的荧光分子等(典型地，共焦体积的体积为1fL左右，所以荧光分子等的浓度优选为1nM左右或其以上。)。即，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅地低于能够统计学处理的程度时(例如，大幅地低于1nM时)，产生测量时间内只有稀少的观测对象物进入微小区域内的状态。因此，在荧光强度的测量结果中长期包括着观测对象物在微小区域内完全不存在的状态，显著的荧光强度的观测量变少。因此,通过如上述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。
专利文献5、6中记载的、使用共聚焦显微镜的光学系统的荧光性物质的检测方法中，不进行如上述的涉及荧光强度的波动的统计学处理。专利文献5和6中公开有，根据数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，判断试样中的成为观测对象的荧光分子等的有无，而得到显著强度的荧光信号的频率与试样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献6中，提出了产生搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，即便是这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地进入微小区域内的荧光分子等的存在，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为。因此，专利文献5和6中，没有实现例如粒子的计数、定量地算出粒子的浓度或数密度。此外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒的存在的技术，而不是用于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等的粒子，即不是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术。即，专利文献7中，并没有实现定量地计算在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度。另外,专利文献7的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程。因此,检测所需要的试样量远大于FCS、FIDA、和PCH等光分析技术所需要的试样量,并且对实施者要求复杂的高难度的操作技术。
另外，将试样溶液中的目标粒子用发光探针标记并使用荧光测定技术进行检测的方法中，不需要在测定前预先从试样溶液中去除游离的发光探针。因此，优选能够将与目标粒子结合的发光探针、和不与目标粒子结合的发光探针区别而进行检测。然而，专利文献8记载的方法中，存在能够使用的荧光物质受限的问题。
本发明的方式目的在于提供：即便在试样溶液中与目标粒子结合的发光探针以及不与目标粒子结合的发光探针共存的情况下也能够检测目标粒子的方法。本发明的方式的方法使用具有以下所示的特征的新型的光分析技术。即，本光分析技术不包含如FCS、FIDA、PCH等现有的光分析技术中实行的统计学处理。因此，本光分析技术能够检测观测对象粒子的浓度或数密度低于这些现有的光分析技术中处理水准的试样溶液中的观测对象粒子的状态或特性。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行深入研究，结果完成了以下这样的本发明。在由与粒子结合后的发光探针发出的光作为指标间接地检测试样溶液中分散并随机运动的粒子的情况下，使用扫描分子计数法进行结合有发光探针的粒子的检测。由此，在试样溶液中的观测对象的粒子的浓度非常低的情况下，也能够灵敏度良好地检测结合有发光探针的粒子。进一步，使观测对象粒子上结合多个发光探针。由此，不必从试样溶液中预先去除不与目标粒子结合的游离的发光探针，也能够将与目标粒子结合后的发光探针和游离的发光探针区别检测。
扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中由本申请的申请人提出的新型光分析技术。
即，本发明中具有以下的方式。
(1)一种目标粒子的检测方法，其为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有：
(a)调制包含目标粒子、和与前述目标粒子结合的1种或2种以上的发光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使每1分子前述目标粒子与2分子以上的前述发光探针结合的工序；和
(b)计算前述工序(a)中调制的试样溶液中存在的、结合有发光探针的目标粒子的分子数的工序，
前述发光探针为结合有同种发光物质的1种或2种以上的探针，
前述工序(b)中的结合有发光探针的目标粒子的分子数的计算具备：使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光检测区域中的粒子发出的荧光的工序；
由前述检测到的光逐个检测来自每个粒子的光信号而逐个检测粒子的工序；
以前述逐个检测到的粒子的光信号的强度作为指标，只计数每1粒子包含有2分子以上前述发光探针的粒子而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述目标粒子的个数的工序。
(2)根据前述(1)所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以规定的速度移动。
(3)根据前述(1)或(2)所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以比前述结合有发光探针的目标粒子的扩散移动速度更快的速度移动。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的目标粒子的检测方法，在由前述检测到的光检测来自每个结合有发光探针的目标粒子的光信号而逐个检测前述结合有发光探针的目标粒子的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状来检测一个结合有发光探针的目标粒子进入了前述光检测区域。
(5)根据前述(1)～(4)的任一项所述的目标粒子的检测方法，前述发光探针包含与前述目标粒子结合的标记用探针、和与每1分子前述标记用探针结合的1或2分子以上的发光物质。
发明的效果
本发明方式的目标粒子的检测方法中应用的扫描分子计数法不实行计算荧光强度的波动这样的统计学处理。因此，通过本发明的方式的目标粒子的检测方法，即便试样中仅极微量地存在作为解析对象的目标粒子时，也能够检测试样中的前述目标粒子。进而，本发明的方式的目标粒子的检测方法中，每1分子与目标粒子结合后的发光探针的发光强度大于每1分子游离的发光探针的发光强度。因此，在利用扫描分子计数法测定前不预先从试样溶液中去除游离的发光探针也能够将与目标粒子结合后的发光探针与游离的发光探针区别而检测。
附图说明
图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。
图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。
图1C是改变镜的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。
图2A是说明基于用于扫描分子计数法的光分析技术的光检测原理的示意图。
图2B是图2A中测量的光强度的时间变化的示意图。
图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的模式图。
图3B是表示图3A的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图4A是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。
图4B是表示图4A的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图5是以流程图的形式显示根据扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。
图6A是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图7表示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、和将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域中拟合的高斯函数(实线)。图中，带有“噪音”的信号作为由噪音或杂质带来的信号被无视。
具体实施方式
首先，对扫描分子计数法进行说明。一边通过微小区域扫描试样溶液内，一边当在试样溶液中分散并随机运动的发出光的粒子(以下，称为“发光粒子”。)横穿微小区域内。此时检测由微小区域中的发光粒子发出的光。由此，能够一个一个逐个检测试样溶液中的发光粒子，获得与发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的相关信息。上述技术中，与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的试样可以是微量(例如，数十μL左右)。另外，测定时间短。另外，与FIDA等光分析技术相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，可以定量检测其浓度或数密度等特性。
需要说明的是，发光粒子是指通过荧光、磷光、化学发光、生物发光以及光散射等发出光的粒子。本实施方式的目标粒子的检测方法中，目标粒子与发光探针结合而成的物质为发光粒子。
本实施方式中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域。当由物镜提供照明光时，“光检测区域”相当于该照明光聚光的区域。需要说明的是，在共聚焦显微镜中，前述区域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。
边在试样溶液内移动光检测区域的位置、即通过光检测区域扫描试样溶液内边逐次地进行光的检测。当移动的光检测区域包含了与随机运动的粒子结合或缔合的发光探针时，检测到来自发光探针的光。由此，检测到一个粒子的存在(根据实验的方式，也包含如下情况：发光探针与希望检测的粒子(目标粒子)暂时结合后，在进行光的检测时与粒子解离。)。接着，在逐次检测到的光中逐个检测来自发光探针的光信号。由此，一个一个地逐个逐次地检测(结合有发光探针的)粒子的存在，能够得到关于粒子在溶液内的状态的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中，可以计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子的个数(粒子的计数)。根据前述构成，通过组合粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算粒子的数密度或浓度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，也可以计算相对于多个试样溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度之比。另外，扫描分子计数法中，采用改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成。由此，光检测区域的移动是迅速的，并且在试样溶液中实质上不产生机械振动、流体力学的作用。因此，作为检测对象的粒子不受力学的作用的影响，能够在稳定的状态下进行光的测量(试样溶液中受到振动或流动作用时，粒子的物理性质存在变化的可能性。)。并且，使试样溶液流通的构成不是必要的。所以，与FCS、FIDA等情况同样地，能够以微量(1～数十μL左右)的试样溶液进行测量和分析。
在上述的逐个地检测粒子的工序中，由逐次检测到的光信号判断与一个粒子结合后的发光探针(包括：一个发光探针与一个粒子结合的情况；多个发光探针与一个粒子结合的情况；以及根据实验方式的、与一个粒子结合之后从粒子解离的发光探针的情况。以下同样)是否进入光检测区域，可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。本实施方式中，典型地，当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，可以检测到与一个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。
此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合后的发光探针的特性或试样溶液中的数密度或浓度，适当改变试样溶液内部的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解，由与粒子结合后的发光探针所检测到的光的形态，可能会根据其特性或试样溶液中的数密度或浓度而改变。特别是，光检测区域的移动速度过快时，由与一个粒子结合后的发光探针得到的光量降低。因此，为了精度良好或灵敏度良好地测量来自与一个粒子结合后的发光探针的光，优选适当地改变光检测区域的移动速度。
进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，优选将试样溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合后的发光探针(即，本发明的目标粒子的检测方法中，与目标粒子结合的状态的发光探针)的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如前所述，扫描分子计数法中，当光检测区域通过存在有与一个粒子结合后的发光探针的存在位置时，检测由该发光探针发出的光而逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合后的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，多次检测到来自一个发光探针(表示希望检测的粒子存在)的光信号。因此，难以将检测到的光信号与一个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合后的发光探针的扩散移动速度(具体而言，设定为以比与目标粒子结合后的状态的发光探针的扩散移动速度快的速度移动)。由此，能够使与一个粒子结合的发光探针对应于一个(表示粒子的存在的)光信号。需要说明的是，扩散移动速度根据与粒子结合后的发光探针而变化。因此，优选根据与粒子结合后的发光探针的特性(特别是，扩散常数)适宜变更光检测区域的移动速度。
可以以任意方式，进行用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路改变。
例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜改变光路，使光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，也可以选自例如圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。
扫描分子计数法，对于其光检测机理自身，与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成。因此，试样溶液的量同样可以为微量。然而，扫描分子计数法中，不实施计算荧光强度的波动这样的统计学处理。因此，扫描分子计数法的光分析技术可以适用于粒子的数密度或浓度比FIDA等光分析技术所需要的水平大幅地低的试样溶液。
另外，扫描分子计数法中，在溶液中分散或溶解的每个粒子被逐个检测出。因此，使用该信息，可以定量地进行粒子的计数、试样溶液中的粒子的浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描分子计数法使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应而一个一个地检测粒子。因此，能够计数溶液中分散并随机运动的粒子。另外，与现有方法相比较，能够精度良好地确定试样溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测与目标粒子结合的状态的发光探针并计数其数目、确定粒子浓度的本实施方式的目标粒子的检测方法，即使试样溶液中的与目标粒子结合的发光探针的浓度是比通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够检测目标粒子。
进一步，根据改变光学系统的光路、利用光检测区域扫描试样溶液中的方式，不对试样溶液产生机械振动或流体力学作用，使试样溶液内部在均匀的状态或试样溶液机械上稳定的状态下进行观察。因此，与例如使试样产生流动的情况(赋予流动的情况下难以恒常地赋予同样的流速，并且装置构成变得复杂，还有需要的试样量大幅地增大，并且由于流动导致的流体力学的作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的可能性。)相比较，定量的检测结果的可靠性提高。另外，对于试样溶液中的成为检测对象的粒子，能够在没有力学作用的影响下或没有人为影响的状态下进行测量。
＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞
可以通过在基本的构成中如图1A中示意性的示例那样组合能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器而构成的光分析装置实施扫描分子计数法。如图1A所示，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控制光学系统的各部分的行为并获得数据、分析该数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样。上述光学系统中，自光源2放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA规定的角度放射为发散的光，通过准直仪4成为平行光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置有分注了1～数十μL的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微孔板9。自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中，分散或溶解有作为观测对象物的粒子、与前述粒子结合的发光探针、以及带有发光标记（典型地为荧光色素等）的分子。与发光探针结合或缔合的粒子(根据实验的方式，与粒子暂时结合后从粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其间被激发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜11处反射，在聚光镜12处聚光。之后，聚光的光(Em)通过小孔13，透过二次滤片14(此处，只选择特定的波长频带的光成分。)被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的电信号。之后，转换的电信号被输入至计算机18，之后按照后面说明的方式实施用于光分析的处理。需要说明的是，在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上。由此，如图1B所示，仅自激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1～10fL左右的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯型分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的略椭球体的体积。)。上述焦点区域被称为共焦体积。另外，扫描分子计数法中，检测到来自一个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱光。因此，光检测器16优选使用能够用于光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，为了改变成为观测对象的孔10，在显微镜的平台(没有图示)上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过前述构成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。
进一步，上述的光分析装置的光学系统中，设置有改变光学系统的光路、通过光检测区域扫描试样溶液内部的、即用于在试样溶液内移动焦点区域(即，光检测区域)的位置的机构。该用于移动前述光检测区域的位置的机构，例如如图1C所示，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17。镜转向器17也可以是装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置。另外，为了实现所希望的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18的控制下，与通过光检测器16的光检测协调而被驱动。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合(可以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。)。需要说明的是，图中没有显示但也可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移动。根据不移动试样溶液而改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成，试样溶液内实质上不发生机械振动、流体力学的作用。因此，能够排除对于观测对象物的力学作用的影响，能够进行稳定的测量。
当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，所以可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2～5。当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。进而，光分析装置1中可以设置多个激发光源2。另外，也可以根据用于将粒子与发光探针的结合体或者发光探针激发的光的波长适宜选择激发光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16。另外，当试样中包含波长不同的多种粒子与发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别检测来自它们的光。
＜扫描分子计数法的光分析技术的原理＞
FIDA等分光分析技术与现有的生物化学分析技术相比，必需的试样量非常少这一点以及可以快速实施检查这一点优异。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。因此，为了获得精度良好的检测结果，要求试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果当观测对象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当观测对象粒子只是偶尔进入光检测区域CV内的水平时，仅在一部分测量时间内出现显著的光强度(光子计数)。因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的浓度大幅地低于测量中通常在光检测区域内存在一个左右的观测对象粒子的水平时，光强度波动的运算易受背景的影响。由此，为了获得对运算而言为充分量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的浓度低于FIDA等分光分析技术要求的水平时，用扫描分子计数法也能够检测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。
扫描分子计数法的光分析技术中，作为实行的处理，驱动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置一边实施光检测。即，一边利用光检测区域CV扫描试样溶液内一边实施光检测。该情况下，例如，如图2A所示，在光检测区域CV移动期间(图中，时间t0～t2)，当通过存在有1个粒子(图中，发光探针结合有荧光色素。)的区域时(t1)，检测到如图2B所示的显著的光强度(Em)。实行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测从而一个一个地检测在此期间出现的显著的光强度。由此，逐个检测出结合有发光探针的粒子，计数其个数。结果，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密度相关的信息。前述扫描分子计数法的光分析技术的原理中，粒子一个一个地被检测出且不进行如荧光强度波动的计算这类统计学运算处理。因此，即便是欲观测的粒子浓度低至无法用FIDA等以充分精度分析程度的试样溶液，也能够得到关于粒子的浓度或数密度的信息。
另外，通过扫描分子计数法这类逐个检测、计数试样溶液中的粒子的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，能够测定至更低的浓度。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而，该情况下，被荧光标记的粒子的浓度充分地降低时，噪音信号的量相对于由被荧光标记的粒子发出的光的信号量变大(S/N比恶化)，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解。结果，确定的浓度值的精度恶化。扫描分子计数法在由被检测的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中排除了噪音信号，只将对应于各个粒子的信号进行计数而计算浓度。因此，与通过假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更低的浓度。
另外，当一个观测对象粒子结合有多个发光探针时，与传统的假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而确定浓度的现有方法相比，扫描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，粒子浓度高一侧的粒子浓度的测量精度提高。在一个观测对象粒子结合有多个发光探针的情况下，向试样溶液添加规定量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每一个观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解。结果，确定的浓度值的精度恶化。扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光强度的降低的影响少，由粒子数计算浓度。因此，与通过假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更高的浓度。
＜通过扫描分子计数法的试样溶液的光强度的测定＞
就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，在测定中驱动镜转向器17，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)。其他的处理，可以按照与FCS或FIDA中的光强度的测定工序同样的方式实施。在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜的平台上。之后，使用者对计算机18输入测定开始的指示，计算机18根据存储装置(没有图示)存储的程序(将用于在试样溶液内移动光检测区域的位置的光路进行改变的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的次序)，开始试样溶液内光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。前述测量中，在根据计算机18的程序的处理操作的控制下，镜偏向器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动。与此同时，光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18。计算机18以任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器。因此，光的检测是以如下方式实施的光子计数：在规定时间内，间隔规定的单位时间(BINTIME)如每10μ秒逐次地测量到达光检测器的光子的个数。另外，按照时间顺序的光强度的数据可以为按照时间顺序的光子计数数据。
光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意的，可以为按照适合例如实验或分析目的的方式设定的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的个数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的。因此，以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系的方式，能够容易地解释测定结果。因此，移动速度基本上优选为恒定速度，但并非仅限于此。
此外，对于光检测区域的位置移动的速度，为了以良好的精度由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒子、或定量实施观测对象粒子数的计数，优选将前述的移动速度设定为比观测对象粒子(更严密地，粒子与发光探针的结合体或者与粒子结合后分解而游离的发光探针、本实施方式中为结合有发光探针的目标粒子)的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。扫描分子计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子。因此，由于布朗运动，位置伴随着时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图3A所示，粒子在区域内随机地移动。由此，如图3B所示，光强度随机地变化(光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)，难以确定对应于各个观测对象粒子的显著的光强度的变化。因此，优选如图4A所示那样粒子略直线地横穿光检测区域。由此，如图4B例示，按照时间顺序的光强度数据中，对应于各个粒子的光强度变化的分布图大致一致(粒子略直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的曲线与激发光强度分布几乎相同。)。即，将光检测区域的位置的移动速度设定为快于粒子的布朗运动导致的平均的移动速度(扩散移动速度)以使每个观测对象粒子与光强度的对应能够容易地确定。
具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解、游离的发光探针)通过半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间Δt是由均方位移的关系式、下述式(1)和(2)得到的。
(2Wo)2=6D.Δt…(I)
Δt=(2Wo)2/6D…(2)
观测对象粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif由下述式(3)得到。
Vdif＝2Wo/Δt=3D/Wo…(3)
光检测区域的位置的移动速度可以参考Vdif而设定为比之更快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，当Wo为0.62μm左右时，则Vdif为1.0×10-3m/s。因此，光检测区域的位置的移动速度设定为其大约10倍的15mm/s即可。需要说明的是，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验。其结果是可以确定合适的光检测区域的位置的移动速度。
＜通过扫描分子计数法的光强度的分析＞
经上述处理获得试样溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算机18中，根据存储在存储装置中的程序进行处理(由检测到的光逐个检测来自各个发光粒子的光信号的次序)，由此实施下述的光强度的分析。
(i)一个观测对象粒子的检测
在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4A所示的几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A所示，具有(由光学系统确定的)反映光检测区域的光强度分布的曲线(通常略呈钟形)。观测对象粒子的检测手法之一中，对于光强度设定阈值Io。超过阈值Io的光强度持续时间宽度Δτ在规定的范围时，也可以判定为该光强度的分布图与一个粒子通过光检测区域相对应，检测到一个观测对象粒子。针对光强度的阈值Io以及针对时间宽度Δτ的规定的范围是根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的光的强度而预想的曲线确定的；所述观测对象粒子相对于光检测区域以规定的速度相对地移动。具体的值可以根据实验任意地设定，此外也可以根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的特性而选择确定。
此外，作为观测对象粒子的检测的其他方法，光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时满足下述式(4)。
I=A·exp(-2t2/a2)…(4)
对显著的光强度的曲线(可以明确判断为非背景的曲线)，拟合式(4)计算强度A和宽度a。计算的强度A和宽度a在规定的范围内时，该光强度的曲线可判断为对应一个观测对象粒子通过了光检测区域，可以进行一个观测对象粒子的检测(强度A和宽度a在规定范围外时，可以在分析中作为噪音或异物而无视。)。
(ii)观测对象粒子的计数
观测对象粒子的计数可以如下进行：通过任意方法计数通过上述观测对象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较大时，也可以通过例如图5和图6B所示的处理来进行。
如图5和图6B所示，在根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子数的方法的一个例子中，在通过上述说明的光强度测定、即用光检测区域扫描试样溶液内和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数数据)后(步骤100)，对前述按照时间顺序的光信号数据(图6B的“检测结果(未处理)”)，进行SMOOTHING(平滑化)处理(步骤110，图6B的“SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率地发出的，所以在微小的时间内存在数据值产生欠缺。因此，通过前述平滑化处理，可以无视如前述的数据值的欠缺。平滑化处理可以例如通过移动平均法而进行。需要说明的是，可以根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当设定实施平滑化处理时的参数(例如，在移动平均法中一次取平均的数据点数或移动平均的次数等)。
然后，为了检测在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中存在显著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值如图6B的“时间微分”所示，信号值变化时间点处的值的变化变大。因此，通过参照前述时间微分值，能够有利地确定显著的信号(峰信号)的起点和终点。
之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)，判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。
具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索、确定一个峰信号的起点和终点，从而确定峰存在区域(步骤130)。一旦确定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合(图6B的“钟形函数拟合”)。结果，计算钟形函数的峰强度Imax、峰宽度(半高全宽(full width half maximum))w、和拟合中的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。由此，判断计算的钟形函数的参数是否落在一个粒子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内。即，峰强度、峰宽度、和相关系数是否分别落在规定范围内等(步骤150)。如图7左侧所示，计算的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号。由此，判断为检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。工序160)。另一方面，如图7右侧所示，将计算的钟形函数的参数没有在预定范围内的峰信号作为噪音而无视。
上述的步骤130～160的处理中的峰信号的搜索和判定可以在按照时间顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行，每检测到一个观测对象粒子则作为粒子而计数。并且，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后(步骤170)，可以将目前为止所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的观测对象粒子的个数。
(iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定
进行了观测对象粒子的计数后，使用在获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、或者光学系统的调整状态而改变。因此，通常难以由设计值计算光检测区域的实际体积。另外，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。因此，典型的是，可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液(参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数。根据检测到的粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。
作为参照溶液的粒子，可以优选为与观测对象粒子所形成的粒子与发光探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则根据下述式(5)求出。
Vt＝N/C…(5)
另外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将计算的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用即可。因此，一旦获得Vt值，粒子的计数结果为n的试样溶液的粒子的数密度c就根据下述式(6)求出。
c＝n/Vt…(6)
需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。此外，本实施方式的光分析装置中，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子的个数N之间的关系(式(5))的信息预先存储在计算机18的存储装置中。由此，装置的使用者在实施光分析时可以适当利用存储的关系信息。
＜目标粒子的检测方法＞
本实施方式的目标粒子的检测方法为检测试样溶液中分散并随机运动的目标粒子的方法。按照使试样溶液中的目标粒子每1分子的发光强度大于游离的发光探针的方式使试样溶液中的目标粒子与发光探针结合而进行标记。之后，通过扫描分子计数法检测结合有发光探针的目标粒子。扫描分子计数法为能够在分子离散的状况下测定每一粒发光粒子的测定方法。即，对于pM级以下的浓度比较低的发光粒子也能够进行测定。因此，通过本实施方式的目标粒子的检测方法，即使当试样溶液中的解析对象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数结合有发光探针的目标粒子。进而，本实施方式的目标粒子的检测方法中，每1分子与目标粒子结合后的发光探针的发光强度大于每1分子游离的发光探针的发光强度。因此，在利用扫描分子计数法测定前不预先从试样溶液中去除游离的发光探针也能够将与目标粒子结合后的发光探针以及游离的发光探针区别而检测。
具体而言，本实施方式的目标粒子的定量方法具备下述工序(a)～(b)。
(a)调制包含目标粒子、和与前述目标粒子结合的1种或2种以上的发光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使每1分子前述目标粒子与2分子以上的前述发光探针结合的工序；
(b)计算前述工序(a)中调制的试样溶液中存在的、结合有发光探针的目标粒子的分子数的工序。
以下，对于每个工序进行说明。
首先，作为工序(a)，调制包含目标粒子、和与前述目标粒子结合的1种或2种以上的发光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使每1分子前述目标粒子与2分子以上的前述发光探针结合。
本实施方式中，“在试样溶液中分散并随机运动的粒子”是指在试样溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的或不发光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。
目标粒子为在试样溶液中分散并随机运动的粒子，是在前述试样溶液中成为检测目标的粒子。作为目标粒子，可列举出例如：蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如：原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，可列举出例如：桥式核酸(BNA,Bridgednucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(Hexitol NucleicAcid，HNA)、或肽核酸(PNA)等。
另外，本实施方式中使用的发光探针为具有与目标粒子特异地或非特异地结合或吸附的部位并且发光的物质。发光探针可以通过例如使与目标粒子特异地或非特异地结合或吸附的物质(标记用探针)结合发光物质而制造。作为发光物质，典型地为荧光性物质，但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、或者光散射等发出光的物质。
作为荧光物质，只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可，没有特别的限定。可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素、量子点中适当的选择使用。本实施方式中，从能够更高灵敏度地检测的优点出发，优选使用荧光物质作为发光物质。
例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，发光探针可列举出：使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质等发光物质而成的物质、结合有荧光物质等发光物质的核酸结合性蛋白质、或者与核酸结合的色素分子等。作为前述寡核苷酸,可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质，还可以为包含部分或全部核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。另外，目标粒子为蛋白质的情况下，作为发光探针，可以使用将目标粒子的抗原或抗体、或者目标粒子的配体或受体用荧光物质等发光物质标记了的物质。需要说明的是，与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质与发光物质的结合可以通过常规方法进行。
发光探针既可以为标记用探针与发光物质通过共价键等直接结合而成的物质，也可以为标记用探针与发光物质通过抗原抗体反应、或配体与受体的结合反应等特异的结合反应结合而成的物质。例如，可以将使与生物素结合的标记用探针、与和链亲合素结合的发光物质通过生物素-链亲合素结合反应结合而成的物质用作发光探针。更具体而言，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以将与目标粒子杂交的寡核苷酸与生物素结合的物质、与和链亲合素结合的发光物质结合而成的物质用作发光探针。另外，目标粒子为蛋白质的情况下，可以将对应于目标粒子的配体或受体与生物素结合的物质、与和链亲合素结合的发光物质结合而成的物质用作发光探针。
发光探针可以为1分子的标记用探针与1分子的发光物质通过特异的结合反应结合的物质，也可以为1分子的标记用探针与2分子以上的发光物质通过特异的结合反应结合的物质。例如，作为发光探针，可以是使具有1处生物素部位的标记用探针与和链亲合素结合的发光物质通过生物素-链亲合素结合反应结合而成的物质。另外，作为发光探针，也可以是具有2处以上生物素部位的标记用探针与和链亲合素结合的发光物质结合而成的物质。
本实施方式中使用的发光探针也可以为与目标粒子非特异地结合等的物质，从目标粒子的检测/定量的精度的优点出发，优选特异地结合等的物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的发光探针，只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可。即，前述发光探针不需要是与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物质。例如，目标粒子为核酸的情况下，被作为发光探针使用的发光物质标记的寡核苷酸既可以具有与前述目标粒子的碱基序列完全地互补的碱基序列，也可以具有与前述目标粒子的碱基序列包含错配的碱基序列。
本实施方式中使用的发光探针可以为一种也可以为两种以上。其中，试样溶液中所添加的全部发光探针通过同种发光物质而发光。例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以一起使用：与目标粒子杂交的第1寡核苷酸与荧光物质等发光物质结合而成的第1发光探针；以及在与前述第1寡核苷酸不同的区域与前述目标粒子杂交的第2寡核苷酸、与和前述第1发光探针同种的发光物质结合而成的第2发光探针。该情况下，试样溶液中的目标粒子以第1发光探针和第2发光探针与目标粒子结合而成的粒子形式存在。即，包含目标粒子的粒子中含有每1粒子2分子的发光物质。因此，通过扫描计数法，由包含目标粒子的粒子能够检测到比游离的第1发光探针和第2发光探针强的光信号。
具体而言，工序(a)首先向适当的溶剂中添加目标粒子和1种或2种以上的发光探针而调制试样溶液。前述溶剂只要是不阻碍由与目标粒子结合后的发光探针发出的光的检测、以及不阻碍利用扫描分子计数法的与目标粒子结合后的发光探针的检测的溶剂，就没有特别的限定。作为前述溶剂，可以从前述技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为前述缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
只是使目标粒子与发光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的情况下，调制试样溶液之后，根据需要以规定时间孵育试样溶液。只进行上述方法就能使目标粒子与发光探针在前述试样溶液中结合。
另一方面，目标粒子、发光探针为双链结构的核酸或者核酸类似物质的情况下，优选使试样溶液中的核酸等变性之后使两者缔合。需要说明的是，“使核酸或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，使分子信标探针中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。需要说明的是，当发光探针是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变性处理也可以形成包含前述发光探针和目标粒子的缔合体。
作为变性处理，可列举出：利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。作为前述变性处理，从对于荧光物质等发光物质的影响比较小且操作简便的优点出发，优选进行热变性。具体而言，热变性通过将前述试样溶液进行高温处理而使前述试样溶液中的核酸等变性。通常地，可以通过使DNA在90℃、RNA在70℃下进行数秒钟至2分钟左右的保温而使之变性。然而，根据目标粒子的碱基的长度等变性的温度不同。因此，只要能够变性，对于该温度就没有限定。另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将前述试样溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。
根据需要使之变性之后，使前述试样溶液中的目标粒子与发光探针缔合。
当进行热变性时，在高温处理后，使前述试样溶液的温度降至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的温度。由此能够使前述试样溶液中的两者适当缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使前述试样溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的浓度。由此能够使前述试样溶液中的两者适当缔合。
需要说明的是，可以根据两者的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向低温变化，测定前述溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。
通常可以用Tm值(熔解温度)，代替两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等。由此，根据发光探针的碱基序列信息，能够计算与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。
此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使试样溶液的温度较缓慢地下降。例如，使试样溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低前述试样溶液的液温。
此外，为了抑制非特异地杂交，优选预先在试样溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够使非特异的杂交难以发生。
之后，作为工序(b)，通过扫描分子计数法计数调制的试样溶液中存在的、结合有发光探针的目标粒子的分子数。具体而言，将目标粒子与发光探针结合后的试样溶液设置于用于前述的扫描分子计数法的光分析装置，通过前述的手法检测由与目标粒子结合状态的发光探针发出的光并解析，由此计数结合有发光探针的目标粒子的个数。计数的目标粒子数为测定试样中所含的目标粒子的个数。
试样溶液中的目标粒子每1分子结合有2分子以上的发光探针。因此，结合有发光探针的目标粒子的每1粒子的光信号的强度强于游离的发光探针(即，具有每1粒子1分子的发光探针的粒子)。因此，将光信号的强度作为指标，能够区别检测到的每个粒子是结合有发光探针的目标粒子、还是游离的发光探针。通过只将每1粒子包含2分子以上发光探针的粒子计数，能够计数目标粒子的个数。例如，预先调制只包含发光探针的溶液，利用扫描分子计数法计数前述溶液中的发光探针的分子数。由此，测定每一分子游离的发光探针的光信号的强度，以不包含由游离的发光探针检测到的光信号强度的方式设定适当的阈值，而能够只计数目标粒子。
实施例
接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于下列实施例。
(实施例1)
使用每1分子具有多个生物素化部位的物质作为目标粒子、使用结合有链亲合素的量子点作为发光探针，利用扫描分子计数法检测试样溶液中的目标粒子。
＜将双链核酸分子作为目标粒子的情况＞
将每1分子具有多个生物素化部位的双链核酸分子作为目标粒子。
具体而言，使用包含生物素标记dCTP的dNTP、和作为模板的质粒pUC19进行PCR，使用800bp的PCR产物作为目标粒子。更详细而言，前述PCR使用TaKaRa ExTaq(TAKARA BIO INC.制)作为耐热性聚合酶，在如下温度循环条件下进行：95℃下进行5分钟处理之后，进行在95℃下30秒、50℃下30秒、68℃下1分钟的热循环40循环，进而在68℃下进行10分钟处理。得到的PCR产物使用Wizard SV Clean Up Kit(promega公司制)进行纯化。将纯化的PCR产物使用电泳系统(Agilent公司制)进行电泳，以换算的浓度为基础，将被检体调制成2nM。
将得到的PCR产物与20nM的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655溶液(将链亲合素结合型的Qdot(注册商标)655(Invitrogen公司制)用STEP缓冲液稀释。)以1：1(体积比)进行混合而调制试样溶液。将前述试样溶液静置30分钟之后使用STEP缓冲液稀释50倍之后再稀释20倍，对其利用扫描分子计数法进行测定。
另外，以将前述链亲合素结合型Qdot(注册商标)655溶液用STEP缓冲液同样地稀释而成的溶液作为对照进行测定。
具体而言，在检测中，使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的1分子荧光测定装置MF20(Olympus Corporation)作为光分析装置，对于上述的各试样溶液，获得按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光使用488nm的激光以300μW进行照射，检测光波长使用带通滤波器设为650nm～690nm。从雪崩光电二极管获得的信号的BIN TIME设为10μ秒，测定时间为20秒。
用Savinzky-Golay算法将由测定获得的按照时间顺序的数据进行平滑化以后，通过微分进行峰检测。从被视为峰的区域中，提取可以拟合为高斯函数的区域作为信号。
将测定结果示于表1。表1中，“Qdot Ref”为仅链亲合素结合型Qdot(注册商标)655溶液的测定结果；“xBiotin-PCR”为测定包含前述PCR产物与链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的试样溶液的结果。其结果，1分子中具有多个生物素化部位且每1分子与多个链亲合素结合型Qdot(注册商标)655结合的前述PCR产物，与游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655相比较，能够得到强的信号，观察到两者存在明显的强度差。即，可知能够区别地检测游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655、和结合有链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的前述PCR产物。
[表1]
光子数 峰数 最大光信号强度
Qdot Ref 70330 57 2.40
xBiotin-PCR 112155 1608 12.58
＜以葡聚糖作为目标粒子的情况＞
将每1分子具有多个生物素化部位的生物素化葡聚糖(Invitrogen公司制)作为目标粒子。
具体而言，分别向PBS缓冲液中添加生物素化葡聚糖以使最终浓度成为1nM，添加链亲合素结合型Qdot(注册商标)655(Invitrogen公司制)以使最终浓度成为10nM而调制试样溶液。将前述试样溶液静置30分钟之后使用PBS缓冲液稀释100倍(链亲合素结合型的Qdot(注册商标)655的浓度：10pM)，利用扫描分子计数法对其进行测定。
另外，以将不添加生物素化葡聚糖而只添加了前述链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的溶液用PBS缓冲液同样地稀释而成的溶液作为对照进行测定。
利用扫描分子计数法的测定与前述的将双链核酸分子作为目标粒子的情况同样地进行。
将测定结果示于表2。表2中，“QdotRef”为仅链亲合素结合型Qdot(注册商标)655溶液的测定结果；“xBiotin-Dex”为测定包含生物素化葡聚糖和链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的试样溶液的结果。其结果，1分子中具有多个生物素化部位且每1分子与多个链亲合素结合型Qdot(注册商标)655结合的生物素化葡聚糖，与游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655相比较，能够得到强的信号，观察到两者存在明显的强度差。即，可知能够区别地检测游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655、和结合有链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的生物素化葡聚糖。
[表2]
光子数 峰数 最大光信号强度
Qdot Ref 70330 57 2.40
xBiotin-Dex 81733 178 7.27
＜将光信号强度的阈值设为3.0的情况＞
由于游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的光信号强度的最大值为2.40，所以将光信号强度的阈值设为3.0，只将3.0以上的峰数作为结合有发光探针(链亲合素结合型Qdot(注册商标)655)的目标粒子(前述PCR产物、或生物素化葡聚糖)而计数。将计数结果示于表3中。其结果，相比于作为对照的只包含链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的溶液，前述包含PCR产物或生物素化葡聚糖和链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的溶液，得到光信号强度为3以上的峰的频率高。
[表3]
峰数 SD
Qdot Ref 0 -
xBiotin-PCR 64 16
xBiotin-Dex 39 9
(实施例2)
使用每1分子具有2处生物素化部位的生物素化葡聚糖(Invitrogen公司制)作为目标粒子、使用结合有链亲合素的量子点作为发光探针，利用扫描分子计数法检测试样溶液中的目标粒子。
具体而言，分别向PBS缓冲液中添加生物素化葡聚糖以使最终浓度成为2nM，添加链亲合素结合型Qdot(注册商标)655(Invitrogen公司制)以使最终浓度成为10nM而调制试样溶液。将前述试样溶液静置30分钟之后，使用PBS缓冲液稀释1000倍，利用扫描分子计数法对其进行测定。
另外，以将不添加生物素化葡聚糖而只添加了前述链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的溶液用PBS缓冲液同样地稀释而成的溶液作为对照进行测定。
利用扫描分子计数法的测定除了以1mW照射激发光以外，与实施例1同样地进行。
将测定结果示于表4。表4中，“QdotRef”为仅链亲合素结合型Qdot(注册商标)655溶液的测定结果；“xBiotin-Dex”为测定包含生物素化葡聚糖和链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的试样溶液的结果。其结果，1分子中具有2处生物素化部位且每1分子结合有2分子链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的生物素化葡聚糖，与游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655相比较，能够得到2倍程度的强信号，观察到两者存在明显的强度差。即，可知能够区别地检测游离的链亲合素结合型Qdot(注册商标)655、和结合有链亲合素结合型Qdot(注册商标)655的生物素化葡聚糖。
[表4]
光子数 峰数 最大光信号强度
Qdot Ref 13295 19 6.37
xBiotin-Dex 12141 16 13.64
产业上的可利用性
根据本发明的目标粒子的检测方法，能够通过扫描分子计数法测定在试样溶液中仅以非常低浓度存在的目标粒子的浓度，所以本发明的目标粒子的检测方法能够利用于临床被检体等解析对象物质的浓度为微量的试样的解析/检查等领域中。
附图标记说明
1 光分析装置(共聚焦显微镜)
2 光源
3 单模光纤
4 准直仪透镜
5 分色镜
6、7、11 反射镜
8 物镜
9 微孔板
10 孔(试样溶液容器)
12 聚光镜
13 小孔
14 二次滤片
15 多模光纤
16 光检测器
17 镜转向器
17a 平台位置变化装置
18 计算机

Claims (5)

1.一种目标粒子的检测方法，
其为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具备：
(a)调制包含目标粒子、和结合有同种发光物质的与所述目标粒子结合的1种或2种以上的发光探针的试样溶液，在所述试样溶液中，使每1分子所述目标粒子与2分子以上的所述发光探针结合的工序；
(b)计算所述工序(a)中调制的试样溶液中存在的、结合有发光探针的目标粒子的分子数的工序；
所述工序(b)中的结合有发光探针的目标粒子的分子数的计算包括：使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由所述光检测区域中的粒子发出的荧光的工序；
由所述检测到的光逐个检测来自每个粒子的光信号而逐个检测粒子的工序；
以所述逐个检测到的粒子的光信号的强度作为指标，只计数每1粒子包含有2分子以上所述发光探针的粒子而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的所述目标粒子的个数的工序。
2.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以规定的速度移动。
3.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以比所述结合有发光探针的目标粒子的扩散移动速度更快的速度移动。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在由所述检测到的光检测来自结合有发光探针的每个目标粒子的光信号而逐个检测所述结合有发光探针的目标粒子的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状来检测一个结合有发光探针的目标粒子进入了所述光检测区域。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，所述发光探针包含与所述目标粒子结合的标记用探针、和与每1分子前述标记用探针结合的1或2分子以上的发光物质。
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