CN112748246A - 追踪慢性进行性肝炎和肝纤维化程度的试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明用于迅速简便地检测早期的肝脏疾病，更具体地，涉及一种诊断试剂盒及其用途，所述诊断试剂盒使用针对α1‑酸性糖蛋白的单克隆抗体，通过该抗体测量作为肝损伤标记的去唾液酸‑α1‑酸性糖蛋白的浓度，以此追踪肝脏疾病的早期阶段即慢性进行性肝炎及肝纤维化程度。另外，本发明提供一种用于从血液样品中特异性测定慢性进行性肝炎和肝纤维化程度的试剂盒及免疫色谱条，其包含保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1‑酸性糖蛋白的单克隆抗体AGP601和与辣根过氧化物酶结合从而与去唾液酸‑α1‑酸性糖蛋白特异性结合的HRP‑RCAII结合物或GOLD(金)‑RCAII结合物。

Description

追踪慢性进行性肝炎和肝纤维化程度的试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及生物诊断试剂领域，本发明涉及一种追踪慢性进行性肝炎和肝纤维化程度的试剂盒及其用途，具体地，所述诊断试剂盒使用α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体，通过该抗体测量肝细胞损伤标记物去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的浓度，以此用于追踪肝病的早期阶段即慢性进行性肝炎及肝纤维化程度。
背景技术
为了准确地早期诊断包括癌症在内的各种严重疾病，使用了各种血清学生物标记物进行筛选，并且寻找更好的血清学生物标记物的研究仍在继续。肝活检是诊断肝纤维化的标准诊断方法，但是由于组织采集错误而存在准确性问题，由于侵入性手术的风险和并发症的产生、检查者之间的熟练程度不同，它用于确诊肝病是有限制的。特别地，术后疼痛相对普遍，并且也曾有与检测相关的死亡报道。由于肝活检引起的许多问题，需进行肝组织活检的医生和接受活检的患者都有些抗拒，当需要重复检查时，肝组织活检变得更加困难。由于这个侵入性问题，以非侵入性方式预测肝纤维化的方法正在被研发中。
替代方法包括腹部超声检查和使用血清标记物的血清测试，目前，使用肝纤维化扫描的肝弹性测试被用作肝纤维化的非侵入性测量。
肝细胞即使有疾病也具有很强的再生功能，如果健康部位占正常组织的20％到30％，它们将几乎保持正常的功能。而用血清学诊断肝病,硬度病变在肝功能检查时有时也会显示无异常，多个测试结果之间相互无关联性的情况较多，因此需要通过各种测试进行全面检查。很难对于慢性肝病患者预测其严重纤维化或肝硬化的进展，作为标准测试方法的肝活检可能会通过侵入性方法引起与手术相关的并发症。
使用肝纤维化扫描(FibroScan)进行肝弹性测试的优点是可以通过非侵入的方式测量肝脏弹性来判断肝纤维化，但是根据患者身体状态弹性波未到达肝细胞以及波探头(wave probe)位置不正确的情况下无法进行测量，并且根据受测者的年龄和高身体质量指数，也存在难以进行肝弹性测试的问题。
由于这些问题，使用几种新的血清学生物标记物来诊断肝纤维化阶段的研究仍在进行中，并且需要开发出通过临床疗效较高的新型血清学生物标记物可以准确诊断肝纤维化阶段的诊断试剂。
慢性肝病是一种严重的疾病，预后较差，将来可能导致肝硬化，并且与发生率相比死亡率很高。特别是在包括韩国在内的肝炎病毒携带者较多的亚洲，发病率较高，因此，评价肝纤维化的程度是用于慢性肝病的早期诊断的重要部分。
在慢性肝炎中，若肝细胞炎症和坏死持续存在，则发生肝纤维化，肝纤维化进一步发展为肝硬化。为了在慢性肝病过程中更准确地评估和诊断肝纤维化，需要研发出血清学肝纤维化诊断的生物标记物，作为对目前使用的通过肝弹性测试测量肝纤维化程度的肝弹性测试(FibroScan，MRE)的补充。
被开发的肝细胞损伤生物标记物去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)对追踪检查慢性进行性肝炎和肝纤维化的程度具有很高的特异性，因此可以推断它在诊断和治疗慢性肝病患者方面具有很高的临床实用性。
在现有技术中，通过测量血液中所含的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的浓度来诊断已超过慢性肝炎进展的肝硬化和肝癌的方法是已知的，但是现有技术是针对肝病已经进展到肝癌的程度才能进行诊断的方法，它难以诊断作为本发明的目的的肝脏疾病的初期进展即慢性肝炎和肝纤维化的程度。
为了解决所述问题，本发明的发明人证实了去唾液酸-α1-酸性糖蛋白在早期肝病中也具有优异的特异性，并且在寻找用于准确诊断肝病发展为肝癌之前即慢性肝炎及肝纤维化的进展阶段的方法中，完成了本发明。
因此，本发明提供的利用去唾液酸-α1-酸性糖蛋白诊断肝脏疾病的方法是优秀的发明，可以在肝脏疾病发展到肝硬化和肝癌阶段之前早期发现，从而在患者的疾病发展到重症之前加以预防。
【现行技术文献】
【专利文献】
韩国注册专利公报10-1606302
韩国公开专利公报10-2015-0041626
发明内容
【发明的详细说明】
【技术课题】
为了解决所述问题而提出本发明。在本发明中，为了追踪和诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化的进展与否，将针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601作为捕获蛋白质，以去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的识别蛋白质RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinuscommunis agglutinin II)和活性HRP(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidase)结合物作为探索蛋白质，与纤维化阶段(Fibrosis stage)比较以确定肝纤维化程度,从而分析了肝病患者的血清。
本发明的有效性评价变量是对于以肝纤维化扫描方法作为标准模型的每个肝纤维化阶段的肝纤维化程度评价的灵敏度和特异性，以此评价对阳性样品的阳性判断和阴性样品的阴性判断。
比较根据所述有效性评估结果的肝纤维化程度，确认随着纤维化程度的加重，血液中AsAGP的浓度增加，并且各肝纤维化阶段的平均AsAGP浓度差异结果其p值(p-value)为0.0414，即为显著，可以确认它可以用作预测慢性进行性肝炎恶化的指标。
由此，确认了利用本发明的针对α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体AGP601及RCAII-HRP结合物，可以追踪诊断慢性进行性肝炎及肝纤维化的进展与否，从而完成了本发明。
【技术解决方法】
为了实现所述目的，本发明开发出测量在血液中所包含的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的方法，完成了本发明。所述方法包括以下步骤：
(a)将由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601吸附至固相载体的步骤；
(b)将含有去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的血液样品添加到所述步骤(a)的吸附了针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601的固相载体上，将去唾液酸-α1-酸性糖蛋白与所述单克隆抗体AGP601结合的步骤；
(c)将与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的HRP(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidase)-RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinus communis agglutinin II)结合物添加到与由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601结合的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白，并使其结合的步骤；
(d)测量并分析去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的步骤。
通过本发明提供的测量血液中所含的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的浓度的方法，可以特异性和准确地确定患者的慢性进展性肝炎和肝纤维化程度。
另外，本发明提供了用于特异性测定血液样品中慢性进行性肝炎和肝纤维化的程度的试剂盒和免疫色谱条，包含由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601及与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)结合或与金纳米颗粒结合从而与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的HRP-RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinus communis agglutinin II)结合物或Gold(金)-RCAII结合物。
【发明的效果】
在本发明中，分离并纯化了抗α1-酸性糖蛋白的抗体AGP601(KCTC13998BP)和特异性结合去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的RCAII，并可以通过所述选择性分离并纯化的抗体AGP601和RCAII-HRP结合物早期追踪并诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化的进展程度。
基于此，可以追踪诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化的程度，从而易于慢性肝病早期发现的同时进行治疗，并可预防致命性肝硬化和肝癌的发展。目前还没有可以准确追踪诊断慢性肝病过程中的肝纤维化程度的血清学检测方法。因此，有必要研发出血清学肝纤维化诊断的生物标记物，作为对目前国内外知名综合医院使用的通过肝弹性测试测量肝纤维化程度的肝弹性测试设备(FibroScan)的补充。
若本发明的技术作为能够追踪诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化进展程度的技术被广泛用于医疗专门机构，则它将对人类健康促进和医疗设备等相关产业的发展做出贡献。
【发明实施的具体形态】
通常，肝病等肝硬化是从慢性肝炎或肝纤维化等的初始症状中逐步恶化并最终转移为肝癌的疾病。诊断肝脏疾病的大多数已知方法仅限于诊断最终阶段即肝硬化或肝癌的方法。这是因为利用图像诊断或存在于血液中的示踪剂的诊断方法时，只有当肝脏疾病已明显转移至肝硬化或肝癌并积聚大量的生物标记物时才能将所述生物标记物的含量与正常肝脏进行对比，从而明确判定肝硬化或肝癌。
另一方面，在肝病的早期阶段即慢性肝炎或肝纤维化的情况下，由于肝病的转移时间较短，所述生物标记物的含量不足，因此即使使用图像诊断或一般的示踪剂，对于慢性肝炎或肝纤维化的判定准确性也很低。
肝细胞即使有疾病也具有很强的再生功能，如果健康部位占正常组织的20％到30％，它们将几乎保持正常的功能。而用血清学诊断肝病,硬度病变在肝功能检查时也有时会显示无异常，在病变的早期阶段，多个测试结果之间相互无关联性的情况较多，很难用现有的诊断试剂或诊断方法对慢性肝病或肝纤维化等早期病变进行判定。
另外，难以预测患有慢性肝病的患者中严重纤维化或肝硬化的进展，并且肝活检可能作为侵入性方法引起与手术相关的并发症。尽管肝纤维化扫描检测具有可以通过非侵入的方式测量肝脏弹性来判断肝纤维化的优点，但根据患者的年龄和身体质量指数，也存在难以进行肝弹性测试的问题。
由于这些问题，一直以来对使用新的血清学生物标记物来诊断肝纤维化阶段的方法进行着各种研究，在这种情况下，本发明的发明人为了诊断所述肝病的早期阶段即慢性肝炎和肝纤维化，尝试了各种生物标记物，结果确认了本发明提供的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白是判定早期肝病的最合适的示踪剂而完成本发明。
有许多方法可以对特定物质如去唾液酸-α1-酸性糖蛋白进行定性或定量分析，但其中颗粒凝集测定法(particle agglutination assays)、放射免疫测定法(radioimmunoassays，RIA)、酶免疫测定法(enzyme immunoassays,EIA)和荧光免疫测定法(fluoroimmunoassays,FIA)被最广泛地使用。其中，放射免疫测定法灵敏度高，但由于使用放射标记物而存在各种问题，因此，灵敏度高、安全简便的酶免疫测定法和荧光免疫测定法被更加广泛地使用。酶免疫测定法通常使用高安全性酶，例如碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)和葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)，作为酶的底物
选择并使用具有高转化率(turn-over rate)的显色底物。该方法由于可以解决放射免疫测定法的缺点，同时具有与放射免疫测定法相似的灵敏度和特异性，因此被广泛使用。
与测量去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的常规方法相比，本发明人研发出作为具有高安全性和可重复性并且可以同时测量多个样品的测量方法及试剂盒，即利用α1-酸性糖蛋白的抗体和识别去唾液酸糖蛋白的凝集素的夹心式测定方法及其测定试剂盒，从而可以有效地测定去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的血液浓度。
本发明提供的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的测定方法，包括
(a)将由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601吸附至固相载体的步骤；
(b)将含有去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的血液样品添加到所述步骤(a)的吸附了针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601的固相载体上，将去唾液酸-α1-酸性糖蛋白与所述特异性单克隆抗体AGP601结合的步骤；
(c)将与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的HRP-RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinus communis agglutinin II)结合物添加到与由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601结合的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白，并使其结合的步骤；
(d)测量并分析去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的步骤。
另外，本发明的另一个目的是提供去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的测定方法，所述方法利用通过所述步骤形成的、用于测量包含在血液中的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白含量而制备的、包含α1-酸性糖蛋白的单一抗体AGP601的试剂盒及免疫色谱条。
更具体地说，本发明的方法可以按如下方式实施。将针对α1-酸性糖蛋白的抗体添加到诸如微量滴定板孔的固相载体中，静置至少1小时以将抗体吸附到微量滴定板孔中，然后在室温下将稀释的血清样品溶液添加到每个孔中进行反应。反应后，把酶或荧光材料标记的凝集素，例如HRP-RCAII结合物添加到每个孔中，并使其在室温下反应。在用洗涤溶液洗涤孔之后，将显色底物，例如邻苯二胺底物溶液，添加到每个孔中以进行显色。一定时间后，停止反应并在适当的波长下测量吸光度，通过比较去唾液酸-α1-酸性糖蛋白标准溶液的吸光度来计算去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的浓度。如果标记物质是荧光物质，则将被荧光物质标记的凝集素添加到每个孔中，在室温下反应，用洗涤液洗涤，并测量荧光强度。
本发明提供的测量去唾液酸α-1酸性糖蛋白的方法是，为了测量在慢性进行性肝炎和肝纤维化进展时在血液中过量形成的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的浓度，使用针对α1-酸性糖蛋白的抗体和凝集素(lectin)的夹心免疫测定法。
换句话说，所述本发明提供的夹心免疫测定法包括(a)将针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601结合至微量滴定板等的固相载体上的步骤；(b)将含有去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的血液样品添加到所述固相载体上，将去唾液酸-α1-酸性糖蛋白与所述单克隆抗体AGP601结合的步骤；(c)添加与HRP结合的标记物HRP-RCAII结合物，将所述结合物结合到与所述单克隆抗体AGP601结合的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的步骤；(d)检测所述标记物HRP-RCAII结合物，以此测量去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的步骤。
本发明的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601可以从保藏于韩国生命工学研究院的KCTC13998BP融合细胞中制备。
另外，本发明使用了RCAII-HRP结合物作为探索蛋白质，该RCAII-HRP结合物通过选择性地分离和纯化特异性识别去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的凝集素蛋白RCAII蛋白而制备。
在根据本发明的实施例的方法中，血液样品可以是从疑似患有慢性进行性肝炎和肝纤维化进展的患者中采集的血液，但不限于此。
此外，本发明提供了用于追踪诊断血液样品中慢性进行性肝炎和肝纤维化的程度的试剂盒，包含由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601及与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)结合从而与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的HRP-RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinus communis agglutininII)结合物。
在本发明中，作为用于追踪诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化的试剂盒，提供了包含吸附α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体AGP601的固相载体和与标记物HRP结合从而与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的RCAII-HRP结合物的试剂盒。
作为本发明的试剂盒，优选地，除了包含吸附了α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体AGP601的固相载体和与标记物HRP结合从而与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的RCAII-HRP结合物以外，还可以进一步包含邻苯二胺(OPD)底物溶液、作为洗涤溶液的含有吐温的磷酸盐缓冲液以及血清稀释剂、去唾液酸-α1-酸糖蛋白标准溶液，但不限于此。
作为另一种诊断方法，本发明提供可有效测量血液样品中去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度从而迅速而简便地检查慢性肝病和肝纤维化可能性的免疫色谱条，其包含对α1-酸性糖蛋白特异性反应的单克隆抗体和识别去唾液酸糖蛋白的凝集素结合物Gold(金)-RCAII结合物。
作为优选的形式，本发明提供一种免疫色谱条，其包含保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的单克隆抗体AGP601和所述HRP-RCAII(蓖麻凝集素Ⅱ，Ricinus communisagglutinin II)结合物或纳米金-RCAII结合物。作为优选的具体例子，本发明提供一种免疫色谱条，其包含本发明的所述RCAII和胶体金结合的玻璃纤维(GF)垫、对照线和用于检测去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的测定线被线性处理的硝酸纤维素(NC)膜、吸收待测样品的样品垫、吸收样品中未反应的物质的吸收垫、以及安装所述材料的粘合塑料背衬。
在本发明的免疫色谱条中，按顺序将所述NC膜、GF垫、样品垫、吸收垫安装在粘合塑料背衬上，但是优选地组装时使材料可以通过毛细管作用连续地移动。免疫色谱条的组装方法可以按照常规的条生产方法进行，本发明的这种免疫色谱条可以以盒式(cassette)形式或棒式(stick)形式制备。
生物材料保藏信息
本发明的细胞系，于2019年10月17日保藏在韩国典型菌种保藏中心，保藏地址：韩国生物科学与生物技术研究所，韩国全罗北道井邑市立新街181，邮编：56212，保藏编号为KCTC13998BP，培养物名称为AGP601。
附图说明
图1是通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹确认本发明的由融合细胞系产生的抗AGP抗体的单克隆抗体的结果。
图2通过分析不同纤维化阶段(Fibrosis Stage)组的AsAGP浓度差异，显示了统计显著性。
图3通过对于HBV慢性肝炎受试者晚期纤维化阶段(advanced fibrosis stage)的灵敏度和特异性及AUC值，显示其有效性。
图4通过HBV慢性肝炎受试者的分界值(cuttoff value)差异，显示其有效性。
图5是显示利用使用本发明的抗AGP抗体AGP601和RCAII-HRP结合物的试剂盒AsAGP，对慢性进行性肝病和肝纤维化程度进行追踪诊断的有效性评价变量的分析结果的图。
图6示出了本发明提供的免疫色谱条的平面图和正面图。
图7显示了通过根据本发明的免疫色谱条测量的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的测量结果。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例的方式详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于以下实施例。
实施例1：对α1-酸性糖蛋白具有特异性的单克隆抗体的生产和RCAII-HRP结合物的制备
为了选择与α1-酸性糖蛋白(AGP)特异性反应的融合细胞，向微孔板中加入每孔100μl的α-1酸性糖蛋白抗原，反应2小时，然后加入磷酸盐缓冲液-Twin 20溶液洗涤。洗涤后，加入邻苯二胺作为山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶的底物溶液进行反应，以选择分泌对α1-酸性糖蛋白抗原具有特定高结合能力的抗体的融合细胞系。所选细胞系AGP601于2019年10月17日保藏在韩国生命工学研究院基因库中，保藏号为KCTC13998BP。
为了批量生产融合细胞系的亚型IgG2b的AGP601单克隆抗体，将300μl不完全佐剂(incomplete adjuvant)注入8周大的Balb/c小鼠的腹腔中。两周后，每只小鼠以200μl(4×106/细胞)的剂量注射在含有牛血清的RPMI培养基中培养的杂交瘤细胞，并从腹腔膨胀的小鼠中采集腹水。采集的腹水按每种小鼠血清离心分离以去除红细胞，并将上清液保存在-20℃下。通过蛋白电泳和免疫印迹证实了对通过蛋白A柱色谱分离和纯化的α1-酸性糖蛋白(AGP)具有特异性的单克隆抗体的特异性抗原反应性(图1)。
根据本领域已知的方法使用蛋白质电泳和免疫印迹法。另外，证实了本发明的AGP601对天然形式(native form)的AsAGP抗原的抗原反应远高于先前已知的As16.89单克隆抗体和AGP501。
从蓖麻籽中分离出的凝集素蛋白RCAII蛋白在4℃下用0.2M碳酸钠缓冲液(NaHCO3，pH 8.3)透析18小时，然后测量RCAII蛋白的浓度，将活性HRP(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidase)和RCAII蛋白分别以一定的浓度比率混合，并在室温下反应3小时。将各活性HRP和RCAII蛋白的混合物保存在棕色玻璃瓶中，并在4℃下反应18小时。反应结束后，向各混合物中加入1M三乙醇胺和0.1M硼氢化钠溶液(sodium borohydridesolution)在4℃下反应60分钟，并向其中加入反应终止溶液，然后在4℃下搅拌以终止反应。对于反应中止的HRP-RCAII结合物，在PBS缓冲液中透析约18小时以除去反应缓冲液，并通过添加2M甘氨酸使其稳定。将稳定的所述反应溶液进行凝胶过滤以分离HRP-RCAII结合物。
实施例2：在不同肝纤维化阶段(Fibrosis Stage)分析去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的差异浓度
使用肝纤维化诊断装置即肝纤维化扫描(FibroScan)测量受测患者的肝纤维化，将实施例1中分离的RCAII蛋白和活性HRP结合物用作搜索蛋白，将针对α1-酸性糖蛋白的抗体AGP601用作捕获蛋白，测定疑似患有慢性进行性肝炎和肝纤维化的患者血清样本中的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)浓度，以此测量不同肝纤维化程度与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的相关性，结果示于图2。
分析肝纤维化程度和AsAGP浓度、及其他变量之间的相关性的结果示于图2。被判定为HBV慢性肝炎的研究对象48人中确认肝纤维化阶段0(Fibrosis stage 0)有20人(41.7％)，肝纤维化阶段1(Fibrosis stage 1)有16人(33.3％)，肝纤维化阶段2(Fibrosisstage 2)和肝纤维化阶段3(Fibrosis stage 3)各有2人(4.2％)，肝纤维化阶段4(Fibrosis stage 4)有8人(16.7％)。
判定为肝纤维化阶段0(Fibrosis stage 0，F0)到肝纤维化阶段2(Fibrosisstage 2，F2)的受试者的平均AsAGP浓度为1.37±0.26，判定为肝纤维化阶段3(Fibrosisstage 3，F3)和肝纤维化阶段4(Fibrosis stage 4，F4)的受试者的平均AsAGP浓度为1.69±0.34。对两组之间平均AsAGP浓度差异进行鉴定的结果，p值(p-value)为0.002，表明差异具有统计学显著性。
判定为肝纤维化阶段0(Fibrosis stage 0，F0)到肝纤维化阶段3(Fibrosisstage 3，F3)的受试者的平均AsAGP浓度为1.38±0.25，判定为肝纤维化阶段4(Fibrosisstage 4，F4)的受试者的平均AsAGP浓度为1.77±0.34。对两组之间平均AsAGP浓度差异进行鉴定的结果，p值(p-value)<0.001，表明差异非常显著。
这些结果表明，比较不同肝纤维化阶段的肝纤维化程度，血液AsAGP的浓度随着纤维化的增加而增加，并且对不同肝纤维化阶段平均AsAGP浓度的差异进行鉴定的结果，p值为0.014，确认具有显著性。
实施例3.通过测量去唾液酸-α1-酸性糖蛋白(AsAGP)水平来预测HBV慢性肝炎患者的肝纤维化程度
通过本发明评价对象患者的不同肝纤维化阶段的有效性结果示于图3。计算HBV慢性肝炎患者的晚期纤维化阶段(advanced fibrosis stage)(阶段3～4)和肝硬化阶段的AUC值，结果HBV慢性肝炎纤维化预测能力为AUC>0.75，即有效水平，可以计算出适当的分界值(cuttoff value)以确认与晚期或肝硬化相应的肝纤维化恶化的阶段。
二次有效性评价变量是通过本发明显示出的对于不同肝纤维化阶段的肝纤维化程度的灵敏度和特异性，由此可以评价阳性样品的阳性判断和阴性样品的阴性判断，结果示于图4。
如图4所示，将HBV慢性肝炎患者中作为晚期纤维化阶段(阶段3至阶段4)的标准的分界值(cuttoff value)设为1.310时，灵敏度为100％，特异性为52.6％。
根据不同的分界值，当分界值为1.355时，灵敏度为80％、特异性提高到60.5％。特异性原本是以正常受试者为对象，而本研究以慢性肝炎患者为对象区分肝纤维化和肝硬化，因此低于原来的特异性。当与正常组相比时，确认测试结果为特异性提高到84％。
这些结果证实了在HBV慢性肝炎患者中判断肝纤维化严重恶化阶段的准确性很高。
实施例4：包含针对α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体AGP601的免疫色谱条的制备
(1)制备RCAII金结合物
将15μg/ml与本发明中筛选的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白反应的RCAII添加至胶体金颗粒溶液中，然后在室温旋转2小时的同时进行反应，然后以1/10体积添加10％BSA，使其浓度为1％并再次反应1小时后，制备了Ab-gold(金)结合物。通过以12,000rpm离心10分钟将上清液弃去，并通过添加2mM硼酸盐缓冲液再次洗涤Ab-金结合物。该洗涤进行了3次。在最后一次洗涤后，添加并悬浮金溶液约1/10体积的含有1％BSA的2mM硼酸盐缓冲液。用紫外光谱仪在530nm处测量吸光度后，将测量值稀释至3.00并使用。
(2)样品垫
作为吸收待测样品的部件，使用了一种由纤维素材质制成的材料。
(3)玻璃纤维(GF)垫
作为样品中去唾液酸-α1-酸性糖蛋白与根据本发明制备的RCAII之间的免疫反应发生的部分，将胶体金颗粒-RCAII暂时固定在GF膜的表面上，制备方法如下。
如所述(1)所述，将由制备的RCAII产生的单克隆抗体结合。
将GF垫(Millipore公司产品，1.0cm×0.7cm)浸入20mM硼酸钠缓冲液中并干燥，然后将以上制备的胶体金颗粒-RCAII均匀地喷涂在GF膜上并在37℃下干燥以制备表面上暂时固定有着色颗粒固相抗体的免疫反应垫的GF垫(也称为结合物垫)。
(4)硝酸纤维素(NC)膜和线(line)处理
将硝酸纤维素膜(Millipore公司)连接到塑料背衬(30cm x 5cm)后，将山羊抗小鼠IgG((goat anti-mouse IgG)在距塑料背衬底部约3.4cm处线性处理作为对照线，在2.7cm处线性处理杂交瘤细胞AGP601作为去唾液酸-α1-酸糖蛋白检测结果测定线，然后进行干燥，以此来制备NC膜。
(5)吸水(absorbent)垫
免疫反应后，使用纤维素膜，吸收样品中未反应的物质，从而使包含分析物的样品溶液通过毛细管作用移动。
(6)免疫色谱条的制备
如图6a和6b所示，将NC膜、GF垫、样品垫和吸收垫依次按顺安装在粘合塑料背衬上，且排列并粘合固定时，各部分重叠约0.1cm，使得材料可以通过毛细管作用连续地移动。
实施例5：使用免疫色谱条分析不同浓度的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白
实施例4中制备的免疫色谱条样品垫中添加用洗脱缓冲液(例如含有5％蔗糖(Sucrose)、1％牛血清白蛋白(BSA)或1％Triton X-100的50mM硼酸盐缓冲液)以1∶10的比例稀释的60至70μl的血清样品溶液，并在3至5分钟后，观察到对照线和测定线有无着色。
图7显示了盒式免疫色谱条的测定结果。第1条是适用对应于肝纤维化阶段0(Fibrosis stage 0，F 0)的血清的条带，第2至5条是适用与肝纤维化阶段1(Fibrosisstage 1，F1)到肝纤维化阶段4(Fibrosis stage 4，F4)对应的肝纤维化程度的血清的条带。如所述结果，通过对照线(上侧线)和检测结果测定线(下侧线)可以确认，对应于肝纤维化阶段1的第2条带显色较弱，而在肝纤维化程度恶化的第4至第5条带(纤维化阶段3，F3,纤维化阶段4，F4)中可观察到显著的红色着色线。
从以上结果中可以看出，使用本发明的利用了针对α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体的免疫分析诊断试剂盒和免疫色谱条，可以简单而方便地诊断血液中存在的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的显著性与否，对于肝脏疾病，可以早期快速简便地诊断肝脏疾病的早期阶段即慢性肝炎和肝纤维化阶段，它可以在患者的病情转移到重症肝癌前早期测量和监控肝疾病的进展程度从而进行预防。
因此，利用本发明的技术的AsAGP诊断试剂盒，以能够追踪和诊断慢性进行性肝炎和肝纤维化的进展程度的技术，可以作为在发展到严重肝病之前的早期诊断的有效检测方法来使用。
【产业适用性】
本发明可以利用于相关产业。

Claims (5)

1.一种用于从血液样品中特异性判定慢性进行性肝炎和肝纤维化进展与否的试剂盒，所述试剂盒包含由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601及与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的HRP-RCAII结合物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用包括以下步骤：
(a)将由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601吸附至固相载体的步骤；
(b)将含有去唾液酸-α1-酸性糖蛋白的血液样品添加到所述步骤(a)的吸附了针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601的固相载体上，将去唾液酸-α1-酸性糖蛋白与所述特异性单克隆抗体AGP601结合的步骤；
(c)将与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的RCAII和辣根过氧化物酶的结合物HRP-RCAII结合物添加到经过所述(b)结合到单克隆抗体AGP601的去唾液酸-α1-酸性糖蛋白，并将其结合的步骤；
(d)测量并分析去唾液酸-α1-酸性糖蛋白浓度的步骤。
3.根据权利要求2的所述的试剂盒，其特征在于，所述血液样品从疑似患有慢性进行性肝炎和肝纤维化的患者中采集。
4.一种用于从血液样品中特异性判定慢性进行性肝炎和肝纤维化进展与否的免疫色谱条，所述免疫色谱条包含由保藏号为KCTC13998BP的融合细胞系产生的针对α1-酸性糖蛋白的特异性单克隆抗体AGP601和与去唾液酸-α1-酸性糖蛋白特异性结合的GOLD-RCAII结合物。
5.根据权利要求4所述的用于特异性判定慢性进行性肝炎和肝纤维化进展与否的免疫色谱条，其特征为，
所述免疫色谱条为盒式形式。
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