KR101675901B1

KR101675901B1 - Ｌ－푸코스 α1→6 특이적 렉틴

Info

Publication number: KR101675901B1
Application number: KR1020117004016A
Authority: KR
Inventors: 유카 고바야시; 준 히라바야시; 히로아키 다테노; 히로카주 가와기시; 히데오 도라
Original assignee: 제이-오일 밀스, 인코포레이티드
Priority date: 2008-07-22
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2016-11-15
Also published as: CN102105490A; CN102105490B; ES2605980T3; EP2305704A4; US20110129938A1; US8461305B2; JP4514163B2; WO2010010674A1; JPWO2010010674A1; RU2524425C2; EP2305704B1; EP2305704A1; KR20110051202A; RU2011103850A

Abstract

본 발명은 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 렉틴을 개시한다. 또한, 본 발명은 상기 렉틴의 용도를 개시한다. 본 발명의 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 하기를 특징으로 한다: (1) 상기 렉틴은 담자균 또는 자낭균으로부터 추출되며, (2) 상기 렉틴은 4,000 내지 40,000 의 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량을 가지며, 그리고 (3) 상기 렉틴은 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 친화성을 가지며, 상기 친화성은 (25℃에서) 1.0×10⁴M^-1 이상의 결합 상수에 의하여 나타내어진다. 상기 렉틴은 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있으며, L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 정제에 효과적이다.

Description

Ｌ－푸코스 α1→6 특이적 렉틴{Ｌ－FUCOSE α1→6 SPECIFIC LECTIN}

본 발명은 신규한 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴, 그 제조 방법, 및 그 적용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 담자균 또는 자낭균으로부터 유래되는 신규한 렉틴, 그 제조 방법, 및 상기 렉틴을 이용한 당 사슬의 검출 및 분획 방법에 관한 것이다.

α1→6-연결을 통하여 L-푸코스 잔기를 N-연결 글리칸의 환원성 말단 N-아세틸글루코사민으로 전이시켜 코어 푸코실화를 형성하는α1→6 푸코실트랜스퍼레이즈(FUT8)의 유전자가 간세포의 암화에 따라 발현한다는 것이 공지되었다. 코어-푸코실화 모노- 및 바이-안테나성 N-글리칸에 친화성을 갖는 LCA(Lens culinaris agglutinin)을 사용하여 간세포 암종이 렉틴 친화성 전기영동에 의하여 최근 검출되었다.

항체-의존성 세포독성(이하, ADCC 활성으로 칭함)은 인간에 의하여 소유된 면역 기능 중 하나이다. ADCC 활성은 자연 살해 세포 및 단핵구와 같은 백혈구가 항체를 통하여 암세포와 같은 표적 세포를 사멸시키 것을 통한 활성이다. ADCC 활성은 암에 대하여 인간화 항체(전이성 유방암 치료제)로서의 헤르셉틴(Herceptin) 및 키메라 항체(비-호지킨 림프종 치료제)(비특허 문헌 1)로서의 리툭산(Rituxan)과 같은 항체 의약품에 의한 항암 메커니즘과 관련이 있다. 이러한 항체 의약품이 낮은 ADCC 활성을 가질때, 고용량의 항체 의약품을 투여하는 필요가 발생하며, 이는 결과적으로 증가된 비용 및 부작용(예컨대, 면역 저하에 따른 감염)과 같은 문제점을 야기한다.

ADCC 활성은 α1→6 L-푸코스가 전달되는 항체와 α1→6 L-푸코스가 전달되지 않는 항체 사이에서 50 내지 100 배 만큼 상이하다(비특허 문헌 2). α1→6 L-푸코스가 전달되지 않는 항체가 획득될 수 있는 경우, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체 제제가 제공될 수 있다.

통상적으로, LCA 에 더하여, 예컨대 PSA(Pisum sativum agglutinin), AAL(Aleuria aurantia lectin), NPA(Narcissus pseudonarcissus agglutinin), VFA(Vicia faba agglutinin), 및 AOL(Aspergillus oryzae lectin)과 같은 다른 코어 푸코스-결합 렉틴이 공지되어 있다(특허 공보 1 내지 5).

비특허 문헌 1 : Clynes RA et al., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. NATURE MED 2000 APR; 6(4): 443-446

비특허 문헌 2 : Toyohide Shinkawa et al., The absence of L-fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetyl glucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem. 2003 Jan 31; 278(5): 3466-73. Epub 2002 Nov 8.

특허 공보 1: WO2002/030954

특허 공보 2: WO2003/084569

특허 공보 3: Example of Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H02-083337

특허 공보 4: Example 5 of Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-112786

특허 공보 5: Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-161633

발명의 개시

L-푸코스 α1→6 당 사슬의 검출에 사용되는 공지된 렉틴은 L-푸코스 α1→6 결합 당 사슬 뿐만 아니라, α1→6 결합 외의 L-푸코스를 갖는 당지질 당 사슬 및 L-푸코스를 갖지 않는 고 만노스 당 사슬에도 친화성을 갖는다. 구체적으로, AAL 및 AOL 은 예컨대 α1→2 L-푸코스 및 α1→3 L-푸코스에도 친화성을 갖는다. 만노스-특이적 LCA, PSA, 및 VFA 는 또한 비-푸코실화 모노- 및 디-안테나성 N-글리칸에도 친화성을 갖는다. 따라서, L-푸코스 α1→6 당 사슬의 정확한 검출이 가능하지 않았으며, 또한 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 분리하는 것도 가능하지 않았다. 오직 L-푸코스 α1→6 당 사슬에만 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 렉틴도 공지된 바 없다.

상기의 관점에서, 본 발명의 목적은 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 렉틴을 제공하는 것이다. 본 발명은 신규한 렉틴을 사용하여 통상적인 경우보다 더욱 정확한 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 검출 방법, 및 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 검출에 기초한 L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 분획 방법을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 L-푸코스 α1→6 을 갖는 당 사슬에 매우 높은 친화성을 갖는 신규한 렉틴을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 신규한 렉틴이 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 렉틴이 L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비 L-푸코스 α1→6 당 사슬(L-푸코스 α1→2, 1→3, 1→4 당 사슬)의 정제에 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 상기 용어 "L-푸코스 α1→6 당 사슬"은 α1→6 결합에 의하여 L-푸코스가 N-결합 글리칸의 환원성 말단 N-아세틸글루코사민에 결합하는 구조를 의미한다. 상기 용어 "비-L-푸코스 α1→6 당 사슬"은 분자 내에 α1→6 결합 L-푸코스를 갖지 않는 당 사슬을 의미한다.

구체적으로, 본 발명은 (1) 담자균 또는 자낭균로부터 추출되며, (2) 4,000 내지 40,000 의 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량을 가지며, 그리고 (3) (25℃에서) 1.0×10⁴M^-1 이상의 결합 상수에 의하여 나타내어지는 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 친화성을 갖는, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 제공한다. 본원에서 결합 상수는 25℃의 분석 온도에서 FAC(frontal affinity chromatography)에 의하여 측정된 수치값을 의미한다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬은 사이알로 N-글리칸을 포함할 수 있다.

또한, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (4) 바람직하게는 고 만노스 당 사슬 및/또는 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하지 않는 당지질에 실질적으로 결합되어 있지 않다.

또한, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (5) (25℃ 에서) 1.0×10⁴M^-1 이상의 결합 상수를 갖는 α1→6 푸코실화된 모노-, 디-, 트리-, 및 테트라-안테나성 N-글리칸에 친화성을 갖는다.

담자균은 예컨대, Strophariacease, Tricholomataceae, Amanitaceae, 또는 Polyporaceae 에 속한다.

담자균은 예컨대, Pholiota terrestris, Pholiota squarrosa, Pholiota adiposa, Stropharia rugosoannulata, Naematoloma sublateritium, Lepista sordid, 또는 Amanita muscaria 이다.

특히, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 아미노산 서열은 (6) 서열 번호 1 에 제시되어 있다.

본 발명은 또한 (a) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시되어 있는 아미노산 서열을 구성하는 단백질 또는 펩티드 또는 (b) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시되어 있는 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산이 결손, 삽입, 또는 치환되고, 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드인, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 제공한다. "기능적으로 동등"이란 표현은 (25℃ 에서) 1.0×10⁴M^-1 이상의 결합 상수에 의하여 나타내어지는 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 친화성을 의미한다.

(b)에 제시된 단백질 또는 펩티드는 예컨대 서열 번호 6 에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 서열 번호 2 내지 6 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에 대하여 37% 이상의 상동성을 가지며, 서열 번호 2 내지 6 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드인 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 제공한다.

본 발명은 또한 담자균 및/또는 자낭균의 수성 배지 추출물(수용성 추출물)이 (i) 소수성 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피, (ii) 친화성 크로마토그래피, 또는 (iii) 이온-교환 크로마토그래피 및 겔 여과에 적용되어, 이에 따라 (vi) 4,000 내지 40,000 의 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량을 가지며, 그리고 (v) (25℃ 에서) 1.0×10⁴M^-1 이상의 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 결합 상수로 나타내어지는 친화성을 갖는 렉틴을 얻을 수 있는, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법을 제공한다.

담자균은 바람직하게는 하나 이상의 Strophariaceae, Tricholomatacease, Amanitaceae 및 Polyporaceae 로부터 선택된다.

담자균은 바람직하게는 Pholiota terrestris, Pholiota squarrosa, Pholiota adiposa, Stropharia rugosoannulata, Naematoloma sublateritium, Lepista sordida, 및 Amanita muscaria 로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법에 사용되는 담자균 및/또는 자낭균은 바람직하게는 자실체(fruiting bodies)이다.

본 발명은 또한 당 사슬이 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴에 작용하도록 하는 단계를 포함하는 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 검출방법을 제공한다.

당 사슬은 예컨대 종양 표지이다.

본 발명은 또한 당 사슬이 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴에 작용하도록 하는 단계를 포함하는 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 분획방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 고정화 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용하여 L-푸코스 α1→6 당 사슬과 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬을 분획하는 방법을 제공한다.

분획방법에 작용하는 당 사슬은 예컨대 항체에 결합된다.

본 발명은 또한 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 검출하는 진단 시약 및 진단 시약 키트를 제공한다. 상기 진단 시약은 활성 성분으로서 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 포함한다.

본 발명의 신규한 렉틴은 통상적인 방법보다 L-푸코스 α1→6 을 갖는 당 사슬, 당펩티드, 및 당단백질에 대하여 1.0×10⁴M^-1 이상의 결합 상수를 갖는 더 높은 친화성을 갖는다. 구체적으로, 오직 L-푸코스 α1→6 당 사슬 구조를 갖는 당 사슬만이 특이적으로 인식될 수 있다. 이러한 특이성을 이용하여, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 하기에 제시되는 바와 같은 다양한 분야에서 사용될 수 있다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 친화성을 갖는 통상적인 렉틴과 비교하여, 본 발명은 더욱 선택적인 특이성으로 α1→6 L-푸코스 당 사슬을 검출할 수 있다.

본 발명의 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 분획방법은 α1→6 L-푸코스의 정확한 검출에 기초하여, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 사이에 보다 엄격한 분획을 제공할 수 있다. 그 결과로, L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬은 높은 순도로 정제될 수 있다. 특히, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 혼합물로 구성된 항체 제제로부터 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 제거하기 위하여, 본 발명의 분획 방법을 사용함에 의하여, 항체 의약품은 증가된 ADCC 활성을 가질 수 있다. 그 결과로, 항체 제제는 감소된 용량으로 제형화될 수 있으며, 따라서 유리하게는 예컨대 감소된 비용 및 감소된 부작용을 나타낸다. 또한, 항체 제제는 증상 또는 부작용에 따라서 처방될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 본 발명의 실시예 및 비교예에 사용된 α1→6 L-푸코스 올리고사카라이드 및 비-α1→6 L-푸코스 올리고사카라이드의 구조도이다.

도 2 는 본 발명의 실시예 및 비교예에 사용된 L-푸코스 α1→6 올리고사카라이드 및 비-L-푸코스 α1→6 올리고사카라이드의 구조도이다.

도 3 은 실시예 1 의 PTL 의 정제 공정을 나타낸 것이다.

도 4 는 실시예 1 의 PTL 의 이온-교환 크로마토그래피의 용출도이다.

도 5 는 실시예 1 의 PTL 의 친화성 크로마토그래피의 용출도이다.

도 6 은 실시예 1 의 PTL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 7 은 실시예 2 의 SRL 의 정제 공정을 나타낸 것이다.

도 8 은 실시예 2 의 SRL 의 소수성 크로마토그래피의 용출도이다.

도 9 는 실시예 2 의 SRL 의 역상 크로마토그래피의 용출도이다.

도 10 은 실시예 2 의 SRL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 11 은 실시예 1 의 PTL 의 MS 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

도 12 는 실시예 2 의 SRL 의 MS 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

도 13 은 실시예 1 의 PTL 을 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 14 는 실시예 2 의 SRL 을 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 15 는 비교예 1 의 AAL 을 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 16 은 비교예 2 의 AOL 을 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 17 은 비교예 3 의 LCA 를 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 18 은 대조구로서 CBB 에 의하여 오직 단백질만이 염색될 때의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 19 는 실시예 1 의 PTL 을 사용한 ELISA 에 의한 당단백질 검출의 결과를 나타낸 것이다.

도 20 은 실시예 2 의 SRL 을 사용한 ELISA 에 의한 당단백질 검출의 결과를 나타낸 것이다.

도 21 은 비교예 1 의 AAL 을 사용한 ELISA 에 의한 당단백질 검출의 결과를 나타낸 것이다.

도 22 는 비교예 2 의 AOL 을 사용한 ELISA 에 의한 당단백질 검출의 결과를 나타낸 것이다.

도 23 은 비교예 3 의 LCA 를 사용한 ELISA 에 의한 당단백질 검출의 결과를 나타낸 것이다.

도 24 는 실시예 1 의 PTL 을 사용한 ELISA 에 의한 α-태아단백질 L1 및 L3 사이에서 당 사슬의 차이점의 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 25 는 실시예 2 의 SRL 을 사용한 ELISA 에 의한 α-태아단백질 L1 및 L3 사이에서 당 사슬의 차이점의 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 26 은 비교예 1 의 AAL 을 사용한 ELISA 에 의한 α-태아단백질 L1 및 L3 사이에서 당 사슬의 차이점의 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 27 은 비교예 2 의 AOL 을 사용한 ELISA 에 의한 α-태아단백질 L1 및 L3 사이에서 당 사슬의 차이점의 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 28 은 비교예 3 의 LCA 를 사용한 ELISA 에 의한 α-태아단백질 L1 및 L3 사이에서 당 사슬의 차이점의 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 29 는 실시예 3 의 NSL 의 정제 공정을 나타낸 것이다.

도 30 은 실시예 3 의 NSL 의 소수성 크로마토그래피의 용출도이다.

도 31 은 실시예 3 의 NSL 의 역상 크로마토그래피의 용출도이다.

도 32 는 실시예 3 의 NSL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 33 은 실시예 4 의 LSL 의 정제 공정을 나타낸 것이다.

도 34 는 실시예 4 의 LSL 의 소수성 크로마토그래피의 용출도이다.

도 35 는 실시예 4 의 LSL 의 역상 크로마토그래피의 용출도이다.

도 36 은 실시예 4 의 LSL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸 것(도면의 대용으로서 사진)이다.

도 37 은 실시예 3 의 NSL 의 MS 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

도 38 은 실시예 4 의 LSL 의 MS 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명을 수행하는 최적의 양식

하기 부분은 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 결합하는 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 예를 타나낸다.

[화학식 1]

[식 중, Man 은 만노스, GlcNAc 는 N-아세틸글루코사민, Fuc 는 L-푸코스를 의미한다].

상기의 것에 더하여, L-푸코스 α1→6 당 사슬은 예컨대 자유 올리고사카라이드, 글리코아미노산, 당펩티드, 당지질, 당단백질, 프로테오글리칸, 및 세포들을 포함한다. 또한, L-푸코스 α1→6 당 사슬은 예컨대 CyDye 에 의하여 형광-표지된 4-에틸 아미노벤조에이트(ABEE), 및 아미노 피리딘을 또한 포함할 수 있다. N-결합 당 사슬은 예컨대 고 만노스-타입의 것, 복합체-타입의 것, 및 혼성-타입의 것을 포함한다. 또한, N-결합 당 사슬은 예컨대 산 또는 하이드라진에 의하여 화학적으로 당 사슬을 부분적으로 분해함에 의하여 얻어지는 것 또는 당 사슬을 부분적으로 분해하기 위하여 사이알리데이즈, 갈락토시데이즈, N-아세틸헥소아미니데이즈, 푸코시데이즈, 및 만노시데이즈가 동시에 또는 단계적 방법으로 사용되는 것일 수 있다. 대안적으로, N-결합 당 사슬은 또한 글루코스와 같은 당 또는 예컨대 아세틸기, 설페이트기, 또는 포스페이트기와 같은 작용기를 당 사슬에 첨가함에 의하여 얻어질 수 있다.

(1) L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 유래되는 담자균 또는 자낭균은, 예컨대, Strophariaceae, Tricholomataceae, Polyporaceae, 및 Amanitaceae 에 속한다. Strophariaceae 는 예컨대 Pholiota terrestris, Stropharia rugosoannulata, Naematoloma sublateritium, Pholiota squarrosa, Pholiota adiposa, 및 Pholiota adiposa 를 포함한다. Tricholomataceae 는 예컨대 Lepista sordida 를 포함한다. Polyporaceae 는 예컨대 Trichaptum elongatum 및 Microporus affinis 를 포함한다. Amanitaceae 는 예컨대 Amanita muscaria 를 포함한다. 상기 담자균 또는 자낭균 중에서, 렉틴 회수 효율 및 당-결합 특이성의 관점에서, Strophariaceae, Tricholomataceae, 또는 Amanitaceae 가 특히 바람직하다.

또한 바람직한 담자균 또는 자낭균은 Pholiota terrestris, Pholiota squarrosa, Pholiota adpiposa, Stropharia rugosoannulata, Naematoloma sublateritium, Lepista sordid, 또는 Amanita muscaria 이다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (2) SDS-PAGE 상에서 4,000 내지 40,000 및 바람직하게는 4,000 내지 20,000 의 분자량을 갖는다. SDS-PAGE 에 의한 분자량은 예컨대 Laemmi 법(Nature, volume 227, page 680, 1976)에 의하여 측정된다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (3) 1.0×10⁴M^-1 이상, 바람직하게는 1.0×10⁵M^-1 이상, 및 더욱 바람직하게는 1.0×10⁶M^-1 이상의 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 결합 상수(K_a)를 가진다. 구체적으로, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 L-푸코스 α1→6 에 친화성을 갖는 것으로 통상적으로 공지된 AAL, AOL, LCA, NPA, 및 PSA 와 비교될 때, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 현저하게 높은 결합 상수를 갖는다. 이는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 통상적인 렉틴에서보다 훨씬 더 높은 선택도로써 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 결합되는 것을 의미한다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬은 그 비환원성 말단에서 사이알산을 가질 수 있다. 통상적인 코어 푸코스 특이적 렉틴(예컨대, LCA, NPA, 및 PSA)은 비환원성 말단에서 사이알산을 갖는 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대하여 낮은 친화성을 갖는다. 다른 한편으로, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 상기 기재된 당 사슬에 대하여서도 또한 높은 친화성을 갖는다는 점에서 통상적인 것보다 우수하다.

하기 부분은 FAC(frontal affinity chromatography)에 의한 결합 상수를 계산하는 방법을 기재한다. 상기 방법은 하기 원칙에 기초한다. 형광-표지된 당 사슬(예컨대, 도 1 및 2 에 제시)의 고정된 농도의 희석제가 렉틴이 고정화된 컬럼내에 흐르게될 때, 당 사슬은 렉틴과 당 사슬이 그 사이에 상호작용할 수 없는 단시간 내에 컬럼 밖으로 흘러 나온다. 따라서, 용출 전단(front)은 즉시 관찰된다. 렉틴과의 친화성이 있을 때, 당 사슬의 용출은 지연된다.

상기 기구에 사용되는 렉틴 컬럼의 제조는 하기 기재된 방법으로 수행된다. 1. 정제된 렉틴을 0.1 내지 0.2 M 의 NaHCO₃ 완충 용액(pH 8.3 내지 8.5)에 용해시킨다. 2. 상기 렉틴을 렉틴 1차 아미노기, NHS 활성화 세파로스와 같은 담체를 통하여 고정화시킨다. 3. 그 후, 상기 렉틴을 예컨대 1차 아민 또는 에탄올아민을 포함하는 트리스 완충 용액에 의하여 차단시킨다. 4. 렉틴-세파로스를 0.8% 의 NaCl(pH 7.4, TBS)를 포함하는 10 mM 트리스 완충액에서 현탁시킨다. 그 후, 렉틴 고정화 수지를 소형 컬럼(φ2mm×10mm, 31.4㎕)에 충진시킨다. 5. 렉틴 고정화 수지가 충진된 상기 소형 컬럼을 지지대에 의하여 보호하고, 렉틴 컬럼을 FAC 자동 분석 기기(FAC-1, SHIMADZU CORPORATION)에 연결시킨다.

평형화된 렉틴 컬럼에, 렉틴의 해리 상수(K_d)보다 충분히 낮은 농도(2.5nM)를 갖기 위하여, 분석 완충 용액(0.8%의 NaCl(pH 7.4, TBS)을 포함하는 10 mM 의 트리스 완충액)에 의하여 희석된 피리딜아민화 당 사슬(PA 당 사슬)을 0.125 ml/min 의 유속에서 300 ㎕ 의 양으로 쏟아부었다. 그 후, 컬럼으로부터의 PA 당 사슬의 용출을 형광 검출기(흥분 파장/형광 파장: 310nm/380nm)에 의하여 검출하였다.

검출 데이터에 기초하여, 참조로서의 렉틴과 상호작용하지 않는 당 사슬(PA 람노스)의 용출 전단(V₀)을 사용하여, 렉틴과 상호작용하는 당 사슬의 용출 전단(V)의 지연(V-V₀)을 상호작용 강도로서 계산하였다. 그 후, 하기의 FAC 기준식에 기초하여, 당 사슬 및 렉틴 사이의 결합 상수(K_a)를 V-V₀ 및 B_t 에 기초하여 계산하였다. 만약 상호작용 강도(V-V₀ 값) 및 결합 상수가 더 높은 경우, 렉틴과 L-푸코스 α1→6 당 사슬 사이에서 더 높은 친화성이 야기된다.

[식 1]

[식 중, A 는 용출에 사용된 물질, A₀ 는 물질 A 의 초기 농도, B 는 고정화 리간드, V 는 용출 부피, V₀ 는 고정화 리간드 B 와 전혀 상호작용하지 않는 물질의 용출 전단 부피, B_t 는 효과적인 리간드 양, K_d 는 해리 상수(결합 상수의 역)를 의미한다].

렉틴의 당 결합 특이성은, 적혈구의 응집을 저해할 수 있는 당 형태 및 그 농도를 조사하기 위하여, 렉틴에 의하여 특이적으로 응집될 수 있는 적혈구를 사용하여 또한 확인될 수 있다.

또한, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (4) 바람직하게는 고 만노스 당 사슬 및/또는 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하지 않는 당지질에 실질적으로 결합하지 않는다. 따라서, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 보다 높은 결합 특이성을 갖는다. 본원에서 "실질적으로 결합하지 않음"이라는 표현은 결합 상수 1.0×10³M^-1 이하, 및 바람직하게는 결합 상수 1.0×10²M^-1 이하, 특히 바람직하게는 0 의 결합 상수를 의미한다.

또한, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 (5) α1→6 푸코실화, 모노-, 디-, 트리-, 테트라-안테나성 N-글리칸에 친화성을 갖는다. 상기 친화성은 (25℃에서) 1.0×10⁴M^-1 이상 및 더욱 바람직하게는 1.0×10⁵M^-1 이상의 결합 상수에 의하여 나타내어진다.

본 발명의 렉틴에 대하여 친화성을 갖는 α1→6 푸코실화, 모노-, 디-, 트리-, 테트라-안테나성 N-글리칸의 구조의 예는 하기와 같다.

[화학식 2]

본 발명의 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 특히 서열 번호 1 에 제시된 바와 같은 공통적인 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 1 의 4번째, 5번째, 6번째, 및 7번째 Xaas 는 Asp/Asn/Glu/Thr, Thr/Ser/Ala, Tyr/Phe, 및 Gln/Lys/Glu 를 의미하며, 각각 이 중에서 대각선은 "또는"을 의미한다.

본 발명의 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 구체적 예는 서열 번호 1 내지 6 에 제시된 단백질 또는 펩티드이다.

서열 번호 2 에 제시된 렉틴은 Pholiota terrestris (이하 PTL 로 칭해짐)으로부터 추출될 수 있는 신규한 렉틴이다. 서열 번호 2 의 10번째 및 17번째 Xaas 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있으나 바람직하게는 Cys 이다. 20번째, 23번째, 27번째, 33번째, 35번째, 및 39번째 Xaas 는 각각 Tyr/Ser, Phe/Tyr, Arg/Lys/Asn, Asp/Gly/Ser, Asn/Ala, 및 Thr/Gln 이다.

서열 번호 3 에 제시된 렉틴은 Stropharia rugosoannulata (이하 SRL 로 칭해짐)으로부터 추출될 수 있는 신규한 렉틴이다. 서열 번호 3 의 10번째 및 17번째 Xaas 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있으나 바람직하게는 Cys 이다. 4번째, 7번째, 9번째, 13번째, 20번째, 27번째, 29번째, 33번째, 34번째, 및 39번째 Xaas 는 각각 Pro/Gly, Glu,/Lys, Val/Asp, Asn/Asp/Glu, His/Ser, Lys/His, Val/Ile, Gly/Asn/Ser, Ala/Thr, 및 Arg/Thr 이다.

서열 번호 4 에 제시된 렉틴은 Lepista sordida (이하 LSL 로 칭해짐)으로부터 추출될 수 있는 신규한 렉틴이다. 서열 번호 4 의 10번째 및 17번째 Xaas 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있으나 바람직하게는 Cys 이다. 1번째, 4번째, 7번째, 8번째, 9번째, 13번째, 16번째, 20번째, 22번째, 25번째, 27번째, 31번째, 및 34번째 Xaas 는 각각 Ala/Gln, Pro/Lys, Ala/Ser, Met/Ile/Val, Tyr/Thr, Asp/Asn, Lys/Glu, Ala/Asn, Val/Asp/Asn, Asp/Asn, Arg/His/Asn, Gin/Arg, 및 Thr/Val 이다.

서열 번호 5 에 제시된 렉틴은 Naematoloma sublateritium (이하 NSL 로 칭해짐)으로부터 추출될 수 있는 신규한 렉틴이다. 서열 번호 5 의 10번째 및 17번째 Xaas 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있으나 바람직하게는 Cys 이다. 13번째, 14번째, 및 16번째 Xaas 는 각각 Asp/Thr, Ser/Ala, 및 Gln/Lys 이다.

서열 번호 6 에 제시된 렉틴은 Naematoloma sublateritium (이하 NSL 로 칭해짐)으로부터 추출될 수 있는 신규한 렉틴이다. 서열 번호 6 은 서열 번호 5 의 펩티드에 하나의 Asn 이 삽입된 변이이다. 서열 번호 6 의 10번째 및 18번째 Xaas 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있으나 바람직하게는 Cys 이다. 14번째, 15번째, 및 17번째 Xaas 는 각각 Asp/Thr, Ser/Ala, 및 Gln/Lys 이다.

서열 번호 2 내지 6 에 제시된 단백질 또는 펩티드가 신규하기 때문에, 본 발명은 (a) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 펩티드 또는 (b) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산이 결손, 삽입 또는 치환되고, 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드인, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 제공한다. 여기서 용어 "기능적으로 동등"이란 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대하여 1.0×10⁴M^-1 이상, 바람직하게는 1.0×10⁵M^-1 이상, 및 더욱 바람직하게는 1.0×10⁶M^-1 이상의 결합 상수를 갖는 친화성을 의미한다. (b)에 나타내어진 변이의 예는 서열 번호 6 에 제시된 단백질 또는 펩티드이다.

본 발명은 또한 (a) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 펩티드 또는 (b) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산이 결손, 삽입 또는 치환되고, 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 제공한다. "기능적으로 동등"이라는 표현은 상기의 것과 동일한 의미를 갖는다.

서열번호 2 내지 6 에 제시된 단백질 또는 펩티드 사이의 상동성은 37% 이상이다(표 14 참조). 따라서, 본 발명은 또한 서열번호 2 내지 6 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에 대하여 37% 이상의 상동성을 갖고, 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드인, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 제공한다. "기능적으로 동등"이라는 표현은 상기의 것과 동일한 의미를 갖는다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 예컨대 공지된 추출 방법, 분리 방법 및 정제 방법의 적절한 조합에 의하여 담자균 및/또는 자낭균으로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 담자균 및/또는 자낭균의 수용성 추출물을 얻기 위하여 수성 용매가 공정에 사용될 수 있다. 이러한 추출물로부터, (iv) SDS-PAGE 에 의한 분자량이 4,000 내지 40,000 및 바람직하게는 4,000 내지 20,000 이고, (v) L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 결합 상수에 의하여 나타내어지는 친화도가 (25℃에서) 1.0×10⁴M^-1 이상, 바람직하게는 1.0×10⁵M^-1 이상, 및 더욱 바람직하게는 1.0×10⁶M^-1 이상인 렉틴이 얻어진다.

담자균은 바람직하게는 하나 이상의 Strophariaceae, Tricholomataceae, Polyporaceae, 및 Amanitaceae 로부터 선택된다. 특히 Pholiota terrestis (Pholiota terrestris Overholts), Pholiota squarrosa (Pholiota squarrosa (Fr.) Kummer), Pholiota adiposa (Pholiota adiposa (Fr.) Kummer), Stropharia rugosoannulata (Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.), Naematoloma sublateritium (Naematoloma sublateritium (Fr.) Karst or Hypholoma sublateritium (Fr.) Quel)와 같은 Strophariaceae, Lepista sordida (Lepista sordida (Schum.:Fr.) Sing.)와 같은 Tricholomataceae, Trichaptum elongatum (Trichaptum elongatum), Microporus affinis (Microporus vernicipes)와 같은 Polyporaceae, Amanita muscaria (Amanita muscaria)와 같은 Amanitaceae 이다. 이러한 담자균 및/또는 자낭균으로부터, 자실체가 바람직하게 사용된다.

예를 들어 담자균 추출물을 얻기 위한 방법은 그 방법이 수성 용매가 예컨대 담자균의 자실체와 접촉을 갖게하는 한 특별히 제한되지 않는다. 추출 효율의 관점에서, 예컨대 담자균의 자실체가 수성 배지에서 미분쇄되어 현탁액을 얻게되는 것과 같은 방법이 바람직하다. 미분쇄화 방법은 예컨대 혼합기 또는 균질화기를 사용한 일반적인 미분쇄화 방법일 수 있다.

수성 용매는 완충 용액 또는 물 또는 완충 용액 및 예컨대 물에 혼합될 수 있는 유기용매의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 완충 용액 또는 유기 용매 및 완충 용액의 혼합물이다.

완충 용액은 특별히 제한되지 않고 공지된 완충 용액일 수 있으며, 이 중 pH 3 내지 10 의 범위의 완충 능력을 갖는 완충 용액이 바람직하고, pH 6 내지 8 의 범위의 완충 능력을 갖는 완충 용액이 더욱 바람직하다. 구체적으로, 예컨대 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 아세트산 완충액, 및 트리스 완충액이 사용될 수 있으며, 이 중 인산염 완충액이 추출 효율의 관점에서 바람직하다.

완충 용액은 특정한 제한된 염 농도를 갖지 않을 수 있다. 염 농도는 추출 효율 및 완충 능력의 관점에서 바람직하게는 1 내지 100 mM 및 더욱 바람직하게는 5 내지 20 mM 이다.

완충 용액은 추가적으로 염을 포함할 수 있다. 예를 들면, 식이성 염의 예컨대 인산염 완충액에 대한 추가적인 첨가에 의하여 얻어진 인산 완충 생리 식염수는 본 발명에서의 수성 용매로서 바람직하다.

유기 용매는 어떠한 제한 없이 물과 혼합될 수 있는 임의의 유기 용매일 수 있으며, 그 중 아세톤, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 및 아세토니트릴이 바람직하다. 유기 용매는 바람직하게는 10 내지 40 질량% 의 함량으로 물 또는 완충 용액과 혼합될 수 있다.

추출 공정은 바람직하게는 예컨대 수성 용매 및 담자균의 자실체로부터, 수성 용매에 불용성인 물질을 제거하는 공정을 추가적으로 포함한다. 상기 불용성 물질의 제거 방법은 예컨대 여과 또는 원심분리일 수 있으나, 제거 효율의 관점에서 바람직하게는 원심분리이다.

추출 단계는 특히 바람직하게는 원심분리에 의하여 불용성 물질을 제거하기 위하여, 인산염-완충 식염수에서 예컨대 담자균의 자실체를 미분쇄하는 공정을 포함하며, 이에 따라 수성 용매 추출물을 얻게된다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조 방법은 하기의 정제 수단 중 임의의 것을 사용할 때 추가적으로 효율적인 정제를 제공한다.

(정제 방법 1)

상기 공정에 의하여 얻어진 수 용매 추출물을 황산암모늄 침전법으로 하여 이에 따라 렉틴 함유 분획을 얻는다. 그 후, 발생한 렉틴 분획은 소수성 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피에 의하여 정제된다.

(정제 방법 2)

상기 공정에 의하여 얻어진 수 용매 추출물을 티로글로불린이 아가로스에 고정화된 담체를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 거치게 한다.

(정제 방법 3)

상기 공정에 의하여 얻어진 수 용매 추출물을 황산암모늄 침전법으로 하여 이에 따라 렉틴 함유 분획을 얻고, 상기 렉틴 함유 분획을 증류 및 동결건조에 대하여 투석시킨다. 이 후, 미정제 렉틴 분획을 트리스 완충 용액에서 용해시키고 연속하여 이온교환 크로마토그래피를 거치게 한다. 그 후, 발생한 활성 분획을 농축하고 연속적으로 겔 여과에 의하여 분리시킨다.

본 발명의 제조방법은 정제를 통하여 얻어진 렉틴을 포함하는 분획을 투석 공정을 거치게 하는 단계, 및 투석 공정을 통하여 얻어진 렉틴 용액을 동결건조를 거치게 하는 단계를 포함할 수 있다. 그 결과, 렉틴은 용이하게 분리될 수 있다. 투석 공정 단계 및 동결건조 단계는 일반적으로 사용되는 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다.

(a) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 펩티드 또는 (b) 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산이 결손, 삽입 또는 치환되고, 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드와 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드인 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 천연 식물로부터의 추출에 의해서 뿐만 아니라, 천연 유래의 것과는 상이한 숙주의 인공 발현 또는 화학적 합성에 의해서도 얻을 수 있다. 상기 기재된 물질은 또한 본 발명의 기술적 범위 내에 있다. 숙주에서의 발현 및 화학 합성은 일반적으로 사용되는 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용하여 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 검출하는 방법을 제공한다. L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 통상적인 경우에서보다 더욱 특이적으로 인식할 수 있으며, 이에 결합될 수 있다. 따라서, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 예컨대 폴리사카라이드, 당지질, 또는 당단백질과 같은 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하는 당 사슬 화합물을 특이적으로 검출하는데 바람직하게 사용된다.

상기 검출 방법에 사용되는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 바람직하게는 표지된 렉틴을 사용한다. 본 발명의 표지 렉틴은 적어도 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴 및 표지 수단을 포함하며, 표지되어 표지 렉틴이 검출될 수 있다.

표지 수단은 특별히 제한되지 않으며 예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 예켠대 표지 화합물의 결합을 포함하는 공지된 표지 방법일 수 있다.

표지 화합물은 특별히 제한되지 않으며 이러한 용도에 일반적으로 사용되는 것일 수 있으며, 예컨대, 직접 또는 간접 표지 화합물, 효소, 또는 예컨대 형광 화합물을 포함한다. 표지 화합물의 구체적 예는 예컨대 바이오틴, 디곡시제닌, 홀스라디시 퍼록시데이즈, 플루오로세인 이소티오시아네이트, 또는 CyDye 를 포함한다. 이러한 표지 화합물은 통상적인 방법에 의하여 렉틴에 결합될 수 있다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 바람직하게는 담자균-유래 렉틴, 특히 바람직하게는 PTL, SRL, NSL, LSL, 및 AML, 그리고 더욱 바람직하게는 PTL 및 SRL 이다. 실시예에 제시된 바와 같이, PTL 및 SRL 은 L-푸코스 α1→6 외의 L-푸코스 및 L-푸코스를 가지지 않는 고 만노스 당 사슬에 결합하지 않는다는 점에서, PTL 및 SRL 은 통상적인 L-푸코스 특이적 렉틴과 상이하다. 따라서, PTL 및 SRL 은 본 발명의 검출 방법에 사용되는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴으로서 최적이다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬의 검출은 예컨대 고정화 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용한 렉틴 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다. 렉틴 크로마토그래피는 당 사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴의 성질을 사용한 친화성 크로마토그래피이다. 렉틴 크로마토그래피가 HPLC(HPLAC)와 조합될 때, 높은 완료 분석이 기대될 수 있다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 고정화되는 담체는 일반적으로 예컨대 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 스타치, 또는 폴리아크릴아미드와 같은 겔 물질을 포함한다. 이러한 겔 물질은 특별한 제한 없이 상업적으로 시판중인 것일 수 있으며, 예컨대 세파로스 4B 및 세파로스 6B (GE Healthcare Bioscience)를 포함한다.

렉틴 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 렉틴이 마이크로플레이트 또는 나노월에 고정화되는 것을 포함한다.

고정화 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 일반적으로 0.001 내지 100 mg/ml 및 바람직하게는 0.01 내지 20 mg/ml 의 범위의 농도를 갖는다. 담체가 아가로스 겔일 때, 상기 담체는 예컨대 CNBr 에 의하여 활성화되며 후속적으로 렉틴과 커플된다. 렉틴은 또한 활성화 스페이서를 사용하여 겔로 고정화될 수 있다. 대안적으로, 렉틴은 또한 포르밀기를 사용하여 겔로 고정화되어 NaCNBH₃에 의하여 후속적으로 환원된다. 대안적으로, NHS-세파로스 (GE Healthcare Bioscience)와 같은 상업적으로 시판중인 활성화 겔이 또한 사용될 수 있다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬 샘플이 컬럼에 적용되고, 그 후 세정 및 평형화의 의도로서 완충 용액이 그 안에 흐르게 된다. 완충 용액의 하나의 예는 5 내지 500 mM 및 바람직하게는 10 내지 500 mM 의 몰 농도를 가지며, 4.0 내지 10.0 및 바람직하게는 6.0 내지 9.0 의 pH 를 가지고, 0 내지 0.5 M 및 바람직하게는 0.1 내지 0.2 M 의 NaCl 농도를 가지며, 0 내지 10 mM 및 바람직하게는 0 내지 5 mM 의 CaCl₂, MgCl₂, 또는 MnCl₂ 함량을 갖는다.

비결합 물질이 완충액으로 세척되고 난 후, L-푸코스 α1→6 당 사슬은 당 사슬이 예컨대 염화나트륨 또는 합텐 당과 같은 탈착제에 의하여 그 안에서 효과적으로 용출될 수 있도록 하는 천연 비변성 완충 용액으로 용출된다. 이러한 완충 용액은 또한 상기의 완충 용액과 동일한 것일 수 있다. 탈착제는 바람직하게는 1 내지 500 mM 및 특히 바람직하게는 10 내지 200 mM 의 농도를 갖는다.

상기 방법에 더하여, 당 사슬은 또한 예컨대 크로마토그래피, 렉틴 칩, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 응집, Biacore^® 시스템과 같은 표면 플라스몬 공명법, 또는 예컨대 당업자에게 공지된 방법에 의한 전기영동에 의하여 검출될 수 있다.

당 사슬을 포함하는 표본은 특별히 제한되지 않는다. 당 사슬을 포함하는 표본은 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 눈물, 침, 체액, 유액, 소변, 세포 배양 상층액, 및 유전자이전 동물로부터의 분비물을 포함할 수 있다.

본 검출 방법의 대상으로서의 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 구체적 예는 α1→6 푸코실트랜스퍼레이즈(FUT8)에 의하여 합성된 당 사슬이다. L-푸코스 α1→6 당 사슬은 예컨대 α-태아단백질, α5β1-인테그린, TGFβ 수용체, 또는 EGF 수용체일 수 있다. 검출 방법에 작용하는 당 사슬은 바람직하게는 종양 표지이다.

α1→6 푸코실화 α-태아단백질의 정확한 검출은 예컨대 임상적으로 경화와의 복합증을 나타내는 간암의 조기 진단, 간암의 미세한 추적, 치료 효과의 정확한 측정, 배아 종양의 조기 검출, 전격성 간염에서 간 재생의 지표로 유용하다. L-푸코스 α1→6 이 전이되는 α5β1-인테그린은 또한 간암의 진단에 있어서 지표로서 기대된다.

본 발명의 검출 방법의 대상은 간암에 더하여, 종양(예컨대, 전립선암, 유방암, 위암, 소장암, 대장암, 결장직장암, 신세포암, 이자암, 소세포 폐암, 비-소세포 암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 연조직 육종, 골암, 흑색종, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 급성 림프종, 악성 림프종, 호지킨 병, 비-호지킨 병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 알러지 병, 자가면역 장애, 및 폐기종과 같은 심혈관계 질병의 진단을 포함한다.

L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 예컨대 당 사슬에 대한 당 결합 특이성과 같은 생리화학적 특성 및 생화학적 특성에서 통상적으로 공지된 렉틴과는 상이한 신규한 렉틴이다. 특히, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 L-푸코스 α1→6 결합을 특이적으로 인식하기 때문에, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 예컨대 진단 시약, 시험 시약, 탄수화물 분리 분석을 위한 특이적 흡착 시약, 및 면역 조절제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성 성분으로서 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 포함하며, L-푸코스 α1→6 트랜스퍼레이즈에 의하여 합성된 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 검출하는데 사용되는 진단 시약, 및 상기 진단 시약을 포함하는 진단 시약 키트를 제공한다. 상기 진단 시약 또는 진단 시약 키트는 예컨대 간암을 진단하는데 사용된다.

본 발명은 또한 결합 매체로서 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용하는 단계를 포함하는 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 분획 방법을 제공하여, L-푸코스 α1→6 당 사슬이 L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬을 분획한다.

L-푸코스 α1→6 당 사슬을 분획하는 방법에 사용되는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 바람직하게는 담자균 렉틴, 특히 바람직하게는 PTL, SRL, NSL, LSL, 및 AML 및 더욱 바람직하게는 PTL 및 SRL 이다.

본 발명의 분획 방법은, 예컨대, 고정화 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용하는 렉틴 크로마토그래피이다. 이의 상세한 내용은 검출 방법과 관련하여 상기 기재된 것과 동일하다. L-푸코스 α1→6 당 사슬이 정제될 때, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 그 후 당 사슬 샘플이 적용되는 관능기를 통하여 아가로스 또는 셀룰로스로 구성된 컬럼 담체에 결합된다. 샘플이 컬럼을 통과한 후에, 흡착된 L-푸코스 α1→6 당 사슬이 수거된다. 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬이 정제될 때, 당 사슬 샘플이 컬럼에 보내지는 동안 흡착되지 않는 이러한 당 사슬 샘플이 수거된다.

본 발명의 분획에 의하여 정제된 대상은 L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 두가지 형태이다. 이의 구체적 예는 항체에 결합된 당 사슬이며, 바람직하게는 인간 IgG 의 당 사슬이다.

분획 방법에 의하여 분획된 당 사슬의 순도(즉, L-푸코스 α1→6 당 사슬의 경우에서, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 총양에 대한 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 비율, 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 경우에서, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 총양에 대한 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 비율)는 일반적으로 90 내지 100%, 바람직하게는 95 내지 100%, 및 특히 바람직하게는 99 내지 100%이다.

본 발명은 또한 90 내지 100%, 바람직하게는 95 내지 100%, 및 특히 바람직하게는 99 내지 100% 의 순도를 갖는 L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬을 활성 성분으로서 포함하는 항체 제제를 제공한다. 특히, α1→6 L-푸코스가 전달되는 항체가 제거되는 항체로 구성되는 항체 제제는 개선된 ADCC 활성을 제공하는 것으로 기대된다. 이의 후보물질은 예컨대 하기를 포함한다: Rituxan (키메라 항체, NH 림프종), Herceptin (인간화 항체, 유방암), Erbitux (키메라 항체, 대장암, 경두부암), Zevalin(마우스 항체, NH 림프종), Campath(인간화 항체, B 세포 만성 림프구성 백혈병), Bexxar (마우스 항체, NH 림프종), 및 Avastin(인간화 항체, 전이성 대장암).

본 발명의 분획 방법에 의하여 얻어진 항체 의약품이 통상적인 것보다 더 높은 특이적 활성을 갖기 때문에 저용량 요법 및 저투여량으로 사용될 수 있다는 점을 제외하고는, 본 발명의 분획 방법에 의하여 얻어진 항체 의약품은 통상적인 방법과 동일한 방법(예컨대, 약리학적으로 승인된 담체, 보조제 또는 첨가제, 투여 경로 또는 투여 형태)으로 사용될 수 있다.

본 발명은 분획 방법에 의하여 분획된 90 내지 100%의 순도를 갖는 L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 뿐만 아니라, 90 내지 100%의 순도를 갖는 L-푸코스 α1→6 당 사슬 또는 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬을 활성 성분으로서 포함하는 의약을 제공한다. 상기 순도는 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 경우에서는, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 총양에 대한 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 비율, 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 경우에서는, L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 총양에 대한 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬의 비율을 의미한다. 상기 의약품은 바람직하게는 항체 제제이다.

본 발명은 또한 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴에 작용하는 당 사슬을 포함하는 유체를 야기시키고, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴에 의하여 흡착된 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 수거하는 단계를 포함한다. 이러한 스크리닝 방법은 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 갖는 신규한 종양 표지를 탐색하는데 유용하다. 본 발명의 검출 방법에 사용될 수 있는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용하여 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하는 질병 표지를 용이하게 스크리닝하는 것이 또한 가능하다.

상기 스크리닝 방법에 사용되는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 바람직하게는 담자균-유래 렉틴이며, 특히 바람직하게는 하나 이상의 Strophariaceae, Tricholomataceae, Polyporaceae, 및 Amanitaceae 로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 PTL, SRL, NSL, LSL, 및/또는 AML 이며, 이 중 PTL 및 SRL 이 가장 바람직하다.

본 발명은 또한 L-푸코스 α1→6 당 사슬 특이적 렉틴을 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들면 고정화 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 사용한다. 다수의 당 사슬을 포함하는 유체는 고정화 렉틴에 작용하는 것이 가능하다. 그 후, 고정화 렉틴으로 흡착된 당 사슬의 시험 프로파일(예컨대, 겔 전기영동)은 유체가 고정화 PTL 또는 SRL 에 작용할 때 렉틴에 의하여 흡착된 당 사슬의 대조 프로파일과 비교된다. 따라서, 대조구와 동일한 프로파일을 갖는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이 추출된다. 각각의 표본 렉틴에 흡착되는 당 사슬을 검출하는 것이 요구되지 않기 때문에, 표적 렉틴은 매우 간단한 작업에 의하여 스크리닝될 수 있다. 따라서 추출된 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴은 차후의 스크리닝 방법에 있어서 대조구로서 사용될 수 있다. 프라이머로서 서열 번호 1 에 제시된 아미노산 서열을 부분적으로 또는 전체적으로 암호화하는 cDNA 를 사용하여 표본 렉틴으로부터 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 선택하는 또다른 방법이 또한 가능하다.

당 사슬은 도 1 및 도 2 에 제시된 바와 같이 하나 이상의 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하며, 바람직하게는 α1→6 결합 외에 L-푸코스가 전달되는 하나 이상의 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 L-푸코스를 갖지 않는 하나 이상의 당 사슬(예컨대, 고 만노스 당 사슬)을 포함한다. 이의 첨가에 의하여, L-푸코스 α1→6 당 사슬 외의 당 사슬에서 어떠한 친화성도 발견되지 않음이 확인될 수 있다.

흡착된 당 사슬의 프로파일은 당업자에게 공지된 다양한 크로마토그래피, 질량 분석, 겔 전기영동, 렉틴 칩, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 예컨대 Biacore^®와 같은 표면 플라스몬 공명, 또는 예컨대 전기영동에 의하여 측정될 수 있다.

하기 부분은 실시예 및 비교예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 예에 제한되지 않는다.

[실시예 1 및 2] (PTL 및 SRL 의 제조, 특성 측정, 및 특징 분석)

(1) PTL 의 제조 (실시예 1)

도 3 에 제시된 정제 공정에 기초하여, Pholiota terrestris 렉틴(PTL)을 버섯 Pholiota terrestris 로부터 정제하였다.

(추 출)

모든 공정은 4℃에서 수행하였다. 50 ml 의 10 mM 의 트리스 완충액(pH 7.2)으로 4℃에서 2 시간 동안 Pholiota terrestris 동결 건조 분말을 추출하였다. 얻은 액체를 원심분리(15,000 rpm, 20 min, 4℃)하였다. 그 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 1 추출물을 얻었다. 상기 추출 잔류물을 50 ml 의 10 mM 의 트리스 완충액(pH 7.2)으로 4℃에서 밤새 재추출하였다. 상기 액체를 원심분리(15,000 rpm, 20 min, 4℃)한 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 2 추출물을 얻었다. 그 후, 이들 추출물을 여과 종이에 의하여 집합적으로 여과하여 이로써 Pholiota terrestris 추출물을 얻었다.

(이온-교환 크로마토그래피)

상기 추출물(87ml)을 10 mM 의 트리스 완충액(pH 7.2)으로 평형화된 DEAE-세파로스(GE Healthcare Bioscience)의 컬럼에 적용하였다. 상기 컬럼을 완충액으로 세척한 후, 결합된 분획을 완충액에서 0.1 M NaCl 로 제거하였다. 그 후, 적혈구응집 활성을 나타내는 분획(도 4 의 ←→으로 나타냄)을 증류수 및 동결건조에 대하여 광범위하게 투석시켰다.

(친화성 크로마토그래피)

동결건조된 투석물을 10 mM 인산염 완충 식염수(pH 7.4, 이하 간략히 PBS 로 칭함)로 재용해시켰다. 그 후, 추출 용액을 동일한 완충액으로 평형화된 티로글로불린 고정화-아가로스의 컬럼에 적용하였다. 상기 컬럼을 PBS 로 세척한 후, 결합된 분획을 0.2 M 암모니아로 제거하였다. 그 후, 적혈구응집 활성을 나타내는 분획(도 5 의 ←→으로 나타냄)을 수거, 초여과, 및 동결건조하고 이로써 1.07 mg 의 PTL 을 얻었다.

(SDS-PAGE)

SDS-PAGE 를 Phastsystem(GE Healthcare Bioscience)의 전기영동 기구 및 Gradient8-25(GE Healthcare Bioscience)의 겔에 의하여 수행하였다. 샘플 용액 및 분자량 표지를 모두 1 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 제품 프로토콜 및 통상적인 방법에 기초하여 전기영동을 수행하였다. 도 6 은 PTL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸다. 도 6 에서, 레인 M, 레인 1 및 2 는 하기에 상응한다. 레인 M: 분자량 표지(APRO), 레인 1: PTL, 2-메르캅토에탄올(-), 레인 2: PTL, 2-메르캅토에탄올(+), 겔: Gradient8-25, 샘플: 1 ㎕/레인, 염료: CBB(Coomassie Brilliant Blue)

8-25% 겔을 갖는 SDS-PAGE 상에서, 주요 성분은 PTL 인 것으로 확인되었다.

(2) SRL 의 제조(실시예 2)

도 7 에 제시된 정제 공정에 기초하여, 버섯 Stropharia rugosoannulata 로부터 Stropharia rugosoannulata 렉틴(SRL)을 정제하였다.

(추 출)

모든 공정은 4℃에서 수행하였다. 1.6 L 의 PBS 로 4℃에서 2 시간 동안 Stropharia rugosoannulata 동결 건조 분말(400g)을 추출하였다. 얻은 액체를 원심분리(15,000 rpm, 20 min, 4℃)하였다. 그 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 1 추출물을 얻었다. 상기 추출 잔류물을 0.8 L 의 PBS 로 4℃에서 밤새 재추출하였다. 상기 액체를 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)하였다. 그 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 2 추출물을 얻었다. 이들 추출물을 혼합하고 이에 따라 Stropharia rugosoannulata 추출액을 얻었다.

(황산암모늄 침전)

상기 얻은 상층액(2.4L)에 고체 (NH₄)₂SO₄(1.3kg)를 첨가하여 80%의 포화도를 얻었다. 4℃에서 밤새 방치한 후, 침전물을 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)에 의하여 수거하고 증류수 및 동결건조에 대하여 광범위하게 투석시켜, 이로써 Stropharia rugosoannulata-80% 황산암모늄 침전 분획을 수거하였다.

(소수성 크로마토그래피)

상기 Stropharia rugosoannulata-80% 황산암모늄 침전 분획을 2 M 의 황산암모늄-PBS 로 평형화된 부틸-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)에 적용하여 소수성 크로마토그래피 정제를 수행하였다. 상기 크로마토그래피에서, 증류수 용출 분획을 수거, 초여과, 및 동결건조하고, 이로써 Stropharia rugosoannulata 렉틴 미정제 분획을 얻었다(도 8 의 ←→으로 나타냄).

(역상 크로마토그래피)

상기 Stropharia rugosoannulata 렉틴 미정제 분획을 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)/아세토니트릴(100/0)으로 평형화된 C8 컬럼(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 적용하였다. 상기 크로마토그래피에서, 0.05% TFA/아세토니트릴(70/30) 용출 분획(도 9 의 ←→으로 나타냄)을 수거하였다. 그 후, 용매를 실온에서 증발에 의하여 제거하고 얻은 건조 분말을 수거하여, 이로써 7.5 mg 의 SRL 을 얻었다.

SDS-PAGE(PhastGel, Gradient8-25)를 Phastsystem (GE Healthcare Bioscience)에서 행하였다. 샘플 용액 및 분자량 표지를 모두 1 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 그 후, 제품 프로토콜 및 통상적인 방법에 기초하여 전기영동을 수행하였다. 도 10 은 SRL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타낸다. 도 10 에서, 레인 M, 레인 1 및 2 는 하기에 상응한다. 레인 M: 분자량 표지(APRO), 레인 1: SRL, 2-메르캅토에탄올(+), 레인 2: SRL, 2-메르캅토에탄올(-), 겔: Gradient8-25, 샘플: 1 ㎕/레인, 염료: 은

8 내지 25% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 상에서, 주요 성분은 SRL 인 것으로 확인되었다.

(3) PTL 및 SRL 의 특성

(MALDI-TOF 질량 분광 분석)

각각 10 ㎍ 의 양으로 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 을 TA(0.1%-TFA 및 아세토니트릴 사이의 부피비가 2:1인 혼합물)에서 분리하여 용해시켰다. 그 후, TA 에 용해된 포화 매트릭스 및 렉틴 TA 용액을 4:1 의 부피비로 혼합하고 얻은 혼합물을 1.0 ㎕ 의 양으로 표적 플레이트에 적가하고, 이로써 샘플을 제조하였다. Autoflex(Bruker Daltonics K.K.)의 질량 분광 분석 기구를 사용하여 LP 모드에서 PTL 및 SRL 의 분자량을 측정하였다. 그 결과는 분자량이 약 4,500 임을 나타냈다(도 11 및 도 12).

(아미노산 서열 분석)

실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 에 대하여, 단백질 펩티드 서열분석기 PPSQ-21 시스템(SHIMADZU CORPORATION)에 의하여 그 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과는 서열 번호 2 및 3 에 각각 제시되었다. 임의의 서열이 신규하였다.

PTL 및 SRL 을 토끼, 말, 돼지, 양, 인간(A, B, O), 및 악티네이즈 E-처리 토끼 적혈구에 대하여 적혈구응집 활성 시험을 하였다. 그 결과는 표 1 의 적혈구응집 활성으로 제시된다.

[표 1]

아미노산 구조 분석 및 적혈구응집 활성 시험의 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 신규한 렉틴이다.

(4) PTL 및 SRL 의 당 결합 특이성의 평가

표 2 에 제시된 다양한 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 및 폴리사카라이드 및 표 3 에 제시된 당단백질에 대해 적혈구응집 저해 시험을 하여 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 을 당 결합 특이성에 대하여 평가하였다.

96 웰 U-하부 마이트로타이터 플레이트 상에서, 이중 희석 시리즈의 10 ㎕ 의 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 및 당단백질 용액을 제조하였다. 그 후, 역가 4 를 갖도록 미리 조절된 렉틴 용액을 10 ㎕ 의 양으로 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 감각화를 위하여 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 그대로 방치하였다. 그 후, 10 ㎕ 의 4%-적혈구 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 추가적으로 실온에서 한 시간 동안 그대로 방치하였다. 이 후에, 적혈구응집이 완전히 저해되는 샘플 용액의 희석 인자를 시각적으로 판정하였다. 저해를 나타내는 가장 낮은 농도를 최소 저해 농도로 추정하였다. 최소 저해 농도가 낮을 수록, 렉틴에 대한 특이성은 더 높았다. 그 결과를 표 2 및 표 3 에 제시하였다.

비교를 위하여, 당 결합 특이성을 하기의 상업적으로 시판중인 렉틴을 사용하여 평가하였다: 비교예 1: AAL(SEKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION -J-OIL MILLS, Inc.), 비교예 2: AOL(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. - Gekkeikan Sake Company, Ltd.), 비교예 3: LCA(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION -J-OIL MILLS, Inc.), 및 비교예 4: PSA(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION -J-OIL MILLS, Inc.). 그 결과를 표 2 및 표 3 에 제시하였다.

[표 2]

[표 3]

표 2 및 표 3 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 오직 L-푸코스 α1→6 을 갖는 티로글로불린에만 결합하였다. 다른 한편, 비교예 1 의 AAL 은 티로글로불린 뿐만 아니라 L-푸코스, 및 프룩토스와 같은 당에도 결합하였고, O-결합 당 사슬에서 L-푸코스를 갖는 뮤신과 같은 당단백질에도 결합하였다. 비교예 2 의 AOL 은 L-푸코스, 및 프룩토스와 같은 당에 결합하였고, O-결합 당 사슬에 L-푸코스를 갖는 뮤신과 같은 당단백질에 결합하였다. 비교예 3 의 LCA 및 비교예 4 의 PSA 는 티로글로불린 뿐만 아니라 만노스 및 메틸 α-만노시도와 같은 당에도 결합하였다. 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 L-푸코스 및 만노스에 결합하지 않고 오직 L-푸코스 α1→6 연결에만 결합하는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴이라는 것이 언급될 수 있다.

(5) L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 PTL 및 SRL 의 결합 상수의 측정

L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 의 결합 상수를 하기 과정에 의하여 측정하였다.

(올리고사카라이드의 제조)

도 1 및 도 2 에 제시된 바와 같은 피리딜아민화(PA) 당 사슬을 FAC(frontal affinity chromatography) 분석에 사용하였다. PA 당을 TAKARA BIO INC., SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION, 및 Masuda Chemical Industries co., LTD. 로부터 구입하였다. PA 당을 또한 GlycoTAG^®(TAKARA BIO INC.)에 의하여 비표지화된 당 사슬 또는 예컨대 당 사슬을 효소 소화시킴으로써 얻어진 당 사슬을 피리미딜화하여 얻었다.

(렉틴 컬럼의 제조)

렉틴을 0.5 M NaCl 을 포함하는 0.2 M NaHCO₃ 완충 용액(pH 8.3)에서 용해시키고, 하기 제조자 지침에 따라 NHS-활성화 세파로스(GE Healthcare Bioscience)에 커플시켰다. 그 후, 렉틴 고정화 세파로스를 0.8%-NaCl 을 포함하는 10 mM 트리스 완충액 (pH 7.4, TBS)에서 현탁시키고, 얻은 물질을 소형 컬럼(φ2mm×10mm, 31.4㎕)에 충진시켰다.

(전단 친화성 크로마토그래피)

전단 친화성 크로마토그래피를 FAC 자동 분석 기구(FAC-1, SHIMADZU CORPORATION)을 사용하여 수행하였다. 특히, 상기 제조된 렉틴 컬럼을 스테인리스강 지지대에 삽입하고 지지대를 FAC-1 기구에 연결시켰다. 유속 및 컬럼 온도를 각각 0.125 ml/min, 25℃ 로 유지하였다. 소형 컬럼을 TBS 에 의하여 평형화시킨 후, 자동 샘플 기구를 사용하여 과량의 부피(0.5 ml 내지 4 ml)의 PA 당 사슬 (3.75 nM 또는 7.5 nM)을 연속적으로 컬럼에 주입하였다.

PA 당의 용출물의 형광 강도(310 nm 의 흥분 파장 및 380 nm 의 형광 파장)을 관찰하여 상호작용 강도[전단 용출물의 표준 올리고사카라이드(PA 람노스)에 대한 차이: V-V₀]를 측정하였다. 상호작용 강도 및 효과적인 리간드 양에 기초하여, 결합 상수 K_a 를 계산하였다. 그 결과는 표 4 내지 9 에 제시된다.

비교를 위하여, 코어-푸코스 특이적 렉틴으로 언급된 AAL (비교예 1), AOL (비교예 2), LCA (비교예 3), 및 PSA (비교예 4)에 대하여 상기의 것과 동일한 절차에 기초하여 결합 상수를 계산하였다. 그 결과를 표 4 내지 7 에 제시하였다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

표 4 내지 7 에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1 의 AAL 및 비교예 2 의 AOL 은 비-α1→6 당지질-기재 L-푸코스 당 사슬(당 사슬 번호. 718, 722, 723, 727, 909, 910, 및 933) 뿐만 아니라 L-푸코스 α1→6 당 사슬(당 사슬 번호 15, 201-203, 및 401-408)에도 결합하였다. 비교예 3 의 LCA 및 비교예 4 의 PSA 는 L-푸코스 α1→6 당 사슬(당 사슬 번호 003, 005-014)를 갖지 않는 다수의 당 사슬에 결합하였다. 다른 한편, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 안정적으로 결합하였고, 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 L-푸코스를 전혀 갖지 않은 당 사슬에는 결합하지 않았다. 또한, 실시예 1 의 PTL 은 통상적인 렉틴보다 더 높은 결합 상수를 가졌다(K_a=1.0×10⁵M^-1 이상). 또한, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 코어-푸코실화 트리안테나성 N-글리칸(당 사슬 번호 407-413) 및 테트라안테나성 N-글리칸(당 사슬 번호 418)에 또한 강하게 결합하였다. 심지어 사이알산이 첨가된 것들(당 사슬 번호 601 및 602)에서도, L-푸코스 α1→6 당 사슬의 결합 상수가 감소하지 않았음을 알 수 있었다.

(6) PTL 및 SRL 을 사용한 당단백질의 검출

(i) 당단백질의 제조

하기의 주요한 당 사슬 구조를 갖는 당단백질 (1) 내지 (9) 및 당을 갖지 않는 우혈청 알부민 (10) 을 제조하였다.

(1) L-푸코스 α1→6 N-결합 글리칸을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 티오글로불린(돼지):

[화학식 3]

(2) L-푸코스 α1→6 N-결합 글리칸을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 락토페린(소):

[화학식 4]

(3) L-푸코스 α1→6 N-결합 글리칸을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 면역 글로불린 G(인간):

[화학식 5]

(4) L-푸코스 α1→6 N-결합 글리칸을 갖지 않는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 트랜스페린(인간):

[화학식 6]

(5) L-푸코스 α1→6 N-결합 글리칸을 갖지 않는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 α1-산성 당단백질(인간):

[화학식 7]

(6) 고 만노스-타입 당 사슬을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 역전효소(효모):

[화학식 8]

(7) L-푸코스 O-결합 당 사슬을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 뮤신(돼지):

[화학식 9]

(8) L-푸코스 O-결합 당 사슬을 갖는 당단백질로서, 하기 식을 갖는 뮤신(소):

[화학식 10]

(ii) 웨스턴 블로팅에 의한 당단백질의 검출

실시예 1 의 PTL, 실시예 2 의 SRL, 비교예 1 의 AAL, 비교예 2 의 AOL, 비교예 3 의 LCA 를 바이오틴-표지하였다

(렉틴의 바이오틴화)

렉틴을 측정하여 0.1 M 탄산수소나트륨 용액(5mg/ml)에 용해시켰다. 그 후, 바이오틴화 시약을 디메틸 술폭사이드에 용해시켰고 그로써 얻은 용액을 렉틴 용액에 첨가하여 그 사이에 반응을 일으켰다. 그 후, 반응물을 증류 및 동결건조시키고, 이로써 바이오틴-표지 렉틴을 얻었다.

(당단백질의 SDS-PAGE 및 블로팅)

2 mg/ml 로 10 mM 인산염 완충 식염수(pH 7.4, PBS)에서 당단백질 샘플을 용해시킴으로써 얻은 용액을 18 ㎕ 의 단위로 마이크로튜브에 분산시켰다. 6 ㎕ 의 SDS 공정 액체(Sample Buffer Solution (2ME-); Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 1.25 ㎕ 의 2-메르캅토에탄올(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 각각의 분산된 유체에 첨가하고, 얻은 혼합물을 5 분 동안 비등시켰다. 이들은 폴리아크릴아미드 겔에 의하여 나타내어졌으며 PVDF 막으로 이동하였다(Immobilon IPVH 304 F0, Milipore K.K.).

(바이오틴-표지화 렉틴에 의한 염색)

필름을 1% BSA(pH 7.4, 1% BSA+TBS)가 첨가된 0.8% NaCl 을 포함하는 10 mM 트리스 완충 용액에 담그고 실온에서 한 시간 동안 흔들었다. 그 후, 필름을 0.8% NaCl 을 포함하는 10 mM 트리스 완충 용액(pH 7.4, TBS)로 3회 세척하였다. 그 후, 필름을 바이오틴-표지화 렉틴 용액(2㎍/ml)에 담그고 실온에서 한 시간 동안 흔들었다. 그 후, 필름을 TBS 로 3회 세척하였다. 그 후, 필름을 1 ㎍/ml (Vector Laboratories)에서 HRP 표지 스트렙타비딘 용액에 담그고 실온에서 30 분 동안 흔들었다. 필름을 TBS 로 3회 세척한 후, POD 면역염색 세트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용하여 염색 시험을 수행하였다. 상기 염색 시험은 바이오틴-표지화 렉틴을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의한 당단백질을 검출하기 위함이다. 도 13 내지 도 17 은 PTL(도 13), SRL(도 14), AAL(도 15), AOL(도 16), 또는 LCA(도 17)에 의하여 염색된 하기의 당단백질을 나타내는 사진이다.

도 13 내지 도 17 에서, 레인 0 내지 6 은 하기에 상응한다. 레인 1: 티로글로불린, 레인 2: 락토페린, 레인 3: 면역 면역글로불린, 레인 4: 트랜스페린, 레인 5: α1-산성 당단백질, 레인 6: 역전효소, 레인 0: 우혈청 알부민(대조구)

비교를 위하여, 단백질을 염색하기 위하여 CBB 염색을 또한 수행하였다. 그 염색 사진은 도 18 에 제시하였다. 도 18 에서, 레인 M 및 1 내지 6 은 하기에 상응한다. 레인 M: 분자량 표지, 레인 1: 티로글로불린, 레인 2: 락토페린, 레인 3: 면역글로불린 G, 레인 4: 트랜스페린, 레인 5: α1-산성 당단백질, 레인 6: 역전효소, 레인 0: 우혈청 알부민

[표 8]

표 8 및 도 13 내지 도 18 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 3 의 LCA 의 경우에서, L-푸코스 α1→6 당 사슬을 갖는 당단백질 뿐만 아니라 고 만노스(역전효소)를 갖는 당단백질도 검출되었다. 이와 대조적으로, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 의 경우에서는, 오직 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 갖는 당단백질만이 검출되었으며 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 L-푸코스를 갖지 않는 당 사슬은 전혀 검출되지 않았다.

(iii) ELISA 에 의한 당단백질의 검출

바이오틴-표지화된 실시예 1 의 PTL, 실시예 2 의 SRL, 비교예 1 의 AAL, 비교예 2 의 AOL, 비교예 3 의 LCA 를 사용하여 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의하여 당단백질을 검출하였다.

대조구로서 당 사슬을 포함하지 않는 단백질로서의 당단백질 및 알부민을 0.1 M 탄산 완충 용액(pH 9.5)에서 1 mg/ml 로 용해시켰다. 그 후, 얻은 용액을 마이크로타이터 플레이트(Nunc 439454)에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 얻은 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척하였다. 이 후, 1% BSA/PBS 를 웰에 첨가하고 그 용액을 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, 1% BSA/0.05% Tween/PBS 로 적절하게 희석된 바이오틴 표지화-렉틴을 웰에 첨가하고 그 용액을 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, 1% BSA/0.05% Tween/PBS 로 희석된 HRP 표지화 스트렙타비딘 용액을 웰에 첨가하고 그 용액을 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, TMB 퍼록시데이즈 기질 시스템(KPL)을 첨가하고 얻은 용액을 빛이 차단되고 있는 동안 실온에서 10 분 동안 배양하였다.

상기 반응을 1 M 인산에 의하여 중단시켰다. 그 후, 마이크로플레이트 리더(MPR-A4i, TOSOH CORPORATION)을 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이 값에 기초하여, 반응 값([당단백질이 플레이트에 대하여 고체상으로 되어 반응하는 웰의 450 nm 에서의 흡광도]-[당단백질이 플레이트에 대하여 고체상으로 되어 반응하지 않는 웰의 450 nm 에서의 흡광도])를 계산하였다. 다음으로, 각각의 렉틴에 대하여, 당단백질(티로글로불린) 값이 100 % 라는 가정에 기초하여 각각의 당단백질에 대한 상호작용 강도(상대적 값)을 계산하였다. 그 계산 결과를 표 9 및 도 19 내지 도 23 에 제시하였다.

[표 9]

표 9 및 도 19 내지 도 23 에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1 의 AAL 및 비교예 2 의 AOL 의 경우에서, L-푸코스 α1→6 당 사슬을 갖는 당단백질 뿐만 아니라 O-결합 당 사슬(뮤신)도 바람직하지 않게 검출되었다. 이와는 대조적으로, 실시예 1 의 PTL 및 실시에 2 의 SRL 의 경우에서는, 오직 L-푸코스 α1→6 당 사슬을 갖는 당단백질만이 검출되었고, 어떠한 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 L-푸코스를 갖지 않는 당 사슬도 검출되지 않았다. 또한, 비교예 1 내지 3 의 렉틴은 티오글로불린보다 열등한 락토페린 및 면역글로불린 G(IgG)에 대한 상호작용 강도를 가졌다. 이와 대조적으로, 실시예 1 및 2 의 렉틴은 티오글로불린과 동일하게 락토페린 및 면역글로불린에 대한 상호작용 강도를 제공하였다.

(iv) ELISA 에 의한 종양 표지 당 사슬의 검출

α-태아단백질(이하 "AFP"로 칭함)은 N-결합 당 사슬을 갖는 혈청에 포함되어 있는 당단백질이다. AFP 는 건강한 성인의 혈청에 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 한편으로, 양성 간 질환을 갖는 환자의 혈청은 증가된 α-태아단백질 L1-타입 당 사슬(AFP-L1)을 갖는다. 또한, α-태아단백질 L3-타입 당 사슬(AFP-L3)이 간암 환자에서 검출되었다. 통상적으로, 당 사슬의 차이는 LCA 에 의하여 측정되었으며, 그 측정 결과는 간 질환의 진단에 사용되어 왔다.

[화학식 12]

바이오틴-표지화된 실시예 1 의 PTL, 실시에 2 의 SRL, 비교예 1 의 AAL, 비교예 2 의 AOL, 및 비교예 3 의 LCA 를 사용하여 ELISA 에 의하여 α-태아단백질의 결합 특성을 평가하였다.

0.1 M 탄산 완충 용액(pH 9.5)를 사용하여 α-태아단백질(인간 제대 혈청으로부터 유래, 주로 L1-타입 당 사슬) 및 α-태아단백질-L3 (인간 간암 세포의 배양 상층액으로부터 제조)을 희석하여 0.01 ㎍/ml 을 얻었다. 그 후, 얻은 용액을 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 첨가하고 4℃에서 하룻 밤 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, 1% BSA/PBS 를 웰에 첨가하고 그 용액을 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, 상기 웰을 1% BSA/0.05% Tween/PBS 로 적절하게 희석된 바이오틴-표지화된 렉틴 용액을 첨가하고, 그 용액을 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, 1% BSA/0.05% Tween/PBS 에 의하여 희석된 HRP 표지화된 스트렙타비딘 용액을 첨가하고, 그 용액을 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 용액을 0.05% Tween/PBS 로 3회 세척한 후, TMB 퍼록시데이즈 기질 시스템(KPL)을 첨가하고 얻은 용액을 빛이 차단되고 있는 동안 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 상기 반응을 1 M 인산에 의하여 중단시켰다. 그 후, 마이크로플레이트 리더(MPR-A4i, TOSOH CORPORATION)을 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

α-태아단백질 및 α-태아단백질-L3이 렉틴과 함께 반응을 일으키게 하는 플레이트의 450 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 이 값에 기초하여, 반응 값([당단백질이 플레이트에 대하여 고체상으로 되어 반응하는 웰의 450 nm 에서의 흡광도]-[당단백질이 플레이트에 대하여 고체상으로 되어 반응하지 않는 웰의 450 nm 에서의 흡광도])를 계산하였다. 다음으로, 각각의 렉틴에 대하여, 상호작용을 계산하였다. 다음으로, 반응 값의 계산 결과를 표 10 및 도 24 내지 도 28 에 제시하였다.

[표 10]

표 10 에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 비교예 3 의 LCA 에 의한 검출과 동등 또는 그 이상의 수준에서 종양 표지(α-태아단백질-L1-타입 당 사슬 및 L3-타입 당 사슬)의 당 사슬의 변화를 검출할 수 있다. 따라서, 실시예 1 의 PTL 및 실시예 2 의 SRL 은 종양 표지의 당 사슬의 변화를 검출함에 의하여 진단 시약 또는 진단 시약 키트에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 렉틴은 표적 L-푸코스 α1→6 당 사슬 화합물이 다른 렉틴보다 더욱 정확한 방법으로 L-푸코스 α1→6 당 사슬 외에 당 사슬을 그 안에 포함하는 당 사슬 화합물 중에서 검출될 수 있는 높은 특이적 가능성을 갖는다.

[실시예 3 및 4] (NSL 및 LSL 의 제조 및 특성 측정)

(1) NSL 의 제조 (실시예 3)

도 29 에 제시된 정제 공정에 기초하여, Naematoloma sublateritium 렉틴(NSL)을 Naematoloma sublateritium 으로부터 정제하였다.

(추 출)

동결 건조된 Naematoloma sublateritium 분말(40g)을 0.8 L 의 PBS 로 4℃에서 2 시간 동안 추출하였다. 상기 액체를 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)하였다. 그 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 1 추출액을 얻었다. 상기 추출 잔류물을 0.4 L 의 PBS 로 4℃에서 하룻밤 재추출하였다. 원심분리 공정(10,000 rpm, 20 min, 4℃)후에, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 2 추출액을 얻었다. 이들 추출물을 조합하여 Naematoloma sublateritium 추출물을 얻었다.

(황산암모늄 침전)

얻은 상층액(1.5L)에 고체 (NH₄)₂SO₄(0.8kg)을 첨가하여 80%의 포화도를 얻었다. 4℃에서 밤새 방치한 후, 침전물을 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)에 의하여 수거하고 증류수 및 동결건조에 대하여 광범위하게 투석시켜, 이로써 Naematoloma sublateritium-80% 황산암모늄 침전 분획을 수거하였다.

(소수성 크로마토그래피)

상기 Naematoloma sublateritium-80% 황산암모늄 침전 분획을 2 M 의 황산암모늄-PBS 로 평형화된 부틸-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)에 적용하여 소수성 크로마토그래피 정제를 수행하였다. 상기 크로마토그래피에서, 증류수 용출 분획을 수거, 초여과, 및 동결건조하고, 이로써 Naematoloma sublateritium 렉틴 미정제 분획을 얻었다(도 30 의 ←→으로 나타냄).

(역상 크로마토그래피)

상기 공정을 통하여 얻은 Naematoloma sublateritium 렉틴 미정제 분획을 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)/아세토니트릴(100/0)으로 평형화된 C8 컬럼(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 적용하였다. 상기 크로마토그래피에서, 0.05% TFA/아세토니트릴(70/30) 용출 분획(도 31 의 ←→으로 나타냄)을 수거하였다. 그 후, 용매를 실온 증발에 의하여 제거하고 이에 의하여 건조 분말을 얻었다. 그 후, 상기 건조 분말을 수거하여, 이로써 NSL 을 얻었다.

SDS-PAGE(PhastGel, Gradient10-15)를 Phastsystem (GE Healthcare Bioscience)에서 행하였다. 샘플 용액 및 분자량 표지를 모두 1 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 제품 프로토콜 및 통상적인 방법에 기초하여 전기영동을 수행하였다. 도 32 는 NSL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타내며, 여기서 레인 1 및 레인 2 는 하기에 상응한다. 레인 M: 분자량 표지, 레인 1: NSL, 2-메르캅토에탄올(+), 레인 2: NSL, 2-메르캅토에탄올(-), 겔: Gradient10-15(GE Healthcare Bioscience), 및 샘플: 1 ㎕/레인, 염료: 은

10-15% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 상에서, 주요 성분은 NSL 인 것으로 확인되었다.

(2) LSL 의 제조(실시예 4)

도 33 에 제시된 정제 공정에 기초하여, 버섯 Lepista sordid 로부터 Lepista sordida 렉틴(LSL)을 정제하였다.

(추 출)

약 400 g 의 Lepista sordida 를 동결건조하여 얻은 동결건조된 Lepista sordida 분말(40g)을 0.8 L 의 PBS 와 함께 첨가하여 4℃에서 2 시간 동안 추출을 수행하였다. 상기 액체를 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)한 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 1 추출액을 얻었다. 상기 추출 잔류물을 0.4 L 의 PBS 로 4℃에서 밤새 재추출하였다. 상기 액체를 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)한 후, 상층액을 거즈 여과하여 이로써 제 2 추출액을 얻었다. 이들 추출물을 조합하여 Lepista sordida 추출물을 얻었다.

(황산암모늄 침전)

얻은 상층액(0.5L)에 고체(NH₄)₂SO₄ (0.8kg)을 첨가하여 80%의 포화도를 얻었다. 4℃에서 밤새 방치한 후, 침전물을 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)에 의하여 수거하고 증류수 및 동결건조에 대하여 광범위하게 투석시켜, 이로써 Lepista sordid-80% 황산암모늄 침전 분획을 수거하였다.

0.5 L 의 추출액을 약 0.8 kg 의 황산암모늄과 함께 첨가하여 80%-포화된 황산암모늄 농도를 달성하고 이로써 용액을 교반하였다. 그 후, 그 완전한 용해를 확인하였다. 그 후, 상기 액체를 7℃에서 하룻밤 그대로 방치하였다. 그 후, 상기 용액을 원심분리(10,000 rpm, 20 min, 4℃)하고, 침전물을 소량의 증류수와 함께 첨가하였다. 그 후, 얻은 용액을 현탁하여, 이로써 Lepista sordid-80% 황산암모늄 침전 분획을 수거하였다. 수거된 Lepista sordid-80% 황산암모늄 침전 분획을 투석 필름에 의하여 순수한 물로 투석시켰다(6,000 내지 8,000 의 분획).

(소수성 크로마토그래피)

상기 Lepista sordid-80% 황산암모늄 침전 분획을 2 M 의 황산암모늄-PBS 로 평형화된 부틸-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)에 적용하여 소수성 크로마토그래피 정제를 수행하였다. 상기 크로마토그래피에서, PBS 용출 분획을 수거, 초여과, 및 동결건조하고, 이로써 Lepista sordida 렉틴 미정제 분획을 얻었다(도 34 의 ←→으로 나타냄).

(역상 크로마토그래피)

Lepista sordida 렉틴 미정제 분획을 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)/아세토니트릴(100/0)으로 평형화된 C8 컬럼(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 적용하였다. 상기 크로마토그래피에서, 0.05% TFA/아세토니트릴(70/30) 용출 분획(도 35 의 ←→으로 나타냄)을 수거하였다. 그 후, 용매를 실온 증발에 의하여 제거하고 건조 분말을 얻었다. 그 후, 상기 건조 분말을 수거하여, 이로써 LSL 을 얻었다.

SDS-PAGE(PhastGel, Gradient10-15)를 Phastsystem (GE Healthcare Bioscience)에서 행하였다. 샘플 용액 및 분자량 표지를 모두 1 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 제품 프로토콜 및 통상적인 방법에 기초하여 전기영동을 수행하였다. 도 36 은 LSL 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타내며, 여기서 레인 M 및 레인 1 은 하기에 상응한다. 레인 M: 분자량 표지, 레인 1: LSL(소수성 크로마토그래피, 역상): 2-메르캅토에탄올(+), 겔: Gradient10-15(GE Healthcare Bioscience), 및 샘플: 1 ㎕/레인, 염료: 은

10-15% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 상에서, 주요 성분은 LSL 인 것으로 확인되었다.

(3) NSL 및 LSL 의 특성

(MALDI-TOF 질량 분광 분석)

각각 10 ㎍ 의 양으로 실시예 3 의 NSL 및 실시예 4 의 LSL 을 실시예 1 과 동일한 방법에 의하여 TA(0.1%-TFA 및 아세토니트릴이 2:1의 부피비를 갖는 혼합물)에서 분리하여 용해시켰다. 그 후, 4:1 의 부피비로 TA 에 용해된 포화 매트릭스 및 렉틴 TA 용액에 의하여 얻은 혼합물을 1.0 ㎕ 의 양으로 표적 플레이트에 적가하고 이로써 샘플을 제조하였다. Autoflex(Bruker Daltonics K.K.)의 질량 분광 분석 기구를 사용하여 LP 모드에서 NSL 및 LSL 의 분자량을 측정하였다. 그 결과는 분자량이 약 4,500 임을 나타냈다(도 37 및 도 38).

(아미노산 서열 분석)

실시예 3 의 NSL 의 아미노산 서열을 단백질 펩티드 서열분석기 PPSQ-21 시스템(SHIMADZU CORPORATION)에 의하여 분석하였다. 실시예 3 의 NSL 은 서열 번호 5 및 6 에 제시된 아미노산 서열의 혼성이었다. 이들 서열은 모두 신규하였다.

유사하게, 실시예 4 의 LSL 의 아미노산 서열을 단백질 펩티드 서열분석기 PPSQ-21 시스템(SHIMADZU CORPORATION)에 의하여 분석하였다. 그 결과를 서열 번호 4 에 제시하였다. 이 서열 또한 신규하였다.

(4) NSL 및 LSL 의 당 결합 특이성의 평가

실시예 3 의 NSL 및 실시예 4 의 LSL 과 관련하여, L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 특이적 결합 특성을 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 평가하였다. 구체적으로, NSL 및 LSL 의 결합 상수(K_a)를 계산하였다. 그 결과를 표 11 내지 13 에 제시하였다.

[표 11]

[표 12]

[표 13]

실시예 3 의 NSL 및 실시예 4 의 LSL 의 경우에서, 오직 L-푸코스 α1→6 당 사슬만이 검출되었고 비-L-푸코스 α1→6 당 사슬 및 L-푸코스를 갖지 않는 당 사슬은 전혀 검출되지 않았다. 또한, 실시예 3 의 NSL 및 실시예 4 의 LSL 은 또한 L-푸코스 α1→6 당 사슬의 트리- 및 테트라-안테나에 강하게 결합하였다. 또한, 심지어 사이알산이 이에 첨가될 때, L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 결합 상수는 감소하지 않았다.

최종적으로, 표 14 는 서열 번호 2 내지 6 에 제시된 단백질 또는 펩티드 사이의 상동성의 계산 결과를 나타낸 것이다. 이 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 서열 번호 2 내지 6 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열에 대하여 37% 이상의 상동성이 얻어질 때, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 얻을 수 있다.

[표 14]

SEQUENCE LISTING <110> J-OIL MILLS, INC. KOBAYASHI, Yuka <120> Fucose alpha 1-6 specific lectin <130> NP2102 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> common part of sequence No.2 to No.5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for Asp/Asn/Glu/Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X stands for Thr/Ser/Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X stands for Tyr/Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X stabds for Gln/Lys/Glu. <400> 1 Cys Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Pholiota terrestris Overholts <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X stands for Tyr/Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> X stands for Phe/Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> X stands for Arg/Lys/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X stands for Asp/Gly/Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> X stands for Asn/Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> X stands for Thr/Gln. <400> 2 Ala Pro Val Pro Val Thr Lys Leu Val Xaa Asp Gly Asp Thr Tyr Lys 1 5 10 15 Xaa Thr Ala Xaa Leu Asp Xaa Gly Asp Gly Xaa Trp Val Ala Gln Trp 20 25 30 Xaa Thr Xaa Val Phe His Xaa Gly 35 40 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for Pro/Gly. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X stands for Glu/Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X stands for Val/Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X stands for Asn/Asp/Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X stands for His/Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> X stands for Lys/His. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X stands for Val/Ile. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X stands for Gly/Asn/Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X stands for Ala/Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> X stands for Arg/Thr. <400> 3 Ala Pro Val Xaa Val Thr Xaa Leu Xaa Xaa Asp Gly Xaa Ser Tyr Lys 1 5 10 15 Xaa Thr Ala Xaa Leu Asp Tyr Gly Asp Gly Xaa Trp Xaa Ala Gln Trp 20 25 30 Xaa Xaa Asn Val Phe His Xaa 35 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Lepista sordida (Schum. : Fr.) Sing. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for Ala/Gln. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for Pro/Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X stands for Ala/Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X stands for Met/Ile/Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X stands for Tyr/Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X stands for Asp/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X stands for Lys/Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X stands for Ala/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X stands for Val/Asp/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> X stands for Asp/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> X stands for Arg/His/Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X stands for Gln/Arg. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X stands for Thr/Val. <400> 4 Xaa Pro Val Xaa Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Xaa Thr Tyr Xaa 1 5 10 15 Xaa Thr Ala Xaa Leu Xaa Tyr Gly Xaa Gly Xaa Trp Val Ala Xaa Trp 20 25 30 Ser Xaa Ala Val Phe His Gln Ser 35 40 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Naematoloma sublateritium (Fr.) Karst/Hypholoma sublateritium(Fr.)Quel <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X stands for Asp/Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for Ser/Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X stands for Gln/Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <400> 5 Ala Pro Val Pro Val Thr Lys Leu Val Xaa Asp Gly Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa Thr Ala Asn Leu Asp Phe Gly Asp Gly Asn Trp Val Ala Gln Trp 20 25 30 Ser Thr Asn Val Phe His Asn 35 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Naematoloma sublateritium (Fr.) Karst/Hypholoma sublateritium(Fr.)Quel <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for Asp/Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X stands for Ser/Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X stands for Gln/Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X stands for any amino acid, preferably Cys. <400> 6 Ala Pro Val Pro Val Thr Lys Leu Val Xaa Asp Asp Gly Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Thr Ala Asn Leu Asp Phe Gly Asp Gly Asn Trp Val Ala Gln 20 25 30 Trp Ser Thr Asn Val Phe His Asn 35 40

Claims

서열 번호 2 내지 6 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 펩티드인, L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴.
하기 단계를 포함하는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법:
담자균 및/또는 자낭균의 수성 용매 추출물을 하기의 크로마토그래피 (i) 소수성 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피, (ii) 친화성 크로마토그래피, 또는 (iii) 이온-교환 크로마토그래피 및 겔 여과 중 임의의 것을 거치게 하는 단계, 및 (iv) 4,000 내지 40,000 의 SDS-PAGE 에 의한 분자량을 가지며, (v) 25℃에서 1.0×10⁴M^-1 이상의 L-푸코스 α1→6 당 사슬에 대한 결합 상수에 의하여 나타내어지는 친화성을 가지며, (vi)푸코스 α1→6 당 사슬을 포함하지 않는 당지질 또는 고 만노즈 당사슬에 대한 1.0×10³M^-1이하의 결합상수에 의하여 나타내어지는 친화성을 가지는 렉틴을 얻는 단계.
제 2 항에 있어서, 상기 담자균이 하나 이상의 Strophariaceae, Tricholomataceae, Amanitaceae, 및 Polyporaceae 으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 담자균이 Pholiota terrestris, Pholiota squarrosa, Pholiota adiposa, Stropharia rugosoannulata, Naematoloma sublateritium, Lepista sordida, 및 Amanita muscaria 으로부터 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 담자균 또는 자낭균의 자실체가 사용되는 것을 특징으로 하는 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴의 제조방법.
L-푸코스 α1→6 당 사슬을 검출하기 위한 진단 시약으로서, 상기 진단 시약이 활성 성분으로서 제 1 항에 따른 L-푸코스 α1→6 특이적 렉틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
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