KR102269748B1 - 간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질 측정을 통한 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도 추적 진단용 키트 및 이의 용도 - Google Patents

간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질 측정을 통한 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도 추적 진단용 키트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신속하고 간편한 초기의 간질환을 검사하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 항체를 이용하여 시료 중에 간기능 손상 표지자로서 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)의 농도를 측정함으로써 간질환의 초기단계인 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 추적하기 위한 진단용 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합 세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체 혹은 Gold-RCAⅡ 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 특이적으로 판별하기 위한 키트 및 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

Description

간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질 측정을 통한 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도 추적 진단용 키트 및 이의 용도{A kit containing asialo-α1-acid glycoprotein as a marker for diagonising progressive chronic liver disease and liver fibrosis and the method of using thereof}
본 발명은 초기 간질환을 신속하고 간편하게 검사하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 항체를 이용하여 시료 중의 간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)의 농도를 측정함으로써 간질환의 초기단계인 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 추적하기 위한 진단용 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
암을 비롯한 각종 중증질환의 정확한 조기진단을 위하여 각종 혈청학적 생물표지자들이 검진을 위해 사용되고 있으며, 보다 나은 혈청학적 생물표지자를 찾기 위한 연구가 계속되고 있다. 간생검은 간 섬유화를 진단하는 표준지단법이지만 조직채취 오류에 의한 오차문제로 정확도에 대한 문제점이 있으며, 침습적 시술과정에서 발생할 수 있는 위험성과 합병증 발생, 검사자 간 숙련도 차이로 인하여 간질환 확인용으로 사용하기에는 한계가 있다. 특히 시술 후의 통증은 비교적 흔하며, 검사와 관련된 사망도 보고된 바 있다. 간생검으로 인한 많은 문제점들로 인하여 간조직 생검을 시행하려는 의사나 시행 받는 환자들에게 거부감이 있으며, 반복적인 검사가 필요한 경우에는 더욱 간조직 생검이 어렵게 되며, 또한 충분한 간조직을 얻지 않으면 진단이 어려운 문제점이 발생한다. 이러한 침습적인 문제점으로 비침습적으로 간섬유화를 예측하는 모델들이 개발되고 있다.
이를 대체하는 방법으로 복부초음파검사, 혈청표지자를 사용하는 혈청검사 등이 있으며, 현재 간섬유화스캔을 이용한 간탄력도검사가 간섬유화의 비침습적 측정법으로 사용되고 있다.
간세포는 장해가 있어도 재생기능이 강하고 건강한 부위가 전체 조직의 20~30% 정도가 정상이면 거의 정상과 같은 기능을 유지하는 특성과 혈청학적 간질환 진단의 경우 경도의 병변에서 간기능 검사 시 이상을 보이지 않기도 하며, 여러 검사 결과에서 상호연관성을 보이지 않는 경우가 많아 여러 가지 검사의 종합적인 검토가 요구된다. 만성간질환 환자에서 중증 섬유화나 간경변증으로의 진행을 예측하기는 쉽지 않으며, 표준시험법으로 사용되고 있는 간생검은 침습적 방법으로 시술과 관련된 합병증을 발생할 수 있다.
간섬유화스캔(FibroScan)을 이용한 간탄력도 검사는 비침습적으로 간탄력도를 측정하여 간섬유화를 평가할 수 있는 장점이 있으나, 환자의 신체적인 상태에 따라 탄력파가 간세포에 도달하지 못할 경우와 wave probe의 위치가 잘못되었을 경우 측정이 불가능하며, 검사자의 나이와 높은 체질량지수에 따라서도 간탄력도 검사가 어려운 문제점이 있다.
이러한 문제점으로 인하여 몇 가지의 새로운 혈청학적 생물표지자를 이용하여 간섬유화 단계를 진단할 수 있는지에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 간섬유화 단계를 정확히 진단할 수 있는 임상적 유효성이 높은 새로운 혈청학적 생물표지자를 통한 진단시약의 개발이 필요하다.
만성간질환은 향후 간경변증으로 진행될 수 있는 예후가 좋지 않은 중증질환 중의 하나로 발생빈도 대비 사망률이 높은 질환이다. 특히 간염 바이러스 보균율이 높은 우리나라를 포함한 아시아권에서 높은 발생빈도를 나타내고 있어 간섬유화 정도의 평가는 만성간질환의 조기진단을 위하여 매우 중요한 부분이다.
만성간염에서 간세포 염증 및 괴사가 지속되면 간 섬유화가 발생하고 간 섬유화가 더 진행되면 간경변증으로 이행된다. 만성간질환의 진행과정에서 간섬유화 정도를 보다 정확히 평가하고 진단하기 위하여 현재 사용되고 있는 간탄력도 검사를 통한 간섬유화 정도를 측정하는 간탄력도 검사법(FibroScan, MRE)과 상호보완적인 혈청학적 간섬유화 진단 생물표지자의 개발이 필요하다.
개발된 간세포손상 생물표지자인 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)은 진행성 만성간염과 간섬유화 정도를 추적 검사하는데 특이성이 높아 만성간질환 환자의 진단과 치료를 위하여 임상적 유용성이 매우 높은 표식자로 이용할 수 있을 것으로 추정된다.
종래의 기술에서는 혈액에 포함되어 있는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 만성간염의 진행을 훨씬 뛰어넘은 간경변 및 간암을 진단하는 방법이 알려져 있으나, 상기 종래기술은 간질환의 정도가 간암정도까지 진행되어야만 진단할 수 있는 방법으로서, 본 발명에서 목적으로 하는 간질환의 초기 진도인 만성간염 및 간섬유화 정도에 대해서는 진단하기 어렵다는 문제점이 있었다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명의 발명자들은 아시알로 알파-1산 당단백질이 초기 간질환에도 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하고, 간질환의 진도가 간암까지 진행되기 전인 만성간염 및 간섬유화의 진행단계를 명확하게 진단할 수 있는 방법을 모색하는 과정에서 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명에서 제공하는 아시알로 알파-1산 당단백질을 이용한 간질환의 진단방법은 간질환의 진행정도가 간경변 및 간암단계까지 진행하기 전에 초기에 발견함으로써, 환자의 질환이 중증으로 확대되기 전에 예방할 수 있는 우수한 발명이다.
한국등록특허공보 10-1606302 한국공개특허공보 10-2015-0041626
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 진행성 만성간염 및 간섬유화 진행여부를 추적 진단하기 위해 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 특이적 단일클론 항체 AGP601을 포획단백질로 하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 인지 단백질인 RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin II)와 활성 HRP(horseradish peroxidase)결합체를 탐색단백질로 구성하여 간섬유화 정도를 확인하기 위하여 파이브로시스 스테이지(Fibrosis stage)를 비교하여 간질환 환자의 혈청을 분석하였다.
본 발명의 유효성 평가변수는 간섬유화스캔법을 표준모델로 한 파이브로시스 스테이지별 간섬유화 정도 평가에 대한 민감도와 특이도로, 이를 통해 양성검체에 대한 양성 판정과 음성 검체에 대한 음성 판정을 평가하였다.
이를 통한 유효성 평가결과에 따른 간섬유화 정도를 비교하면 섬유화가 심해질수록 혈중 AsAGP 농도가 증가하였고, 간섬유화단계별 평균 AsAGP 농도 차이 결과도 p-value가 0.0414로 유의한 것으로 확인되어 이는 진행성 만성간염의 악화를 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용할 경우 혈액으로 진행성 만성간염 및 간섬유화 진행여부를 추적 진단할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601을 고상체에 흡착시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601이 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP601에 결합시키는 단계;
(c) 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP (horseradish peroxidase)-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 수탁번호 KCTC 13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계;
(d) 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계를 포함하여 이루어지는 혈액에 포함되어 있는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 제공하는 혈액에 포함되어 있는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하는 방법에 의해서 환자의 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 특이적으로 정확하게 판별하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합 세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되거나 혹은 금나노 입자와 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체 혹은 Gold-RCAⅡ 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 특이적으로 판별하기 위한 키트 및 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.
본 발명에서는 알파-1산 당단백질에 대한 항체인 AGP601(KCTC13998BP)과 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 RCAⅡ를 분리 및 정제하였으며, 상기와 같이 선택적으로 분리 및 정제된 항체 AGP601과 RCAⅡ-HRP 접합체를 통하여 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 초기에 추적하여 진단하는 것이 가능하게 되었다.
이를 바탕으로 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도의 추적 진단이 가능함으로 인하여 만성간질환의 조기발견과 함께 치료를 용이하게 하여 치명적인 간경변과 간암으로 진행되는 것을 미연에 방지할 수 있게 될 것이다. 만성간질환의 진행과정에서 간섬유화 정도를 정확히 추적 진단하는 혈청학적 검사법은 없는 상태이다. 따라서 현재 국내외 유명종합병원에서 간탄력도 검사를 통한 간섬유화 정도를 측정하는 진단의료기기인 FibroScan과 상호보완적인 혈청학적 간섬유화 진단 생물표지자의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 기술은 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도의 추적 진단할 수 있는 기술로서 의학적 전문기관에서 널리 이용될 경우 인류 건강증진과 의료기기 등 관련 산업의 발전에도 큰 일익을 담당할 것이다.
도 1은 본 발명의 융합세포주가 생산한 항-AGP 항체에 대한 단일클론항체를 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 2는 Fibrosis Stage 군별 AsAGP 농도차이를 분석하여 통계적 유의성을 나타낸 것이다.
도 3은 HBV 만성간염 대상자의 advanced fibrosis stage에 대한 민감도, 특이도 및 AUC 값을 통한 유효성을 나타낸 것이다.
도 4는 HBV 만성간염 대상자의 cuttoff value의 차이에 따른 유효성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 항-AGP 항체 AGP601과 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용한 키트 AsAGP를 이용하여 진행성 만성간질환 및 간섬유화 정도의 추적 진단에 대한 유효성 평가변수 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 면역크로마토그라피 스트립의 평면도와 정면도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립에 의해 측정되는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도별 측정결과를 나타낸 것이다.
일반적으로 간질환 등 간경변증은 만성간염 또는 간섬유화 등 초기 병증에서 심화되어 최종적으로 간암으로 전이되는 질병이다. 종래에 알려진 대부분은 간질환에 대한 진단방법은 최종 단계인 간경화 내지 간암을 진단하는 방법에 한정되어 있다. 이것은 영상진단 또는 혈액에 존재하는 추적자를 이용한 진단방법은 간질환이 상당히 전이된 간경화 내지 간암단계에 이르러서야 이를 판별할 수 있는 바이오 마커 등의 함량이 상당히 축적되어 상기의 바이오마커의 함량을 건강한 간과 대비하였을 때에 명확하게 간경화 내지는 간암으로 판별이 가능하기 때문이다.
반면에 간질환의 초기 단계인 만성간염 또는 간섬유화증의 경우에는 간질환의 전이가 얼마 되지 않아 위와 같은 바이오마커 등의 함량이 부족하여 영상진단 또는 일반적인 추적자를 이용하여도 만성간염 또는 간섬유화의 판별에 대한 정확도가 상당히 떨어지기 때문이다.
간세포는 장해가 있어도 재생기능이 강하고 건강한 부위가 전체 조직의 20-30% 정도가 정상이면 거의 정상과 같은 기능을 유지하는 특성이 있고, 혈청학적 간진환 진단의 경우 경도의 병변에서 간기능 검사 시 이상을 보이지 않기도 하여, 병변의 초기 단계에서는 여러 검사 결과에서 상호연관성을 보이지 않는 경우가 많아 만성간염 또는 간섬유화 같은 초기 병변은 기존의 진단시약 내지 진단방법 으로는 판별하기가 어렵다.
또한, 만성간질환 환자에서 중증 섬유화나 간경변증으로의 진행을 예측하기가 어렵고, 간생검은 침습적 방법으로서 시술과 관련되는 합병증을 유발할 수 있고, 간섬유화스캔을 이용한 간탄력도 검사는 비침습적으로 간탄력도를 측정하여 간섬유화를 평가할 수 있다는 장점이 있으나, 환자의 신체적인 상태 또는 나이와 체질량 지수에 따라서 간탄력도의 측정이 어려울 수도 있다는 문제점이 있다.
이러한 문제점으로 인하여 새로운 혈청학적 생물표지지를 이용한 간섬유화 단계를 진단할 수 있는 방법에 대한 연구가 다양하게 추진되어 왔고, 이러한 상황 에서 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 간질환의 초기 단계의 질병인 만성 간염 또는 간섬유화를 진단하기 위해 다양한 바이오마커 등을 사용해본 결과 본 발명 에서 제공하는 아시알로 알파-1산 당단백질이 가장 적합한 초기 단계의 간질환을 판별할 수 있는 추적자임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
아시알로 알파-1산 당단백질 등 특정물질을 정성 또는 정량적으로 분석하는 방법에는 여러 가지가 있으나 이들 방법 중 미립자 응집반응 측정방법(particle agglutination assays), 방사선 면역측정방법(radioimmunoassays, RIA), 효소 면역 측정방법(enzyme immunoassays, EIA) 및 형광 면역측정방법(fluoroimmunoassays, FIA) 등이 가장 널리 이용되고 있다. 이들 중 방사선 면역측정방법은 감도가 높기는 하지만 방사선 표지물의 사용에 따른 여러 가지 문제점을 가지므로, 감도가 높으면서도 안전하고 간단한 효소 면역측정방법과 형광 면역측정방법이 보다 보편적으로 사용되고 있다. 효소 면역측정방법에서는 일반적으로 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)나 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 포도당 산화효소(glucose oxidase) 등 안전성이 높은 효소들을 사용하며, 효소의 기질로서 전환율(turn-over rate)이 높은 발색 기질을 선택하여 이용하고 있다. 이 방법은 방사선 면역측정방법과 근사한 감도와 특이성을 가지면서도 방사선 면역측정방법의 단점을 해결할 수 있어 광범위하게 이용되고 있다.
본 발명자들은 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하는 기존의 방법들에 비해 안전성과 재현성이 높고 다수의 시료를 동시에 측정할 수 있는 측정방법 및 킷트로서, 알파-1산 당단백질에 대한 항체와 아시알로 당단백질을 인지하는 렉틴을 사용한 샌드위치형 측정방법 및 이를 위한 측정용 킷트를 개발함으로써 이를 이용 하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 혈중 농도를 효과적으로 측정할 수 있게 되었다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명에서 제공하는 아시알로 알파-1산 당단백질의 측정방법은 다음의 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에서 제공하는 아시알로 알파-1산 당단백질의 측정방법은,
(a) 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601을 고상체에 흡착시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601이 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP601에 결합시키는 단계;
(c) 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP(horseradish peroxidase)-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 수탁번호 KCTC 13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계;
(d) 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계;를 포함 하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 단계로 이루어지는 혈액 중에 포함되어 있는 아시알로 알파-1산 당단백질의 함량을 측정하기 위하여 제조되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체 AGP601을 포함하는 키트 및 면역크로마토그래피 스트립을 이용한 아시알로 알파-1산 당단백질의 측정방법을 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다. 알파-1산 당단백질에 대한 항체를 마이크로타이터 플레이트웰과 같은 고상체에 가하고, 1시간 이상 방치하여 항체를 마이크로타이터 플레이트웰에 흡착시킨 다음, 혈청시료 희석 용액을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 반응 후 효소 또는 형광물질로 표지된 렉틴, 예를 들어 HRP-RCAⅡ 접합체를 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 상기 웰을 상기 세척액으로 세척한 후, 효소의 발색기질, 예를 들어 오르소-페닐렌 다이아민 기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 아시알로 알파-1산 당단백질 표준액의 흡광도와 비교하여 혈중 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 산출한다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는 형광 물질로 표지된 렉틴을 각 웰 에 가하여 실온에서 반응시킨 다음, 세척액으로 세척하고 형광 강도를 측정한다.
본 발명에서 제공하는 아시알로 알파-1산 당단백질의 측정방법은 진행성 만성간염 및 간섬유화가 진행될 때 혈액 내에서 과량으로 형성되는 것으로 추정 되는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하기 위하여, 알파-1산 당단백질에 대한 항체와 렉틴(lectin)을 이용하는 샌드위치 면역측정법을 이용한다.
즉, 상기에 기재된 본 발명에서 제공하는 샌드위치 면역측정법은 (a) 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601을 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 결합시키고, (b) 상기 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP601에 결합시키며, (c) 표지물질인 HRP가 결합된 RCAⅡ-HRP 접합체를 가하여 상기 접합체를 상기 항체에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질인 RCAⅡ-HRP 접합체를 검출하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601은 한국생명공학연구원에 기탁된 KCTC13998BP인 융합세포로부터 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 아시알로 알파-1산 당단백질을 특이적으로 인지하는 렉틴 단백질 RCAⅡ 단백질을 선택적으로 분리정제하여 제조된 RCAⅡ-HRP 접합체를 탐색단백질로 사용하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 혈액시료는 진행성 만성간염 및 간섬유화 진행이 의심되는 환자로부터 채취한 혈액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 진행성 만성간질환 및 간섬유화를 추적 진단하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에서는 진행성 만성간질환 및 간섬유화 정도를 추적 진단하는 키트 로서, 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601이 흡착된 고상체 및 표지물질 HRP가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트로서 바람직하게는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601이 흡착된 고상체, 표지물질 HRP가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 RCAⅡ-HRP 접합체에 더하여 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 아시알로 알파-1산 당단백질 표준용액을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 진단방법으로서 본 발명은 혈액 시료 중 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 신속하고 간편하게 만성 간질환 및 간섬유화의 가능성을 검사하는데 유용한 알파-1산 당단백질에 대해 특이적으로 반응하는 단일 클론 항체와 아시알로 당단백질을 인지하는 렉틴의 접합체인 Gold-RCAⅡ 접합체를 포함하는 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 수탁번호 수탁번호 KCTC13998BP로 기재되어 있는 융합세포주로부터 생산되는 단일클론 항체 AGP601과 상기 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체 또는 골드나노-RCAⅡ 접합체를 함유하는 면역 크로마토그래피 스트립을 제공한다. 바람직한 구체예로서, 본 발명은 전술한 본 발명의 RCAⅡ와 골드 콜로이드가 접합 처리된 글라스화이버(GF) 패드와 대조 라인과 아시알로 알파-1산 당단백질 검출 결과의 판정 라인이 직선 처리되어 있는 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인, 시험하고자 하는 시료를 흡수하는 부분인 시료 패드, 시료내 미반응 물질을 흡수하는 흡수 패드, 전술한 구성 부재들이 장착되는 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 스트립은 전술한 접착용 플라스틱 백킹 위에 NC 멤브레인, GF 패드, 시료 패드 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 조립하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립의 조립방법은 통상적인 스트립 제조방법에 따라 실시할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립은 카세트(cassette) 형태 또는 막대(stick) 형태로 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 특이적인 단일클론 항체생산 및 RCAⅡ-HRP 접합체 제조
알파-1산 당단백질(AGP)에만 특이적으로 반응하는 융합세포를 선별하기 위하여, 마이크로플레이트에 상기 알파-1산 당단백질 항원을 웰 당 100 ㎕씩 가하여 2시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충용액-트윈 20 용액으로 세척하였다. 세척 후 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬퍼옥시다제의 기질 용액으로 오르소-페닐렌디아민을 넣어 반응시켜 알파-1산 당단백질 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합 세포주들을 선별하였다. 선별된 세포주 AGP601은 한국생명공학 연구원 유전자은행에 2019년 10월 17일에 기탁번호 KCTC13998BP로 기탁하였다.
융합세포주의 서브클래스가 IgG2b인 AGP601 단일클론 항체를 대량생산하기 위하여 8주령 Balb/c 생쥐의 복강에 불완전 어주번트(incomplete adjuvant)를 300 ㎕ 주입하였다. 2주 후에 소혈청을 함유한 RPMI 배지에서 키운 하이브리도마 세포들을 생쥐 1 마리당 200 ㎕(4×106/cells)씩 주입하고 복강이 부풀어 오른 생쥐로부터 복수액을 채취하였다. 채취한 복수액은 생쥐 혈청별로 원심분리하여 적혈구를 제거한 후 상등액을 -20℃에서 보관하였다. 단백질 A 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 분리 정제한 알파-1산 당단백질(AGP)에 대해 특이적인 단일클론 항체의 특이적 항원 반응성을 단백질 전기영동과 웨스턴 블롯법을 시행하여 확인하였다(도 1).
상기 단백질 전기영동과 웨스턴 블롯법은 당해 기술분야에 널리 알려진 방법에 따라 실시하였다. 또한 본 발명의 AGP 601은 기존에 이미 알려진 As16.89 단일클론 항체 및 AGP501보다 native form 상태의 AsAGP 항원에 대한 항원반응성이 훨씬 높게 나타나는 점을 확인하였다.
피마자씨로부터 분리한 렉틴단백질인 RCAⅡ 단백질을 0.2 M 탄산나트륨 완충용액(NaHCO3, pH 8.3)으로 4℃에서 18시간 동안 투석한 후, RCAⅡ 단백질의 농도를 측정하여 활성 HRP(horseradish peroxidase, 서양고추냉이 퍼옥시다제)와 RCAⅡ 단백질을 각각 일정농도 비율로 혼합하여 실온에서 3시간 반응하였다. 활성 HRP와 RCA Ⅱ 단백질을 각각 혼합한 액을 갈색유리병에 보관한 채로 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 각 혼합액은 1 M 트리에탄올아민과 0.1 M 소듐 보로하이드리드 용액(sodium borohydride solution)을 첨가하여 4℃에서 60분간 반응시키고, 반응 정지액을 첨가한 다음 4℃에서 교반시켜 반응을 정지시켰다. 반응이 종료된 RCAⅡ-HRP 접합체는 PBS 완충액에서 약 18시간 동안 투석하여 반응용 완충액을 제거한 다음 2 M 글리신을 첨가하여 안정화시켰다. 이와 같이 안정화된 상기 반응액을 겔 여과하여 RCAⅡ-HRP 접합체를 분리하였다.
실시예 2. 간섬유화 (Fibrosis Stage) 단계별 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP) 농도차이 분석
대상 환자의 간섬유화 측정은 간섬유화 진단 의료기기인 파이브로스캔(Fibrosacn)으로 측정하였으며, 실시예 1에서 분리한 RCAⅡ 단백질과 활성 HRP 결합체를 탐색단백질로 사용하고 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 항체 AGP601을 포획단백질로 구성하여, 진행성 만성간질환 및 간섬유화가 의심되는 환자의 혈청시료 중에서의 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP) 농도를 측정하여 간섬유화 정도에 따른 아시알로 알파-1산 당단백질과의 상관관계를 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 2에 제시하였다.
간섬유화 정도와 AsAGP의 농도, 그 이외 변수들의 상관관계를 분석한 결과는 도1과 같다. HBV 만성간염 대상자로 판정된 48명의 간섬유화 단계 0 (Fibrosis stage 0)는 20명 (41.7%), 간섬유화 단계 1 (Fibrosis stage 1)은 16명 (33.3%), 간섬유화 단계 2 (Fibrosis stage 2)와 간섬유화 단계 3 (Fibrosis stage 3)은 각각 2명(4.2%), 간섬유화 단계 4 (Fibrosis stage 4)는 8명(16.7%)로 확인되었다.
간섬유화 단계 0(Fibrosis stage 0, F0)부터 간섬유화 단계 2 (Fibrosis stage 2, F2)까지 판정 된 대상자의 AsAGP 농도의 평균은 1.37±0.26, 간섬유화 단계 3 (Fibrosis stage 3, F3)과 간섬유화 단계 4 (Fibrosis stage 4, F4)로 판정된 대상자의 AsAGP 농도의 평균은 1.69±0.34로 확인되었다. 이 두 집단 간 AsAGP 평균 농도에 대한 차이 검정 결과 p-value가 0.002로 그 차이가 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.
간섬유화 단계 0(Fibrosis stage 0, F0)부터 간섬유화 단계 3 (Fibrosis stage 3, F3)까지 판정 된 대상자의 AsAGP 농도의 평균은 1.38±0.25, 간섬유화 단계 4 (Fibrosis stage 4, F4)로 판정된 대상자의 AsAGP 농도의 평균은 1.77±0.34로 확인되었다. 이 두 집단 간 AsAGP 평균 농도에 대한 차이 검정 결과 p-value가 <0.001로 그 차이가 통계적으로 대단히 유의한 것으로 나타났다.
이러한 결과는 간섬유화 단계에 따른 간섬유화 정도를 비교하면 섬유화가 심해질수록 혈중 AsAGP 농도가 증가하였고 간섬유화 단계별 평균 AsAGP 농도에 대한 차이 검정 결과 p-value가 0.014로 유의한 것으로 확인되었다.
실시예 3. 아시알로 알파- 1산 당단백질( AsAGP ) 농도 측정을 통한 HBV 만성 간염 환자에서 간섬유화 정도 예측
본 발명을 통한 대상 환자의 간섬유화 단계(Fibrosis stage)별 유효성 평가 결과는 도 3에 나타내었다. HBV 만성간염 대상자의 advanced fibrosis stage (stage3~4)와 간경변 stage에 대한 AUC 값을 산출한 결과 HBV 만성간염 섬유화 예측력은 AUC>0.75로 유효한 수준으로서, 적절한 cutoff value를 계산하여 advance 또는 cirrhosis에 해당하는 간섬유화가 중증으로 악화되는 단계에 대한 확인이 가능하였다.
이차 유효성 평가변수는 본 발명을 통한 간섬유화 단계별 간섬유화 정도에 대한 민감도와 특이도를 나타낸 것으로서, 이를 통하여 양성검체에 대한 양성 판정과 음성검체에 대한 음성 판정을 평가할 수 있고, 그 결과를 도 4에 제시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 HBV 만성간염 환자 중 advanced fibrosis stage(stage 3~4)의 기준이 되는 cutoff value를 1.310으로 설정할 경우 민감도는 100%, 특이도는 52.6%로 확인되었고, cutoff value에 따른 민감도, 특이도 차이는 cutoff value가 1.355에서 민감도는 80%, 특이도는 60.5%까지 높아지는 것을 확인 하였다. 특이도는 원래 정상인을 대상으로 해서 나오는 결과인데 본 연구에서는 만성간염환자를 대상으로 간섬유화/간경변을 구분한 것이기에 원래의 특이도 보다는 낮게 나타난 것이다. 기존 정상군과 비교한 시험 결과에서는 특이도가 84%까지 높아지는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 HBV 만성간염 환자에서 간섬유화가 중증으로 악화되는 단계에 대한 판정 정확도가 높은 수준임을 확인하였다.
실시예 4. 알파- 1산 당단백질에 대한 단일클론 항체 AGP601을 포함하는 면역 크로마토그래피 스트립의 제조
(1) RCAⅡ골드 접합체 제조
본 발명에서 선별한 아시알로 알파-1산 당단백질에 대해 반응성인 RCAⅡ를 콜로이드성 골드 입자 용액에 15㎍/㎖ 가한 후 실온에서 2시간 회전시키면서 반응시킨 후 10% BSA를 1/10 부피로 가하여 1% 농도가 되도록 한 후 다시 1시간 동안 반응시켜 Ab-골드 접합체를 제조하였다. 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 다시 2mM 붕산염 완충액을 가하여 Ab-골드 접합체를 세척하였다. 이와 같은 세척을 3회 실시하였다. 마지막 세척 후에 1% BSA를 함유한 2 mM 붕산염 완충액을 골드 용액의 약 1/10 부피로 가해서 현탁시켰다. UV 분광분석기로 530 nm에서 흡광도를 측정한 후 측정값이 3.00이 되도록 희석하여 사용하였다.
(2) 시료 패드
시험하고자 하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서, 셀룰로스소재로 된 것을 사용하였다.
(3) 글라스화이버(GF) 패드
시료내 아시알로 알파-1산 당단백질과 본 발명에 따라 제조된 RCAⅡ간의 면역 반응이 일어나는 부분으로 GF 멤브레인 표면상에 골드 콜로이드 미립자 RCAⅡ가 일시 고정되어 있으며, 그 제조 방법은 다음과 같다.
제조된 RCAⅡ로부터 생산된 단일클론 항체를 상기 (1)에서 제시된 바와 같이 접합하였다.
GF 패드(Milipore사 제품, 1.0㎝ x 0.7㎝)을 20mM 붕산 나트륨 완충액에 충분히 적시어 건조시킨 후, 상기에서 제조한 골드 콜로이드 미립자-RCAⅡ를 GF 멤브레인에 고르게 분무하고 37℃에서 건조시켜 표면상에 착색 미립자 고상형 항체가 일시 고정된 면역 반응 패드용 GF 패드(접합체 패드라고도 함)를 제조하였다.
(4) 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인 및 라인(line) 처리
나이트로셀룰로스 멤브레인(Millipore사)을 플라스틱 백킹(30cm ×5cm)에 부착한 후, 플라스틱 백킹 하단에서 약 3.4 ㎝ 되는 지점에 대조 라인으로서 염소 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG)를 직선 처리하고, 2.7 ㎝ 되는 지점에 아시알로 알파-산 당단백질 검출 결과 판정 라인으로서 하이브리도마 세포 AGP601를 직선 처리한 다음, 건조시켜 NC 멤브레인을 제조하였다.
(5) 흡수(absorbent) 패드
면역 반응후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석 물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하도록 셀룰로즈 멤브레인을 사용하였다.
(6) 면역크로마토그래피 스트립 제조
도 6a와 도 6b에 제시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹위에 NC 멤브레인, GF 패드, 시료 패드 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 조립하여 접착 고정시켰다.
실시예 5. 면역크로마토그래피 스트립을 이용한 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도별 분석
실시예 4에서 제조한 면역크로마토그래피 스트립의 시료 패드에 용출완충액(예, 5% 슈크로스(Sucrose), 1% 소혈청알부민(BSA) 또는 1% Triton X-100을 함유 하는 50 mM 붕산염 완충액)으로 1:10 비율로 희석시킨 혈청 시료 용액을 60 내지 70 ㎕ 가하고, 3 내지 5분 후 대조라인과 판정 라인의 착색 유무를 관찰하였다.
도 7은 카세트형 면역크로마토그래피 스트립에서 판정한 결과를 도시한 것이다. 라인 1번은 간섬유화 단계 0(Fibrosis stage 0, F 0)에 해당하는 혈청을 적용한 스트립 이며, 라인 2번 내지 5번은 간섬유화 단계 1(Fibrosis stage 1, F1)에서 간섬유화 단계 4(Fibrosis stage 4, F4)에 해당하는 간섬유화 정도에 따른 혈청을 적용한 스트립이다. 상기의 결과로부터 알 수 있듯이, 간섬유화 단계 1에 해당하는 2번 라인에서는 미약하지만 간섬유화 정도가 심해지는 4번 내지 5번 스트립(Fibrosis stage 3, Fibrosis stage 4, F4)에서는 뚜렷한 적색의 착색선을 대조 라인(상측 라인) 및 검출 결과 판정 라인(하측 라인)에서 확인할 수 있었다.
상기의 결과들로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론항체를 이용한 면역분석용 진단키트 및 면역크로마토그래피스트립을 이용하면, 혈액 중 존재하는 아시알로 알파-1산 당단백질의 유의성 여부를 간단하고 편리하게 진단할 수 있어 간질환을 초기단계인 만선간염 및 간섬유화 단계를 조기에 신속하고 편리하게 진단할 수 있고, 이로부터 환자들이 중증질병인 간암까지 전이되기 전에 조기에 간질환의 진행정도를 측정하거나 모니터링하여 예방할 수 있는 효과가 있다.
따라서 본 발명의 기술을 이용한 AsAGP 진단키트는 진행성 만성간염 및 간섬유화의 진행 정도를 추적 진단할 수 있는 기술로서 중증간질환으로 진행되기 전에 조기진단을 할 수 있는 유용한 검사법으로 적용될 수 있다.
본 발명은 산업상 이용가능하다.
한국생명공학연구원 KCTC13998BP 20191017

Claims (5)

  1. 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 특이적으로 판별하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
    (a) 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 특이적인 단일항체 AGP601을 고상체에 흡착시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601이 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP601에 결합시키는 단계;
    (c) 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 단백질인 RCA II(Ricinus communis agglutinin Ⅱ)와 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP, horseradish peroxidase)의 결합체인 HRP-RCA Ⅱ 접합체를 상기 (b)단계를 거친 단일항체 AGP601에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계;
    (d) 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계;를 포함하여 이루어지고,
    상기 혈액시료는 진행성 만성간염 및 간섬유화로 의심되는 환자로부터 채취한 혈액인 것을 특징으로 하는 혈액시료로부터 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도를 특이적으로 판별하기 위한 방법
  2. 삭제
  3. 수탁번호 KCTC13998BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP601과 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 포함하는, 혈액 시료로부터 진행성 만성간염 및 간섬유화 진행여부를 특이적으로 판별하기 위한 키트
  4. 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체 AGP601과 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 Gold-RCAⅡ 접합체를 포함하는, 혈액 시료로부터 진행성 만성간질환 및 간섬유화 진행여부를 특이적으로 판별하기 위한 면역 크로마토그래피 스트립
  5. 제4항에 있어서 상기 면역크로마토그래피 스트립은 카세트의 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는, 진행성 만성간질환 및 간섬유화 진행여부를 특이적으로 판별 하기 위한 면역크로마토그래피 스트립

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