JPWO2013021687A1 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents

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Abstract

この標的粒子の検出方法は、（ａ）標的粒子と、前記標的粒子に結合する１種類又は２種類以上の発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記発光プローブを結合させる工程と、（ｂ）工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の分子数を、走査分子計数法により、１粒子当たりの光信号の強度を指標として算出する工程と、を有し、前記発光プローブが、同種の発光物質が結合された１種類又は２種類以上のプローブである。

Description

本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、発光プローブにより標識された粒子を検出する方法に関する。本願は、２０１１年８月１１日に、日本に出願された特願２０１１−１７５８６２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子の微弱光の検出・測定が可能となってきている。前記微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置、又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、及び非特許文献１〜３参照）が提案されている。上記方法においては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度が測定される。また、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報が得られる。また、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象が検出できる。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）が提案されている。上記方法においては、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングする。これにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６においては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７においては、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従来の方法と比べて、低濃度及び微量で足りる（一回の測定で使用される量は、数十μＬ程度）。また上記方法によれば、その測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従来の生化学的方法と比べて、低いコストで、迅速に実験又は検査が実行できることが期待されている。
一方で、検出対象である標的粒子を発光プローブで標識し、ＦＩＤＡ等により検出する方法において、試料溶液中に標的粒子と結合している発光プローブと標的粒子と結合していない発光プローブとが共存している場合には、両者を区別して検出できることが重要である。例えば特許文献８では、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素で標識された発光プローブを用い、退色防止剤の存在下においてＦＩＤＡを行う。これにより、標的粒子と結合した発光プローブから検出される蛍光強度と、標的粒子と結合していない発光プローブから検出される蛍光強度とに差を設け、両者を区別して検出する方法が開示されている。
その他、特許文献９には、発光プローブからのシグナルを増幅する方法として、例えば、リガンドとレセプターの結合反応を利用し、一の標的粒子に複数の発光プローブを結合させる方法が開示されている。
特開２００５−０９８８７６号公報 特開２００８−２９２３７１号公報 特許第４０２３５２３号公報 日本国国際公開２００８−０８０４１７号公報 特開２００７−２０５６５号公報 特開２００８−１１６４４０号公報 特開平４−３３７４４６号公報 特開２００９−２５０７２１号公報 特開２０００−１０６８７６号公報
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１〜１４３８ページ。 メイヤー−アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４〜２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１〜２７７ページ。
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、及びＰＣＨなどの光分析技術では、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出される。また、そのゆらぎの大きさに基づいて、試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調製されている必要がある。試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。すなわち、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生する。したがって、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれ、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。このため、上記の蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。
特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行わない。特許文献５及び６には、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができない。したがって、特許文献５及び６において、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。すなわち、特許文献７において、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。このため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、及びＰＣＨなどの光分析技術に比べて、大幅に多くなり、実施者に対して、複雑で高度な操作技術が要求される。
また、試料溶液中の標的粒子を発光プローブで標識して蛍光測定技術を用いて検出する方法では、測定前に予め試料溶液から遊離した発光プローブを除去する必要がない。このため、標的粒子と結合している発光プローブと、標的粒子と結合していない発光プローブとを、区別して検出できることが好ましい。しかしながら、特許文献８に記載の方法では、使用可能な蛍光物質が限定されるという問題がある。
本発明の態様は、試料溶液中に、標的粒子と結合している発光プローブと標的粒子と結合していない発光プローブとが共存している場合であっても、標的粒子が検出可能な方法を提供することを目的とする。本発明の態様に係る方法は、以下に示す特徴を有する新規な光分析技術を用いる。すなわち、この光分析技術は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの従来の光分析技術にて実行されているような統計的処理を含まない。従って、この光分析技術は、観測対象粒子の濃度又は数密度がこれら従来の光分析技術で取り扱われる水準よりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能である。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下のような本発明を完成させた。試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、前記粒子と結合した発光プローブから放出される光を指標として間接的に検出する場合、発光プローブと結合した粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行う。これにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が非常に低い場合も感度よく発光プローブと結合した粒子を検出することができる。さらには、観測対象の粒子に複数の発光プローブを結合させる。これにより、標的粒子と結合していない遊離した発光プローブを試料溶液から予め除去せずに、標的粒子と結合している発光プローブと遊離した発光プローブとを区別して検出できる。
走査分子計数法は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、本願の出願人により提案されている新規な光分析技術である。
すなわち、本発明には、以下の態様を有する。
（１） 試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
（ａ）標的粒子と、前記標的粒子に結合する１種類又は２種類以上の発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記発光プローブを結合させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記発光プローブが、同種の発光物質が結合された１種類又は２種類以上のプローブであり、
前記工程（ｂ）における発光プローブと結合した標的粒子の分子数の算出を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の粒子から放出される蛍光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の粒子からの光信号を個別に検出して、粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された粒子の光信号の強度を指標として、前記発光プローブが１粒子当たり２分子以上含まれている粒子のみを計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
を備える標的粒子の検出方法、
（２） 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される前記（１）に記載の標的粒子の検出方法、
（３） 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される前記（１）又は（２）に記載の標的粒子の検出方法、
（４） 前記検出された光から、発光プローブと結合した個々の標的粒子からの光信号を検出して、前記発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、発光プローブと結合した１つの標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の標的粒子の検出方法、
（５） 前記発光プローブが、前記標的粒子と結合する標識用プローブと、前記標識用プローブ１分子当たり１又は２分子以上結合する発光物質とからなる前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の標的粒子の検出方法。
本発明の態様に係る標的粒子の検出方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するという統計的処理が実行されない。このため、本発明の態様に係る標的粒子の検出方法により、解析対象である標的粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合も、試料中の前記標的粒子を検出することができる。さらに、本発明の態様に係る標的粒子の検出方法では、標的粒子と結合した発光プローブの１分子当たりの発光強度が、遊離した発光プローブの１分子当たりの発光強度よりも大きい。このため、走査分子計数法による測定前に予め試料溶液中から遊離した発光プローブを除去せずに、標的粒子と結合した発光プローブと遊離した発光プローブとを区別して検出することができる。
走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 ミラーの向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 図２Ａにおける計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
まず、走査分子計数法について説明する。微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切る。このときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。上記技術においては、ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、測定時間が短い。また、ＦＩＤＡ等の光分析技術と比べて、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
なお、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、及び光散乱等により光を発する粒子を意味する。本実施形態の標的粒子の検出方法においては、標的粒子と発光プローブとが結合したものが、発光粒子である。
本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域である。「光検出領域」は、対物レンズから照明光が与えられる場合、その照明光が集光された領域に相当する。なお、前記領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される（実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出したい粒子（標的粒子）と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出する。これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数してもよい（粒子のカウンティング）。前記構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出してもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されている。これにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。このため、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく、安定した状態で、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではない。このため、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブ（１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合を含む。以下同様）が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて行われてもよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されてもよい。
また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて、適宜変更されてもよい。当業者において理解されているように、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減する。このため、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本発明の標的粒子の検出方法においては、標的粒子と結合した状態の発光プローブ）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定されることが好ましい。前述したように、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまう。このため、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。したがって、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定する（具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する）。これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わる。このため、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式により行われてもよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されている。このため、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術では、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要な水準よりも大幅に低い試料溶液が適用できる。
また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっている。このため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出する。このため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となる。また、従来の方法と比べて、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、標的粒子と結合した状態の発光プローブを個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の標的粒子の検出方法によれば、試料溶液中の標的粒子と結合した発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度でも、標的粒子を検出することが可能である。
更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測する。このため、例えば、試料に流れを発生させる場合（流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）と比べて、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示するように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により、実現可能である。図１Ａに示すように、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御し、データを取得し、そのデータを解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。上記光学系では、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブ、及び典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射して、コンデンサーレンズ１２にて集光される。その後、集光された光（Ｅm）は、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換される。その後、変換された電気信号は、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が行われる。なお、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに示すように、レーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域である（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）。上記焦点領域は、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出される。このため、光検出器１６としては、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器を用いることが好ましい。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察対象となるウェル１０を変更するために、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。前記構成により、検体が複数在る場合も、迅速な計測を行うことができる。
更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられている。前記光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに示すように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。ミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置であってもよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するために、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されてもよい。試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなる。したがって、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、複数の励起光源２が設けられていてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できてもよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよい。また、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できてもよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従来の生化学的な分析技術と比べて、必要な試料量が極めて少ないという点、及び迅速に検査が実行できるという点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。このため、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在する水準であり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しない水準である場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れない。これにより、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在する水準よりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすい。これにより、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求される水準よりも低い場合も、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、光検出が実行される。即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。この場合、例えば、図２Ａに示すように、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに示す有意な光強度（Ｅｍ）が検出される。上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する有意な光強度を一つずつ検出する。これにより、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントする。その結果、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。前記走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出のような、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。したがって、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度は蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れる。その結果、決定される濃度値の精度が悪化する。走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出する。このため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度を検出できる。
また、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従来の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で所定量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れる。その結果、決定される濃度値の精度が悪化する。走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出する。このため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度を検出できる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う。その他の処理は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置する。その後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始する。前記計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下において、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に、光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。したがって、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングでもよい。また、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。したがって、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となる。このため、移動速度は、基本的に、一定速度が好ましいが、これに限定されない。
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、前記移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、発光プローブと結合した標的粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子である。このため、ブラウン運動によって位置が時間とともに移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比べて遅い場合には、図３Ａに示すように、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、図３Ｂに示すように、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。このため、図４Ａに示すように、粒子が光検出領域を略直線に横切ることが好ましい。これにより、図４Ｂに示すように、時系列の光強度データにおいて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となる（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）。すなわち、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）が、ブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式、下記式（１）及び（２）から得られる。
Figure 2013021687
Figure 2013021687
 観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、下記式（３）から得られる。
Figure 2013021687
 光検出領域の位置の移動速度は、Ｖdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度とすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなる。このため、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行する。その結果、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）により、下記の光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４に示す略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに示すように、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定する。閾値Ｉｏを超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子が検出されてもよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて決定される。具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布であると仮定できるときには、下記式（４）を満たす。
Figure 2013021687
 有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして強度Ａ及び幅ａを算出する。算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が行われてもよい（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。）。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより行われてもよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに示す処理により行われてもよい。
図５及び図６Ｂに示すように、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、前記時系列光信号データ（図６Ｂにおける「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が行われる（ステップ１１０、図６Ｂにおける「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出され、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得る。このため、前記スムージング処理によって、前記データ値の欠落を無視できる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により行われもよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ（例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など）は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂの「時間微分」に示すように、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。したがって、前記時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
その後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われる（図６Ｂの「釣鐘型関数フィッティング」）。その結果、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、及びフィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否かが判定される。即ち、ピーク強度、ピーク幅、及び相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。図７の左側にて示されたように、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出され、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７の右側にて示されたように、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
上記のステップ１３０〜１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
観測対象粒子のカウンティングが行われると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、又は光学系の調整状態に依存して変動する。このため、光検出領域の実効体積を、設計値から算定することは、一般に困難である。また、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。したがって、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行う。検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されてもよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合した後に遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、下記式（５）により得られる。
Figure 2013021687
 また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、下記式（６）により得られる。
Figure 2013021687
 なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてもよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶する。これにより、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できてもよい。
＜標的粒子の検出方法＞
本実施形態の標的粒子の検出方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法である。試料溶液中の標的粒子を、遊離した発光プローブよりも１分子当たりの発光強度が大きくなるように、発光プローブと結合させて標識する。その後、走査分子計数法によって発光プローブと結合した標的粒子を検出する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法である。すなわち、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、発光プローブと結合した標的粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の標的粒子の検出方法は、標的粒子と結合した発光プローブの１分子当たりの発光強度が、遊離した発光プローブの１分子当たりの発光強度よりも大きい。このため、走査分子計数法による測定前に予め試料溶液中から遊離した発光プローブを除去せずに、標的粒子と結合した発光プローブを遊離した発光プローブと区別して検出することができる。
具体的には、本実施形態の標的粒子の定量方法は、下記工程（ａ）〜（ｂ）を備える。
（ａ）標的粒子と、前記標的粒子に結合する１種類又は２種類以上の発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記発光プローブを結合させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、標的粒子と、前記標的粒子に結合する１種類又は２種類以上の発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記発光プローブを結合させる。
本実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれでもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であって、前記試料溶液中で検出されることを目的とした粒子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
また、本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する部位を有し、かつ発光する物質である。発光プローブは、例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質（標識用プローブ）に、発光物質を結合させることによって製造することができる。発光物質としては、典型的には、蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、又は光散乱等により光を発する物質であってもよい。
蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではない。ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素や量子ドット等の中から適宜選択して用いることができる。本実施形態においては、より高感度に検出可能である利点から、発光物質として蛍光物質を用いることが好ましい。
例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させたもの、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、又は核酸に結合する色素分子等が挙げられる。前記オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、又は標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
発光プローブは、標識用プローブと発光物質とが、共有結合等により直接結合しているものであってもよく、標識用プローブと発光物質とが、抗原抗体反応やリガンドとレセプターとの結合反応等の特異的な結合反応によって結合するものであってもよい。例えば、ビオチンと結合した標識用プローブと、ストレプトアビジンと結合した発光物質とを、ビオチン−ストレプトアビジン結合反応を介して結合させたものを、発光プローブとして用いることができる。より具体的には、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとビオチンを結合させた物質と、ストレプトアビジンに結合させた発光物質とを結合させたものを、発光プローブとして用いることができる。また、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターとビオチンを結合させた物質と、ストレプトアビジンに結合させた発光物質とを結合させたものを、発光プローブとして用いることができる。
発光プローブは、１分子の標識用プローブと１分子の発光物質とが特異的な結合反応によって結合するものであってもよく、１分子の標識用プローブと２分子以上の発光物質とが特異的な結合反応によって結合するものであってもよい。例えば、発光プローブとしては、１箇所のビオチン部位を有する標識用プローブとストレプトアビジンと結合した発光物質とをビオチン−ストレプトアビジン結合反応を介して結合させたものであってもよい。また、発光プローブとしては、２箇所以上のビオチン部位を有する標識用プローブとストレプトアビジンと結合した発光物質とを結合させたものであってもよい。
本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の利点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよい。すなわち、前記発光プローブは、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、前記標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、前記標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
本実施形態において用いられる発光プローブは、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。但し、試料溶液に添加される全ての発光プローブは、同種の発光物質により発光するものである。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、標的粒子とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させた第１の発光プローブと、前記第１のオリゴヌクレオチドとは異なる領域で前記標的粒子とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドに、前記第１の発光プローブと同種の発光物質を結合させた第２の発光プローブとを、共に用いることができる。この場合、試料溶液中の標的粒子は、第１の発光プローブと第２の発光プローブと標的粒子とが結合した粒子として存在する。すなわち、標的粒子を含む粒子には、１粒子当たり２分子の発光物質が含まれている。このため、走査計数法によって、標的粒子を含む粒子からは、遊離した第１の発光プローブ及び第２の発光プローブよりも強い光信号が検出される。
具体的には、工程（ａ）は、まず、標的粒子と１種類又は２種類以上の発光プローブを適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。前記溶媒は、標的粒子と結合した発光プローブから放出される光の検出、及び、走査分子計数法による標的粒子と結合した発光プローブの検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではない。前記溶媒として、前記技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
標的粒子と発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間前記試料溶液をインキュベートする。上記方法を行うだけで、前記試料溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。
一方で、標的粒子や発光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、前記発光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。前記変性処理としては、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるという利点から、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができる。しかしながら、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は異なる。したがって、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブを会合させる。
熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させる。これにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させる。これにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いる。これにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の分子数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、標的粒子を発光プローブと結合させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、標的粒子と結合した状態の発光プローブから放出される光を検出し解析することにより、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する。計数された標的粒子数が、測定試料中に含まれている標的粒子の数である。
試料溶液中の標的粒子は、１分子当たり２分子以上の発光プローブと結合している。このため、発光プローブと結合した標的粒子の１粒子当たりの光信号の強度は、遊離した発光プローブ（すなわち、１粒子当たり１分子の発光プローブを有する粒子）よりも強い。このため、光信号の強度を指標として、検出された個々の粒子が、発光プローブと結合した標的粒子なのか、遊離した発光プローブなのかを区別することができる。発光プローブが１粒子当たり２分子以上含まれている粒子のみを計数することによって、標的粒子の数を計数することができる。例えば、予め発光プローブのみを含む溶液を調製し、走査分子計数法により前記溶液中の発光プローブの分子数を計数する。これにより、遊離した発光プローブの一分子当たりの光信号の強度を測定し、遊離した発光プローブから検出される光信号強度が含まれないように適当な閾値を設定することにより、標的粒子のみを計数することができる。
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
１分子当たり多数のビオチン化部位を有する物質を標的粒子とし、ストレプトアビジンと結合した量子ドットを発光プローブとして用い、試料溶液中の標的粒子を走査分子計数法により検出した。
＜２本鎖核酸分子を標的粒子とした場合＞
１分子当たり多数のビオチン化部位を有する２本鎖核酸分子を標的粒子とした。
具体的には、ビオチン標識ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰと、鋳型としてプラスミドｐＵＣ１９とを用いてＰＣＲを行い、８００ｂｐのＰＣＲ産物を標的粒子として用いた。より詳細には、前記ＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（タカラ社製）を用い、９５℃で５分間処理した後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行った後、さらに６８℃で１０分間処理する温度サイクル条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｋｉｔ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて電気泳動し、換算された濃度を基に、検体を２ｎＭに調製した。
得られたＰＣＲ産物と２０ｎＭのストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５溶液（ストレプトアビジン結合型のＱｄｏｔ（登録商標）６５５（インビトロジェン社製）をＳＴＥＰバッファーにより希釈。）とを１：１（容積比）で混合することにより、試料溶液を調製した。前記試料溶液を３０分間静置した後、ＳＴＥＰバッファーを用いて５０倍希釈した後、さらに２０倍希釈したものを、走査分子計数法により測定した。
また、前記ストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５溶液をＳＴＥＰバッファーにより同様に希釈したものを、リファレンスとして測定した。
具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて、３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６５０〜６９０ｎｍとした。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルを、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２０秒間とした。
測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ−Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。
測定結果を表１に示す。表１中、「Ｑｄｏｔ Ｒｅｆ」がストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５溶液のみを測定した結果であり、「ｘＢｉｏｔｉｎ−ＰＣＲ」が前記ＰＣＲ産物とストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５を含む試料溶液を測定した結果である。この結果、１分子中に多数のビオチン化部位を有し、１分子当たり多数のストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合している前記ＰＣＲ産物は、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と比べて強いシグナルが得られ、両者には明らかな強度差が観察された。すなわち、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５とストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合している前記ＰＣＲ産物とが区別して検出可能であることがわかった。
Figure 2013021687
＜デキストランを標的粒子とした場合＞
１分子当たり多数のビオチン化部位を有するビオチン化デキストラン（インビトロジェン社製）を標的粒子とした。
具体的には、ＰＢＳバッファーに、最終濃度が１ｎＭとなるようにビオチン化デキストランを、最終濃度が１０ｎＭとなるようにストレプトアビジン結合型のＱｄｏｔ（登録商標）６５５（インビトロジェン社製）をそれぞれ添加し、試料溶液を調製した。前記試料溶液を３０分間静置した後、ＰＢＳバッファーを用いて１００倍希釈したもの（ストレプトアビジン結合型のＱｄｏｔ（登録商標）６５５の濃度：１０ｐＭ）を、走査分子計数法により測定した。
また、ビオチン化デキストランを加えず、前記ストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５のみを添加した溶液をＰＢＳバッファーにより同様に希釈したものを、リファレンスとして測定した。
走査分子計数法による測定は、前記の２本鎖核酸分子を標的粒子とした場合と同様にして行った。
測定結果を表２に示す。表２中、「Ｑｄｏｔ Ｒｅｆ」がストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５溶液のみを測定した結果であり、「ｘＢｉｏｔｉｎ−Ｄｅｘ」がビオチン化デキストランとストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５を含む試料溶液を測定した結果である。この結果、１分子中に多数のビオチン化部位を有し、１分子当たり多数のストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合しているビオチン化デキストランは、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と比べて強いシグナルが得られ、両者には明らかな強度差が観察された。すなわち、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５とストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合しているビオチン化デキストランとが区別して検出可能であることがわかった。
Figure 2013021687
＜光信号強度の閾値を３．０とした場合＞
遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５の光信号強度の最大値は２．４０であったことから、光信号強度の閾値値を３．０とし、３．０以上のピーク数のみを発光プローブ（ストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５）と結合した標的粒子（前記ＰＣＲ産物、又はビオチン化デキストラン）として計数した。計数結果を表３に示す。この結果、リファレンスであるストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５のみを含む溶液よりも、前記ＰＣＲ産物又はビオチン化デキストランとストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５とを含む溶液のほうが、光信号強度が３以上のピークが得られる頻度が高かった。
Figure 2013021687
（実施例２）
１分子当たり２箇所のビオチン化部位を有するビオチン化デキストラン（インビトロジェン社製）を標的粒子とし、ストレプトアビジンと結合した量子ドットを発光プローブとして用い、試料溶液中の標的粒子を走査分子計数法により検出した。
具体的には、ＰＢＳバッファーに、最終濃度が２ｎＭとなるようにビオチン化デキストランを、最終濃度が１０ｎＭとなるようにストレプトアビジン結合型のＱｄｏｔ（登録商標）６５５（インビトロジェン社製）をそれぞれ添加し、試料溶液を調製した。前記試料溶液を３０分間静置した後、ＰＢＳバッファーを用いて１０００倍希釈したものを、走査分子計数法により測定した。
また、ビオチン化デキストランを加えず、前記ストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５のみを添加した溶液をＰＢＳバッファーにより同様に希釈したものを、リファレンスとして測定した。
走査分子計数法による測定は、励起光を１ｍＷで照射した以外は、実施例１と同様にして行った。
測定結果を表４に示す。表４中、「Ｑｄｏｔ Ｒｅｆ」がストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５溶液のみを測定した結果であり、「ｘＢｉｏｔｉｎ−Ｄｅｘ」がビオチン化デキストランとストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５を含む試料溶液を測定した結果である。この結果、１分子中に２箇所のビオチン化部位を有し、１分子当たり２分子のストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合しているビオチン化デキストランは、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と比べて２倍程度強いシグナルが得られ、両者には明らかな強度差が観察された。すなわち、遊離したストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５とストレプトアビジン結合型Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５と結合しているビオチン化デキストランとが区別して検出可能であることがわかった。
Figure 2013021687
本発明の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により検出することができるため、本発明の標的粒子の検出方法は、臨床検体等の解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用が可能である。
１ 光分析装置（共焦点顕微鏡）
２ 光源
３ シングルモードオプティカルファイバー
４ コリメータレンズ
５ ダイクロイックミラー
６、７、１１ 反射ミラー
８ 対物レンズ
９ マイクロプレート
１０ ウェル（試料溶液容器）
１２ コンデンサーレンズ
１３ ピンホール
１４ バリアフィルター
１５ マルチモードオプティカルファイバー
１６ 光検出器
１７ ミラー偏向器
１７ａ ステージ位置変更装置
１８ コンピュータ

Claims (5)

  1. 試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
    （ａ）標的粒子と、同種の発光物質が結合され前記標的粒子に結合する１種類又は２種類以上の発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記発光プローブを結合させる工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する発光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する工程と、
    前記工程（ｂ）における発光プローブと結合した標的粒子の分子数の算出を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の粒子から放出される蛍光を検出する工程と、
    前記検出された光から、個々の粒子からの光信号を個別に検出して、粒子を個別に検出する工程と、
    前記個別に検出された粒子の光信号の強度を指標として、前記発光プローブが１粒子当たり２分子以上含まれている粒子のみを計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、を備える標的粒子の検出方法。
  2. 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
  3. 前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
  4. 前記検出された光から、発光プローブと結合した個々の標的粒子からの光信号を検出して、前記発光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、発光プローブと結合した１つの標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  5. 前記発光プローブが、前記標的粒子と結合する標識用プローブと、前記標識用プローブ１分子当たり１又は２分子以上結合する発光物質とからなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
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