KR100455762B1

KR100455762B1 - 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 이용한 아사이알로당단백질의 농도 측정방법

Info

Publication number: KR100455762B1
Application number: KR10-2001-0074908A
Authority: KR
Inventors: 정태화; 송은영; 김경아; 김영대; 강호범; 서영교; 곽주원; 이홍수; 최용경; 유동주
Original assignee: 네오바이오다임 주식회사
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2004-11-06
Also published as: KR20030044225A

Abstract

본 발명은 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 이용한 아사이알로당단백질의 농도 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 인간 아사이알로당단백질(asialoglycoprotein, ASGP) 수용체를 발현하기 위한 재조합 벡터 pET/ASGPR를 제작하여 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 대량 생산하고 이 재조합 단백질과 렉틴을 이용하여 간 질환 발생시 혈액 내에서 증가하는 아사이알로당단백질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 이용한 아사이알로당단백질의 농도 측정방법{Method for measuring serum asialoglycoprotein concentration}

아사이알로당단백질은 간 질환의 진행상태를 반영하는 혈청 내 표식자로 급성간염 발병시 급격히 증가하고 회복기에 들어서면 다시 감소하는 것으로 보고되었다[T.Sawamura, et al. Gastroenterology, 1981;81:527∼533]. 동물에 간염을 유도했을 때 아사이알로당단백질과 간 조직의 아사이알로당단백질 수용체의 농도는 서로 대칭되는 현상을 나타내므로 혈중 아사이알로당단백질 또는 간 조직 내 아사이알로당단백질 수용체의 농도는 병의 진전상태를 판단할 수 있는 임상적인 표식자이다[T.Sawamura,et al, Gastroenterology, 1984:87;1217∼1221]. 또한, 간암의 경우 혈중 아사이알로당단백질의 농도와 간암 조직의 크기가 정비례함을 보여 아사이알로당단백질은 간암의 상태를 평가하는 표식자임이 밝혀지기도 했다[T. Sawamura, et al, Gastrologia Japonica, 1985:20;201∼208]. 상기와 같이 아사이알로당단백질과 그의 수용체는 간의 정상 기능과 특이적인 관계를 가지고 있으며, 이들의 혈중 또는 간 조직 내에서의 농도는 정상적인 간 기능 또는 환자의 임상적인 상태를 반영한다.

아사이알로당단백질 수용체는 간세포에 특이적으로 발현하는 막 단백질이며혈청 중으로 돌아다니는 아사이알로당단백질을 포획하여 소멸시키는 기능을 가지고 있다. 아사이알로당단백질의 수용체는 HepG2 세포에 많이 발현되어 있으며 혈중에 돌아다니는 용해성 아사이알로당단백질의 수용체 분자량이 35 ∼ 40 kD인 반면 인간의 간 추출물(human liver extract)에 있는 것은 분자량이 46 kD이다. 아사이알로당단백질 수용체는 H1, H2의 서브유닛으로 이루어진 헤테로멀티머(heteromultimer)이며 세린(serine)기에 당화(glycosylated)되어 있다. 그 중 H1 도메인은 291 잔기로 이루어져 있으며, 2군데의 n-연결된 당화 부위(n-linked glycosylation site)가 있으며 H2 서브유닛 보다 중요한 역할을 담당한다.

종래에는 아사이알로당단백질의 농도를 측정하기 위해 아사이알로당단백질 수용체를 인체 또는 다른 동물(토끼, 쥐 등)에서 분리, 정제하여 포획 단백질로 사용했고, 방사선 표지 기질을 사용한 경쟁적 방사능수용체 분석방법(competitive radioreceptor assay) 또는 전기면역확산방법(electroimmunodiffusion)을 사용하였다[J.S.Marshall, et al. J. Lab. Clin. Med.,1978;92:30∼37, N. Serbource-Goguel, et al.Hepatology, 1983;3:356∼359].

본 발명자들은 아사이알로당단백질 수용체의 확보의 어려움, 경쟁적 방사능수용체 분석방법과 전기 면역확산방법의 문제점들을 해결하여 본 발명자들은 특허[PCT/KR00/00840 (2000. 8. 1), 미국 출원 09/662,363 (2000. 9. 13), 대한민국 출원 제 2000-040609호 (2000. 7. 14)]에서 혈중 아사이알로당단백질 측정으로 간 기능의 진단 또는 간 질환의 치료에 사용할 수 있는 재현성 있고 정확한 측정방법과 킷트를 개발한 바 있다. 상기 본 발명자들이 개발한 방법들은 아사이알로 당단백질 중 중요할 것으로 유추되는 사이알산이 제거된α1-산 당단백질(α1-acid glycoprotein), 햅토글로빈(haptoglobin),α2-매크로글로불린(α2-macroglobulin) 등을 예로 들어 이들의 항체를 이용한 항체-렉틴 샌드위치형 측정방법과 아사이알로 당단백질에 특이적인 렉틴-렉틴 샌드위치형 측정방법에 의한 아사이알로당단백질의 측정법을 개발하였다. 항체-렉틴 샌드위치형 측정방법은 아사이알로 당단백질 중 특정 단백질의 양만 알 수 있고 전체적인 아사알로 당단백질의 양이 간질환에 미치는 영향은 알 수 없다는 단점이 있고 렉틴-렉틴 샌드위치형 측정방법은 수용체를 사용하였을 경우에 비해 다소 비특이적이라는 문제점을 안고 있다. 본 발명자들은 이러한 문제점들을 해결하여 혈중 아사이알로 당단백질의 전체양을 측정하기 위하여 기존의 분리 정제로는 확보하기 어려웠던 아사이알로 당단백질수용체를 재조합단백질로 제조하여 대량 생산하였으며 이를 이용하여 수용체- 렉틴형 샌드위치 측정방법을 개발하였다.

이에, 본 발명자들은 보다 더 다양한 아사이알로당단백질에 대한 총괄적인 농도를 측정하고 기존의 방법들보다 더 안전성과 재현성이 높고 다수의 시료를 동시에 측정하기 위하여 연구 노력한 결과, 아사이알로당단백질 수용체를 생산하기 위한 발현벡터를 제작하여 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 대량 생산하고, 이를 이용하여 아사이알로당단백질을 특이적으로 인지하는 렉틴을 사용한 샌드위치형 측정방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 간 질환 발생 시 혈액 내에서 증가되는 아사이알로당단백질의 혈중 농도를 측정하기 위하여 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 생산하고 이를 이용하여 아사이알로당단백질 농도를 측정하는 샌드위치형 측정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1a는 인간 아사이알로당단백질 수용체의 세포막외 도메인(extracellular domain) 유전자에 대한 재조합 단백질을 생산하기 위한 벡터 모식도이다.

도 1b는 아사이알로당단백질 수용체의 PCR 생산물의 아가로스 젤 전기영동으결과를 나타낸 것이다[lane M : 1 kb DNA ladder, lane N : 100 bp DNA ladder, lane 2-8 : 아사이알로당단백질 수용체 PCR 생산물].

도 1c는 인간 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체로부터 발현도를 확인하고 분리, 정제한 결과를 나타낸 것이다[lane M : 마커, lane 1 : 유도되지 않은 상태, lane 2 : 0.5 mM IPTG(isopropyl-β-D-1 thiogalactoside)로 유도했을 때, lane 3 : 초음파 분쇄 후 수용성 분획, lane 4 : 불용성 분획, lane 5-7 : 세척액, lane 8 : 부분적으로 정제된 inclusion body].

도 1d는 형질전환체로부터 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 확인한 SDS-PAGE 결과와 이를 재조합 단백질의 특이적인 항체(단일클론항체)로 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다[(A) : 정제된 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질, (B) : (A)를 α1-산 당단백질(α1-acid glycoprotein, AGP)에 대한 항체와 반응시킨 웨스턴 블랏팅, (C) : (A)를 렉틴의 일종인 리시누스 코뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis agglutinin; RCA)과 반응시킨 렉틴 블럿(Lectin blot)].

도 2는 인간 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질과 렉틴을 이용한 고상형 샌드위치형 측정방법(solid-phase sandwich assay)에서 아사이알로당단백질의 농도에 따른 반응성을 나타낸 곡선으로, α1-산 당단백질과 사이알산이 제거된 α1-산 당단백질, 햅토글로빈(haptoglobin)과 사이알산이 제거된 햅토글로빈, α2-매크로글로불린(α2-macroglobulin)과 사이알산이 제거된 α2-매크로글로불린의 농도에 따른 반응성을 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질과 렉틴을 이용한 수용체-렉틴 샌드위치형 측정시약의 표준곡선에 대한 그래프이다

도 4는 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질과 렉틴을 이용한 수용체-렉틴 샌드위치형 측정방법으로 정상인, 간질환 환자 혈청모음, 간암환자 혈청시료를 각각 희석해 가면서 함유된 아사이알로당단백질의 농도를 흡광도로 나타낸 그래프이다

본 발명은 아사이알로당단백질 수용체를 발현하기 위한 재조합 벡터 pET/ASGPR를 제작하고, 이 벡터를 대장균 JM109에 도입하여 형질전환된 대장균(기탁번호: KCTC 10101BP)로부터 발현된 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 포획 단백질(capture protein)로, 렉틴을 프로브 단백질(probe protein)로 사용하여 아사이알로당단백질의 농도를 측정하는 방법 및 측정용 킷트를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 제작하기 위하여 Hep G2 세포로부터 H1 서브유닛 중 세포막외 영역을 포함하는 cDNA를 얻고 pET29b(+) 벡터의NdeI 위치에 삽입하여 발현벡터 pET/ASGPR를 제작하고 이 벡터를 대장균에서 발현시켜 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 분리, 정제한다.

상기 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고상체에 가하고 한시간 이상 방치하여 수용체를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시킨다. 세척액으로 웰을 세척한 후, 혈청시료 희석 용액을 각 웰에 가하고 실온에서 반응시킨다. 상기 세척액으로 웰을 세척한 후, 효소로 표지된 렉틴 결합물을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 웰을 상기 세척액으로 세척한 후 효소의 발색기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 아사이알로당단백질 표준액이 나타내는 흡광도와 비교하여 혈중 아사이알로당단백질의 농도를 산출한다.

본 발명의 측정방법에 의하여 여러 종류의 아사이알로당단백질을 표준물질로 사용할 때 혈중 아사이알로당단백질을 0.02 ∼ 2 unit/㎖의 농도 범위에서 검출할 수 있다.

따라서, 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질은 혈중 아사이알로당단백질의 농도를 측정하기 위한 수용체-렉틴 샌드위치형 방법 및 측정용 킷트의 원료로 사용가능하며, 아사이알로당단백질 수용체에 대한 항체 생산에 유용하게 사용할 수 있고 아사이알로당단백질 수용체에 대한 항체 측정에 사용가능하며 표준액으로 사용가능하다. 특히, 수용체-렉틴 샌드위치형 방법에 의한 혈중 아사이알로당단백질 측정은 간 질환의 조기진단과 치료성과의 평가에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아사이알로당단백질 수용체(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)의 발현을 위한 벡터 제작

(1) 아사이알로당단백질 수용체의 클로닝

인간 아사이알로당단백질 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포주 HepG2를 DMEM 배지에서 배양하여 회수한 다음, 1 ×10⁶개에 해당하는 세포들로부터 산 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름(acid guanidium thiocyanate-phenol-

chloroform) 추출방법을 사용하여 세포의 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA 10 ㎍을 4종류의 dNTP 혼합물(각각 10 mM), 올리고 d(T)15 프라이머 80 pmol, RNase 억제제 15 unit, AMV 역전사효소와 함께 42 ℃에서 2시간동안 반응시켜 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여 아사이알로당단백질 수용체의 세포막외 도메인(extracellular domain, rE)을 증폭하기 위한 서열번호 1로 표시되는 5' 프라이머는 5'-AAT CAT ATG CAA AAC TCC CAG CTA CAG GAG-3'로서, 제한효소NdeI 절단 서열과 ATG 개시 코돈을 포함하고 있으며, 서열번호 2로 표시되는 3' 프라이머는 5'-TGC CAT ATG TTA AAG GAG AGG TGG CTC CTG-3'로서, 제한효소NdeI 절단 서열 및 발현 정지 코돈인 TAA 서열을 포함하였다. PCR을 실시하기 위해 상기의 각 프라이머를 100 pmol씩 넣고 50 ㎕의 부피로 dNTP 0.2 mM, MgCl₂0.5 mM, Taq DNA 중합효소 2.5 unit를 첨가하였다. PCR의 첫 번째 반응조건은 95 ℃ 60초, 53 ℃ 10초, 72 ℃ 20초로, 두 번째부터는 95 ℃ 10초, 53 ℃ 10초, 72 ℃ 20초로 35번 반복하며, 끝으로 95 ℃ 60초, 53 ℃ 10초, 72 ℃ 180초로 실시하였다. PCR로 얻어진 711 bp DNA절편[서열번호 3]을 각각 pGEMT-easy벡터(Promega)에 클로닝한 후, 염기서열 분석과 제한효소지도를 작성하였다.

(2) 발현벡터 제작 및 발현

상기에서 얻어진 DNA 단편을 발현 벡터에 연결하기 위하여 제한효소NdeI 절단해서 분리한 후, 얻어진 cDNA절편을 T4 DNA 결합효소를 이용하여 pET29b(+)에 연결하였다. 벡터에 대한 몰비율로 1 : 3 정도 되게 한 다음, 전체 20 ㎕의 50 mM Tris-HCl(pH 7.6), 1 mM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂완충용액에 넣고, T4 DNA 리가아제 1 unit를 가하여 23.5 ℃에서 4시간 반응하였다. 아사이알로당단백질 수용체를 발현하기 위한 신규 벡터를 제작하였으며, pET/ASGPR라 명명하였다. 이 벡터를 이 접합 반응액 5㎕를 Hanahan의 방법[Hanahan, J. Mol. Biol. 1983, 116, 557]에 따라 대장균 JM109에 도입하여 형질전환된 대장균 JM109(DE3)/pET29-ASGPR를 한국생명공학연구원에 2001년 11월 2일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC 10101BP이다.

상기 형질전환된 대장균 JM109(DE3)/pET29-ASGPR(기탁번호: KCTC 10101BP)를 가나마이신(kanamycin)이 30 ㎍/㎖ 농도로 들어있는 LB 배지에서 OD₆₀₀= 0.5이 되도록 배양한 1 mM IPTG로 도입된 유전자의 발현을 유도하고 37 ℃에서 3시간 더 배양하여 대장균 세포들을 회수하였다. 이 균주로부터 클로닝된 아사이알로당단백질 수용체가 생산되는 것을 확인하기 위하여 대장균 세포들을 원심 분리하여 회수하고 변성용액[50 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 5% β-머캡토에탄올, 20% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루]에서 녹인 다음, SDS가 함유된 15% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동에 의하여 분석하였다. 도 1c에서 보는 바와 같이, 분자량 약 25 KDa 정도의 단백질이 IPTG에 유도되어 나타나는 것을 관찰하였다[lane 2].

대장균에서 발현되는 단백질의 용해성 정도를 알아보기 위해 원심분리하여 얻은 세포들은 초음파기로 파쇄하고 다시 원심분리하여 상등액과 펠렛을 따로 모아 전기영동하였다[lane 3, 4]. 발현된 단백질은 모두가 IB(inclusion bodies) 형태의 불용성 단백질로 발현되었으며 발현양을 확인한 결과 대장균으로부터 발현되는 전체 단백질 중 약 40%에 해당하는 양이었다.

실시예 2 : 아사이알로당단백질 수용체의 분리 및 정제

(1) IB(inclusion bodies)의 분리

IB를 충분히 모으기 위해, 발현이 유도된 세포를 앞서 기술한 방법으로 250 ㎖을 배양하여 원심분리로 모은 후, 상등액은 버리고 침전물만을 취하였다. 이를 용해(lysis) 버퍼[0.1 M Tris-Cl(pH 8.0), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100]에 녹인 다음, 초음파기로 10분 동안 세포를 분쇄한 후, 다시 5,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성인 침전물만을 모았다. 이와 같은 과정을 3번 반복하여 IB를 부분 정제하였다. IB를 부분정제하는 과정에서 단, 마지막 세 번째 세척 후에는8 M 유레아 , 0.2 M NaCl, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액에 녹였다.

(2) 재폴딩(Refolding)

상기에서 준비된 IB 용액에 0.01% 2-머캡토에탄올과 CaCl₂를 25 mM이 되도록 첨가하여 얼음속에서 1시간 정도 정치한 후 프로테아제 억제제가 들어있는 0.2 M NaCl, 25 mM CaCl₂, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 4 ℃에서 24시간 동안 투석하였으며, 이때 완충액은 3회 바꿔주었다. 침전물을 원심분리하여 제거하였다.

앞서 확인된 아사이알로당단백질 수용체 IB의 폴딩 반응을 진행하기 위해 세척 후 초음파기로 세포를 깨는 과정을 3번 반복한 후[도 1c lane 5-7], 다음 단계를 수행하였다. IB가 변성(denaturing) 버퍼에서 서서히 녹는 이 때, 잘못 형성될 수 있는 이황화 결합 형성을 막아 주기 위해 DTT, DTE 등의 환원제를 사용하여 실험하였다. 또한, IB를 녹이기 위해 8 M 유레아가 들어있는 완충액을 사용하여 0.2 M NaCl, 25 mM CaCl₂, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 투석하여 재폴딩하였다.

(3) 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)

아사이알로당단백질 수용체의 리간드인 아사이알로당단백질의 N-아세틸갈락토사민과 갈락토우스 잔기이므로, 폴딩하여 준비한 아사이알로당단백질 수용체를 갈락토우스가 결합되어 있는 아가로스 비드(agarose bead)를 이용하여 분리하였다.0.2 M NaCl, 25 mM CaCl₂, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 평형시켜 놓은 컬럼에 재폴딩된 아사이알로당단백질 수용체를 결합시킨 후, 0.2 M NaCl, 25 mM CaCl₂, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 세척한 다음 0.5 M β-락토오스가 첨가된 0.2 M NaCl, 25 mM CaCl₂, 20 mM Tris(pH 8.0) 완충액을 사용하여 용출시켰다. 이렇게 얻어진 단백질을 SDS 전기영동과 웨스턴 블럿으로 확인한 결과[도 1d], 아사이알로 α1-산 당단백질(AsAGP)에 특이적으로 반응함을 알 수 있었다.

실시예 3 : 혈청에서 아사이알로당단백질의 분리 및 정제

사람의 혈장에 포함되어 있는 당단백질 중에서 α1-산 당단백질(AGP)을 다음과 같이 분리 및 정제하였다.

사람의 혈장 200 ㎖에 트롬빈 2 NIH 단위를 넣어 37 ℃에서 2시간, 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 원심분리하여 혈병을 제거하였다. 준비된 혈청을 0.05 M 초산 나트륨 완충액(pH 4.3)으로 투석한 다음, 0.05 M 초산 나트륨 완충액(pH 4.3)으로 평형시켜 놓은 DEAE-셀룰로즈 칼럼에 로딩하고 0.05 M 초산 나트륨 완충액(pH 4.3)과 0.1 M 초산 나트륨 완충액(pH 4.3)을 섞어 직선 비례로 증가하는 농도 구배(linear concentration gradient)로 용출시켰다. AGP와 그 외의 단백질을 함유한 분획을 모아 황산암모늄을 0.5 ｇ/㎖가 되도록 넣어 단백질을 침전시킨 다음 원심분리하고, 상청액에 다시 0.18 ｇ/㎖의 양으로 황산암모늄을 넣어 단백질을 침전시켰다. 이 침전물을 소량의 증류수에 용해시킨 후 증류수로 충분히 투석하여 동결 건조시켰다.

이와 같이 분리한 AGP 40 ㎎을 0.1 N 황산용액 6 ㎖로 80 ℃에서 2시간 동안 가수분해하고 1 N 수산화나트륨으로 중화시킨 다음 0.01 M 인산 완충액(pH 7.4)으로 투석하였다. 이렇게 하여 얻어진 사이알산이 제거된 α1-산 당단백질(AS-AGP) 28 ㎎을 세파덱스 G-200 칼럼에 로딩하고 0.01 M 인산 완충액(pH 7.4)으로 젤 여과한 후 단백질을 함유한 분획을 모았다.

실시예 4 : 아사이알로당단백질 측정법 개발

아사이알로당단백질 수용체와 렉틴을 이용한 아사이알로당단백질 측정방법을 확립하기 위하여 고상체로 마이크로타이터 플레이트를 사용하였으며 수용체를 고상체에 흡착시키고 서양고추냉이 퍼옥시다제 효소를 렉틴에 결합시킨 샌드위치형 측정방법을 이용하였다.

상기 실시예 2에서 준비한 아사이알로당단백질 수용체를 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 1% 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켰다. 0.05% 트윈(Tween)이 함유된 인산염 완충액("세척액")으로 웰을 세척한 후, AGP, HG, MG와 아사이알로당단백질(사이알산이 제거된 AGP, HG, MG)를 희석한 용액 100 ㎕씩 각 웰에 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 세척액으로 웰을 3회 세척한 후 서양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 프로브 렉틴 중 리시누스 코뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis agglutinin; RCA)을 1 : 1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척한 다음 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액을 100 ㎕씩 각 웰에 가하여 발색시켰다. 10분 후, 2.5 N 황산 용액을 가하여 반응을 중지시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 2와 같이 아사이알로당단백질들은 농도에 따른 반응성을 나타내었고, AGP, HG, MG는 반응성이 없음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 아사이알로당단백질 표준액 및 표준곡선

혈액 중에 있는 아사이알로당단백질과 유사한 표준곡선을 확립하기 위해 AsAGP, AsHG, AsMG를 여러 농도로 혼합하여 기울기 시험을 하였다. 먼저 환자혈청 희석시험을 수행하여 기울기를 계산한 다음 그 평균치를 정하였다. 그 후 위의 3가지 단백질을 혼합하여 혈청의 평균기울기와 같게 되도록 혼합하는 농도를 정하였다. 25명의 환자 혈청을 희석시험을 통해 혈청 기울기의 평균값을 구하고 AsAGP, AsHG, AsMG를 일정한 농도의 비율로 혼합하여 시험한 다음 혈청의 평균기울기와 가장 가까운 혼합 비율을 결정하였다. AsAGP, AsHG, AsMG의 혼합농도에 5를 곱한 값을 IU로 정하여 IU와 흡광도를 나타낸 표준곡선은 도 3과 같다.

실시예 6 : 수용체-렉틴 샌드위치형 킷트에 의한 환자혈청 희석검사

다음의 구성요소들을 사용하여 아사이알로당단백질 농도 측정용 킷트를 제조하였다:

A. 고상형 수용체: 수용체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서 재조합 아사이알로 당단백질 수용체를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4 ℃에서 하룻밤동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.

B. 효소결합 렉틴: 서양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 RCA 용액(RCA-퍼옥시다제)

C. 혈청 희석용액

D. 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질액

E. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액

F. 표준용액: 아사이알로당단백질 표준용액.

상기 킷트를 이용하여 정상인, 간경화 환자, 간암 환자 및 만성 간염 환자의 혈청 중 아사이알로당단백질의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다.

A의 고상형 수용체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료 9정상, 간암, 간질환 환자 pool)를 혈청 희석용액(C)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, D, E의 구성요소들을 사용하여 상기 실시예 4와 같은 샌드위치형 측정방법으로 아사이알로당단백질 농도를 검사하였다.

도 4는 아사이알로 당단백질 수용체와 RCA-HRP를 이용한 샌드위치형 킷트로 각각 수행한 실험결과를 나타낸 혈청희석 반응곡선이다.

간암을 포함한 간 질환 환자의 혈청 중 아사이알로당단백질 농도가 정상인의 혈중 농도보다 높은 반응성을 보였다.

이로부터 아사이알로당단백질이 간경변, 간암 같은 간 질환의 진단과 질병의 상태를 판단할 수 있는 표식자로 사용할 수 있음을 보여 주고 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 제조하고, 이 재조합 단백질을 포획 단백질(capture protein)로, 렉틴을 프로브 단백질(probe protein)로 사용하는 샌드위치형 측정방법에 관한 것으로서, 재조합 단백질은 항체 생산에 이용할 수 있으며 샌드위치 측정방법은 간 질환 발생시 혈액 내에서 증가하는 것으로 추정되는 아사이알로당단백질의 농도를 측정하는데 활용할 수 있다. 본 발명은 간경화, 간암 등 간 질환의 조기진단과 치료성과의 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 다량의 시료를 동시에 재현성 있고 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

<110> KOBIAS CO., LTD. <120> Preparation of recombinant asialoglycoprotein receptor and method for measuring serum asialoglycoprotein concentration <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-PRIMER <400> 1 aatcatatgc aaaactccca gctacaggag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-PRIMER <400> 2 tgccatatgt taaaggagag gtggctcctg 30 <210> 3 <211> 711 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aatcatatgc aaaactccca gctgcaggag gagctgcggg gcctgagaga gacgttcagc 60 aacttcacag cgagcacgga ggcccaggtc aagggcttga gcacccaggg aggcaatgtg 120 ggaagaaaga tgaagtcgct agagtcccag ctggagaaac agcagaagga cctgagtgaa 180 gatcactcca gcctgctgct ccacgtgaag cagttcgtgt ctgacctgcg gagcctgagc 240 tgtcagatgg cggcgctcca gggcaatggc tcagaaagga cctgctgccc ggtcaactgg 300 gtggagcacg agcgcagctg ctactggttc tctcgctccg ggaaggcctg ggctgacgcc 360 gacaactact gccggctgga ggacgcgcac ctggtggtgg tcacgtcctg ggaggagcag 420 aaatttgtcc agcaccacat aggccctgtg aacacctgga tgggcctcca cgaccaaaac 480 gggccctgga agtgggtgga cgggacggac tacgagacgg gcttcaagaa ctggaggccg 540 gagcagccgg acgactggta cggccacggg ctcggaggag gcgaggactg tgcccacttc 600 accgacgacg gccgctggaa cgacgacgtc tgccagaggc cctaccgctg ggtctgcgag 660 acagagctgg acaaggccag ccaggagcca cctctccttt aactgatggc a 711

Claims

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형질전환된 대장균JM109(DE3)/pET29-ASGPR(KCTC 10101BP)로부터 발현된 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 흡착시킨 후, 고상체에 아사이알로당단백질을 함유한 시료를 가하여 아사이알로당단백질을 상기 수용체에 결합시키고, 효소가 결합된 RCA(Ricinus communis agglutinin)을 가하여 상기 수용체에 결합된 아사이알로당단백질에 결합시키며, 상기 효소의 발색기질을 가하여 발색시켜 흡광도를 측정하고 아사이알로당단백질 표준액의 흡광도와 비교하여 혈중 아사이알로당단백질의 농도를 산출하는 것을 특징으로 하는 아사이알로당단백질의 농도 측정방법.
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제 3 항에 있어서, 상기 아사이알로당단백질이 α1-산 당단백질(α1-acid glycoprotein), 햅토글로빈(haptoglobin), α2-매크로글로불린(α2-macroglobulin) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 아사이알로당단백질의 농도 측정방법.
마이크로타이터 플레이트에 흡착된 아사이알로당단백질에 대한 수용체, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA(Ricinus communis agglutinin) 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 검체의 혈청시료 희석용액, 트윈을 포함하는 인산염 완충액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 중의 아사이알로당단백질의 농도를 측정하기 위한 킷트.
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