KR101645113B1

KR101645113B1 - 가용성 면역반응성 트레포네마 팔리둠 ｔｐｎ４７ 항원

Info

Publication number: KR101645113B1
Application number: KR1020147022002A
Authority: KR
Inventors: 엘케 파츠; 페터 샤르슈미트; 우르반 슈미트; 크리슈티안 숄츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2016-08-02
Also published as: SG11201403953QA; JP2015506364A; WO2013107633A1; AU2013211242A1; CA2856187C; MX2014008293A; EP2804874B1; MX353464B; ES2561462T3; CN104080801A; EP2804874A1; HK1202126A1; EP2617731A1; KR20140108730A; CN104080801B; JP5985657B2; CA2856187A1; US20150079604A1; AU2013211242B2; US9316642B2

Abstract

본 발명은 완전한 TpN47 단백질 분자의 적어도 도메인 B, 또는 적어도 도메인 A 및 B, 임의로 도메인 D 를 포함하는 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 의 가용성 변이체로서, TpN47 의 도메인 C (아미노산 잔기 224 내지 351) 를 결여하는 항원에 관한 것이다. TpN47 항원은 샤페론에 융합될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 이러한 항원을 인코딩하는 DNA, 이러한 항원의 생산 방법 뿐만 아니라 단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 대한 항체의 탐지를 위한 면역진단 검정에서 이러한 항원의 용도를 포함한다.

Description

가용성 면역반응성 트레포네마 팔리둠 ＴＰＮ４７ 항원 {SOLUBLE IMMUNOREACTIVE TREPONEMA PALLIDUM TPN47 ANTIGENS}

본 발명은 적어도 TpN47 단백질 분자의 아미노산 잔기 63 내지 174 (즉, 도메인 B) 를 포함하는 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 항원 47 (TpN47) 의 가용성, 안정적 및 면역반응성 변이체로서, TpN47 의 아미노산 224 내지 351 (즉, 도메인 C) 를 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 TpN47 항원에 관한 것이다. 본 발명은 또한 도메인 B 및 D 또는 도메인 A+B 및 D 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, 또한 도메인 C 를 결여하는 항원에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 이러한 가용성, 안정적 및 면역반응성 TpN47 변이체의 생산 방법 뿐만 아니라 단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 대한 항체의 탐지를 목적으로 하는 면역진단 검정에서 이러한 항원의 용도에 관한 것이다.

트레포네마 팔리둠은 스피로헤타 (spirochetes) 의 세균 과에 속하고, 매독 (syphilis) 의 원인인자이다. 루에스 (Lues) 로도 호칭되는 매독은 주로 성적 접촉에 의해 전파된다. 트레포네마 팔리둠은 또한 임신 동안 어머니로부터 아기에게 전달될 수 있다. 이 질환은 구별되는 임상 단계 및 및 장기간의 잠복, 무증상 감염을 특징으로 한다. 많은 사람들이 증상을 의식하지 못하고, 따라서 그들의 매독 감염을 수년간 알지 못한다. 일차 감염은 국한되고, 통상적으로 작은 무통 궤양을 야기한다 (초기 단계, "루에스 I"). 페니실린에 의해 처리되지 않은 채 방치되면, 이 질환은 두번째 단계 루에스 II 로 진행하며 (감염 후 약 8 주), 이는 독감 같은 증상, 가렵지 않은 피부 발진 및 부어오른 림프절을 수반한다. 수년 후에, 루에스 III 단계에서, 매독성 결절이 신체 전체에서 출현한다. 마지막 단계 (루에스 IV) 는 중추신경계가 파괴되어 최종적으로 신경 및 심장 장애, 전신 마비, 운동실조, 치매 및 실명을 초래하는 것을 특징으로 한다.

20 세기 중반에 페니실린이 도입된 이후 효과적인 요법이 이용가능해졌지만, 매독은 여전히 중요한 세계적 건강 문제로 남아 있다. 트레포네마 감염 환자를 식별하고, 항생제 요법을 지원하고, 이에 따라 매독의 전파를 방지하는 것은 의무적이다. 결과적으로, 신뢰할 수 있는 진단 도구 예컨대 트레포네마 팔리둠에 대한 항체의 탐지를 위한 면역검정을 제공하는 것이 필수적이다. 그러나, 혈청학적 적용에서 특이적 화합물로서 사용되기 위하여, 재조합 단백질은 여러 요건 예컨대 용해도, 안정성 및 항원성을 만족시켜야 한다.

트레포네마 팔리둠 (매독 감염의 원인인자) 의 막-연합 폴리펩티드 중 하나가, 434 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 큰 단백질인 TpN47 이다. TpN47 은 트레포네마에 대한 체액성 면역 응답에서 면역우성으로 여겨지며 (Folia Microbiol. (2003) 48 (4), 549-553), TpN47 대한 항체는 트레포네마-감염된 개체로부터의 인간 혈청에서 빈번히 발견된다. 따라서, 재조합 TpN47 의 가용성 및 항원성 변이체는 높은 민감성 및 특이성을 조합하는 트레포네마 항체의 탐지를 위한 면역검정을 확립하기 위한 매우 귀중한 구성요소일 것이다. 최선의 경우에, 그러한 항원은 IgG 및 IgM 분자 둘 모두의 탐지를 가능하게 할 것이다.

TpN47 의 재조합 변이체는 문헌에서 기재되었다. Journal of Immunology (1996) Jul 15;157(2):720-31 에서, Baughn 등은 TpN47 의 전체 서열을 포함하는 12-량체 펩티드 (중첩 (overlap) 8 아미노산 잔기, 오프셋 (offset) 4 아미노산 잔기) 의 에피토프 스캔에 대해 보고한다. 이러한 스캔에 기초하여, 저자들은 무려 10 개의 면역-우성 TpN47 조각 (9 내지 29 개 아미노산 잔기 길이) 을 기재한다. TpN47 의 결정 구조 및 도메인 위상기하학이 또한 기재되었다 (Journal of Biological Chemistry (2002), 277 (4), 41857-41864, Deka 등).

트레포네마 항체의 탐지를 위한 면역검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Rostopira 등 (Folia Microbiol. 48(4), 549-553, 2003) 은 TpN47 을 면역우성 항원의 하나로서 식별하는, TpN17 및 TpN47 항원의 조합을 사용하는 매독 진단을 위한 면역 검정을 기재한다. 이 공개에서 전장 TpN47 이 항원으로서 사용되었다.

본 발명자들은 대장균 (E. coli) 숙주 (BL21/DE3) 에서 TpN47 의 전장 변이체를 과잉생산했고, TpN47 항원을 동종으로 제조하는데 성공했다. 그러나, TpN47 의 전장 버전을 사용하는 본 발명자들의 초기 실험은 이러한 단백질이 35℃ 초과의 온도에서 응집하는 경향이 있음을 분명히 밝혔다. 탠덤 (tandem) 샤페론 융합물 예컨대 EcSlyD-EcSlyD 또는 심지어는 (더욱 열안정적인) EcSlpA-EcSlpA 의 융합에도 불구하고, 전장 TpN47 은 35 ℃ 초과의 온도에서 고분자량 연합물로 필연적으로 응집된다. 트레포네마 팔리둠은 상당히 온도-민감성인 병원체로 알려져 있으므로, 그것의 주요 막 단백질 중 하나가 온도 민감성을 공유한다는 발견은 별로 놀라워 보이지 않을 수 있다. 어쨌든, 면역검정에서 단백질성 성분의 열 유도성 응집 과정은 통상적으로 신호의 상실 또는 특이성의 상실을 초래한다. 따라서, 전장 TpN47 (심지어는 용해도-증강 샤페론 예컨대 SlyD 또는 SlpA 와의 융합물로) 이 심지어는 중간 정도로 상승된 온도 (> 35 ℃) 에서도 응집하는 경향이 있다는 사실은 이러한 분자의 DAGS 포맷의 민감성 면역검정에서의 단순하고 간단한 적용을 명백히 방해한다.

TpN47 에 대한 상세한 구조적 지식 (Deka 등 Journal of Biological Chemistry (2002), 277 (4), 41857-41864) 에도 불구하고, 선행 기술은 TpN47 의 현저한 열 불안정성을 개시하지 않을 뿐만 아니라, 열 유도성 응집 및 이에 수반되는 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 대한 항체의 탐지를 위한 면역-검정에서 민감성 상실의 문제를 극복하는 TpN47 항원 변이체도 개시하지 않는다.

Guo 등 (Xiamen Daxue Xuebao -Ziran Kexue Ban (2008), 47(6), 874-878) 은 대장균에서 재조합적으로 발현되는 특이적 가용성 TpN47 N- 또는 C-말단 절두된 (truncated) 돌연변이체를 기재한다. 그러나, 전장 TpN47 단백질의 열 불안정성 및 응집 경향의 문제는 다루어지지 않는다. 또한, Guo 등의 데이타는 TpN47 의 도메인 C 및 D (C190) 의 조합이 전장 TpN47 단백질의 항원성과 거의 동등함을 시사한다.

안정성 문제는 본 발명에서 적어도 TpN47 단백질 분자의 도메인 B (aa 63-174) 를 포함하는 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 의 가용성, 안정적 및 면역반응성 변이체로서, TpN47 의 도메인 C (aa 224-351) 를 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 TpN47 항원을 생성함으로써 해결되었다.

이러한 문제의 추가의 해결책은 도메인 B 및 D (SEQ ID NO. 1 의 aa 63-174 및 352 내지 434) 를 포함하는 가용성 TpN47 항원 또는 도메인 A+B 및 D (SEQ ID NO. 1 의 aa 26 내지 223 및 352 내지 434) 를 포함하는 TpN47 항원이다. 2 가지 변이체 모두 TpN47 의 도메인 C 를 결여한다.

본 발명은 적어도 도메인 B (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174) 또는 적어도 도메인 A+B (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223) 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원, 즉, TpN47 항원으로서, 도메인 C (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351) 를 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 TpN47 항원에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 도메인 B (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174) 및 도메인 D (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434), 또는 도메인 A+B (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223) 및 도메인 D (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434) 를 포함하는 가용성 TpN47 항원으로서, 도메인 C (SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351) 를 결여하는 항원에 관한 것이다. 이들 항원은 그것의 용해도를 추가로 증가시키기 위해 샤페론 또는 또다른 융합 파트너에 융합될 수 있다.

본 발명은 추가로 상기 TpN47 항원을 인코딩하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이고, 본 발명은 또한 작동가능하게 연결된 또는 통합된 위에 기재된 TpN47 항원을 인코딩하는 DNA 를 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 발현 벡터로 형질전환되 숙주 세포 및 또한 상기 TpN47 항원의 생산 방법에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 매독 탐지를 위한 시험관내 진단 방법, 즉, 상기 TpN47 항원 변이체를 사용하여 TpN47 에 대한 항체를 탐지하는 방법에 관한 것이며, 본 발명 또한 본 발명에 따른 TpN47 항원을 포함하는 시약 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명 또한, 예를 들어 TpN47 항원 및 TpN17 또는 TpN15 항원을 포함하는 두 가지 이상의 트레포네마 팔리둠 항원의 조성물에 관한 것이다. 또다른 구현예에서 상기 조성물은 TpN47 항원 및 TpN17 및 TpN15 항원 둘 모두를 포함한다. 부가적으로, 본 발명은 이러한 항원의 생산 방법 뿐만 아니라 단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 대한 항체의 탐지를 위한 면역-진단 검정에서 이러한 항원의 용도에 관한 것이다.

도 1-6 은 Superdex 200 HR 10/30 칼럼에서 구별되는 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 도메인 구축물의 분석적 겔 여과 프로파일을 보여주며, 실시예 5 를 또한 참고한다. 약 200 ㎕ 의 1.3 ㎎/㎖ 단백질 용액 (150 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA 에 용해된 융합 단백질) 이 SEC 칼럼에 적용되었고, 용리가 280 ㎚ 에서 유속 0.8 ㎖/min 에서 모니터링되었다. FPLC 표준 (밝은 회색 점선) 은 β-갈락토시다제 (465 000 Da), 양 (sheep) IgG (150 000 Da), 양 IgG Fab 조각 (50 000 Da), 말 (horse) 미오글로빈 (17 000 Da), 및 디펩티드 글리신-티로신 (238 Da) 을 함유한다.
모든 단백질 구축물이 몰농도 15.2 μM - 26.5 μM 과 대등한 농도 1.3 ㎎/㎖ 에서, 동일한 완충액 농도 (150 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA) 하에 밤새 인큐베이션 (18 h) 에서 상승된 온도 (35℃, 40℃) 에 적용되었다. 열 스트레스에 뒤이어, 단백질 샘플이 원심분리에 적용되었고, 그 후 위에 기재된 바와 같은 FPLC 분석에 의해 응집 경향에 대해 평가되었다.
도 1 은 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (26-223) 의 열안정성을 보여준다. 300 ㎍ 단백질에 상응하는 230 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃, 35℃ 및 40℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/AB 의 용리 프로파일은 매우 잘 일치한다. 응집 또는 연합 과정에 대한 힌트가 전혀 없다. 280 ㎚ 에서의 흡수에 의해 모니터링된 용리 프로파일은 심지어는 상승된 온도 예컨대 40℃ 에서도 가용성 단백질 조각 TpN47/AB 를 나타낸다.
도 2 는 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (63-174) 의 열안정성을 보여준다. 350 ㎍ 단백질에 상응하는 270 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃, 35℃ 및 40℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/B 의 용리 프로파일은 거의 완벽하게 일치한다. 응집 또는 연합 과정에 대한 힌트가 전혀 없다. 280 ㎚ 에서의 흡수에 의해 모니터링된 용리 프로파일은 단백질 조각 TpN47/B 가 심지어는 상승된 온도 예컨대 40℃ 에서도 가용성 및 안정적이라는 유력한 증거를 제공한다.
도 3 은 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/C (224-351) 의 열안정성을 보여준다. 200 ㎍ 단백질에 상응하는 154 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃ 및 35℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/C 의 용리 프로파일은 거의 완벽하게 일치한다. 그러나, 심지어는 35℃ 에서도, TpN47 C 의 매우 적은 부분이 겔 여과 칼럼의 보이드 부피 (void volume) 에서 용리하며 (연속적 어두운 회색 선), 이는 응집 과정의 시작을 나타낸다. 40℃ 에서 인큐베이션 후, 융합 단백질의 거의 3 분의 1 이 SEC 칼럼의 보이드 부피에서 용리하며, 이는 큰 응집된 단백질 입자의 형성을 나타낸다. 도 3 으로부터 TpN47 도메인 C 가 35℃ 초과의 온도에서 상당한 응집 경향을 보유함이 명백해진다.
도 4 는 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/CD (224-434) 의 열안정성을 보여준다. 250 ㎍ 단백질에 상응하는 195 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/CD 의 용리 프로파일은 매우 대칭적인 피크를 보여주며, 이는 가용성 및 동종 단백질을 나타낸다. 35℃ 에서 인큐베이션되었을 때, EcSlyD-EcSlyD-TpN47/CD 는 큰 응집된 단백질 입자를 형성하며, 이는 SEC 칼럼의 보이드 부피에서 단백질의 많은 부분이 용리함을 보여주는 상응하는 프로파일에 의해 판단된다 (연속적 어두운 회색 선). 40℃ 에서 인큐베이션 후, CD 융합 단백질의 라이온의 공유 (lion's share) 가 겔 여과 칼럼의 보이드 부피에서 용리한다 (연속적 검은색 선). 도 4 로부터 TpN47 의 C-말단 부분, 즉 융합 단백질 CD 가 심지어는 중간 정도로 상승된 온도 예컨대 35 ℃ 에서도 응집하는 높은 본질적 경향을 보유함이 명백하다.
도 5 는 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/D (352-434) 의 열안정성을 보여준다. 430 ㎍ 단백질에 상응하는 331 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃, 35℃ 및 40℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/D 의 용리 프로파일은 거의 구별하기 어렵고, 완벽하게 일치한다. 응집 또는 연합 과정에 대한 힌트가 전혀 없다. 280 ㎚ 에서의 흡수에 의해 모니터링된 용리 프로파일은 단백질 조각 TpN47/D 가 심지어는 상승된 온도 예컨대 40℃ 에서도 완벽하게 가용성 및 안정적이라는 유력한 증거를 제공한다.
도 6 은 Superdex 200 칼럼에서 분석적 겔 여과에 의해 평가된 전장 TpN47 변이체 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/ABCD (21-434) 의 열안정성을 보여준다. 117 ㎍ 단백질에 상응하는 90 ㎕ 가 칼럼에 적용되었다. 4℃ 에서 인큐베이션 후 TpN47/ABCD 의 용리 프로파일은 13.5 ㎖ 의 용리 부피에서 정확한 피크를 보여주며, 이는 가용성 및 동종 단백질을 나타낸다. 35℃ 에서 인큐베이션되었을 때, EcSlyD-EcSlyD-TpN47/ABCD 는 큰 응집된 단백질 입자를 형성하며, 이는 SEC 칼럼의 보이드 부피에서 단백질의 66 % 초과가 용리함을 보여주는 상응하는 프로파일에 의해 판단된다 (연속적 어두운 회색 선). 40℃ 에서 인큐베이션 후, 전장 TpN47 의 거의 96 % 가 겔 여과 칼럼의 보이드 부피에서 용리한다 (연속적 검은색 선). 도 6 으로부터 전장 TpN47 이 심지어는 중간 정도로 상승된 온도 예컨대 35 ℃ 에서도 응집하는 엄청난 본질적 경향을 보유함이 명백하다.
전장 단백질의 희소성으로 인해, 오직 117 ㎍ EcSlyD-EcSlyD 만 Superdex 칼럼에 적용되었으며 (더 낮은 흡수 신호를 초래함), 이는 다른 TpN47 변이체와 비교할 때 매우 적은 양이다. 그러나, 열 스트레스 평가는 각각의 TpN47 변이체에 대해 동일한 조건 하에 수행되었다.
도 7 은 면역우성 TpN47 항원 변이체에 대한 탐색에서 본 발명자들의 B-세포 에피토프 맵핑 계획을 보여준다. 상부에서: 전장 TpN47 (21-434, 도메인 ABCD 를 포함함) 과 TpN47 N-말단에 융합된 EcSlyD-EcSlyD. 중간 부분: 개별 TpN47 폴리펩티드 조각 (EcSlyD 에 대한 융합은 제시되지 않음), 사다리 모양 순서로: SEQ ID NOs. 8-16 에 따른 TpN47 폴리펩티드 조각 30-66, 106-132, 137-170, 197-219, 225-250, 273-296, 321-362, 368-388, 391-434; 실시예 4 에 따른 이들 펩티드의 면역반응성에 대한 실험 결과가 표 2 (도 8a-c) 에 제시되어 있다. 바닥: 전장 TpN47 에 상대적인 TpN47 도메인 B, AB, C, D 및 CD 의 위치 (EcSlyD-EcSlyD 에 대한 융합은 제시되지 않음); 실시예 4 에 따른 이들 TpN47 융합 변이체의 면역반응성 (즉, 항원성) 에 대한 실험 결과가 표 3 (도 9) 에 제시되어 있다.
도 8a-c 는 실시예 4 에서 수득된 결과를 포함하는 표 2: EcSlyD 샤페론에 융합된 짧은 (선형) 비구조화 TpN47 조각의 면역 반응성을 보여준다. 면역검정은 Elecsys^® 2010 분석기를 사용하여 수행되었다. 신호 동역학은 트레포네마-음성 샘플에 대해 수득된 평균 값에 상대적으로 정규화되어 있다. 트레포네마-양성 혈청은 Boca Biolistics (Coconut Creek, FL, USA) 로부터 구입되었고, 트레포네마-음성 대조군은 내부 혈액 공여자였다. 오른쪽 칼럼 (실험 10, 전장 TpN47) 은 도 8a, b 및 c 에서 동일함에 주의한다.
도 9 는 실시예 4 에서 수득된 결과를 포함하는 표 3: EcSlyD-EcSlyD 탠덤 샤페론에 융합된 큰 TpN47 조각 (도메인) 의 면역 반응성 (즉, 항원성) 을 보여준다. 면역검정은 Elecsys^® 2010 분석기를 사용하여 수행되었다. 신호 동역학 (SD) 은 트레포네마-음성 샘플에 대해 수득된 평균 값에 상대적으로 정규화되어 있다. 트레포네마-양성 혈청은 Boca Biolistics (Coconut Creek, FL, USA) 로부터 구입되었고, 음성 대조군은 내부 혈액 공여자였다.
도 10 은 표 4: 열 스트레스 (42℃ 에서 72h) 후 TpN47 도메인 AB (26-223) & B (63-174) 의 잔류 항원성을 보여준다. 기재된 바와 같이 도메인 AB 및 도메인 B 는 둘 모두 용해도-증강 탠덤 샤페론 모듈 EcSlyD-EcSlyD 에 융합되었다. 면역검정은 Elecsys^® 2010 분석기를 사용하여 수행되었다. 신호 동역학 (SD) 은 트레포네마-음성 샘플에 대해 수득된 평균 값에 상대적으로 정규화되어 있다. 트레포네마-양성 혈청은 SeraCare (MA, USA) 로부터 구입되었고, 트레포네마-음성 대조군은 Trina Bioreactives AG (Nanikon, Switzerland) 로부터 구입되었다.
도 11 은 표 5: 열 스트레스 (42℃ 에서 72h) 후 TpN47 도메인 C (224-351) & D (352-434) 의 잔류 항원성을 보여준다. 기재된 바와 같이 도메인 C 및 D 는 둘 모두 용해도-증강 탠덤 샤페론 모듈 EcSlyD-EcSlyD 에 융합되었다. 면역검정은 Elecsys^® 2010 분석기를 사용하여 수행되었다. 신호 동역학 (SD) 은 트레포네마-음성 샘플에 대해 수득된 평균 값에 상대적으로 정규화되어 있다. 트레포네마-양성 혈청은 SeraCare (MA, USA) 로부터 구입되었고, 트레포네마-음성 대조군은 Trina Bioreactives AG (Nanikon, Switzerland) 로부터 구입되었다.
도 12 는 표 6: 열 스트레스 (42℃ 에서 72h) 후 TpN47/CD (224-434) 및 전장 TpN47 (21-434) 의 잔류 항원성을 보여준다. 기재된 바와 같이 도메인 CD 및 전장 TpN47 은 둘 모두 용해도-증강 탠덤 샤페론 모듈 EcSlyD-EcSlyD 에 융합되었다. 면역검정은 Elecsys^® 2010 분석기를 사용하여 수행되었다. 신호 동역학 (SD) 은 트레포네마-음성 샘플에 대해 수득된 평균 값에 상대적으로 정규화되어 있다. 트레포네마-양성 혈청은 SeraCare (MA, USA) 로부터 구입되었고, 트레포네마-음성 대조군은 Trina Bioreactives AG (Nanikon, Switzerland) 로부터 구입되었다.
서열 목록에 상세히 제시된, 하기 단백질 서열이 본 명세서에서 사용된다:
SEQ ID NO. 1 은 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 전장 TpN47 을 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47 (Swiss Prot P29723 의 aa 21-434 TpN47 이 밑줄그어져 있다); 위치 315 에서, 시스테인이 알라닌으로 대체되었고, 정제 목적을 위해 헥사-히스티딘 tag 가 C-말단에 첨가되었다.

SEQ ID NO. 2 는 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 TpN47 의 도메인 AB 를 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (Swiss Prot P29723 의 aa 26-223 TpN47 이 밑줄그어져 있다); 정제 목적을 위해 헥사-히스티딘 tag 가 C-말단에 첨가되었다.

SEQ ID NO. 3 은 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 TpN47 의 도메인 B 를 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (Swiss Prot P29723 의 aa 63-174 TpN47 이 밑줄그어져 있다); 정제 목적을 위해 헥사-히스티딘 tag 가 C-말단에 첨가되었다.

SEQ ID NO. 4 는 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 TpN47 의 도메인 C 를 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47/C (Swiss Prot P29723 의 aa 224-351 TpN47 이 밑줄그어져 있다); 위치 315 에서, 시스테인이 알라닌으로 대체되었고, 정제 목적을 위해 헥사-히스티딘 tag 가 C-말단에 첨가되었다.

SEQ ID NO. 5 는 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 TpN47 의 도메인 CD 를 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47/CD (Swiss Prot P29723 의 aa 224-434 TpN47); 위치 315 에서, 시스테인이 알라닌으로 대체되었고, 정제 목적을 위해 헥사-히스티딘 tag 가 C-말단에 첨가되었다.

SEQ ID NO. 6 은 2 개의 대장균 SlyD 분자에 융합된 TpN47 의 도메인 D 를 보여준다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47/D (Swiss Prot P29723 의 aa 352-434 TpN47)

SEQ ID No. 7 은 실시예 1 에 묘사된 링커 서열 (GGGS)₅GGG 를 보여준다. 글리신-풍부 가요성 링커 서열이 2 개의 대장균 SlyD 분자 사이, 및 또한 SlyD 와 TpN47 항원 사이에 삽입되어 있다:

SEQ ID No. 8 은 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p02-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 30-66 을 보여준다:

SEQ ID No. 9 는 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p03-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 106-132 를 보여준다:

SEQ ID No. 10 은 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p04-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 137-170 을 보여준다:

SEQ ID No. 11 은 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p05-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 197-219 를 보여준다:

SEQ ID No. 12 는 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p06-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 225-250 을 보여준다:

SEQ ID No. 13 은 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p07-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 273-296 을 보여준다:

SEQ ID No. 14 는 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p08-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 321-362 를 보여준다:

SEQ ID No. 15 는 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p09-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 368-388 을 보여준다:

SEQ ID No. 16 은 TpN47 펩티드 EcSlyD-TpN47/p10-1, Swiss Prot P29723 에 따른 트레포네마 팔리둠 47 항원 서열의 아미노산 391-434 를 보여준다:

본 발명은 가용성 트레포네마 팔리둠 항원, 더욱 정확하게는 트레포네마 항원 TpN47 의 가용성 변이체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 TpN47 항원은 도메인 C (SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 224 내지 351) 를 결여하고, 시험관내 진단 면역검정에서 안정적 및 면역반응성이다.

형질전환된 원핵생물 숙주 세포로부터 전장 TpN47 을 동종으로 정제하는데 성공했다. TpN47 의 전장 버전을 사용하는 본 발명자들의 초기 실험은 이러한 단백질이 중간 정도로 상승된 온도에 노출되었을 때 응집하는 경향이 있음을 명백히 밝혔다. 전장 항원에 대한 고도 가용화 탠덤 샤페론 융합물 예컨대 EcSlyD-EcSlyD 또는 심지어는 (더욱 열안정적인) EcSlpA-EcSlpA 의 융합에도 불구하고, 전장 TpN47 은 35℃ 초과의 온도에서 고분자량 연합물로 필연적으로 응집된다. 전장 TpN47 에 의해 제기되는 안정성 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 대장균에서 샤페론 융합 단백질로서 짧은 TpN47 조각을 클로닝하고 과잉생산했고, 조각을 동종으로 정제했고 (쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 판단됨), 그들 각각의 항원성에 대해 평가했다. 요약하면, 이러한 접근은 완전한 실패였다. 놀랍게도, 조각 10 개 중 오직 1 개만이 유의한 (비록 상당히 불량했지만) 항원성을 보였다 (표 2/도 8a, TpN47 30-66 참고). 유망한 짧은 TpN47 조각의 나머지는 전혀 활성이 아니었다. 이러한 발견은 놀랍게도 Baughn 등, J. Immunol. (1996) 157 (2), 720-731 에 제시된 문헌 데이타와 상충되었다. 결과적으로, 전장 TpN47 의 열 유도성 응집을 피할 또다른 방법을 탐색해야 했다.

TpN47 의 짧고 아마도 구조화되지 않은 펩티드 조각에 집중하는 대신에, 본 발명자들은 TpN47 의 입체형태적으로 폴딩된 부분을 디자인하려고 시도했다. Journal of Biological Chemistry (2002), 277 (4), 41857-41864 에서, Deka 등은 TpN47 의 결정 구조를 제시하고, 이러한 단백질의 도메인 위상기하학을 밝힌다. 이러한 문헌에 따르면, TpN47 은 4 개의 도메인으로 이루어지며, 즉, TpN47 은 4 개의 자율 폴딩 유닛을 포함한다. 그러나, Deka 등은 식별된 도메인의 면역학적 특색에 대해서는 침묵한다.

놀랍게도, 본 발명자들은 대장균 숙주에서 TpN47 도메인 및 도메인 조합 AB, B, C, CD 및 D 를 성공적으로 발현시킬 수 있었다. 본 발명의 하나의 구현예에서, TpN47 항원은 샤페론 모듈 예컨대 SlyD, FkpA, SlpA 및 Skp 와의 융합물로 생성되었다. 모든 이들 구축물은 동종으로 정제되었고, 자동 Elecsys 분석기에서 인간 항-매독 혈청으로 그들의 항원성에 대해 평가되었다. 결과는 매우 명백했다: 항원성은 상당히 높았고 C < D < CD < B << AB 순서로 증가했다. 흥미롭게도, 도메인 C 는 온도 스트레스 검정에서 불안정한 것으로 확인될 수 있었다 (도메인 C 및 도메인 조합 CD 는 35 ℃ 초과의 온도에서 인큐베이션시 강하게 응집되었지만, AB, B 및 D 는 완벽하게 가용성으로 남았다). 간략히, AB, B 및 D 는 전장 TpN47 과 비교할 때 약간 감소된 항원성을 갖지만 현저히 개선된 용해도를 갖는 TpN47 조각으로서 확인되었다. 따라서, 본 발명자들의 디자인 실험의 데이타는 C 도메인을 결여하는 TpN47 변이체가 용해도 및 안정성에 관해서 유의하게 개선된다는 유력한 증거를 제공한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 항원은 그러므로 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47) 의 도메인 B 를 포함하고, TpN47 의 도메인 C 를 결여하며, 즉, 본 발명은 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 으로서, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 TpN47 항원에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 구현예는 도메인 A 및 B 를 포함하고, 도메인 C 를 결여하는 TpN47 항원이다. 이는 본 발명이 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 을 포함하고, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하는 가용성 TpN47 항원을 포괄함을 의미한다. 추가의 구현예에서 TpN47 항원은 도메인 B 또는 도메인 A+B 를 포함하며, 도메인 D 는 TpN47 항원의 부가적 부분이다. 그러나, 또한 이들 구현예에서 도메인 C 는 빠져 있다. 도메인 D 는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434 를 포함한다. 또한 이들 구현예에서 TpN47 항원은 샤페론과 융합되어 있다.

부가적 구현예는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 으로서, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434 (도메인 D) 를 부가적으로 포함하는 TpN47 항원에 관한 것이다.

추가의 구현예는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 을 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434 (도메인 D) 를 부가적으로 포함하는 TpN47 항원에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 용어 트레포네마는 유기체 트레포네마 팔리둠 (매독을 야기하는 병원체) 에 대한 완전한 용어의 짧은 형태이고, 두 용어 모두 호환되게 사용될 수 있다.

"TpN47 항원" 은 면역 검정에서 사용되는 항원으로서 적합한 TpN47 아미노산 서열을 함유하는 단백질이다. 이는 본 발명에 따른 항원이 생리적 완충 조건 하에, 예를 들어 세제의 첨가 없이 주위 온도에서 포스페이트 완충 시스템 중에서 가용성임을 의미한다. 항원은 또한 TpN47 에 특이적인 항체, 예컨대 예를 들어 인간 혈청과 같은 단리된 샘플에 존재하는 항-TpN47 항체에 결합할 수 있거나 또는 그에 의해 인지되고 결합될 수 있다.

본 발명에 따르면 또한 TpN47 항원의 변이체가 포함된다. 이 문맥에서 용어 "변이체" 는 상기 단백질과 실질적으로 유사한 단백질 또는 단백질 조각 (즉, 폴리펩티드 또는 펩티드) 에 관한 것이다. 특히, 변이체는 가장 우세한 단백질 동형 (isoform) 의 아미노산 서열과 비교되는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 보이는 동형일 수 있다. 하나의 구현예에서, 그러한 실질적으로 유사한 단백질은 단백질의 가장 우세한 동형과 80% 이상, 또다른 구현예에서 85% 이상 또는 90% 이상, 또다른 구현예에서 95% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 용어 "변이체" 는 또한 번역후 수식된 단백질 예컨대 글리코실화된 또는 인산화된 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 변이체는 시험관내 진단 면역검정에서 면역반응성이 유지되는 한, 즉, 변이체가 샘플에 존재하는 항-TpN47 항체에 여전히 결합하고 그것을 탐지할 수 있는 한 TpN47 항원 변이체로서 분류된다. "변이체" 는 또한 예를 들어 단백질 또는 항원에 대한 표지 또는 담체 모이어티의 공유적 또는 비공유적 부착에 의해 수식된 단백질 또는 항원이다. 가능한 표지는 방사성, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 효소 또는 기타 예를 들어 예컨대 디그옥시게닌 또는 비오틴이다. 이들 표지는 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 항원은 또다른 단백질에 융합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "융합 단백질" 은 본 발명에 따른 TpN47 항원에 상응하는 하나 이상의 단백질 부분 및 융합 파트너로서의 역할을 하는 또다른 단백질에서 유래하는 하나 이상의 단백질 부분을 포함하는 단백질을 언급한다.

본 발명의 또다른 구현예에 따르면 TpN47 항원은 샤페론에 융합될 수 있다. 고전적 폴딩 헬퍼 (classical folding helper) 로서 알려진, 샤페론은 다른 단백질의 폴딩 및 구조적 완전성의 유지를 돕는 단백질이다. 폴딩 헬퍼의 예는 WO 03/000877 에 상세히 기재되어 있다. 본 발명에 따르면 펩티딜 프롤릴 이소머라제 클래스의 샤페론 예컨대 FKBP 패밀리의 샤페론은 TpN47 항원에의 융합에 사용될 수 있다. TpN47 항원에 대한 융합 파트너로서 적합한 FKBP 샤페론의 예는 FkpA, SlyD 및 SlpA 이다. TpN47 에 대한 융합 파트너로서 적합한 추가의 샤페론은 FKBP 패밀리에 속하지 않는, 대장균으로부터의 주변세포질 삼량체 샤페론, Skp 이다. 샤페론의 완전한 서열을 사용하는 것이 항상 필요한 것은 아니다. 요구되는 능력 및 기능을 여전히 보유하는 샤페론의 기능적 조각 (소위 결합-적격 모듈) 이 또한 사용될 수 있다 (WO 98/13496 참조).

본 발명의 추가의 구현예에 따르면 FKBP 샤페론 예컨대 예를 들어 대장균 SlyD, SlpA 또는 FkpA 의 하나 이상의 또는 두 개 이상의 모듈이 TpN47 항원의 발현을 위한 융합 모이어티로서 사용된다. 또한 샤페론 Skp 도 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 2 개의 FKBP-샤페론 도메인의 융합은 결과적인 융합 폴리펩티드의 개선된 용해도를 초래한다. 융합 모이어티는 TpN47 항원의 N-말단에 또는 C-말단에 또는 양쪽 말단에 (샌드위치 처럼) 위치할 수 있다.

본 발명에 따른 TpN47 항원은 재조합 DNA 기술에 의해 생성 및 제조될 수 있다. 그러므로 본 발명의 또다른 양상은 위에 정의된 TpN47 항원 및 그의 변이체를 인코딩하는 재조합 DNA 분자이다.

용어 "재조합 DNA 분자" 는 유전 공학 기술 또는 화학적 합성에 의한 폴리뉴클레오티드의 단리된 분절의 인공 조작으로 달성되는 서열의 2 개의 그렇지 않은 경우 분리된 분절의 조합으로 제조되는 분자를 언급한다. 그렇게 함으로써 원하는 기능의 폴리뉴클레오티드 분절들을 함께 연결하여 기능들의 원하는 조합을 생성할 수 있다. 원핵생물 또는 저등 또는 고등 진핵생물 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위한 재조합 DNA 기술이 당업계에 잘 알려져 있다. 이는 예를 들어 Sambrook 등 (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 에 의해 기재되었다.

본 발명의 추가의 주제는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 에 따른 아미노산 서열을 포함하는 TpN47 항원에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47) 을 인코딩하는 재조합 DNA 분자로서, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 에 대한 코딩 영역을 결여하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 구현예에서 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 에 따른 아미노산 서열을 포함하는 TpN47 항원을 인코딩하고, 상기 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 에 대한 코딩 영역을 결여한다.

본 발명의 추가의 구현예에서 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 또는 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 에 따른 아미노산 서열을 포함하는 TpN47 항원을 인코딩한다. 또한, 재조합 DNA 분자는 도메인 D, 즉, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352 내지 434 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩한다. 이전에 기재된 바와 같이, 또한 이들 구현예에서 상기 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 에 대한 코딩 영역을 결여한다.

본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는 TpN47 항원과 융합 모이어티 사이에 및 또한 여러 융합 모이어티 사이에 10 내지 100 개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 인코딩하는 서열을 또한 함유할 수 있다. 그러한 링커 서열은 예를 들어 단백질가수분해 절단 자리를 보유할 수 있다.

본 발명의 추가의 양상은 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자, 즉, TpN47 항원을 인코딩하는 재조합 DNA 분자 또는 TpN47 항원 및 펩티딜 프롤릴 이소머라제 샤페론, 예컨대 FKBP-샤페론을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터이며, 여기서 FKBP-샤페론은 FkpA, SlyD 및 SlpA 로부터 선택된다. 대안적 구현예에서 재조합 DNA 분자는 TpN47 항원 및 Skp 를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 본 발명에 따른 재조합 DNA 를 포함하는 발현 벡터는 무세포 번역 시스템에서 TpN47 항원을 발현시키는데 사용될 수 있거나 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 TpN47 항원의 발현을 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 또다른 양상은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에서 재조합 TpN47 항원은 대장균 세포에서 생성된다.

TpN47 항원 및 샤페론 예컨대 Skp 또는 펩티딜 프롤릴 이소머라제 클래스 샤페론 예컨대 FKBP 샤페론을 함유하는 융합 단백질로서 생성될 수 있는, 가용성, 안정적 및 면역반응성 TpN47 항원의 생성 방법이 또한 고려된다. 본 발명의 추가의 구현예에서 상기 FKBP 샤페론은 SlyD, FkpA 및 SlpA 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) TpN47 항원을 인코딩하는 유전자를 함유하는 위에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 배양;

b) 상기 TpN47 항원을 인코딩하는 유전자의 발현;

c) 상기 TpN47 항원의 정제.

임의로, 부가적 단계 d) 로서, 당업계에 공지된 리폴딩 기술에 의해 TpN47 항원을 가용성 및 면역반응성 입체형태로 만드는 기능적 가용화가 수행될 필요가 있다.

본 발명의 부가적 양상은 단리된 인간 샘플 중 항-트레포네마 항체의 탐지 방법으로서, 본 발명에 따른 TpN47 항원이 항체에 대한 결합 파트너로서 사용되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 따라서 단리된 샘플 중 트레포네마에 특이적인 항체의 탐지 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 포함한다:

a) 체액 샘플을 본 발명에 따른 TpN47 항원과 혼합함으로써 면역반응 혼합물을 형성하는 단계;

b) 체액 샘플에 존재하는 상기 TpN47 항원에 대한 항체가 상기 TpN47 항원과 면역반응하여 면역반응 산물을 형성하기에 충분한 시간 동안 면역반응 혼합물을 유지하는 단계; 및

c) 상기 면역반응 산물의 존재 및/또는 농도를 탐지하는 단계.

추가의 양상에서 상기 방법은 IgG 및 IgM 서브클래스의 트레포네마 항체를 탐지하는데 적합하다.

항체의 탐지를 위한 면역검정은 당업계에 잘 알려져 있고, 그러한 검정 및 실제 적용 및 절차를 수행하기 위한 방법도 당업계에 잘 알려져 있다. 사용되는 표지와 무관하게 그리고 탐지 방식 (예를 들어, 방사선동위원소 검정, 효소 면역검정, 전자화학발광 검정 등) 또는 검정 원리 (예를 들어, 시험 스트립 검정, 샌드위치 검정, 간접 시험 컨셉 또는 동질 검정 등) 와 무관하게, 본 발명에 따른 TpN47 항원을 사용하여 항-트레포네마 항체의 탐지를 위한 검정을 개선할 수 있다. 전문가에게 공지된 모든 생물학적 액체가 항-트레포네마 항체의 탐지를 위한 샘플로서 사용될 수 있다. 통상적으로 사용되는 샘플은 체액 예컨대 전혈, 혈청, 혈장, 소변 또는 타액이다.

본 발명의 추가의 구현예는 소위 이중 항원 샌드위치 컨셉 (Double Antigen Sandwich Concept: DAGS) 에 따라 수행되는 단리된 샘플 중 항-트레포네마 항체의 탐지를 위한 면역검정이다. 때때로 이러한 검정 컨셉은 이중 항원 가교 컨셉 (double antigen bridge concept) 으로도 호칭되는데, 이는 2 개의 항원이 항체 분석물에 의해 가교되기 때문이다. 그러한 검정에서 그것의 2 개 (IgG, IgA, IgE) 또는 10 개 (IgM) 파라토프로 항원의 두 개 이상의 상이한 분자에 결합하는 항체의 능력이 요구되고 이용된다.

더욱 상세히, 이중 항원 가교 포맷에 따른 항-트레포네마 항체의 확인을 위한 면역검정은 항-트레포네마 항체를 함유하는 샘플을 2 가지 상이한 TpN47 항원, 즉, 제 1 ("고체 상") TpN47 항원 및 제 2 TpN47 ("탐지") 항원과 함께 인큐베이션함으로써 수행되며, 여기서 각각의 상기 항원은 상기 항-트레포네마 항체에 특이적으로 결합한다. 제 1 항원은 고체 상에 직접 또는 간접 결합될 수 있고, 통상적으로 바이오아핀 (bioaffine) 결합 쌍의 일부인 효과기 예컨대, 예를 들어, 비오틴 및 아비딘을 보유한다. 예를 들어, 제 1 항원이 비오틴에 접합되는 경우, 고체 상은 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 제 2 항원은 표지를 보유한다. 따라서 제 1 항원, 샘플 항체 및 제 2 항원을 포함하는 면역-반응 혼합물이 형성된다. 제 1 항원이 결합될 수 있는 고체 상은 상기 항원에 샘플이 첨가되기 전에 또는 면역반응 혼합물이 형성된 후에 첨가된다. 이러한 면역반응 혼합물은 체액 샘플 중 상기 TpN47 항원에 대한 항-트레포네마 항체가 상기 TpN47 항원과 면역반응하여 면역반응 산물을 형성하기에 충분한 시간 동안 유지된다. 다음 단계는 분리 단계이며, 여기서 액체 상이 고체 상으로부터 분리된다. 마지막으로, 임의의 상기 면역반응 산물의 존재가 고체 또는 액체 상 또는 둘 모두에서 탐지된다.

상기 DAGS 면역검정에서 "고체상 항원" 및 "탐지 항원" 의 기본 구조는 본질적으로 동일하다. 이중 항원 가교 검정에서, 면역적으로 교차반응성인, 유사하지만 상이한 TpN47 항원을 사용하는 것이 또한 가능하다. 그러한 검정을 수행하기 위한 본질적 요건은 관련 에피토프 또는 관련 에피토프들이 항원 둘 모두에 존재하는 것이다. 본 발명에 따르면 각각의 TpN47 항원에 대해 상이한 융합 모이어티 (예를 들어 고체 상 측에 TpN47 에 융합된 SlyD 및 탐지 측에 TpN47 에 융합된 FkpA) 를 사용하는 것이 가능하며, 이는 그러한 변이가 비특이적 결합의 문제를 유의하게 완화시키고 따라서 거짓-양성 결과의 위험을 경감시키기 때문이다.

그러므로 본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 제 1 TpN47 항원 또는 융합 단백질, 및 본 발명에 따른 제 2 TpN47 항원 또는 융합 단백질이 사용되는 이중 항원 가교 컨셉에 따른 면역검정이다.

본 발명은 또한 항-트레포네마 항체의 탐지를 위한 진단 시험에서 TpN47 의 하나 이상의 항원의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 부가적 주제는, 면역검정을 위한 통상적 시험 첨가제에 더하여, 확인될 트레포네마 항체에 특이적으로 결합하기에 적합하고 가능하게는 표지를 보유하는 TpN47 항원의 하나 이상의 항원 뿐만 아니라 필요한 경우 기타 통상적 첨가제를 함유하는, 트레포네마에 대한 항체의 탐지를 위한 시약 키트이다. 특히 시약 키트는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 를 포함하는 TpN47 항원 또는 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 을 포함하는 TpN47 항원을 함유하며, 각각의 상기 항원은 SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 에 상응하는 서열을 결여한다. 상기 시약 키트의 일부인 항원은 샤페론에 융합되어 있다.

추가의 구현예에서 상기 시약 키트는 이전에 정의된 바와 같이 도메인 B 또는 A+B 를 포함하고, 부가적으로 도메인 D, 즉, SEQ ID NO. 1 의 아미노산 잔기 352-434 를 포함하는 TpN47 항원을 포함한다. 또한 이러한 구현예에서 TpN47 항원은 도메인 C 를 결여하며, 즉, 이러한 TpN47 항원에 아미노산 잔기 224-351 이 존재하지 않는다.

또한, 위에 정의된 시약 키트는 대조군 및 표준 용액 뿐만 아니라 당업자에 의해 사용되는 통상적 첨가제, 완충액, 염, 세제 등과의 하나 이상의 용액으로 시약을 함유한다.

또다른 양상은 백신으로서의 본 발명에 따른 TpN47 항원의 용도이다. 면역원성 폴리펩티드를 활성 성분으로서 함유하는 백신의 제조는 당업계에 공지되어 있다. 그러한 백신은 통상적으로 주사제로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다. 활성 성분, 즉, TpN47 항원 또는 그것의 융합 단백질은 약학적으로 허용가능하고 활성 성분 예컨대 예를 들어 물, 수성 생리적 완충액, 식염수, 덱스트로스, 에탄올과 화합성인 부형제와 혼합된다. 백신은 관습적으로 비경구적으로, 주사에 의해 투여된다.

또다른 구현예는 본 발명에 따른 TpN47 항원 및 TpN17 항원 및 TpN15 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 가지 이상의 부가적 트레포네마 팔리둠 항원을 포함하는 두 가지 이상의 트레포네마 팔리둠 항원의 조성물이며, 상기 조성물은 TpN47 항원, TpN17 항원 또는 TpN15 항원, 또는 TpN15 및 TpN17 항원 둘 모두를 포함한다. 또다른 추가의 구현예는 본 발명에 따른 TpN47 항원 및 TpN17 및 TpN15 항원 둘 모두를 포함하는 3 가지 이상의 트레포네마 팔리둠 항원의 조성물이다.

본 발명은 또한 항-트레포네마 팔리둠 항체의 탐지를 위한 시험관내 진단 시험에서 본 발명에 따른 TpN47 항원의 용도에 관한 것이다.

실시예 섹션은 본 발명의 추가로 설명한다. 특히, 실시예는 본 발명자들이 전장 TpN47 단백질 분자보다 가용성이 높고 열불안정성이 유의하게 낮은 TpN47 의 변이체를 개발하고 생성한 것을 설명한다. 용해도 및 안정성 둘 모두가 개선된다. 본 발명자들의 TpN47 변이체는 예를 들어 대장균에서 풍부하게 과발현될 수 있고, 고정된 금속 킬레이트 크로마토그래피 (IMAC) 를 통해 용이하게 정제되고 리폴딩되고, 만족스러운 안정성 특성을 나타내고, 인간 혈청 중 항-트레포네마 항체를 신뢰성 있게 탐지하는데 사용될 수 있다 (추가의 구현예에서 트레포네마 팔리둠으로부터의 2 가지 다른 면역-우성 막 단백질, TpN17 및/또는 TpN15 와의 조합으로). FkpA-TpN47/AB 및 Skp-TpN47/AB 융합 단백질이 심지어는 IgM 분자를 탐지하기에 충분한 에피토프 밀도를 갖는 천연 올리고머를 형성한다는 것이 주목할 만하다. 본 발명자들은 전체 면역글로불린의 탐지 (즉, IgG 및 IgM 둘 모두의 탐지) 를 위한 면역검정을 개발하는 것을 목적으로 하므로, 올리고머 종 FkpA-TpN47/AB 및 Skp-TpN47/AB 는 유리하게는 DAGS 포맷의 양측에서 지정자 (specifier) 로서 사용될 수 있다 (예를 들어 FkpA-TpN47/AB-비오틴 및 Skp-TpN47/AB-루테늄, 또는 그 반대).

실시예 1

TpN47 및 TpN47 샤페론 융합 폴리펩티드의 클로닝 및 정제

발현 카세트의 클로닝

Novagen (Madison, WI, USA) 의 pET24a 발현 플라스미드에 기초하여 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 융합 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 기본적으로 기재된 바와 같이 (Scholz, C. 등, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1241) 수득했다. TpN47 항원의 서열을 SwissProt 데이타베이스 (SwissProt ID P29723) 로부터 검색했다. N-말단에 인 프레임 (in frame) 융합된 글리신-풍부 링커 영역을 갖는 성숙 TpN47 aa 21-434 (아미노산 잔기 1-20 을 포괄하는 신호 펩티드가 생략되었음) 를 인코딩하는 합성 유전자를 Medigenomix (Martinsried, Germany) 로부터 구입했다. 원치 않는 부작용 예컨대 산화 또는 분자간 디설피드 가교를 방지하기 위해 위치 315 에서 TpN47 의 고유의 시스테인 잔기를 알라닌으로 변화시켰다. BamHI 및 XhoI 제한 자리가 각각 TpN47-코딩 영역의 5' 및 3' 말단에 있었다. 글리신-풍부 링커 영역을 통해 연결된 2 개의 EcSlyD 유닛 (SEQ ID NO. 1 에 따른 잔기 1-165, SwissProt accession no. P0A9K9) 을 인코딩하고 C-말단에서 추가의 링커 영역의 부분을 포함하는 추가의 합성 유전자를 마찬가지로 Medigenomix 로부터 구입했다. NdeI 및 BamHI 제한 자리가 각각 이러한 카세트의 5' 및 3' 말단에 있었다. 단순 결찰에 의해 샤페론 부분 EcSlyD-EcSlyD 및 TpN47 항원 부분의 인 프레임 융합을 가능하게 하도록 유전자 및 제한 자리를 디자인했다. 의도하지 않은 재조합 과정을 회피하고 대장균 숙주에서 발현 카세트의 유전적 안정성을 증가시키기 위해, EcSlyD 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 확장된 링커 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 축퇴시켰으며, 즉, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 상이한 코돈 조합을 사용했다.

pET24a 벡터를 NdeI 및 XhoI 로 소화시키고, 트레포네마 TpN47 조각 21-434 (Cys 315 Ala) 에 인 프레임 융합된 탠덤-SlyD 를 포함하는 카세트를 삽입했다. SlyD 또는 Skp 또는 FkpA 를 포함하는 발현 카세트, 뿐만 아니라 전장 TpN47 와 상이한 표적 폴리펩티드, 특히 도메인 및 도메인 조합 B (TpN47 63-174), AB (TpN47 26-223), C (TpN47 224-351), CD (TpN47 224-434) 및 D (TpN47 352-434) 를 포함하는 발현 카세트를 그에 따라 구축했다. 모든 재조합 융합 폴리펩티드 변이체는 Ni-NTA-지원 정제 및 리폴딩을 촉진하는 C-말단 헥사히스티딘 tag 를 함유했다. QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 표준 PCR 기술을 사용하여 각각의 발현 카세트 내에서 점 돌연변이, 결실, 삽입 및 확장 변이체 또는 제한 자리를 생성했다.

하기 도면은 그것의 N-말단에 인 프레임 융합된 2 개의 SlyD 샤페론 유닛을 보유하는 트레포네마 TpN47 전장 항원 21-434 의 도식을 보여준다. SlyD 융합 파트너의 대장균 기원을 표시하기 위해, 묘사된 융합 폴리펩티드는 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 (21-434) 로 명명되었다.

결과적인 플라스미드의 삽입물을 서열분석했고, 원하는 융합 단백질을 인코딩하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 개별 TpN47 항원의 완전한 아미노산 서열은 SEQ ID NOs. 1 내지 6 에 제시되어 있다. 링커 L 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 7 에 제시되어 있다.

TpN47 을 포함하는 융합 단백질의 정제

모든 TpN47 융합 단백질 변이체를 실질적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 정제했다. 특별한 pET24a 발현 플라스미드를 보유하는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 37℃ 에서 LB 배지 + 카나마이신 (30 ㎍/㎖) 에서 OD₆₀₀ 1.5 까지 성장시켰고, 1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시데를 첨가함으로써 시토졸 과발현을 유도했다. 유도 후 3 시간에, 세포를 원심분리 (5000 g 에서 20 min) 에 의해 수집하고, 동결시키고, -20℃ 에서 저장했다. 세포 용해를 위해, 동결된 펠렛을 차갑게 한 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 8.0, 7.0 M GdmCl, 5 mM 이미다졸에 재현탁시키고, 세포가 완전히 용해될 때까지 현탁액을 2 h 동안 얼음 위에서 교반했다. 원심분리 및 여과 (0.45 ㎛/0.2 ㎛) 후에, 미정제 용해물을 5.0 mM TCEP 를 포함하는 용해 완충액으로 평형시킨 Ni-NTA 칼럼 위로 적용했다. 후속 세정 단계를 각각의 표적 단백질에 맞춰 조정했고, 5 내지 15 mM 이미다졸 (50 mM 나트륨 포스페이트 pH 8.0, 7.0 M GdmCl, 5.0 mM TCEP 중) 범위었다. 적어도 10-15 부피의 세정 완충액을 적용했다. 그 후, GdmCl 용액을 50 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 10 mM 이미다졸, 5.0 mM TCEP 로 대체하여 매트릭스-결합 단백질의 입체구조적 리폴딩을 유도했다. 프로테아제의 동시정제의 재활성화를 회피하기 위해, 프로테아제 저해제 칵테일 (Complete^® EDTA-프리 (free), Roche) 을 리폴딩 완충액에 포함시켰다. 총 15-20 칼럼 부피의 리폴딩 완충액을 밤새 반응에서 적용했다. 그 후, 3-5 칼럼 부피 50 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 10 mM 이미다졸로 세정하여 TCEP 및 Complete^® EDTA-프리 저해제 칵테일을 제거했다. 후속적으로, 비특이적으로 결합된 단백질 오염물을 제거하기 위해 이미다졸 농도 (또한 50 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl 중) 를 25 mM 로 상승시켰다. 그 후 천연 단백질이 동일한 완충액 중 500 mM 이미다졸에 의해 용리되었다. 단백질-함유 분획을 트리신-SDS-PAGE 에 의해 순도에 대해 평가하고, 푸울링했다 (pool). 마지막으로, 단백질을 크기-배제-크로마토그래피 (Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia) 에 적용하고, 단백질-함유 분획을 푸울링하고, Amicon cell (YM10) 중 10-20 ㎎/㎖ 로 농축시켰다.

연결된 정제 및 리폴딩 프로토콜 후에, 각각의 표적 단백질에 따라 대략 5-20 ㎎ 의 단백질 수율이 1 g 의 대장균 습 (wet) 세포로부터 수득될 수 있었다.

실시예 2

분광 측정

Uvikon XL 이중-빔 분광광도계로 단백질 농도 측정을 수행했다. Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423 에 기재된 절차를 사용하여 몰 흡광 계수 (ε_M280) 를 확인했다. 구별되는 Tpn47 융합 폴리펩티드에 사용되는 몰 흡광 계수 (ε_M280) 가 표 1 에 명시되어 있다.

표 1: 이 연구에서 사용된 TpN47 융합 변이체의 단백질 파라미터

TpN47 도메인 변이체의 아미노산 서열이 SEQ ID No. 1 내지 6 에 제시되어 있다. TpN47 펩티드 변이체 p02-1 내지 p10-1 의 Swiss Prot P29723 로부터 유래하는 TpN47 특이적 서열이 SEQ ID NOs. 8 내지 16 에 제시되어 있다.

실시예 3

융합 단백질에 대한 비오틴 및 루테늄 모이어티의 커플링

융합 폴리펩티드의 라이신 ε-아미노 기를 각각 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 비오틴 및 루테늄 표지 분자로 단백질 농도 10-30 ㎎/㎖ 에서 수식했다. 표지/단백질 비율은 각각의 융합 단백질에 따라 2:1 에서부터 5:1 (mol:mol) 까지 다양했다. 반응 완충액은 150 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 1 mM EDTA 였다. 반응을 실온에서 15 min 동안 수행했고, 완충된 L-라이신을 최종 농도 10 mM 로 첨가함으로써 중단시켰다. 표지의 가수분해 불활성화를 회피하기 위해, 각각의 스톡 용액을 건조된 DMSO (세코졸브 품질 (seccosolv quality), Merck, Germany) 중에 제조했다. 반응 완충액 중 20% 이하의 DMSO 농도는 연구된 모든 융합 단백질에 의해 잘 용인되었다. 커플링 반응 후에, 미정제 단백질 접합체를 겔 여과 칼럼 (Superdex 200 HiLoad) 위로 통과시킴으로써 미반응 자유 표지를 제거했다.

실시예 4

폴리펩티드 융합 단백질의 면역 반응성

자동 Elecsys^® 2010 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 상이한 융합 단백질의 면역 반응성 (즉, 항원성) 을 평가했다. Elecsys^® 는 Roche group 의 등록 상표이다. 이중 항원 샌드위치 포맷으로 측정을 수행했다.

Elecsys^® 2010 에서의 신호 탐지는 전자화학발광에 기초한다. 비오틴-접합체 (즉, 포획-항원) 는 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드의 표면에 고정되어 있지만, 탐지-항원은 신호전달 모이어티로서 착물화된 루테늄 양이온 (산화환원 상태 2+ 와 3+ 사이에서 스위칭함) 을 보유한다. 특이적 면역글로불린 분석물의 존재 하에, 발색 루테늄 착물은 고체 상에 가교되고, 백금 전극에서 여기 후에 620 ㎚ 에서 광을 발한다. 신호 출력은 임의적 광 유닛이다.

재조합 트레포네마 TpN47 변이체를 이중 항원 샌드위치 (DAGS) 면역검정 포맷으로 쌍별 평가했다. 예를 들어, EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (26-223)-비오틴 접합체를 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (26-223)-루테늄 착물 접합체와 함께 각각 농도 70 ng/㎖ 에서 평가했다. 또한, EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (63-174)-비오틴 접합체를 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (63-174)-루테늄 착물 접합체와 함께 각각 농도 70 ng/㎖ 에서 적용했다.

TpN47 의 융합 폴리펩티드 변이체의 비오틴 및 루테늄 접합체를 각각 농도 70 ng/㎖ 에서 적용했다. 모든 측정에서, 화학적으로 중합된 표지되지 않은 EcSlyD-EcSlyD 를 항-간섭 물질로서 반응 완충액 중 과잉으로 (~ 10 ㎍/㎖) 사용하여 샤페론 융합 유닛을 통한 면역학적 교차 반응을 회피했다. 항-트레포네마 음성 인간 혈청을 대조군으로서 사용했다.

표 2 (도 8a-c) 에서, TpN47 펩티드 융합 변이체 (표 1 에 열거됨) 의 면역 활성이 제시되어 있다. 전장 TpN47 분자와 비교할 때 짧은 TpN47 조각의 항원성이 매우 불량함이 일견하여 명백하다. 오직 EcSlyD-TpN47/p02-1 (TpN47 30-66) 만, 비록 매우 낮은 정도이지만, 유의한 항원성을 나타낸다. 이러한 결과로부터 본 발명자들은 일부 약한 선형 에피토프가 TpN47 의 가장 N-말단 부분에 존재할 수 있지만, TpN47 분자의 나머지는 본 발명자들의 DAGS 설정에서 탐지가능한 선형 에피토프를 전혀 보유하지 않는다는 결론을 내린다. 이러한 발견은 트레포네마 항원 TpN47 내의 면역-우성 짧은 에피토프에 대해 보고하는 문헌 데이타 (Baughn 등, Journal of Immunology (1996) Jul 15;157(2):720-31) 와 현저히 상충한다. 이들 문헌 데이타와 대조적으로, 짧은 TpN47 조각을 이용한 본 발명자들의 실험 발견은 선형 에피토프가 트레포네마 감염에 뒤따르는 체액성 면역 응답에서 상당히 부차적인 역할을 수행함을 시사한다.

직접적인 결과로서, 본 발명자들은 선형 에피토프를 식별하려는 추가의 시도를 포기했고, 대신에 입체구조적 에피토프의 식별에 초점을 맞췄다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 Ranjit 등, J. Biol. Chem. (2002) 277 (44), pp 41857-41864 에 개시된 TpN47 도메인을 표적화했다. 비구조화 짧은 펩티드와 상이하게, 단백질의 단리된 도메인 (즉, 자율 폴딩 유닛) 은 한정된 입체구조를 취한다고 추측되고, 따라서 입체구조적 에피토프를 제시할 것으로 예상된다. 그러나, 전장 단백질의 구조적 맥락으로부터 절제되었을 때 단리된 TpN47 도메인이 천연 같은 입체구조를 취할 수 있는지 여부는 매우 불확실했다. 실제로, 작은 비구조화 TpN47 조각과 비교할 때 단리된 TpN47 도메인이 엄청나게 높은 면역 활성을 나타내는 것으로 드러났다 (결과에 대해 표 3, 도 9 참조). 이들 데이타로부터, 본 발명자들은 단리된 도메인이 실제로 질서가 잡힌, 천연 같은 입체구조를 취할 수 있다고 추론한다. 본 발명자들의 면역학적 평가로부터 판단되는 바와 같이, 도메인 조각의 항원성은 C<D<CD<B<AB<ABCD 순서로 증가한다; 특히, TpN47 도메인 조합 AB 는 항-트레포네마-양성 인간 혈청으로 전장 단백질의 신호 수준의 약 50% 를 초래한다.

실시예 5

FPLC 분석에 의해 평가되는 TpN47 도메인 융합의 열안정성

TpN47 도메인 (즉, 한정된 입체구조를 갖는 질서가 잡힌 자율 폴딩 유닛) 이 유의한 항원성을 나타낸다는 유력한 증거를 수집했으므로, 본 발명자들은 구별되는 도메인이 열 스트레스에 노출되었을 때 상이한 안정성을 보유할지 여부에 대해 궁금했다. 이 질문을 다루기 위해, 본 발명자들은 모든 본 발명자들의 TpN47 도메인 융합 단백질을 동일한 조건 하에 인큐베이션했고, 그들을 상승된 온도에 적용했다 (단백질 농도 각각 1.3 ㎎/㎖ 에서, 30℃, 35℃ 및 40℃ 에서 150 mM 칼륨 포스페이트 pH 8.0, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA 중 밤새 인큐베이션). 그 후, 본 발명자들은 모든 샘플을 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200) 에 의해 평가했고, 각각의 TpN47 융합 단백질에 대해 신호 회복 (흡수 곡선 아래 피크 면적) 및 응집 경향 (즉, 겔 여과 칼럼의 보이드 부피 중 큰 입자의 용리) 둘 모두를 체크했다 . 결과가 도 1-6 에 제시되어 있다. 온도-유도성 응집물을 형성하는 경향이 전장-TpN47> CD > C > D, B, AB 순서로 유의하게 감소하는 것으로 드러났다. 간략히, TpN47 도메인 D, B 및 AB 는 전장 TpN47 보다 응집 경향이 훨씬 낮았다. 열 스트레스시, 그들은 그들의 용리 프로파일에서 우수한 신호 회복을 예외 없이 보이고, 오직 무시해도 될 정도의 연합물 또는 응집물 형성 경향을 나타낸다. 반대로, 도메인 C (즉, 전장 TpN47, C, CD) 를 포함하는 모든 TpN47 변이체는 심지어는 중간 정도로 상승된 온도 예컨대 35℃ 에서도 강한 응집 경향을 나타낸다.

실시예 6

Elecsys ^® 측정에 의해 평가되는 면역검정에서 TpN47 도메인 융합물의 열안정성

Elecsys^® 측정에 의해 구별되는 TpN47 융합 단백질의 열내성을 확인하기 위해, EcSlyD-EcSlyD-TpN47 변이체를 하기와 같이 상승된 온도 조건에 적용했다: EcSlyD-EcSlyD-TpN47 비오틴 및 루테늄 접합체를, 별도로, 42 ℃ 에서 3 일 동안 인큐베이션했다. 이러한 스트레스 검정에서 접합체의 농도는 각각 70 ng/㎖ (~ 1 nM) 였고, 검정 완충액은 100 mM MES pH 6.5, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA 였다. 후속적으로, 열 스트레스를 받은 샘플을 위에 기재된 실험 조건 하에 Elecsys^® 2010 자동 분석기에서 그들의 잔류 면역 반응성 (즉, 그들의 잔류 항원성) 에 대해 평가했다. EcSlyD-EcSlyD-TpN47 의 공격받지 않은 샘플 (2-8 ℃ 에서 저장됨) 을 레퍼런스로서 사용했다.

실험 결과가 표 4-6 (도 10-12) 에 제시되어 있다.

표 4 (도 10) 는 기재된 바와 같은 자동 Elecsys^® 분석기에서 인간 항-트레포네마 양성 및 항-트레포네마 음성 혈청과의 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (26-223) 및 EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (63-174) 의 면역 반응성을 묘사한다. 42 ℃ 에서 가혹한 3-일-인큐베이션 전후의 항원 변이체 둘 모두의 성능이 제시되어 있다. 표 5 (도 11) 는 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 C (224-351) 및 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 D (352-434) 의 항원성을 묘사하고, 표 6 (도 12) 은 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 CD (224-434) 및 전장 TpN47 (21-434) 의 항원성을 나타낸다.

실험 결과는 신호 회복의 면에서 전장 TpN47 단백질보다 열-스트레스 받은 TpN47 도메인이 우수함을 명백히 입증한다.

열 공격시, 전장 TpN47 (21-434) 의 신호 회복은 초기 값의 대략 50 % 로 하락하지만, TpN47/B, TpN47/AB 및 TpN47/D 의 신호 회복은 각각 초기 값의 ~93 %, ~88 % 및 100 % 에 이른다. 따라서, 신호 회복은 전장 분자 대신에 TpN47 의 도메인을 사용할 때 현저히 증강된다.

TpN47 의 C 도메인 (224-351) 이 면역 활성을 전혀 나타내지 않는 것이 주목할 만하다 (결과에 대해 표 5, 도 11 참조). 이러한 발견은 다른 TpN47 도메인 및 도메인 조합 B, AB, CD 및 D 에 대해 발견된 항원성과 명백히 대조된다. 겉보기에는, C 도메인은 - 적어도 단리시 - TpN47 단백질 분자의 놀라운 항원성에 거의 또는 전혀 기여하지 않는다.

TpN47 의 CD 융합 변이체 (224-434) 는 열 스트레스에 뒤따르는 그것의 신호 회복이 대략 70% 에 이르고 다른 TpN47 도메인 및 도메인 조합보다 명백히 열등하다는 점이 주목할 만하다 (결과에 대해 표 6, 도 12 참조). D 도메인 단독의 신호 회복은 매우 높고, 열 스트레스 후에 거의 변함 없다 (표 5, 도 11 참조).

요약하면, 전장 TpN47 과 비교할 때 TpN47 도메인 B, AB 및 D 는 열 공격시 명백히 증강된 신호 회복을 보인다.

본 발명에 따르면, 도메인 C (224-351) 는 면역진단 목적에 불필요하며, 이는 그것이 TpN47 항원성에 눈에 띄게 기여하지 않기 때문이다. 게다가, 도메인 C 는, 도메인 D 에 융합되었을 때, 구축물 CD (224-434) 의 안정성을 약화시키며, 이는, 전장 TpN47 을 제외하고는, 시험된 모든 도메인 및 도메인 조합 중 최저 신호 회복을 보인다 (~ 70 %, 결과에 대해 표 6, 도 12 참조).

자동 면역검정 예컨대 Elecsys^® 에 의해 평가되는 구별되는 TpN47 도메인의 상대적 신호 수율 (열 스트레스시) 은 FPLC 분석에서의 본 발명자들의 발견과 상관관계가 있다. 이는 2 가지 실험이 매우 상이한 농도에서 수행되었으므로 더욱더 주목할 만하다: FPLC 분석에서 단백질 농도는 중간 마이크로몰농도 범위 (15.2 μM - 26.7 μM) 였지만, 면역학적 분석에서 단백질 농도는 매우 낮은 나노몰농도 범위 (0.82 nM - 1.44 nM) 였다. 응집-유도성 도메인 예컨대 TpN47 도메인 C 의 제거는 높은 단백질 농도의 조건 하에 최선의 결과를 초래할 것 (즉, 응집 효과를 완화시킬 것) 으로 예상된다. 본 발명자들의 면역학적 데이타는 도메인 C 의 제거가 심지어는 매우 낮은 단백질 농도의 조건 하에서도 나머지 TpN47 분자의 안정성 및 용해도 둘 모두를 명백히 개선함을 분명히 보여준다. 이러한 발견은 더욱 강력한 면역검정 키트의 개발을 가능하게 해주고, 항-트레포네마 항체의 TpN47-기반 혈청학적 탐지에서 중대한 성취를 이룬다.

본 발명자들의 실험은 전장 TpN47 이 35 ℃ 초과의 중간 정도로 상승된 온도에 노출되었을 때 극도의 응집 경향이 있다는 유력한 증거를 제공한다. 이들 관찰로부터, 본 발명자들은 검정 혼합물로부터 이러한 응집-경향 분자의 열-유도성 상실을 회피하기 위한 예방조치가 취해지지 않는 한, 전장 재조합 TpN47 의 사용이 임의의 트레포네마 면역검정의 특이성 및 민감성에 결정적이라고 추론한다. TpN47 의 열-유도성 응집을 회피 (또는 적어도 완화) 하는 단순하고 편리한 방법이 본 특허 출원에 개시되어 있다: 그것은, 명백히 항원성에 직접 기여하지 않고, 그 위에서, TpN47 분자 내의 일반적 탈안정화 인자를 구성하는 것으로 보이는, TpN47 도메인 C 를 단순히 생략하는 것으로 이루어진다. TpN47 도메인 C 가 배제되면 (AB, B 및 D 에서와 같이), TpN47 단백질 분자의 열안정성은 유의하게 완화된다.

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Soluble immunoreactive Treponema pallidum TpN47 antigens <130> 30807 WO-IR <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 797 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion of TpN47 full length 21-434 to tandem SlyD <400> 1 Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg 1 5 10 15 Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30 Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45 Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60 Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro 65 70 75 80 Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe 85 90 95 Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile Thr Ala Val 100 105 110 Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln 115 120 125 Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 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Leu Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Val Lys <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 197-219 <400> 11 Glu Asp Ser Arg Val Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met Leu 1 5 10 15 Thr Glu Asp Ser Phe Ser Ala 20 <210> 12 <211> 26 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 225-250 <400> 12 Met Glu Ser Pro His Asp Leu Val Val Asp Thr Val Gly Thr Gly Tyr 1 5 10 15 His Ser Arg Phe Gly Ser Asp Ala Glu Ala 20 25 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 273-296 <400> 13 Asn Phe Asn Thr Val Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Thr Asn Leu Met Ala Ser Tyr Gly 20 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 321-362 <400> 14 Phe Asp Arg Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ile Ala Asn Gly Tyr Arg Asp Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro 20 25 30 Lys Tyr Glu Gly Asn Ile Asp Ile Gly Leu 35 40 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 368-388 <400> 15 Thr Ile Gly Gly Ala Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp 1 5 10 15 Val Phe Ala Asp Gly 20 <210> 16 <211> 44 <212> PRT <213> Treponema pallidum Swiss Prot P29723 391-434 <400> 16 Lys Leu Val Ser Asp Gln Ala Val Ser Leu Gly Gln Asn Val Leu Ser 1 5 10 15 Ala Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Glu Val Arg Phe Lys 20 25 30 Glu Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val Ala Gln 35 40

Claims

Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47.
Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 을 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, 샤페론과 융합되어 있는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 352 내지 434 (도메인 D) 를 부가적으로 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47.
Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 63 내지 174 (도메인 B) 를 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 352 내지 434 (도메인 D) 를 부가적으로 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47.
Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 26 내지 223 (도메인 A+B) 을 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 로서, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 224 내지 351 (도메인 C) 을 결여하고, Swiss Prot P29723 의 아미노산 잔기 352 내지 434 (도메인 D) 를 부가적으로 포함하는 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 을 인코딩하는 재조합 DNA 분자.
작동가능하게 연결된 제 6 항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 7 항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
가용성 및 면역반응성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 의 생산 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
- 제 8 항에 따른 숙주 세포의 배양;
- 상기 TpN47 항원의 발현; 및
- 상기 TpN47 항원의 정제.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 및 TpN17 항원 및 TpN15 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 트레포네마 팔리둠 항원을 포함하는 두 가지 이상의 트레포네마 팔리둠 항원의 조성물.
단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 특이적인 항체의 탐지 방법으로서, 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 또는 조합이 포획 시약으로서, 상기 트레포네마 팔리둠 항체에 대한 결합 파트너로서, 또는 포획 시약 및 트레포네마 팔리둠 항체에 대한 결합 파트너로서 사용되는 방법.
단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 특이적인 항체의 탐지 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
a) 체액 샘플을 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원) 과 혼합함으로써 면역반응 혼합물을 형성하는 단계;
b) 체액 샘플에 존재하는 상기 트레포네마 항원에 대한 항체가 상기 트레포네마 항원과 면역반응하여 면역반응 산물을 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 면역반응 혼합물을 유지하는 단계; 및
c) 상기 면역반응 산물의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도를 탐지하는 단계.
삭제
적어도 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 가용성 트레포네마 팔리둠 항원 47 (TpN47 항원)을 포함하는, 항-트레포네마 팔리둠 항체의 탐지를 위한 시약 키트.
단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 특이적인 항체의 탐지 방법으로서, 제 10 항에 따른 항원의 조성물이 포획 시약으로서, 상기 트레포네마 팔리둠 항체에 대한 결합 파트너로서, 또는 포획 시약 및 트레포네마 팔리둠 항체에 대한 결합 파트너로서 사용되는 방법.
단리된 샘플 중 트레포네마 팔리둠에 특이적인 항체의 탐지 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
a) 체액 샘플을 제 10 항에 따른 두 가지 이상의 트레포네마 팔리둠 항원의 조성물과 혼합함으로써 면역반응 혼합물을 형성하는 단계;
b) 체액 샘플에 존재하는 상기 트레포네마 항원의 조성물에 대한 항체가 상기 트레포네마 항원의 조성물과 면역반응하여 면역반응 산물을 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 면역반응 혼합물을 유지하는 단계; 및
c) 상기 면역반응 산물의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도를 탐지하는 단계.
제 10 항에 따른 항원 조성물을 포함하는, 항-트레포네마 팔리둠 항체의 탐지를 위한 시약 키트.