본 발명에서는 간장이 정상에서 간염, 간경변 또는 간암으로 이행될 때 혈액 내에서 과량으로 나타나는 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 측정, 그 비율로서 간질환을 진단하는 방법이다.
이를 위한 본 발명은, (A) 혈청 시료의 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계; (B) 혈청 시료의 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계; (C) [(알파1산 당단백질의 농도)/(아사이알로 알파1산 당단백질의 농도)]값이 10% 이상이면 간질환인 것으로 판단하는 단계;를 포함하여 이루어지는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법을 제공한다.
또한 본 발명에서 상기 단계 (A)는 (a) 알파1산 당단백질의 1차 항체에 대한 2차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계; (b) 상기 고상체에 ① 1차 항체, ② 표지화된 알파1산 당단백질 및 ③ 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체에 대해 경쟁반응을 시키는 소단계; (c) 상기 경쟁반응 이후에, 결합된 [(고상체)-(2차 항체)-(1차 항체)-(표지화된 또는 표지화되지 않은 알파1산 당단백질)] 복합체 이외의 물질을 세척하는 소단계; (d) 상기 고상체에 표지화된 알파1산 당단백질과 특이결합하는 제2표지물질을 가하여 충분히 반응시키는 소단계; 및 (e) 상기 제2표지물질을 검출하여 알파1산 당단백질의 상대적 농도를 측정하는 소단계;를 포함하여 이루어질 수도 있다. 이때 상기 표지화된 알파1산 당단백질은 바이오티닐회된 알파1산 당단백질이며, 상기 제2표지물질은 streptavidin-HRP인 것이 바람직하다. 이외에도 표지화된 알파1산 당단백질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지화된 것이 바람직하다
또한 본 발명에서 상기 단계 (B)는 (a) 아사이알로 알파1산 당단백질의 1차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계; (b) 상기 고상체에 아사이알로 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체와 결합시키는 소단계; (c) 상기 결합 소단 계 이후에 아사이알로 알파1산 당단백질의 말단기에 노출된 당과 특이적으로 결합하는 표지물질을 가하여 반응시키는 소단계; 및 (d) 결합된 [(고상체)-(항체)-(아사이알로 알파1산 당단백질)-(표지물질)] 복합체 이외의 물질을 세척한 후 상기 표지물질을 검출하여 아사이알로 알파1산 당단백질의 (상대적) 농도를 측정하는 소단계;를 포함하여 구성될 수 있다. 이때 상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지된 렉틴인 것이 좋다.
본 발명에서는 상기단계 (A)와 (B)의 비율로서 간질환 여부를 판별한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서는, 알파1산 당단백질을 측정하기 위해 알파1산 당단백질을 인지하는 항체에 대한 경쟁반응법을 이용하였다. 즉, (a) 안정되고 많은 양의 항체가 반응하도록 항 마우스 IgG를 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 흡착시키고, (b) 고상체에 biotinylate로 접합시킨 알파1산 당단백질과 혈청 시료, 알파1산 당단백질에 대한 항체를 가하여 항체에 대해 혈청 중 알파1산 당단백질과 biotinylated 알파1산 당단백질이 경쟁하게 만들고 (c) 2차 표지물질이 결합된 스트렙타아비딘을 가하여 항체와 결합한 바이오티닐레이티드 알파1산 당단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질을 검출하여 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함한다.
또한 간이 정상에서 간염, 간경변 또는 간암으로 이행될 때 혈액내에서 과량 으로 형성되는 것으로 추정되는 아사이알로당단백질의 농도를 측정하기 위하여, 아사이알로당단백질에 대한 항체와 렉틴(lectin)을 이용하는 샌드위치 면역측정법을 제공한다. 즉, (a) 아사이알로당단백질에 대한 항체를 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 결합시키고, (b) 고상체에 혈청 시료를 가하여 혈중 아사이알로단백질을 항체에 결합시키고, (c) 표지물질이 접합된 렉틴을 가하여 항체에 결합한 아사이알로단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질을 검출하여 아사이알로단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함한다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다.
알파1산 당단백질의 양을 측정하기 위하여 알파1산 당단백질의 마우스 유래 1차 항체에 대한 2차 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고상체에 가하고 한시간 이상 방치하여 항체를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시킨다. 세척액, 예를 들어, 트윈(Tween)계 계면활성제가 함유된 인산염 완충액(PBS)으로 웰을 세척한다. 한편 혈청자체가 지니고 있는 matrix effect를 최소화하고 측정하고자 하는 시료가 표준곡선 내에 들게 하기 위해 혈청시료를 혈청시료 희석 용액으로 미리 희석시켜 놓는다. 상기 세척액으로 웰을 세척한 후, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질과 알파1산 당단백질이 들어있는 시료, 알파1산 당단백질에 대한 항체를 가해 항체에 대해 경쟁시키고 효소 또는 형광물질로 표지된 스트렙타아비딘(streptavidin), 예를 들어, 스트렙타아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 결합물을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 웰을 상기 세척액으로 세척한 후 효소의 발색기질, 예를 들어, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 알파1산 당단백질 표준액이 나타내는 흡광도와 비교하여 혈 중 알파1산 당단백질의 농도를 산출한다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는 형광 물질로 표지된 Streptavidine을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨 다음 세척액으로 세척하고 형광 강도를 측정한다.
또한 아사이알로 알파1산 당단백질의 양을 측정하기 위하여 아사이알로 알파1산 당단백질에 대한 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고상체에 가하고 한 시간 이상 방치하여 항체를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시킨다. 세척액, 예를 들어, 트윈(Tween)계 계면활성제가 함유된 인산염 완충액으로 웰을 세척한 후, 혈청시료 희석 용액을 각 웰에 가하고 실온에서 반응시킨다. 상기 세척액으로 웰을 세척한 후, 효소 또는 형광물질로 표지된 렉틴, 예를 들어, RCA-서양고추냉이 퍼옥시다제 결합물을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 웰을 상기 세척액으로 세척한 후 효소의 발색기질, 예를 들어, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 아사이알로 알파1산 당단백질 표준액이 나타내는 흡광도와 비교하여 혈 중 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 산출한다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는 형광 물질로 표지된 렉틴을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨 다음 세척액으로 세척하고 형광 강도를 측정한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에서 당단백질에 대한 항체를 아사이알로당단백질을 인지하는 렉틴으로 대체하여, 렉틴을 마이크로타이터 플레이트에 흡착시키고 당단백질에 대한 항체를 표지물질로 표지하여 사용하는 변형된 방법도 포함한다.
본 발명의 측정방법에 의하여 아사이알로 알파1산 당단백질을 표준물질로 사용할 때 혈 중 아사이알로당단백질을 0.03 ㎍/㎖ ~ 10 ㎍/㎖의 농도 범위에서 검출할 수 있으며 알파1산 당단백질은 20 ㎍/㎖ ~ 1000 ㎍/㎖의 농도 범위에서 검출할 수 있다.
본 발명에서는, 또한 알파1산 당단백질 측정용 킷트로서, 마우스에 대한 항체가 흡착된 고상체 및 표지물질이 결합된 알파1산 당단백질, 알파1산 당단백질에 대한 항체, 표지물질이 포함한 효소 킷트를 제공한다. 즉 본 발명은, (A) 마우스에 대한 항체가 흡착된 고상체, 알파1산 당단백질에 대한 항체, 바이오티닐화된 알파1산 당단백질, 효소와 결합된 strepavidine 용액, 혈청시료 희석용액, 효소 기질용액, 세척액, 및 알파1산 당단백질 표준용액을 포함하는 제1킷트;와 (B) 아사이알로 알파1산 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 혈청 희석용액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함하는 제2킷트;를 포함하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 측정용 킷트로 바람직하게는 고상체에 흡착된 마우스항체, 알파1 산 당단백질에 대한 항체, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질, 스트렙타아비딘이 결합된 효소, 표지물질의 검출용액, 혈청 희석용액, 세척액, 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다. 표지물질이 효소인 경우, 표지물질의 검출용액은 효소의 기질 용액이고, 표지물질이 형광물질인 경우에는 표지 물질에서 방출되는 형광 강도를 직접 측정한다.
구체적으로 예를 들면, 본 발명의 측정용 킷트는 알파1산 당단백질 대한 항체 마우스항체가 흡착되어 있는 마이크로타이터 플레이트, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질, 서양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타아비딘 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 알파1산 당단백질 표준용액을 포함한다.
또한 아사이알로당단백질 측정용 킷트로서, 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체 및 표지물질이 결합된 렉틴을 포함한 킷트를 제공한다. 본 발명의 측정용 킷트로 바람직하게는 고상체에 흡착된 알파1산 당단백질에 대한 항체 또는 이 단백질을 인지하는 렉틴, 표지물질이 결합된 렉틴용액, 표지물질의 검출용액, 혈청 희석용액, 세척액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다. 표지물질이 효소인 경우, 표지물질의 검출용액은 효소의 기질 용액이고, 표지물질이 형광물질인 경우에는 표지 물질에서 방출되는 형광 강도를 직접 측정한다.
구체적으로 예를 들면, 본 발명의 측정용 킷트는 알파1산 당단백질에 대한 항체 또는 렉틴이 흡착되어 있는 마이크로타이터 플레이트, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것에 불과할 뿐 본 발명의 권리가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 혈청에서 알파1산 당단백질 과 아사이알로 알파1산 당단백질의 분리 및 정제
사람 혈액으로부터의 알파1산 당단백질(AGP) 및 아사이알로 알파1산 당단백질(AsAGP)의 분리 및 정제는 트롬빈과 과산화수소처리, 황산을 통한 desialylation과 sephadex G-200 컬럼을 사용하였다.
알파1산 당단백질을 분리하기 위하여 200 ㎖의 사람혈액에 2.0 NIH 단위의 트롬빈을 첨가하여 37℃에서 밤새워 반응시킨 후 침전물을 제거하기 위하여 원심분리하였다. 침전물이 제거된 용액 50 ㎖에 1.2 M 과염소산 50 ㎖을 천천히 저어 주며 첨가한 후 30 분 동안 상온에서 반응시키고 원심분리를 통해 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용액을 4℃에서 PBS(Phosphate buffered saline)으로 투석시켜준 후 동결건조를 하였다.
아사이알로 알파1산 당단백질을 얻기 위하여 위에서 분리된 알파1산 당단백 질을 탈시아릴레이션(Desialylation)시켰다. Desialylation을 하기 위하여 동결 건조된 알파1산 당단백질 샘플 5 g을 0.05 N 황산을 이용하여 녹인 후 75℃에서 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플은 1 N 수산화나트륨으로 중성화 시켜준 후 1 PBS 용액에서 투석하였고 마지막으로 Sephadex G-200 컬럼을 이용하여 아사이알로 알파1산 당단백질을 분리하였다.
사람 혈액으로부터 분리 및 정제된 알파1산 당단백질 및 아사이알로 알파1산 당단백질은 SDS(sodium dodecyl sulfate), non-SDS 겔 전기영동법(도 1에서 A)과 웨스턴블랏(도 1에서 B)을 통해 분리 정도를 확인하였고, 분리된 AGP 및 AsAGP의 농도는 Bradford 분석법을 이용하여 측정하였다.
실시예 2 : 아사이알로 알파 1산 당단백질에 대한 단일클론항체 As16.89 제조
단일클론항체 As16.89의 정제는 protein G (Sigma Co, 미국) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 컬럼에 protein G를 충진한 후 PBS 용액으로 2시간 동안 안정화 시켜준 후 시료를 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않고 남은 항체들을 1 PBS 용액을 이용하여 씻어준 후 0.1M glycine을 첨가하여서 1 ㎖씩 분취한 후 280 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 흡광도 값이 0.5 이상인 분취된 시료들을 취하여 투석한 후 SDS 젤 전기영동법에 의해 정제 유무를 확인하였다. 도 2는 As16.89 항체가 정제되었음을 보여주는 SDS 전기영동 결과의 사진이다.
실시예 3 : 알파1산 당단백질의 biotinylation
알파1산 당단백질 5 mg을 PBS 1㎖에 녹인 후 sulfo-NHS-LC-Biotin 200㎕ (=10㎍/㎕)를 가하고 냉장에서 2시간 동안 방치한 후 desalting column을 통과시켜 분리해 내었다.
실시예 4 : 경쟁효소면역측정법에 의한 알파1산 당단백질 측정
Goat anti-mouse IgG (1 ㎍/㎖)를 4℃에서 96-well microtiter plate에 밤새워 코팅한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 2% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 해 준 후 3번 세척하였다. 알파1산 당단백질 표준 시료 25 ㎕, biotin-AGP 50㎕, 알파1산 당단백질에 대한 항체 As16.89 25㎕를 섞어준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였다. 1000배 희석된 streptavidin-HRP을 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척하였고 마지막으로 OPD를 이용하여 발색하였다. 발색된 시료의 흡광도는 ELISA reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm 파장에서 측정하였다.
도 3은 알파1산 당단백질에 대한 특이도를 나타내는 그림이며 도 4는 알파1산 당단백질에 대한 표준곡선을 나타내는 그림이며 도 5는 각 혈청의 희석비율에 따른 알파1산 당단백질의 반응성을 나타낸 그림이다. 재현성(recovery)은 표 2와 같다.
실시예 5 : 경쟁효소면역측정법에 의한 알파1산 당단백질 측정 Kit 제작
다음의 구성요소들을 사용하여 알파1산 당단백질 농도 측정용 킷트를 제조하였다.
상기 킷트를 이용하여 정상인, 간경화 환자, 간암 환자 및 만성 간염 환자의 혈청 중 알파1산 당단백질의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다.
고상형 항체(A), 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(E)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 25 ㎕씩 가한 후, B, C, D, F, G의 구성요소들을 사용하여 실시예 5와 같은 경쟁반응 측정방법으로 알파1산 당단백질 농도를 검사하였다.
도 6은 알파1산 당단백질에 대한 실험결과를 나타낸 혈청내 농도이다.
실시예 6 : 항체-렉틴 샌드위치형 측정방법에 의한 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도측정
효소면역측정법을 이용하여 혈청으로부터의 아사이알로 알파1산 당단백질 측정은 선행연구에서 서술된 방법과 유사하다 [PCT/KR00/00840, US pendinding # 09/662,363]. 알파1산 당단백질에 대한 항체 As16.89 (1 ㎍/㎖)를 4℃에서 96-well microtiter plate에 밤새워 코팅한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 해 준 후 3번 세척하였고 아사이알로 알파1산 당단백질 표준 시료와 20배 희석된 혈청은 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였다. 100배 희석된 RCA-HRP을 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였고 마지막으로 OPD를 이용하여 발색한 후 흡광도를 측정하였다.
실시예
7 :
알파1산
당단백질/
아사이알로
알파1산
당단백질비율에 의한 환자혈청 검사
실시예 7에서 사용한 킷트로 환자 혈 중 아사이알로당단백질 농도를 측정하였다.
정상인(16), 만성간염환자(16), 간경변환자(16), 간암(16)환자의 혈청을 20배씩 희석한 후 실시예 5와 6의 방법에 의해 혈청 중 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질을 측정 비율을 계산하였다.
실험결과에 따르면 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도는 간경변과 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 농도를 보였다(도 6, 표 4). 이 결과는 혈청내 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도 상승이 간경변 또는 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.