KR101863508B1 - 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 agp501 및 rcaⅱ-hrp 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도 - Google Patents

알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 agp501 및 rcaⅱ-hrp 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도 Download PDF

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조재현
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Abstract

본 발명은 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해 간경변 및 간암 여부의 정확한 진단으로 간경변 또는 간암의 조기발견과 함께 치료를 용이하게 할 수 있다. 현재 혈액을 통하여 간경변을 조기에 진단하는 체외진단시약은 없는 상태이며, 간암진단의 경우 AFP가 사용되고 있으나 간암에 대한 양성율이 매우 낮아 새로운 간암진단시약의 개발이 매우 필요한 상태이다. 본 발명의 기술을 이용한 간경변 및 간암 전문 진단키트 AsAGP의 제품화를 통하여 국내외 전문 의료기관에 널리 공급되어 의료기기 산업 및 진단의학의 발전에 일익을 담당할 것이다.

Description

알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도{Kit for liver cirrhosis or liver cancer specific diagnosis comprising monoclonal antibody AGP501 against asialo α-1 acid glycoprotein and RCAⅡ-HRP conjugates and uses thereof}
본 발명은 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
질병관리에 대한 패러다임이 치료 중심에서 조기진단을 통한 예방중심으로 전환됨에 따라 과거 진단기기의 보조적인 역할로 인식되던 체외진단용 시약이 진단검사 결과의 판정에 결정적인 영향을 주는 제품으로 인식되고 있어 체외진단용 시약의 개발이 근래 들어 더욱 중요하게 여겨지고 있다. 또한 기술 집약적이며 치료제보다 시간과 비용이 적게 드는 산업이어서 다양한 체외진단용 시약이 개발되어 있으나, 국내에서 개발한 간경변, 간암, 대장암, 위암 등 중증질환 관련 진단시약은 전무한 실정이고, 외국산 수입시약의 사용빈도가 90% 이상을 차지하고 있어 국내 기술로 개발된 특화된 간경변, 간암, 위암 등 중증질환 진단시약의 개발이 시급한 실정이다.
간염, 간경변, 간암 등을 포함하는 간질환은 대한민국, 중국 등 동아시아 국가에서는 단일 질병으로 가장 많은 환자가 발생하고 있다. 만성 간질환은 만성 간염에서부터 섬유화를 거쳐 간경변증으로 진행하는 연속적인 질환으로 만성 간질환의 예후와 치료 시점은 만성적인 간손상으로 인한 간섬유화의 정도에 크게 좌우된다. 만성적인 간내 염증으로 세포외 기질이 과다하게 침착되어 간내 구조가 변형되고 간세포수가 감소하는 간섬유화가 일어나면 진행성 간부전 및 문맥고혈압이 되어 결국 간경변과 일차 간세포암종으로 진행하게 된다. 간생검은 간 섬유화를 진단하는 표준 진단법이지만 조직 채취 오류에 의한 오차문제로 정확도에 대한 문제점이 있으며, 침습적 시술과정에서 발생할 수 있는 위험성과 합병증 발생, 검사자 간 숙련도 차이로 인하여 간질환 확인용으로 사용하기에는 한계가 있다. 이를 대체하는 방법으로 간섬유화스캔, 복부초음파 검사, 혈청 생화학 표지자를 조합한 특허 알고리듬을 이용하여 판정하는 시험법 등이 소개되어 있다. 가장 기본적인 간질환 검사는 혈액 중 AST(aspartate transaminase, GOT), ALT(alanine transaminase, GPT), TB(total bilirubin), ALP(alkaline phosphate), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), AFP(α-fetoprotein)등의 양을 측정하여 간질환의 상태를 측정하고 있다.
그러나 현재 간질환 진단으로 사용되고 있는 AST, ALT 등의 측정은 단지 간의 염증 정도 및 급성간염 여부를 반영하는 척도에 불과하며, 특히 간경변 등 중증 간질환으로 진행되었을 경우 상기의 진단방법들은 정상인의 간 수치와 유사한 진단 결과치를 시현하고 있어 커다란 문제점이 내포되어 있다 할 것이다. 또한 간암진단의 경우 AFP(alpha-feto protein)와 같은 표식자가 사용되고 있으나 그 양성율이 약 40%대 수준에 머물고 있어 이의 개선책을 마련하여 실행하는 것도 현 간질환 진단에서 매우 시급한 과제이다.
간질환에서 특이적으로 많이 나타나고 있는 아시알로 알파-1산 당단백질은 간질환 발생 시 혈청 내 표식자로서 간질환 발생시 급격히 증가하고 회복기에 들어서면 다시 감소하는 것으로 보고되었으며, 혈중 아시알로 알파-1산 당단백질 또는 아시알로 알파-1산 당단백질 수용체의 농도는 간질환의 진전상태를 알 수 있는 임상적표식자로 보고되었다. 이와 같이 아시알로 알파-1산 당단백질은 간 질환에 대한 특이성이 높으므로 간 질환의 조기 진단에 유용한 표식자로 이용할 수 있을 것으로 추정된다.
한편, 한국등록특허 제0394940호에서는 '간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로 당단백질양의 측정방법 및 측정용 킷트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0834932호에서는 '알파-1산 당단백질과 아사이알로 알파-1산 당단백질의 비율을 이용한 간질환 진단킷트'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 중증 간질환인 간경변 및 간암 진단 양성율을 높이기 위해 알파-1산 당단백질 특이적 단일클론 항체 AGP501을 생산하였으며, 또한 아시알로 알파-1산 당단백질을 인지하는 기존의 렉틴 단백질 RCA에서 RCAⅠ 단백질을 제거하고, RCAⅡ 단백질을 선택적으로 분리정제 하였다. RCA, RCAⅠ 및 RCAⅡ 단백질과 활성 HRP 결합체를 탐색단백질로, 알파-1산 당단백질 특이적 단일클론 항체 AGP501을 포획단백질로 구성하여 간경변 환자의 혈청시료를 대상으로 분석한 결과, RCAⅠ및 RCAⅡ 단백질 혼합물인 RCA-HRP를 탐색단백질로 사용하였을 경우 75.5%의 민감도를 나타내었으나, 본 발명의 단일클론 항체 AGP501와 RCA 단백질에서 RCAⅠ 단백질을 제거한 본 발명의 RCAⅡ-HRP를 탐색단백질로 사용하였을 경우 87.6%의 민감도를 나타내어 간경변 진단 양성율에 있어서 기존의 방법보다 12% 이상의 매우 높은 민감도 개선을 가져왔음을 확인하였다.
또한, 간암 환자에 대한 민감도를 조사하기 위하여 간암 환자의 혈청시료에서 가장 높은 민감도를 나타내는 RCAⅡ-HRP 접합체를 탐색단백질로 알파-1산 당단백질 특이적 단일클론 항체 AGP501을 포획단백질로 구성하여 간암환자의 혈청시료를 대상으로 기존에 사용하고 있는 간암진단시약 AFP와의 민감도를 비교한 결과 기존 간암진단시약인 AFP의 경우 45%의 민감도를 나타내었으나, 본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 사용하였을 경우 76%의 민감도를 나타내어 기존 간암진단시약인 AFP에 비하여 30% 이상의 매우 높은 민감도 개선을 가져왔음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용할 경우 혈액을 통해 간경변 및 간암을 초기에 정확하게 판별할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501을 고상체에 흡착시키는 단계;
(b) 상기(a) 단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501가 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP501에 결합시키는 단계;
(c) 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 상기(b) 단계의 단일항체 AGP501에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 검출하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액시료로부터 간경변 또는 간암 여부를 특이적으로 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 간경변 또는 간암을 특이적으로 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에서는 알파-1산 당단백질에 대한 항체인 AGP501을 생산하였으며, 또한 아시알로 알파-1산 당단백질을 인지하는 기존의 렉틴 단백질 RCA 단백질에서 RCAⅠ단백질을 제거하고, RCAⅡ 단백질을 선택적으로 분리정제하여 제조된 RCAⅡ-HRP 접합체를 통하여 간경변 및 간암 환자에 대한 진단 양성율을 크게 상승시켰다.
이를 바탕으로 간경변 여부의 정확한 진단을 통하여 간경변의 조기발견과 함께 치료를 용이하게 하여 치명적인 간암으로 진행되는 것을 미연에 방지할 수 있게 될 것이다. 현재 혈액을 통하여 간경변을 조기에 진단하는 체외진단시약은 없는 상태이며, 또한 혈액을 통한 간암 진단의 경우도 현재 모든 병원에서 사용하고 있는 간암진단시약인 AFP의 특이성이 매우 낮아 의료현장에서 오진의 직접적인 원인이 되고 있어, 기존 간암진단시약 AFP를 대체하고 보완할 수 있는 새로운 간암진단시약의 개발이 매우 시급한 실정이다.
본 발명의 기술을 이용한 간경변 및 간암 전문 진단키트 AsAGP의 제품화를 통하여 국내외 전문 의료기관에 널리 공급되어 의료기기산업 및 진단의학의 발전에 일익을 담당할 것이다.
도 1은 본 발명의 융합세포주가 생산한 항-AGP 항체에 대한 단일클론항체를 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 2는 엘리자(ELISA) 방법으로 해리상수(Kd)를 측정하여 항원과의 반응성을 나타낸 것이다.
도 3은 Bio-LC 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 탈시알화된 아시알로 알파-1산 당단백질에서 시알산 존재여부를 나타내는 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 강 양이온수지 컬럼 크로마토그래피인 SP(sulphopropyl)-세파로스 수지를 이용하여 RCA 단백질에서 RCAⅠ 단백질과 RCAⅡ 단백질을 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 강 양이온 수지에서 분획 및 농축한 분획액(RCAⅠ단백질, RCAⅡ 단백질)을 각각 별도로 약 양이온 교환수지인 CM(carboxymethyl) 세파로스 수지 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 고 분리로 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 피마자로부터 분리정제한 RCA, RCAⅠ및 RCAⅡ 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 결과(a) 및 혈구응집소 활성도(hemagglutinin activity)(b)를 보여주는 사진이다.
도 7은 분리한 RCA, RCAⅠ및 RCAⅡ 단백질에 과산화효소(HRP)를 결합시킨 접합체의 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 흡착력에 대한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 항체와 각각의 RCA-HRP, RCAI-HRP 및 RCAⅡ-HRP을 이용한 효소면역측정방법으로 간경변 환자의 혈청에 대한 적합성 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 항-AGP 항체(AGP501)와 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용한 키트 AsAGP와 기존 간암 진단시약 AFP(alpha-feto protein)를 이용하여 간경변 환자와 간암환자의 혈청시료에 대한 반응성 시험에 대한 비교 결과를 나타내는 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501을 고상체에 흡착시키는 단계;
(b) 상기(a) 단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501가 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP501에 결합시키는 단계;
(c) 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 상기(b) 단계의 단일항체 AGP501에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 검출하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액시료로부터 간경변 또는 간암 여부를 특이적으로 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 간이 정상에서 간염, 간경변 또는 간암으로 이행될 때 혈액 내에서 과량으로 형성되는 것으로 추정되는 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하기 위하여, 아시알로 알파-1산 당단백질에 대한 항체와 렉틴(lectin)을 이용하는 샌드위치 면역측정법을 제공한다. 즉, (a) 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501을 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 결합시키고, (b) 상기 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP501에 결합시키고, (c) 표지물질인 HRP가 결합된 RCAⅡ-HRP 접합체를 가하여 항체에 결합한 아시알로 알파-1산 당단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질 HRP를 검출하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함한다.
본 발명의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501는 한국생명공학연구원에 2017년 06월 12일자로 기탁된 KCTC13283BP인 융합세포로부터 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 아시알로 알파-1산 당단백질을 인지하는 기존의 렉틴 단백질 RCA에서 RCAⅠ단백질을 제거하고, RCAⅡ 단백질을 선택적으로 분리정제하여 제조된 RCAⅡ-HRP 접합체를 탐색단백질로 사용하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 혈액시료는 간경변 또는 간암으로 의심되는 환자로부터 채취한 혈액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 간경변 또는 간암을 특이적으로 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에서는 간경변 또는 간암 특이적 판별용 키트로서, 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501이 흡착된 고상체 및 표지물질 HRP가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 RCAⅡ-HRP 접합체를 포함한 키트를 제공한다.
본 발명의 간경변 또는 간암 특이적 판별용 키트로 바람직하게는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501이 흡착된 고상체, 표지물질 HRP가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 RCAⅡ-HRP 접합체에 더하여 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 아사이알로당단백질 표준용액을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알파- 1산 당단백질( AGP )에 의한 단일클론 항체생산 및 분리ㆍ정제
알파-1산 당단백질(AGP)에만 특이적으로 반응하는 융합세포를 선별하기 위하여, 마이크로플레이트에 알파-1산 당단백질 항원을 웰 당 100㎕씩 가하여 2시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충용액-트윈 20 용액으로 세척하였다. 세척 후 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬퍼옥시다제의 기질 용액으로 오르소-페닐렌디아민을 넣어 반응시켜 알파-1산 당단백질(AGP) 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합 세포주들을 선별하였다. 이들 융합 세포주들 중 알파-1산 당단백질(AGP) 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 생성 세포주를 선별하여 효소면역 측정법으로 역가를 측정하고 이중면역확산법으로 서브클래스를 분석한 결과 선별된 클론이 분비하는 항체가 IgG 임을 확인하였으며, 선별된 세포주(AGP501)는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2017년 6월 12일에 기탁번호 KCTC13283BP로 기탁하였다.
융합세포주의 서브클래스가 IgG 인 AGP501 단일클론 항체를 대량생산하기 위하여 8주령 Balb/c 생쥐의 복강에 불완전 어주번트(incomplete adjuvant)를 300 ㎕ 주입하였다. 2주 후에 소혈청을 함유한 RPMI 배지에서 키운 하이브리도마 세포들을 생쥐 1 마리당 200 ㎕(4×106/cells)씩 주입하고 복강이 부풀어 오른 생쥐로부터 복수액을 채취하였다. 채취한 복수액은 생쥐 혈청별로 원심분리하여 적혈구를 제거한 후 상등액을 -20℃에서 보관하였다. 단백질 A 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 분리ㆍ정제한 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 단일클론 항체의 특이적 항원반응성을 단백질 전기영동과 웨스턴 블롯법을 시행하여 확인하였다(도 1). 상기 단백질 전기영동과 웨스턴 블롯법은 당해 기술분야에 널리 알려진 방법에 따라 실시하였다. 도 1에서 수탁번호 KCTC 13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체 AGP501은 알파-1산 당단백질뿐만 아니라 시알산이 제거된 아시알로 알파-1산 당단백질도 동시에 인식할 수 있는 항체로 기존에 알려진 알파-1산 당단백질에 대한 단일클론 항체보다 아시알로 알파-1산 당단백질에 대해 높은 특이성을 보였다. 또한 엘리자 방법으로 해리상수(Kd)를 측정하여 항원과의 반응성을 확인하였다(도 2). 따라서, 본 발명의 AGP 501은 기존에 이미 알려진 As16.89 단일클론 항체보다 항원에 대한 알파-1산 당단백질 항원 반응성이 훨씬 높게 나타나는 점을 확인하였다.
실시예 2. 아시알로 알파-1산 당단백질의 분리ㆍ정제 및 아시알로 알파-1산 당단백질의 시알산 분석
아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)를 제조하기 위하여 알파-1산 당단백질(AGP)을 탈시알산화(desialylation) 하였다. AGP 15 mg을 0.1 N 황산에 녹인 후 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 시료는 1.0 N 수산화나트륨으로 중화시킨 후 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.8) 용액에서 투석하였다. 투석이 끝난 시료는 FPLC에서 Superose 6(10/300) 컬럼을 이용하여 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)를 분리하였다. 분리정제한 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)은 Native 단백질 전기영동법과 웨스턴 블롯법으로 분리 정도를 확인하였고, 브래드포드 분석법을 이용하여 농도를 측정하였다.
아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)은 알파-1산 당단백질(AGP)에서 시알산(sialic acid)이 제거된 당단백질로 본 발명의 효과를 나타내기 위해 매우 중요한 원료물질이다. 따라서 황산처리에 의해 탈시알화된 AsAGP에서 시알산이 제거되었는지를 확인하기 위하여 시알산 분석시험을 실시하였다. 동결 건조된 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP) 파우더 1 mg을 취하여 산 처리한 후 CarboPac PA10 컬럼을 사용하여 Bio-LC에서 시알산을 분석하였다. 도 3에서 (A)는 시알산 표준물질인 N-NANA(acetylnuraminic acid)이며, (B)는 소혈청 알부민으로 음성대조군으로 사용하였다. (C)는 알파-1산 당단백질(AGP)로 단백질에 결합되어 있는 시알산이 검출되었으나, (D)에서는 황산 처리한 AsAGP에서 시알산이 거의 검출되지 않았다. 본 발명에서 제조한 AsAGP는 시알산을 함유하지 않아 표준물질로 사용 가능하다는 것이 검증되었다. 표 1은 시험물질에서 검출된 시알산의 농도를 표시한 것이다.
시알산 농도
구 분 N-acetylneuraminic acid(nmole)
BSA 0.245±0.037
AGP 20.6733±4.144
AsAGP 0.101±0.024
실시예 3. 알씨에이 (RCA), 알씨에이 Ⅰ(RCAⅠ)과 알씨에이 Ⅱ(RCAⅡ) 단백질의 분리·정제
1) 단백질의 추출
피마자 0.5 kg을 3% 초산 용액 1 L에 침지시켜 냉장고에서 하루 밤 정도 넣어 두었다. 상등액은 버리고 믹서기에 피마자와 새로운 3% 초산액을 적당량 넣고 믹서기로 균질화시켜, 3% 초산액을 1 L가 되게 하였다. 균질화된 액을 냉장고에 넣고 1일 동안 교반하였다.
추출물을 원심분리(8,000 rpm, 4℃, 60분)하여 상등액만 취해, 기름성분을 제거하였다. 이 여액에 황산암모늄을 처리한 후에 냉장고에 하루밤 배양하였다. 이 용액을 원심분리(8000 rpm, 4℃, 30분)하여 침전물을 회수한 후에 침전물에 3 mM-초산나트륨 완충액(sodium acetate, pH 6.4)을 적당량 첨가하여 침전물을 용해하였다. 이 용액을 투석막(10 KDa)에 넣고 3 mM 초산나트륨 완충액(pH 6.4)로 5℃에서 투석하였다. 투석한 용액을 원심분리(10,000 rpm, 4℃, 60분)하여 상등액만을 얻은 후 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이 상등액에는 알씨에이(RCA) 단백질이 존재하며, 알씨에이(RCA) 단백질에는 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질과 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질이 함께 존재한다.
2) 강 양이온 교환수지 크로마토그래피에 의한 분리
본 정제 공정에서는 알씨에이(RCA) 단백질에 있는 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질과 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질을 분리하는 단계로서 강 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피인 SP(sulphopropyl)-세파로스 수지를 사용하여 분리하였다. 컬럼 평형 완충액은 30 mM 초산 나트륨 완충액(pH 6.4)로 충분히 평형시킨 후에 시료를 로딩하고 컬럼 혹은 시료량의 2 내지 3배 정도로 평형 완충액을 흘려보내 수지와 결합하지 못한 불순물을 제거하였다. 용출 완충액은 30 mM 초산나트륨 완충액에 0.5 M 염화나트륨에 함유된 완충액을 사용하여 레진과 결합된 단백질은 용출하였다. 용출은 컬럼 볼륨의 10배 정도의 구배(linear gradient)를 주며, 용출개시와 동시 분획을 받아 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질과 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질을 분리하였다(도 3). 각각의 피크 1(p-1)과 피크 2(P-2) 분획을 모아 농축기(membrane 분자량 사이즈 : 30KDa)로 농축하였다. 피크 1과 피크 2의 분획을 SDS-PAGE(reduce, Non-reduce)로 확인한 결과 피크 1은 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질이며 피크 2는 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질이었다(도 5).
3) 약 양이온 교환수지 크로마토그래피에 의한 정제
알씨에이(RCA) 단백질로부터 분리한 피크 2의 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질과 피크 1의 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질을 각각 고 분리로 정제하는 단계로서 약 양이온 교환수지는 CM(carboxymethyl) 세파로스 수지를 사용하여 정제하였다(도 5). 강 양 이온수지에서 분획 및 농축한 분획액 중 피크 2와 피크 1을 각각 별도로 컬럼 크로마토그라피를 수행하여, 각각의 시료를 컬럼 평형화 완충액인 50 mM 인산나트륨 완충액(sodium phosphate, pH 7.2)에 투석한 후에 컬럼 로딩 시료로 사용하였다.
투석한 시료를 CM(carboxymethyl) 세파로스 수지에 로딩한 후 컬럼 혹은 시료량의 3~4배 정도로 평형화 버퍼를 흘려주었다. 그리고 용출버퍼를 사용하여 컬럼 볼륨의 15~20배 정도의 구배(stepwise gradient)를 주며, 용출 개시와 동시에 분획을 받았다. 피크를 확인 후 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질과 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질 분획을 확인하기 위해 SDS-PAGE(도 5)와 혈구응집소 활성도(hemagglutinin activity, 도 6)로 확인하였다. 그 결과 혈구응집소 활성도는 알씨에이Ⅰ(RCAⅠ) 단백질이 가장 높으며 알씨에이(RCA) 단백질, 알씨에이Ⅱ(RCAⅡ) 단백질 순으로 활성이 나타났다.
혈구응집소 활성도 측정은 염소 혈액과 0.1 M NaCl을 1:2로 혼합한 뒤 3,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 3회 세척하여 적혈구만을 분리하여 0.1 M NaCl으로 희석하여 1% 적혈구 용액을 준비하였다. 96 웰 둥근 플레이트에 각 알씨이에(RCA) 단백질 농도를 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.625, 0.8125, 0.40625, 0.203125, 0.1015625, 0 μg/mL로 100 ㎕씩 넣어준 뒤, 30 mM Tris-HCl+0.15 M NaCl(pH 6.8) 100 ㎕와 1% 적혈구 용액(0.1 M NaCl) 30 ㎕를 넣어준 뒤 상온에서 하룻밤 동안 반응시켜 응집 여부를 확인하였다.
실시예 4. RCA- HRP , RCAⅠ- HRP , RCAⅡ- HRP 접합체의 제조 및 정제
실시예 2에서 분리한 RCA, RCAⅠ, RCAⅡ 단백질을 각각 0.2 M 탄산나트륨 완충용액(NaHCO3, pH 8.3)으로 4℃에서 18시간 동안 투석한 후, RCA, RCAⅠ, RCAⅡ 단백질의 농도를 측정하여 활성 HRP(horseradish peroxidase)와 RCA, RCAⅠ, RCAⅡ 단백질을 각각 일정농도 비율로 혼합하여 실온에서 3시간 반응하였다. 활성 HRP와 RCA, RCAⅠ, RCA Ⅱ 단백질을 각각 혼합한 액을 갈색유리병에 보관한 채로 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 각 혼합액은 1 M 트리에탄올아민과 0.5 M 소듐 보로하이드리드 용액을 첨가하여 4℃에서 60분간 반응시키고, 반응 정지액을 첨가하여 4℃에서 교반시켜 반응을 정지시켰다. 반응이 종료된 RCA-HRP, RCAⅠ-HRP, RCAⅡ-HRP 접합체는 PBS 완충액에서 약 18시간 동안 투석하여 반응용 완충액을 제거한 다음 2 M 글리신을 첨가하여 안정화시켰다. 이와 같이 안정화된 각각의 접합체를 겔 여과하여 RCA-HRP, RCAⅠ-HRP, RCAⅡ-HRP 접합체를 분리하였다.
실시예 5. RCA- HRP , RCAⅠ- HRP , RCAⅡ- HRP 접합체의 아시알로 알파-1산 당단백질( AsAGP)에 대한 흡착력 시험
상기에서 분리한 RCA-HRP, RCAⅠ-HRP, RCAⅡ-HRP 접합체들의 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 흡착력을 측정하였다. 흡착력 측정을 위한 포획단백질은 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 단일클론 항체인 AGP501을 사용하고 탐색단백질을 RCA-HRP, RCAⅠ-HRP, RCAⅡ-HRP 접합체를 각각 사용하여 효소면역 샌드위치법을 실시하였다. 정제된 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 항체(AGP501)를 2 μg/mL의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 마이크로타이터플에이트의 각 웰에 코팅시키고 1% BSA-T로 차단 후 희석한 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)를 100 ㎕씩 넣고 2시간 반응시킨 후 세척하였다. RCA-HRP, RCAⅠ-HRP, RCAⅡ-HRP 접합체를 각각 적절한 농도로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 1시간 반응시킨 후 세척하여 기질(OPD)로 발색시켰으며 황산용액으로 반응을 중지시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7에서와 같이 RCAⅠ단백질은 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대하여 매우 낮은 흡착력을 나타내었으며, RCAⅠ 단백질과 RCAⅡ 단백질의 혼합물인 RCA 단백질의 경우 RCAⅠ단백질의 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 비특이적인 특성으로 인하여 저해를 받는 것으로 나타났다. RCA 단백질에서 RCAⅠ단백질을 떼어내고 순수 분리한 RCAⅡ 단백질의 경우 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 매우 높은 흡착력을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 항체 AGP501과 RCA, RCAⅠ- HRP RCA Ⅱ- HRP 접합체를 이용한 키트 에 의한 아시알로 알파-1산 당단백질 반응성 시험을 통한 간경변 진단
실시예 3에서 분리한 RCA, RCAⅠ과 RCAⅡ 단백질과 활성 HRP 접합체를 탐색단백질로 사용하고 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 항체(AGP501)를 포획단백질로 구성하여, 간경변 환자의 혈청시료 중에서의 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대한 반응성 시험을 위하여 포획단백질 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 항체(AGP501)와 탐색단백질 RCA, RCAⅠ과 RCAⅡ 단백질과 활성 HRP 접합체를 적절한 농도로 희석하여 실시예 5와 같은 방법으로 측정하였다. 측정에 사용된 혈청시료는 정상인 206명, 간경변 환자 347명의 혈청을 적절한 농도로 희석하여 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)의 농도를 측정하였다.
그 결과는 도 8에서와 같이 RCAⅠ과 RCAⅡ 단백질의 혼합물인 RCA-HRP를 탐색단백질로 사용하였을 경우 75.5%의 높은 민감도를 나타내었으나 RCA 단백질에서 RCAⅠ단백질을 제거한 RCAⅡ-HRP를 간경변 진단을 위한 탐색단백질로 사용하였을 경우 87.6%의 민감도를 나타내어, 12% 이상의 매우 높은 민감도 개선을 가져왔음을 확인할 수 있었다.
간경변 진단 적합성 시험
Parameter RCA-HRP RCAI-HRP RCAⅡ-HRP
간경변 검사 민감도
(sensitivity)		 75.5 57.1 87.6
특이도
(specificity)		 78.1 53.4 85.4
양성예측도
(positive predictive value) 		85.3 67.3 91.0
음성예측도
(negative predictive value) 		65.4 42.5 80.4
실시예 7. 항- AGP 항체( AGP501 )와 RCA Ⅱ- HRP 접합체를 이용한 키트 AsAGP와 기존 간암 진단시약 AFP와의 간경변 진단 비교시험
항-AGP 항체(AGP501)와 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용한 키트 AsAGP와 기존 간암 진단시약 AFP(alpha feto protein)을 시중에서 구입하여 적당한 농도로 희석한 간경변환자(100명) 및 간암환자(100명)의 혈청 시료들을 이용하여 두 시약간의 반응성의 차이를 확인하였다.
도 8의 결과에서 항-AGP 항체(AGP501)와 RCAⅡ-HRP 접합체를 이용한 키트인 AsAGP는 1단계로 알파-1산 당단백질(AGP)에 대한 항체를 마이크로타이터플레이트에 흡착시키고, 2단계로 혈청시료를 1단계의 항체에 결합시킨 후, 3단계로 RCAⅡ 단백질과 HRP 접합체를 2단계)의 혈청시료에 반응시켰고, 4단계로 혈액 시료 내 표지물질인 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하였다.
도 9에서와 같이 간경변에서 AsAGP 분석의 경우 87%의 높은 양성율을 나타낸 반면, 기존 간암 진단시약인 AFP 분석의 경우 간경변에서 23%의 양성율을 나타내어 AFP는 간경변 진단을 위한 유의미한 값을 나타내지 못했으며, 간암에서는 기존 간암진단시약 AFP는 45%의 양성율을 보여 유의미한 값을 나타내었으나, AsAGP 분석의 경우 간암에서 양성 76%의 높은 양성율을 나타내어 30% 이상의 민감도 개선을 가져와 기존 간암진단시약 AFP를 대체할 수 있는 새로운 간암진단시약으로 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명의 기술을 이용한 아시알로 알파-1산 당단백질에 높은 특이성을 나타내는 RCAⅡ 단백질을 이용한 진단 키트인 AsAGP는 간경변과 간암의 정확한 조기검진을 통하여 효과적인 치료를 할 수 있는 유용한 방편이 될 수 있는 것으로 분석되었다.
한국생명공학연구원 KCTC13283BP 20170612

Claims (5)

  1. (a) 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501을 고상체에 흡착시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501가 흡착된 고상체에 아시알로 알파-1산 당단백질을 함유한 혈액시료를 가하여 아시알로 알파-1산 당단백질을 상기 단일항체 AGP501에 결합시키는 단계;
    (c) 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 상기(b) 단계의 단일항체 AGP501에 결합된 아시알로 알파-1산 당단백질에 가하여 결합시키는 단계; 및
    (d) 상기 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 검출하여 아시알로 알파-1산 당단백질의 농도를 측정하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액시료로부터 간경변 또는 간암 여부를 특이적으로 판별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액시료는 간경변 또는 간암으로 의심되는 환자로부터 채취한 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어, 아시알로 알파-1산 당단백질에 특이적으로 결합하는 HRP-RCAⅡ(Ricinus communis agglutinin Ⅱ) 접합체를 포함하는, 혈액시료로부터 간경변 또는 간암을 특이적으로 판별하기 위한 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 수탁번호 KCTC13283BP로 기탁되어 있는 융합세포주에 의하여 생산되는 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 AGP501은 알파-1산 당단백질 보다 아시알로 알파-1산 당단백질(AsAGP)에 대해 더 특이적으로 반응하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 RCA II는 렉틴 단백질 RCA에서 RCA I 단백질이 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
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면역 ? 기술에 의한 간질환 조기 진단장치 시스템 개발, (주) 코비아스 (생명공학연구원), 산업자원부 최종 연구보고서 (2003. 12. 31.) *
면역 ?? 기술에 의한 간질환 조기 진단장치 시스템 개발, (주) 코비아스 (생명공학연구원), 산업자원부 최종 연구보고서 (2003. 12. 31.)

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