KR20220144822A - 재조합 칼프로텍틴 - Google Patents

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마이클 아드리안 게르스파흐
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마이클 타카스
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Abstract

본 발명은 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 사슬; SEQ ID NO:2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 사슬; 및 제1 사슬과 제2 사슬을 연결하는 링커를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 진단 방법에서 교정기 및 표준으로서 이들 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 칼프로텍틴
본 발명은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 사슬; SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 사슬; 및 제1 사슬과 제2 사슬을 연결하는 링커를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단 방법에서 교정기 및 표준으로서 이들 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
칼프로텍틴(CP: Calprotectin)은 호중구, 단핵구 및 대식세포와 같은 다양한 골수 세포 유형에서 발현되는 세포질 단백질이다. 호중구에서 칼프로텍틴은 구성상 발현되며 전체 세포질 단백질의 약 40%를 구성할 수 있는 반면, 상피 세포와 각질세포에서는 칼프로텍틴 발현이 유도될 수 있다.
칼프로텍틴은 2개의 폴리펩티드 사슬인 Mrp8(동의어: S100A8, 칼그래눌린 A) 및 안정한 이량체를 형성하는 Mrp14(동의어: S100A9, 칼그래눌린 B)로 구성된다. 약 150 μM Ca2+의 존재 하에서 2개의 Mrp8/Mrp14 이종이량체가 염증 과정 동안 미생물을 굶주리게 하는 Zn2+(Zygiel EM, Nolan EM. Transition Metal Sequestration by the Host-Defense Protein Calprotectin (2018). Annu. Rev. Biochem 87: 621-43)와 같은 다른 2가 양이온에 대한 킬레이트 복합체로서 영양 면역에 중요한 작용을 하는 이종사량체를 형성할 수 있다.
염증 부위에서 방출되기 때문에 칼프로텍틴은 알라민(alarmin)으로 간주되며 염증 과정을 모니터링하기 위한 바이오마커로 자주 사용된다. 예를 들어, 대변 칼프로텍틴은 현재 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)과 같은 염증성 장 질환(IBD)을 진단하고 모니터링하기 위한 최적 표준이다(Konikoff MR, Denson LA. Role of Fecal Calprotectin as a Biomarker of Intestinal Inflammation in Inflammatory Bowel Disease (2006). Inflamm. Bowel Dis. 12 (6): 524-34).
또한 혈청 CP는 류마티스 관절염과 같은 다양한(만성) 염증성 질환을 모니터링하는 바이오마커로 검증되었다(Austermann J et al. S100 proteins in rheumatic diseases (2018). Nat. Rev. Rheumatol. 14: 528-541; Ometto F et al. Calprotectin in rheumatic diseases (2017). Exp. Biol. Med. 242: 859-873).
칼프로텍틴을 측정할 수 있는 신뢰할 수 있는 면역분석법을 개발하기 위해서는 천연 칼프로텍틴과 최대한 유사한 고도로 정제된 칼프로텍틴 항원을 사용하는 것이 중요하다. 이는 교정기, 대조군 및 샘플 간의 항체 반응성 차이로 인한 분석상의 문제를 방지한다. 현재 칼프로텍틴은 유기 IBD와 비유기성 과민성 대장 증후군(IBS)을 구별하기 위한 대변 바이오마커로 주로 사용되지만, 혈액 또는 대변 분석 검정을 보정하는 데 사용할 일반적으로 허용 및/또는 검증된 참조 물질은 없다. 방법 비교는 다른 제조업체의 대변 칼프로텍틴 분석 사이에 명확한 보정 차이가 있음을 보여주는데(De Sloovere MW et al. Analytical and Diagnostic Performance of Two Automated Fecal Calprotectin Immunoassays for Detection of Inflammatory Bowel Disease (2017). Clin. Chem. Lab. Med. 55 (9): 1435-1446), 이는 의사의 검사 결과 해석을 심각하게 악화시킨다.
순수한 칼프로텍틴을 얻기 위한 최신 방법은 정교한 재접힘 과정 (Hadley and Nolan, Methods in Molecular Biology, 2019) 또는 인간 혈액에서 분리된 과립구로부터 칼프로텍틴 정제(Nilsen T, Haugen SH. Extraction, isolation, and concentration of calprotectin antigen (S100A8/S100A9) from granulocytes (2018). Health Sci. Rep. 1: e35)를 통해 불용성 봉입체에서 Mrp8 및 Mrp14의 세균 발현을 포함한다.
그러나 두 방법 모두 몇 가지 단점이 있다. 봉입체에서 얻은 Mrp8 및 Mrp14의 재접힘은 동종이량체 또는 기타 재접힘 인공물을 초래할 수 있다(Vogl et al. Biophysical Characterization of S100A8 and S100A9 in the Absence and Presence of Bivalent Cations (2006). Biochim. Biophys. Acta 1763 (11): 1298-12306). ㄷ다른 한편으로, 혈액 기증자로부터 칼프로텍틴을 정제하는 것은 수율이 낮고 노동 집약적이며 비용이 많이 들고 칼프로텍틴의 부위 지정 돌연변이유발을 허용하지 않는다.
따라서, 천연 칼프로텍틴과 매우 유사하고 면역 검정 및 기타 분석 검정을 위한 신뢰할 수 있는 교정기 및 대조군으로 작용할 수 있는 인공 칼프로텍틴이 당업계에 필요하다.
따라서 해결해야 할 문제는 천연 칼프로텍틴의 중요한 특성을 유지하는 재조합 칼프로텍틴을 제공하는 것이다.
도 1: HiPrep Sephacryl S200 16/60(GE Healthcare)에서 완충 용액 A(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5% 글리세롤, 1mM DTT) 중 본 발명에 따른 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피. 정제된 융합 단백질은 단분산이며 컬럼에서 단량체(26.8 kDa)로 용리된다.
도 2: 융합 단백질의 3C 소화. 15 ug의 정제된 rCAL(Mrp14-Mrp8 융합) 단량체를 150 ng (++) 또는 50 ng(+)의 정제된 3C 프로테아제로 실온에서 3시간 동안 소화시켰다. 그런 다음 샘플을 LDS 완충 용액(x4)를 사용하여 SDS-PAGE용으로 준비하고 950 ℃에서 12분 동안 변성하였다. SDS-PAGE는 융합 단백질이 3C 프로테아제에 의해 S100A8 및 S100A9 사슬로 효율적으로 절단된다는 것을 밝혀냈다.
도 3: 완충 용액 A에 2 mM CaCl2를 첨가하면 실시예 1의 재조합 융합 폴리펩티드의 용출 부피가 크게 변화하는데, 이는 이량체화를 나타낸다. 이는 내인성 칼프로텍틴에서 S100A8/S100A9의 칼슘 의존성 이종사량체화와 동등하다.
도 4: 칼프로텍틴에 대한 단일클론 항체 27E10의 결합은 S100A8 및 S100A9(Hessian PA, Fisher L. The heterodimeric complex of MRP-8 (S100A8) and MRP-14 (S100A9). Antibody recognition, epitope definition and the implications for structure (2001). Eur. J. Biochem. 268: 353-363)의 이종이량체화를 필요로 한다. 융합 단백질은 BLI(생물층 간섭계) 측정에서 27E10 mAB에 대한 높은 친화성을 나타내며, 이는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 3D 구조가 내인성 칼프로텍틴 이종사량체의 이종이량체 표면 구조를 모방함을 시사한다.
도 5: 단일클론 포획 및 검출 항체를 갖는 재조합 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO:3)의 일련의 희석물을 사용하는 샌드위치 ELISA 측정. 포획 항체는 TMB 첨가 후 OD 450에서 농도 의존적 판독을 유도하는 HRP에 결합된다. 스파이크된 융합 폴리펩티드 농도(0.5 ug/ml에서 10 ug/ml까지)와 OD 450 신호의 선형 상관 관계는 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO: 3)가 농도 의존적 방식으로 단일클론 칼프로텍틴 항체에 의해 인식될 수 있음을 시사한다.
도 6: 다클론 항체와 재조합 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO: 3)의 일련의 희석물을 사용하는 탁도 측정. PETIA(입자 강화 탁도계 면역분석)는 또한 스파이크 융합 폴리펩티드 농도(0에서 21.7 ug/ml)와 상관되는 흡수 신호를 보여준다. 따라서, S100A8/S100A9에 대한 다중클론 항체는 또한 이의 구조가 내인성 칼프로텍틴을 모방함을 입증하는 본 발명의 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO: 3)를 쉽게 인식한다.
도 7: 23개의 혈청 인간 샘플에서 얻은 결과와 도 6에 설명된 탁도 면역 측정법의 비교. 이에 의해 첫번째 제형에서 면역분석은 정제된 내인성 칼프로텍틴(S100A8/A9 이종사량체)으로 교정되었고 두번째 제형에서는 본 발명의 재조합 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO: 3)를 사용하여 교정되었다. 그런 다음 두 결과 세트가 상호 연관되어 Passing-Bablok 플롯과 같이 표시되었다.
도 8: 실시예 5(도 5)에 기재된 바와 같은 단일클론 항체를 사용하는 ELISA로 본 발명의 재조합 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO:3)의 4가지 상이한 희석액 및 23개의 혈청 인간 샘플로부터 수득된 결과와 실시예 5(도 6)에 기술된 바와 같은 다중클론 항체를 사용하는 탁도 면역분석법의 비교. 이 실험을 위해 두 분석 모두 내인성 칼프로텍틴으로 교정되었다. 그런 다음 두 결과 세트가 상호 연관되어, Passing-Bablok 플롯과 같이 표시되었다.
도 9: SEQ-ID NO:3 융합 단백질의 부위 지정 돌연변이유발 및 그 결과. S100A8/S100A9의 이종사량체화, 즉 S100A9 폴리펩티드 사슬의 E78A를 손상시키는 이전에 기술된 돌연변이(EP3248015 A1)가 융합 단백질에 도입되었다. 이 E78A 돌연변이는 CaCl2가 있는 경우에도 단량체로 남아 있다. 돌연변이되지 않은 융합 단백질을 이량체화를 나타내는 용리 부피로 이동시키는 완충 용액 A + 2mM CaCl2에서 S200 크기 배제 크로마토그래피(약 63 ml)는 칼슘을 첨가하지 않은 완충 용액 A와 비교할 때 E78A 돌연변이를 포함하는 융합 단백질의 용출 프로파일(약 56ml)을 변경하지 않는다.
본 발명은 가용성 칼프로텍틴을 발현시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 SEQ ID NO: 11에 대해 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 사슬, SEQ ID NO: 12와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 사슬 및 제1 사슬과 제2 사슬을 연결하는 링커를 포함하는 벡터로부터 칼프로텍틴을 발현시키는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 벡터 상의 제1 및 제2 사슬을 연결하는 링커는 18 내지 180개의 뉴클레오티드, 18 내지 120개의 뉴클레오티드, 18 내지 90개의 뉴클레오티드 또는 18 내지 60개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 21 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이 길이를 갖는 링커는 올바른 폴딩을 허용하기 위해 두 사슬의 충분한 근접성을 보장한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "S100A8"은 SEQ ID NO: 1을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. SEQ ID NO:11에 의해 코딩되는 인간 S100A8은 또한 당업계에서 Mrp8 또는 칼그래눌린 A로 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "S100A9"는 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. SEQ ID NO:12에 의해 암호화된 인간 S100A9는 또한 Mrp14 또는 칼그래눌린 B로서 당업계에 공지되어 있다.
S100A8과 S100A9의 이종이량체는 이 두 분자가 서로 접촉하는 즉시 자발적으로 형성된다. 금속 이온, 특히 Ca2+와 같은 2가 금속 이온의 존재 하에, 2개의 S100A8/S100A9 이종이량체가 이종사량체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서, "S100A8/S100A9의 올리고머"라는 용어는 하나 이상의 S100A8 및 S100A9 단량체를 포함하는 다량체를 포함하는 이종이량체, 이종사량체 및 올리고머를 지칭한다. 특히, 용어 "S100A8/S100A9의 올리고머"는 내인성 "칼프로텍틴", 즉 각각의 S100A8 및 S100A9의 2개의 단위를 포함하는 이종사량체를 지칭한다.
본 발명 이전에, 재조합 칼프로텍틴은 각각의 서브유닛을 봉입체로 개별적으로 발현시킨 다음, 서브유닛을 정제, 재접힘 및 이량체화하여 천연 발생 이종이량체 및 이종사량체를 형성함으로써 수득되었다. 이 과정은 노동 집약적일 뿐만 아니라 오류가 발생하기 쉽다. 왜냐하면, 그 과정에서 종종 분석적 가치가 거의 없는 동종이량체가 형성되기 때문이다.
본 발명자들은 놀랍게도 2개의 서브유닛을 연결하고 이들을 하나의 융합 단백질로 발현시킴으로써 정확하게 폴딩된 이종이량체가 발현 즉시 얻어지고, 따라서 후속 정제를 크게 용이하게 한다는 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 칼프로텍틴의 세포외 재접힘 단계를 포함하지 않는다. 달리 말하면, 본 발명의 방법은 칼프로텍틴이 발현 시 이미 정확하게 접혀 있음을 보장한다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 이종이량체는 천연 칼프로텍틴 이종이량체와 유사하게 2가 금속 이온의 존재 하에 이종사량체로 후속적으로 조립된다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 가용성 칼프로텍틴은 천연 칼프로텍틴과 구조적으로 본질적으로 동일하고, 따라서 S100A8/S100A9 이종이량체, 특히 단일클론항체 mAb27E10에 특이적인 단일클론항체에 결합할 수 있다.
클론 ID가 mAb27E10인 단일클론 항체는 Abcam, UK(ab17050) 또는 Santa Cruz Biotechnology, TX, USA(sc-33714)와 같이 상업적으로 얻을 수 있다. mAb27E10가 Hessian and Fisher, Eur. J. Biochem. 268, 353-363 (2001)에서 추가로 설명되었다.
본 발명은 추가로 다음을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
a) SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 사슬;
b) SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 사슬; 및
c) 제1 및 제2 사슬을 연결하는 링커, 여기서 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함하는 펩티드 링커이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 및 2 각각에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 2개의 사슬을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "80% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열"이라는 용어는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 각각의 순서를 포함한다. 모든 경우에, 동일성은 상응하는 아미노산 서열의 전체 길이에 대한 동일성이다.
SEQ ID NO: 1은 인간 S100A8에 상응하고 SEQ ID NO: 2는 인간 S100A9에 상응한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 인간 칼프로텍틴을 구성하는 2개의 단량체와 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 여기에서, 제1 사슬은 당업계에 공지된 S100A8의 동형 중 하나, 특히 93개의 아미노산을 갖는 동형(SEQ ID NO: 1)인 것으로 예상된다. 마찬가지로, 제1 사슬은 101, 116 또는 117개의 아미노산을 갖는 S100A8 동형에 해당할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 제1 사슬은 바람직하게는 적어도 80, 85 또는 90개 아미노산 길이이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제1 사슬은 정확히 93, 20, 101, 116 또는 117개의 아미노산 길이이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 제2 사슬은 바람직하게는 적어도 90, 100 또는 110개 아미노산 길이이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제1 사슬은 정확히 114개 아미노산 길이이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에서, 2개의 사슬은 펩티드 링커에 의해 연결된다. 이러한 링커는 용이하게 적응되고 본 발명의 폴리펩티드에 통합될 수 있다는 이점이 있다.
바람직하게는, 펩티드 링커는 1 내지 20개의 아미노산 길이이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 5 내지 10개 아미노산 길이이다. 이러한 길이를 갖는 펩티드 링커는 내인성 칼프로텍틴에서 S100A9와 S100A8의 이량체 상호작용을 연상시키는 두 사슬 사이의 상호작용을 허용하는 방식으로 본 발명에 따른 폴리펩티드의 두 사슬을 연결하는 데 특히 적합하다.
펩티드 링커는 프로테아제 인식 서열, 즉, 프로테아제에 의해 인식되고 절단될 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이것은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제1 및 제2 사슬이 각각의 프로테아제의 첨가에 의해 서로 분리될 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, 이 구체예에 따른 폴리펩티드는 일단 발현되고 조립되면 Mrp8 및 Mrp14에 상응하는 2개의 사슬로 절단될 수 있고 그 결과 Mrp8과 Mrp14가 영구적으로 연결되지 않은 생리적 상태를 복원할 수 있다.
프로테아제 인식 서열의 많은 예가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 인식 서열은 라이노바이러스 3C 프로테아제(정밀 프로테아제)에 대한 LEVLFQGP, TEV 프로테아제에 대한 ENLYFQG, 트롬빈에 대한 LVPRGS, 인자 Xa에 대한 IEDGR 또는 엔테로펩티다아제에 대한 DDDDK일 수 있다.
링커는 제1 사슬을 N-말단으로 또는 C-말단으로 제2 사슬에 연결할 수 있다. 제1 사슬은 링커와 제2 사슬에 N-말단으로 연결된다. 이 배열은 E. coli에서 폴리펩티드의 가용성 발현을 촉진하기 때문에 유리하다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 금속 이온의 존재 하에 서로 올리고머화, 특히 이량체화할 수 있다. 바람직하게는, 금속 이온은 2가 금속 이온, 가장 바람직하게는 Ca2+이다. 올리고머화될 때, 본 발명의 폴리펩티드는 천연 발생 칼프로텍틴 이종사량체와 매우 유사한 구조를 형성할 수 있다. 이것은 내인성 칼프로텍틴의 검출을 목표로 하는 면역분석을 테스트하고 보정하는 데 유용하다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 내인성 칼프로텍틴을 포함하는 S100A8 단량체, S100A9 단량체, S100A8/S100A9 이량체 및/또는 그의 올리고머를 인식하는 결합 시약에 의해 인식되는 구조를 형성할 수 있다.
결합 시약은 S100A8 단량체, S100A9 단량체, S100A8/S100A9 이량체 및/또는 이들의 올리고머, 특히 칼프로텍틴을 인식하는 임의의 실체일 수 있다. 결합 시약은 항체 또는 시바디, 나노바디, 모노바디, CAMELID HC 항체, 어피바디, TandAb, 바이사이클릭 페티드, DARPin, 아비머, 안키린 반복 서열, BiTE, DART, 안티칼린 또는 뉴클레오티드 서열의 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 정제(purification), 확인(identification), 국재화(localization) 및 인식(recognition)을 가능하게 하는 당업계에 공지된 태그, 마커, 인식 서열 또는 신호를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 크로마토그래피를 사용한 폴리펩티드의 효율적인 정제를 가능하게 하는 His-Tag를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드에 사용될 수 있는 다른 태그 또는 마커는 모두 당업자에게 공지된 FLAG-Tag, HA-Tag, Strep-Tag 또는 GFP이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열 7, 8, 9, 10, 18 또는 19에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 18 또는 19에 대해 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 18 또는 19에 대해 100% 서열 동일성을 갖는다. SEQ ID NO: 7 내지 10은 라이노바이러스 SC 프로테아제에 대한 프로테아제 서열을 포함하는 짧은 아미노산 서열에 의해 제1 또는 제2 사슬에 연결된 His-Tag를 포함하고 있어 His-Tag는 라이노바이러스 3C 프로테아제를 첨가하여 2개의 사슬과 링커를 포함하는 폴리펩티드의 일부로부터 절단될 수 있다. 따라서, SEQ ID NO: 7 내지 10을 갖는 폴리펩티드는 효과적으로 정제될 수 있고, His-Tag는 후속적으로 폐기될 수 있다. 또한, SEQ ID NO: 7 내지 10에 사용된 두 사슬 사이의 링커는 TEV 프로테아제에 대한 인식서열을 포함하고 있어 TEV 프로테아제가 첨가되어 두 사슬이 분리될 수 있다.
다른 구체예에서, SEQ ID NO: 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 His-Tag와 25개의 2개 사슬 사이에 동일한 프로테아제 인식 서열을 포함하여 His-Tag를 제거하고 단일 단계에서 두 사슬 사이를 절단할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사슬은 천연 발생 S100A8 및 S100A9와 비교하여 하나 이상의 특이적 돌연변이를 보유한다. 돌연변이는 사슬의 올리고머화 및/또는 특정 결합제에 의한 인식에 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 EP3248015 A1에 기재된 것과 같은 돌연변이를 가질 수 있고 이는 S100A8과 S100A9의 이종이량체 사이의 올리고머화를 방지한다. 이러한 폴리펩티드는 외부 조건에 의해 영향을 받지 않는 잘 정의된 구조를 제공하기 때문에 교정기 또는 표준으로 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석 완충액이나 생물학적 시료에 존재하는 칼슘 이온 및/또는 기타 물질의 존재 하에서 이종사량체화되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건 하에 SEQ ID NO: 5의 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건 하에 SEQ ID NO: 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NO: 5는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 암호화하고, SEQ ID NO: 6은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 암호화한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화(hybridization)" 또는 "혼성화하다(hybridize)"는 핵산 분자의 가닥이 염기쌍을 통해 상보적 가닥과 결합하는 임의의 과정을 포함한다(J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). 혼성화 및 혼성화의 강도(즉, 핵산 분자 간의 결합 강도)는 핵산 분자, 관련된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 Tm, 핵산 분자 내 G:C 비율 사이의 상보성 정도와 같은 요인에 의해 영향을 받는다.
본 명세서에 사용된 용어 "Tm"은 "용융 온도"와 관련하여 사용된다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산 분자의 집단이 단일 가닥으로 반 해리되는 온도이다. 핵산 분자의 Tm을 계산하기 위한 방정식은 당업계에 잘 알려져 있다. 핵산 분자가 1M NaCl 수용액에 있을 때(예: Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985) 참조), 표준 참조에 표시된 대로 Tm 값의 간단한 추정은 다음 방정식으로 계산할 수 있다: Tm = 81.5 + 0.41 (% G+C). 다른 참조에는 Tm 계산을 위해 구조적 특성과 시퀀스 특성을 고려하는 보다 정교한 계산이 포함된다. 엄격한 조건은 당업자에게 알려져 있으며 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾을 수 있다.
특히 "엄격한 조건"이라는 용어는 조건을 의미하고, 여기서 상보적 핵산 분자(DNA, RNA, ssDNA 또는 ssRNA)와 동일하거나 단편인 100개 이상의 인접 뉴클레오티드, 150개 이상의 인접 뉴클레오티드, 200개 인접 뉴클레오티드, 250개 이상의 인접 뉴클레오티드가 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서 2 x SSC, 0.1% SDS에서 특정 핵산 분자(DNA, RNA, ssDNA 또는 ss RNA)로 세척된 50℃에서 1mM EDTA에서 혼성화된 동등한 조건에서 혼성화된다. 바람직하게는, 혼성화 조건은 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS로 세척된 50℃에서 1mM EDTA에서의 혼성화와 동등하며, 더 바람직하게는 혼성화 조건은 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS로 세척된 50℃에서 1 mM EDTA에서 혼성화와 동등하다. 바람직하게는, 상보적 뉴클레오티드는 단편 또는 전체 핵산과 혼성화한다. 대안적으로, 바람직한 혼성화 조건은 65℃에서 1 x SSC 또는 42℃에서 1 x SSC 및 50% 포름아미드 혼성화되고 65℃에서 0.3 x SSC로 세척 또는 50℃에서 4 x SSC에서 또는 40℃에서 6 x SSC 및 50% 포름아미드로 혼성화되고 2 x SSC에서 50℃에서 세척되는 것을 포함한다. 더 바람직한 혼성화 조건은 0.1% SDS, 0.1 SSD 및 65℃이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 추가로 프로모터, 뉴클레아제 인식 부위, 마커 유전자, 인핸서 및 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 및 형질전환에 유용한 기타 유전적 요소를 보유할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 올리고머를 형성할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 2개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 올리고머에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 올리고머는 본 발명에 따른 정확히 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드 올리고머는 2개의 S100A8 및 2개의 S100A9 단량체를 포함하는 내인성 칼프로텍틴 이종사량체에 해당한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 올리고머는 2가 금속 이온, 바람직하게는 Ca2+의 존재하에 형성된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 올리고머는 동물의 면역화에 사용될 수 있다. 본원에서 "면역화"는 대상체 또는 동물에서 면역 반응을 유도할 목적으로 대상체 또는 동물에 물질을 투여하는 것을 지칭한다. 면역 반응에는 항체 생성이 포함될 수 있다.
동물은 임상 연구 또는 산업 응용에 유용한, 예를 들어 생쥐, 쥐, 토끼, 염소, 개, 암탉, 상어, 낙타, 돼지 또는 원숭이와 같은 모든 동물일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역화할 때, 폴리펩티드는 예를 들어 추가 면역원성 화합물의 첨가에 의해 당업계에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.
면역화 과정에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 칼프로텍틴에 대한 항체를 얻기 위해 내인성 칼프로텍틴을 대체할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 올리고머는 또한 시험관내 선택 또는 S100A8 단량체, S100A9 단량체, S100A8/S100A9 이량체 및/또는 그의 올리고머, 특히 내인성 칼프로텍틴을 인식하는 결합 시약의 친화성 정제를 위한 에피토프로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 다량으로 용이하게 수득될 수 있기 때문에, 시험관내 선택 및 정제 방법에서 이들을 사용하면 재현 가능한 방식으로 적합한 결합 시약의 비용 효율적인 선택 및 정제가 가능하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 의약으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 의약은 면역 반응의 조절 또는 염증 과정의 감소/억제를 필요로 하는 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 보정 기준 물질로서 사용될 수 있다. 여기에서 보정 참조 물질은 모든 종류의 분석 검정의 추적성 및/또는 비교 가능성을 위한 것이거나 새로운 분석 검정을 수립할 때 표준으로 사용되는 (국제적으로 인정된) 1차 참조 물질(최고 등급)로 사용되는 물질을 참조하는 것으로 이해된다. 따라서 보정 기준 물질은 새로운 결합제 또는 분석 시스템의 민감도와 특이성을 테스트하는 데 사용할 수 있다. 마찬가지로 보정 기준 물질은 분석 검정을 보정하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 신규 분석법, 특히 면역분석법을 확립하는 방법 및 결합제의 시험 및 분석법 교정에 사용될 수 있다. 이들 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 에피토프 제시 및 결합 특성과 같은 천연 칼프로텍틴의 모든 필수 특성을 나타내지만 이전에 보정 기준 물질로 사용된 칼프로텍틴보다 얻기가 더 쉽기 때문에, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 보정 기준 물질로서 표준 이종이량체 또는 이종이량체 칼프로텍틴을 대체할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 분석 검정에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용하는 샘플에서 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이의 올리고머, 특히 칼프로텍틴을 측정하는 방법에 관한 것이다:
a) 분석 검정을 사용하여 상기 폴리펩티드의 상이한 양을 측정하는 단계;
b) a) 단계에서 얻은 분석 결과를 사용하여 검량선을 설정하는 단계;
c) 샘플을 측정하는 단계;
d) b) 단계의 검량선과 샘플의 분석 결과를 비교하는 단계; 및
e) 샘플에서 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이들의 올리고머의 농도를 정량화하는 단계.
당업자는 분석 검정을 보정하는 방법을 알고 있다. 간단히 말해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 상이한 양은 분석적 분석을 사용하여 측정되어 분석 결과를 얻은 다음 이를 보정 곡선을 설정하는 데 사용된다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 올리고머는 분석 검정을 위한 보정 기준 물질로서 사용된다. 이들의 단분산성 및 균질성으로 인해, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용한 보정은 빠르고 매우 신뢰할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 샘플은 동일한 분석 테스트를 사용하여 측정되고 이러한 측정의 분석 결과는 보정 곡선과 비교된다. 비교로부터, 샘플 내 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이들의 올리고머의 농도를 정량화할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 올리고머는 또한 대상체에서 급성 또는 만성 염증성 질환을 진단하는 방법에 사용될 수 있으며 하기 단계를 포함한다.
a) 피험자로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
b) 보정 기준 물질로서 본 발명에 따른 폴리펩티드 올리고머를 사용하여 a) 단계의 생물학적 샘플에서 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이의 올리고머, 특히 칼프로텍틴의 양을 정량화하는 단계; 및
c) b) 단계에서 결정된 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이의 올리고머의 양을 급성 또는 만성 염증성 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 대상체로부터의 참조 데이터와 비교하는 단계.
당업자는 다양한 유형의 급성 또는 만성 염증성 질환을 알고 있다. 예를 들어, 알레르기, 천식, 자가면역질환, 체강질환, 사구체신염, 간염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 크론병, 관류전 손상, 이식 거부반응, 감염성 대장염, 괴사성 장염, (장)낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직 척추염, 관절 종창, 건선, 건선 관절염, 베체트병, 치은염, 편도선염, 맹장염, 루푸스, 원인불명 발열, 패혈증, 심장병, 심근경색, 다발성 경화증 및 대장암과 같은 암이 그것이다. 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환은 염증성 장 질환, 특히 궤양성 대장염 또는 크론병, 및 염증성 관절염, 특히 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염 또는 강직성 척추염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 측면에서, 참조 데이터와 비교하여 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이의 올리고머, 특히 칼프로텍틴의 유의하게 증가된 양은 대상체가 급성 또는 만성 염증성 질환을 앓고 있음을 나타낸다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 올리고머를 사용하여 염증성 질환을 쉽고 확실하게 진단할 수 있고 이의 치료법을 모니터링할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 샘플은 당업계에서 사용되는 특정 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 타액, 소변, 눈물, 땀, 잇몸 틈새액, 대변, 위장관 세척액, 기관지 세척액, 세포 배양 상청액 또는 조직 추출물과 같은 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 대변 샘플 또는 혈액 샘플이다.
분석적 분석은 당업계에 공지된 임의의 분석적 분석, 예를 들어 면역분석, 생화학적 분석, 생물물리학적 분석 또는 물리적 분석일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석 검정은 효소 결합 면역 흡수 분석(ELISA), 측면 유동 면역 분석(LFIA) 또는 입자 강화 면역탁도 분석(PETIA)과 같은 고친화성 결합 시약에 의한 분석물의 인식을 필요로 하는 방법을 기반으로 하는 면역분석이다.
본 발명에 따른 방법에서, 샘플의 분석 결과는 광학 판독, 흡수, UV/VIS 분광법, 광산란, 탁도 측정, 측광 측정, 광산란, 반사 측정, 형광, 발광, 화학 발광, 표면 플라즈몬 공명, 전류 측정법, 자기 측정법, 전압 측정법, 전위차 측정법, 전도도 측정법, 전기량 측정법, 폴라로그래피, 중량 측정 혹은 캔틸레버 등을 기반으로 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석 결과는 흡수, UV/VIS 분광법, 광산란, 탁도 측정, 비구 측정, 반사 측정, 형광, 발광 또는 화학 발광에 의해 측정된 면역검정을 기반으로 한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 분석 결과는 흡수 분광법, 광산란 또는 화학발광에 의해 측정된 면역분석에 기초한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 키트와 관련된 것이다.
a) 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 이의 올리고머;
b) 테스트 용기(containment);
c) 완충 용액;
d) S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이들의 올리고머, 특히 칼프로텍틴에 특이적인, 바람직하게는 고체 지지체 상에 고정된 제1 결합 시약;
한 실시양태에서, 제1 결합 시약은 물질로 표지되거나 상기 폴리펩티드 및 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 그의 올리고머의 정량적 측정을 허용하는 물질에 결합된다.
테스트 용기는 그 안에서 분석적 검정을 수행하는 데 사용된다. 예를 들어, 테스트 용기는 테스트 카트리지, 멤브레인, 튜브, 타이터 플레이트 또는 베슬(vessel)일 수 있다.
당업자는 적절한 완충 용액을 선택하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 완충 용액은 포스페이트, 말레에이트(maleate), 클로로아세테이트, 포르메이트(formate), 벤조에이트, 피리딘, 피페라진, 프로피오네이트, 3-N-모르폴리노프로판설폰산(MOPS), 1,3-비스 트리스하이드록시메틸) 메틸아미노프로판(비스-TRIS), 트리스-(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS), 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄-말레산(TRIS-말레에이트), 2-(-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)에탄설폰산(TES), 1,4-피페라진비스-에탄설폰산)(PIPES), 4-모르폴리노에탄설폰산(MES) ), N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2에탄설폰산(HEPES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산(ADA), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산(ACES) 및 당업자에게 알려진 다른 것일 수 있다. 완충 용액은 염, 항균제, 계면활성제, 킬레이트제, 카오트로픽제, 및/또는 소포제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 S100A8, S100A9, S100A8/S100A9 또는 이들의 올리고머에 특이적인 제1 및 선택적으로 제2 결합 시약을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1/제2 결합 시약은 S100A8 및 S100A9를 포함하는 이종사량체, 즉 칼프로텍틴에 특이적이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1/제2 결합 시약은 S100A8 및 S100A9를 포함하는 이종이량체에 특이적이다. 그러나, 제1/제2 결합 시약이 S100A8 또는 S100A9 단량체에 특이적이라는 것이 본 발명에 의해 또한 예상된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 서열 때문에, S100A8, S100A9, S100A8/S100A9 또는 그의 올리고머에 특이적인 결합 시약은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체 상에 고정된다. 이를 통해 키트를 ELISA, LFIA 또는 PETIA에 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 제1/제2 결합 시약은 물질로 표지되거나 상기 폴리펩티드 및 S100A8, S100A9, S100A8/A9 또는 이들의 올리고머의 정량적 측정을 허용하는 물질에 결합될 수 있다. 당업자는 분석물의 정량적 측정에 사용할 수 있는 물질 또는 표지를 알고 있다. 예를 들어, 결합 시약은 라텍스, 형광성, (상자)자성, 유색 셀룰로오스, 제2철, 금 또는 실리카(나노) 입자; 형광단 또는 형광 염료; 양자점; 양고추냉이 과산화 효소(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 말산 탈수소효소, NADH 탈수소효소, 아세틸콜린에스테라제와 같은 효소; 루시페라제 또는 루미놀 및 유도체와 같은 화학발광 반응물; 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질과 같은 형광 단백질; 및 방사성 동위원소로 표시될 수 있다.
선택적으로 키트는 생물학적 샘플을 정제하는 수단을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 키트는 샘플에서 칼프로텍틴의 정량적 측정을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 특이적으로 이종이량체 또는 이종사량체를 형성하기 때문에, 키트에서 이들의 사용은 위양성을 피하고 따라서 샘플에서 칼프로텍틴의 신뢰성 있는 정량화를 가능하게 한다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 폴리펩티드의 제조.
SEQ ID NO: 5는 IPTG 유도성 T7 전사를 위해 PET21 벡터(Novagen) 내로 클로닝되었다. 발현 균주 E. coli BL21을 상응하는 플라스미드로 형질전환시켰다. IPTG에 의한 단백질 발현의 유도는 SEQ-ID NO: 3을 갖는 가용성 폴리펩티드를 얻기 위해 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 보다 구체적으로, 각각의 발현 균주는 100 ug/ml 카르베니실린이 포함된 LB 배지에서 37 ℃ 200 rpm에서 OD600 = 0.5까지 성장시켰다. 이어서, 세포 배양물을 18℃로 냉각시키고 OD600 = 0.8에서 0.2 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현 유도를 시작하였다. 발현은 대장균 발현 균주를 7,000 x g에서 원심분리에 의해 수확하고 완충 용액 A(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5% 글리세롤, 1 mM DTT)에서 세척하기 전에, 180℃ 200 rpm에서 14 내지 16시간 동안 수행되었다.
용해 완충 용액(완충액 A + 20mM 이미다졸)에서 유도된 발현 균주의 재현탁 및 초음파 처리(Branson Sonifier)에 의한 후속 세포 파괴는 20,000 x g에서 원심분리에 의해 세포 파편으로부터 가용성 단백질의 분리를 허용하였다. 상층액을 NiNTA 수지에 적용하고 정제된 융합 단백질을 이미다졸 구배로 용출시켰다. Q Sepharose 컬럼에 적용하면 NaCl 구배를 사용하여 핵산 오염 물질에서 융합 단백질을 분리하였다. S200 크기 배제 컬럼을 사용한 최종 정제 단계(도 1)는 완충 용액 A(도 2, 레인 3)에서 순수 및 단분산 융합 단백질을 발생시켰다.
실시예 2: 융합 폴리펩티드의 단량체로의 단백질 분해 절단.
이 버전의 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)에서 His-Tag와 S100A9 및 S100A9와 S100A8을 연결하는 3C 프로테아제 (PreScissionTM) 인식 서열로 인해, 단일 융합 폴리펩티드는 단백질 분해에 의해 3개의 폴리펩티드로 절단될 수 있고, 이는 3C 인식 서열(도 2, 레인 4)의 각 잔류 아미노산이 있는 유리 His-Tag, S100A8 및 S1OOA9에 해당한다.
실시예 3: Ca 2+ 이온의 존재하에서 재조합 융합 폴리펩티드의 이량체화.
재조합 융합 폴리펩티드는 S100A8 및 S100A9의 이종이량체인 내인성 칼프로텍틴과 특징을 공유한다. 2 mM CaCl2를 포함하는 완충 용액 A의 크기 배제 크로마토그래피는 이량체화를 나타내는 융합 단백질의 용출 부피에 상당한 변화를 제공하였으며, 이는 2개의 S100A8 및 S100A9 이종이량체의 칼슘 의존성 이종사량체화와 동일하다(도 3). 재조합 폴리펩티드 단량체(S100A8/S100A9 이량체와 동일)는 약 62 ml에서 용리되는 반면, 재조합 폴리펩티드 이합체(S100A8/A9 사량체와 동일)는 약 58 ml에서 더 빠르게 용리된다.
실시예 4: 본 발명에 따른 재조합 융합 폴리펩티드의 면역원성 특성.
기술된 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)은 내인성 칼프로텍틴과 유사한 면역원성을 나타낸다. S100A8 및 S100A9의 이량체에만 결합하지만 개별 단량체에는 결합하지 않는 단일클론항체 27E10 (Hessian PA, Fisher L. The heterodimeric complex of MRP-8 (SIOOA8) and MRP-14 (SIOOA9). Antibody recognition, epitope definition and the implications for structure (2001) Eur. J. Biochem. 268: 353-363). 단일클론항체 27E10를 Biacore 칩 센서에 고정하여 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)을 인식하였으며, 이는 표면 플라즈몬 공명(도 4)을 사용하여 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)과의 상호작용시 농도 의존적 반응 단위로 표시된다.
실시예 5: 본 발명에 따른 재조합 융합 폴리펩티드에 기초한 면역분석.
단일클론 포획 항체를 사용한 ELISA는 CaCl2의 존재 하에 다양한 농도의 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)로 수행되었다. HRP 결합 검출 항체를 사용하여 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸이벤지딘) 기반 색상 변화를 유도하였다. 산성 정지 용액을 첨가한 후, 450 nm에서 OD를 측정하고 A280 흡수 측정에 의해 이전에 평가된 스파이크 농도의 정제된 융합 단백질(SEQ-ID NO:3)과 비교하여 선형 상관관계를 보여주었다(도 5). 유사하게, 다클론 항체를 이용한 면역탁도법 테스트는 융합 단백질(SEQ ID NO: 3)이 내인성 칼프로텍틴(S100A8/S100A9)에 대해 기술된 것과 본질적으로 동일한 특성을 나타낸다는 것을 확증하는 다양한 농도의 융합 단백질(SEQ ID NO: 3) (도 6) 과 상관관계가 있고, 따라서 대변 샘플 또는 혈액 유래 과립구와 같은 내인성 인간 공급원으로부터 정제된 S100A8/S100A9와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
실시예 6: 본 발명에 따른 내인성 칼프로텍틴 또는 재조합 융합 폴리펩티드로 구성된 교정기의 상호교환성.
본 발명의 재조합 융합 폴리펩티드(SEQ ID NO: 3)를 교정자로 사용하여 23개의 인간 혈청 샘플을 탁도 측정하여 정제된 내인성 칼프로텍틴(S100A8/A9 이종사량체)을 교정기 물질로 사용한 동일한 면역분석 결과와 비교하였다. 결과는 서로에 대해 표시되었으며 사용된 교정기 재료와는 독립적으로 완벽한 상관관계(기울기 = 1.009; R2=0.999)를 나타내었다(도 7).
실시예 7: 본 발명의 융합 폴리펩티드는 다중클론 및 단일클론 항체에 대해 동일한 면역학적 특성을 나타낸다.
4개의 상이한 희석액의 재조합 융합 폴리펩티드 및 23개의 혈청 인간 샘플을 실시예 5에 기재된 바와 같은 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 대 실시예 5에서 또한 기재된 다중클론 항체를 사용하는 탁도 면역분석으로 분석하였다. 이 실험을 위해 두 분석 모두 내인성 칼프로텍틴을 교정 물질로 사용하였다. 두 결과 세트는 상관 관계가 있었고 Passing-Bablok 플롯으로 표시되었다(도 8). 다중클론 대 단일클론 항체에 의해 생성된 결과 사이에 실질적으로 양적 차이가 관찰되지 않았고, 본 발명의 융합 폴리펩티드(SEQ ID NO: 3)도 인간 혈청 샘플에 대해서도 마찬가지였다.
실시예 8: 점 돌연변이를 도입함에 따른 본 발명의 융합 폴리펩티드(SEQ-ID NO: 3)의 이중화 또는 올리고머화의 방지.
부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 융합 단백질(SEQ-ID NO: 3)의 S100A9 사슬(EP3248015 A1 참조)에 돌연변이 E78A를 도입하였다. 내인성 칼프로텍틴에서 이 돌연변이는 이종이량체화를 폐기한다(Leukert N et al. Calcium-dependent tetramer formation of S100A8 and S100A9 is essential for biological activity (2006). J. Mol. Biol. 359: 961-972). 유사하게, 융합 단백질(SEQ-ID NO: 3) 내로 이 돌연변이의 도입은 CaCl2 의존성 이량체화를 방지하였다. 2 mM CaCl2를 함유하는 완충 용액 A에서 돌연변이 및 비돌연변이 융합 단백질(SEQ-ID NO: 3)의 S200 크기 배제 크로마토그래피를 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 수행하였다(도 9).
<110> Buehlmann Laboratories AG <120> Recombinant Protein <130> 38366-BHL-P-WO <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human S100A8/Mrp8 protein sequence <400> 1 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly 50 55 60 Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 85 90 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human S100A9/Mrp14 protein sequence <400> 2 Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile 1 5 10 15 Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu 20 25 30 Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe 35 40 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Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr 115 120 125 Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys 130 135 140 Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys 145 150 155 160 Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu 165 170 175 Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe 180 185 190 Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe 195 200 205 Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys Ser His 210 215 220 Glu Glu Ser His Lys Glu 225 230 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MRP8-3C Protease Seq.[Linker]-MRP14-3C Protease Seq.-HisTag <400> 4 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly 50 55 60 Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu Leu Glu Val 85 90 95 Leu Phe Gln Gly Pro Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn 100 105 110 Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly 115 120 125 His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys 130 135 140 Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile 145 150 155 160 Glu His Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser 165 170 175 Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His 180 185 190 Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro 195 200 205 Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro His 210 215 220 His His His His His 225 <210> 5 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of HisTag-3C Protease Seq.-MRP14-3C Protease Seq.[Linker]-MRP8 for expression in E.coli <400> 5 atgcaccatc atcaccatca cttggaagtt ctgtttcaag gcccaatgac gtgcaaaatg 60 agccagttgg aacgcaatat tgaaaccatc attaacacct ttcatcagta ttccgtcaaa 120 ctgggtcatc cggataccct taatcaaggg gaatttaaag agctggtacg caaagatctc 180 cagaatttcc tgaagaaaga aaacaagaac gagaaagtca tcgaacacat tatggaagat 240 ctggatacca acgcggataa acagttatcg tttgaggagt tcattatgct gatggcacgt 300 ctgacatggg cctcacatga gaaaatgcat gaaggcgatg agggtcctgg acatcatcac 360 aaaccggggt taggcgaagg aactccgtta gaagtgttgt ttcaaggtcc gatgctgacg 420 gaactggaga aagcgcttaa cagcattatt gacgtttacc acaaatacag tctgatcaaa 480 ggcaatttcc atgcggtata tcgtgacgat ctgaagaaac ttctcgaaac ggaatgtccc 540 cagtatatcc gcaagaaagg tgccgatgtg tggttcaaag aactggacat taacactgac 600 ggtgcagtga atttccagga atttctcatt ctggtgatca aaatgggcgt tgctgctcac 660 aagaaatcgc atgaagagtc tcacaaagaa taa 693 <210> 6 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence for expression of MRP8-3C Protease Seq.[Linker]-MRP14-3C Protease Seq.-HisTag in E.coli <400> 6 atgctgacgg aactggagaa agcgcttaac agcattattg acgtttacca caaatacagt 60 ctgatcaaag gcaatttcca tgcggtatat cgtgacgatc tgaagaaact tctcgaaacg 120 gaatgtcccc agtatatccg caagaaaggt gccgatgtgt ggttcaaaga actggacatt 180 aacactgacg gtgcagtgaa tttccaggaa tttctcattc tggtgatcaa aatgggcgtt 240 gctgctcaca agaaatcgca tgaagagtct cacaaagaat tggaagttct gtttcaaggc 300 ccaatgacgt gcaaaatgag ccagttggaa cgcaatattg aaaccatcat taacaccttt 360 catcagtatt ccgtcaaact gggtcatccg gataccctta atcaagggga atttaaagag 420 ctggtacgca aagatctcca gaatttcctg aagaaagaaa acaagaacga gaaagtcatc 480 gaacacatta tggaagatct ggataccaac gcggataaac agttatcgtt tgaggagttc 540 attatgctga tggcacgtct gacatgggcc tcacatgaga aaatgcatga aggcgatgag 600 ggtcctggac atcatcacaa accggggtta ggcgaaggaa ctccgttgga agttctgttt 660 caaggcccac accatcatca ccatcactaa 690 <210> 7 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HisTag-3C Protease Seq.-MRP14-TEV Protease seq.[Linker]-MRP8 <400> 7 Met His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met 1 5 10 15 Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn 20 25 30 Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn 35 40 45 Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu 50 55 60 Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met 85 90 95 Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly 100 105 110 Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr 115 120 125 Pro Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala 130 135 140 Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr 165 170 175 Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys 180 185 190 Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu 195 200 205 Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu 210 215 220 Glu Ser His Lys Glu 225 <210> 8 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HisTag-3C Protease Seq.-MRP8-TEV Protease seq.[Linker]-MRP14 <400> 8 Met His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met 1 5 10 15 Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His 20 25 30 Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp 35 40 45 Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys 50 55 60 Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala 65 70 75 80 Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala 85 90 95 Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu Glu Asn Leu Tyr 100 105 110 Phe Gln Ser Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu 115 120 125 Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro 130 135 140 Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu 145 150 155 160 Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His 165 170 175 Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu 180 185 190 Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys 195 200 205 Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu 210 215 220 Gly Glu Gly Thr Pro 225 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HisTag-TEV Protease seq.-MRP14-3C Protease Seq. [Linker]-MRP8 <400> 9 Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Thr 1 5 10 15 Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr 20 25 30 Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln 35 40 45 Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu Asp Leu 65 70 75 80 Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu 85 90 95 Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp 100 105 110 Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 115 120 125 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala 130 135 140 Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr 165 170 175 Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys 180 185 190 Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu 195 200 205 Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu 210 215 220 Glu Ser His Lys Glu 225 <210> 10 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HisTag-TEV Protease seq.-MRP8-3C Protease Seq. [Linker]-MRP14 <400> 10 Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Leu 1 5 10 15 Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys 20 25 30 Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp Leu 35 40 45 Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys Gly 50 55 60 Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val 65 70 75 80 Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala 85 90 95 His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu Leu Glu Val Leu Phe 100 105 110 Gln Gly Pro Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu 115 120 125 Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro 130 135 140 Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu 145 150 155 160 Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His 165 170 175 Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu 180 185 190 Glu Phe Ile Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys 195 200 205 Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu 210 215 220 Gly Glu Gly Thr Pro 225 <210> 11 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human S100A8/Mrp8 DNA sequence <400> 11 atgttgaccg agctggagaa agccttgaac tctatcatcg acgtctacca caagtactcc 60 ctgataaagg ggaatttcca tgccgtctac agggatgacc tgaagaaatt gctagagacc 120 gagtgtcctc agtatatcag gaaaaagggt gcagacgtct ggttcaaaga gttggatatc 180 aacactgatg gtgcagttaa cttccaggag ttcctcattc tggtgataaa gatgggcgtg 240 gcagcccaca aaaaaagcca tgaagaaagc cacaaagagt ag 282 <210> 12 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human S100A9/Mrp14 DNA sequence <400> 12 atgttgaccg agctggagaa agccttgaac tctatcatcg acgtctacca caagtactcc 60 ctgataaagg ggaatttcca tgccgtctac agggatgacc tgaagaaatt gctagagacc 120 gagtgtcctc agtatatcag gaaaaagggt gcagacgtct ggttcaaaga gttggatatc 180 aacactgatg gtgcagttaa cttccaggag ttcctcattc tggtgataaa gatgggcgtg 240 gcagcccaca aaaaaagcca tgaagaaagc cacaaagagt ag 282 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recognition sequence for Rhinovirus 3C Protease (Prescission protease) <400> 13 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> <220> <223> Recognition sequence for TEV protease <400> 14 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recognition sequence for thrombin <400> 15 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recognition sequence for factor Xa; X is E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D or E <400> 16 Ile Xaa Gly Arg 1 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recognition sequence for an enteropeptidase <400> 17 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 18 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recognition sequence for an enteropeptidase <400> 18 Met His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met 1 5 10 15 Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn 20 25 30 Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn 35 40 45 Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu 50 55 60 Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met 85 90 95 Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly 100 105 110 Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr 115 120 125 Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Ser Leu Val Ser Cys Leu 130 135 140 Ser Glu Asp Leu Lys Val Leu Phe Phe Arg Trp Gly Lys Ser Val Gly 145 150 155 160 Ile Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val 165 170 175 Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg 180 185 190 Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg 195 200 205 Lys Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp 210 215 220 Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly 225 230 235 240 Val Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 245 250 <210> 19 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HisTag-3C Protease Seq.- MRP8 (Isoform a)-3C Protease Seq.[Linker]- MRP14 <400> 19 Met His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met 1 5 10 15 Ser Leu Val Ser Cys Leu Ser Glu Asp Leu Lys Val Leu Phe Phe Arg 20 25 30 Trp Gly Lys Ser Val Gly Ile Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu 35 40 45 Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn 50 55 60 Phe His Ala Val Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu 65 70 75 80 Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu 85 90 95 Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile 100 105 110 Leu Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu 115 120 125 Ser His Lys Glu Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Met Thr Cys Lys 130 135 140 Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe His 145 150 155 160 Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu 165 170 175 Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu 180 185 190 Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr 195 200 205 Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile Met Leu Met Ala 210 215 220 Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly 225 230 235 240 Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 245 250

Claims (26)

  1. SEQ ID NO: 11에 대해 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 사슬, SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 사슬 및 제1 사슬과 제2 사슬을 연결하는 링커를 포함하는 벡터로부터 칼프로텍틴을 발현시키는 단계를 포함하는, 가용성 칼프로텍틴을 얻는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 가용성 칼프로텍틴은 단일클론항체 mAb27E10에 결합할 수 있는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법은 칼프로텍틴의 세포외 재접힘 단계를 포함하지 않는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 18개 내지 180개 뉴클레오티드, 바람직하게는 21개 내지 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 프로테아제 인식 서열, 특히 라이노바이러스 3C 프로테아제 인식 서열, TEV 프로테아제 인식 서열, 트롬빈 인식 서열, 인자 Xa 인식 서열 또는 엔테로펩티다제 인식 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  6. a) SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 사슬;
    b) SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 사슬; 및
    c) 제1 및 제2 사슬을 연결하는 링커;를 포함하고,
    상기 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함하는 펩티드 링커인, 폴리펩티드.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 프로테아제 인식 서열은 라이노바이러스 3C 프로테아제 인식 서열, TEV 프로테아제 인식 서열, 트롬빈 인식 서열, 인자 Xa 인식 서열 또는 엔테로펩티다제 인식 서열인 폴리펩티드.
  8. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 금속 이온의 존재 하에 올리고머화할 수 있는, 폴리펩티드.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 2가 금속 이온, 바람직하게는 Ca2+ 이온의 존재 하에 이량체를 형성할 수 있는, 폴리펩티드.
  10. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 S100A8 단량체, S100A9 단량체, S100A8/S100A9 이량체 및/또는 이들의 올리고머를 인식하는 결합 시약에 의해 인식되는 구조를 형성할 수 있는 폴리펩티드.
  11. 제 4항에 있어서,
    SEQ ID NO: 3의 상기 폴리펩티드에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  12. 제 4항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 7 내지 10, 18 또는 19의 상기 폴리펩티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  13. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 올리고머.
  14. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머의 동물의 면역화를 위한 용도.
  15. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머의 SIOOA8 단량체, S100A9 단량체, SIOOA8/SIOOA9 이량체 및/또는 이들의 올리고머를 인식하는 결합 시약의 시험관 내 선택을 위한 에피토프로서의, 용도.
  16. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머의 S100A8 단량체, S1OOA9 단량체, SIOOA8/S1OOA9 이량체 및/또는 이들의 올리고머를 인식하는 결합 시약의 친화성 정제를 위한, 용도.
  17. 약제로 사용하기 위한, 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머.
  18. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머의 교정 기준 물질로서의, 용도.
  19. 분석 검정에서 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 사용하여 샘플 내 S1OOA8, S1OOA9, S1OOA8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머를 측정하는 하기의 단계들을 포함하는 방법:
    a) 분석 검정을 사용하여 상기 폴리펩티드의 상이한 양을 측정하는 단계;
    b) a) 단계에서 얻은 분석 결과를 사용하여 검량선을 설정하는 단계;
    c) 분석 검정을 사용하여 샘플을 측정하는 단계;
    d) 상기 샘플의 분석 결과를 b) 단계의 검량선과 비교하는 단계; 및
    e) 상기 샘플에서 S1OOA8, S1OOA9, S1OOA8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머의 농도를 정량화하는 단계.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 타액, 소변, 눈물, 땀, 잇몸 틈새액, 대변, 위장관 세척액, 기관지 세척액, 세포 배양 상청액 또는 조직 추출물인 방법.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 분석 검정이 면역분석, 생화학적 분석, 생물물리학적 분석 또는 물리적 분석인 방법.
  22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플의 분석 결과는 광학 판독, 흡수, UV/VIS 분광법, 탁도 측정, 비탁법, 광산란, 반사 측정, 형광, 발광, 화학 발광, 표면 플라즈몬 공명, 전류 측정법, 자기 측정법, 전압 측정법, 전위차 측정법, 전도도 측정법, 전기량 측정법, 폴라로그래피, 중량 측정법 또는 캔틸레버에 기반한, 방법.
  23. 대상체에서 급성 또는 만성 염증성 질환을 진단하는 하기 단계를 포함하는 방법에 사용하기 위한, 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머:
    a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공받는 단계;
    b) 교정 기준 물질로서 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 수득된 폴리펩티드 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머를 사용하여 a) 단계의 생물학적 샘플에서 S1OOA8, S1OOA9, S1OOA8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머의 양을 정량화하는 단계; 및
    c) b) 단계에서 결정된 S100A8, S100A9, S100A8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머의 양을 급성 또는 만성 염증성 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 대상체로부터의 기준 데이터와 비교하는 단계.
  24. 하기를 포함하는 키트:
    a) 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드, 또는 제 13항에 따른 폴리펩티드 올리고머;
    b) 테스트 용기(test containment);
    c) 완충 용액; 및
    d) S100A8, S100A9, S100A8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머에 특이적인 제1 결합 시약.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 제1결합 시약은 상기 폴리펩티드 및 S100A8, S100A9, S100A8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머의 정량적 측정을 가능하게 하는 물질로 표지되거나 물질에 결합되는 것인 키트.
  26. 제 25항에 있어서,
    S100A8, S100A9, S100A8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머에 특이적인 제2결합 시약을 추가로 포함하고, 상기 제1결합 시약은 고체 지지체 상에 고정되고, 상기 제2결합 시약은 상기 폴리펩티드 및 S100A8, S100A9, S100A8/A9 이량체 또는 이들의 올리고머의 정량적 측정을 가능하게 하는 물질로 표지되거나 물질에 결합되는 것인 키트.
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